Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глутаминатсинтетаза и глутаматсинтаза листьев пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глутаминатсинтетаза и глутаматсинтаза листьев пшеницы"

АКАДЕЛИ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.н/ БАХА

На правах рукописи

КИМ ЭЛЬДАР ЭРНЕСТОВИЧ

УДК 577.152.631

ГЛУТАМИЖШТЕТАЗА И ГЛУТАМАТСШ1ТАЗА ЛИСТЬЕВ ПШЕНИЦЫ

03.00.04 - Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ" •диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук -

Москва 1991

Работа выполнена в группе энзимологии ассимиляции аммиака Ордена Ленина Института биохимия им. А.Н.Баха

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор З.Г.Евстигнеева

Официальные оппоненты - доктор биологических

наук В.И.Муронец

- кандидат биологических наук А.В.Софьии

Ведущая организация - Институт почвоведения в

фотосинтеза АН СССР

Защита состоятся " " ¿?1сГс{ 1991 г.

в 10 часов на заседании специализированного совета (К 002.96.01) по присуждении ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха АН СССР (.117071 Москва, Ленинский проспект, 33,корпус 2).

С диссертацией мохно ознакомиться в библиотеке биологический литературы АН СССР (117071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус I).

Автореферат разослан " ^ Я/7" 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

М.И.Молчанов

/ ■ ' ' 'гтя/

I 1 /ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО ЯП'\ РАБОТУ

тггувлЩусть проблемы. Зерновые культуры обеспечивают почти половину всех запасов белка для человечества. Еа:гл1?.1 направлением в решения задачи повышения продуктивности зерновых культур я увеличения их белковости является изучение энзпмоло-гии биохимических процессов, лежащих в основе усвоения растениями неорганического азота (Прянишников,1943; Кретович,1954).

Изучение уровня активности ферментов и органной топографии процессов, определяющих усвоение неорганического азота (Измайлов, 1986), актуально как с теоретической, так и с практической точки зрения. На этой основе могут о успехом решаться не только вопросы диагностики обеспеченности растения азотом, необходимости и сроков внесения азотннх удобрений, но и вопросы способа внесения этих удобрений в целях получения максимальной продуктивности сельскохозяйственных растений.

Знание особенностей распределения активности ферментов, катализирующих реакции ассимиляции минерального азота модцу различными органами, представляет значительный интерес в создании теоретических основ для целенаправленных селекционных работ по получению оортов с высокой ассимилирующей способное-, тью и, соответственно, с повышенным Содержанием белка в зерне. Усвоение аммиака растения:,® монет происходить, в первую очередь, с помодью фермента глутаминсинтетазы (1С, КЭ 6.3.1.2.), а такзв глутаматдегидрогеназы (ГДГ, Ю 1.4.1.2; 1.4.1.3; 1.4.1.4).' Образующийся глутамин используется на синтез ряда важнейших азотсодержащих соединений клетки, в том числе на синтез глутаминовой кислоты в реакции, катализируемой глута-матсинтазой (ГОГАТ, ДО 1.4.1.13; 1.4.1.14; 1.4.7.1).

В настоящее время сложилось представление, что главный путь ассимиляции аммиака у растений проходит через реакции, катализируемые ГС и ГОГАТ. По сравнению с П5 и ГОГАТ из микроорганизмов и ряда высших растений (-/ОТ/Л», ¿ео ,1976; Евстигнеева, 1930) у пшеницы эти ферменты изучены недостаточно. Можно указать лишь работы В.Л.Кретовича с сотрудниками (Кретович, Евстигнеева, 1949; Кретович, Яковлева, 1959), исследовавших биосинтез глутачина в проростках пшеницы и созревающем колосе, затем работу Стрсйта и Феллера ( 5г><?//, 7еНег , 1983),

которые показали наличие двух форм ГС в листьях пшеницы, а так?.е работы Е.В.Быковой (1987) и Н.Д.Алехиной с сотрудниками (1984, 1986) по изучению 1С ич корнай пшеницы. В отношении 10ГАТ пшеницы известна лишь одна работа, посвященная изучению феррецоксинзависимой ГОГАТ (Фд-.ГОГАТ) из листьев пшеницы ( ¿Ьелр, ТЪлр ,1987). Все вышесказанное предопределило постановку данной работы.

Целью работа явилось изучение 1С и ФдгГОГАТ из листьев пшениш. В задачи работы I,ходило:

1. Разработать метод очистки и получить в галогенном состоянии наиболее активную - хлоропластную форму ГС листьев пшеницы, изучить ее структуру, кинетику и регуляш'.з.

2. Разработать метод очистки Фц-ГОГАТ из листьев шениш и на очищенном препарате определить наиболее важные кинетические параметры.

3. Изучить распределение по органам растений пшеницы активностей основных <]>ер!лентов ассимиляции азота в процессе вегетации.

4. Исследоьать вопрос, о наличия согласованности в индукции синтеза ГС и 1д-Г0ГАТ в листьях пшеницы.

Научная човизна работы. В результате проведенных исследований обнаружено наличие двух форм 1С в листьях пшеницы: гито-зольной II хлоропластной. Разработан метод очистки хлоропласт-ной 1С.

Установлено, что хло^епластная ГС является олигомернш ферментом, состоянии из 8 идентичных мономоров с молекулярной массой 53 ООО Да, для которых впервые изучены физико-химические и кинетические характеристики.

Показано наличие регуляции 1С хлоропластов листьев пшени-пы по принципу отрицателпюй обратной связи рядом аминокислот.

Разработан метод частичной очистки Ьд-ГОГАТ из листьев пшеницы и определены некоторые кинетические параметры фермента. Обнаружено, что активность ключевых ферментов азотного обмена нитратредуктазы(НР),- 1С, ГДГ, Фд-ГОГАТ на всем протяжении вегетации коррелирует с дозой азотных удобрений, вносимых в почву, что создает благоприятные условия для усвоения минерального азота яровой пшеницей. Исследовано распределение активности этих ферментов по органам растений пшеницы и показано, что ак-

тивность ПЗ намного выше, чем активность Фд-ГОГАТ и ГДГ. Наличия согласованности в регуляции синтеза 1С и Од-ГСГАТ рядом азотсодержащих метаболитов не обнаружено.

Практическая ценность работы. Полученной экспериментальный материал расширяет и углубляет общие представления для понимания процесса усвоения неорганического азота шенипеЗ. Обнаруженная зависимость между содержанием азота в почве и активностью ключевых ферментов азотного обмена в растениях "пленили может служить показателем интенсивности процесса усвоения азота. Результаты работы могут быть использованы для разработки методов повышения белковости зерна пшенапы..

■Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на совместном заседании лаборатории метаболизма азота и биосинтеза белка и группы энзимологии ассимиляции аы.\*лаха Института биохимии т. А.Н.Баха АН СССР.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, I работа сдана в печать.

Структур*» и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 ' рисунками, 10 таблицами и 2 схемами. Список литературы включает 178 наименований.

* МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ .

I. ОпытныЯ матепичл. В качестве объекта исследования была использованы растения пшеницы ( Тн^си/я оеьЪУил? ¿. ) двух сортов: яровая "Московская 35" и яровая "Казахстанская 4". В вегетационных опытах при выращивании на двух различных уровнях азота использовали яровую пшеницу сорта "Московская 35й. Для всех остальных исследований использовалась яровая пшеница сорта "Казахстанская 4".

Проростки пшеницы выращивали в условиях оранжереи. В работе использовались 10-дневные проростки. В опытах по изучению активности основных ферментов ассимиляции азота в процессе вегетации на двух уровнях азотного питания, выращивание растений проводили в вегетационных сосудах во Всесоюзном научно-исследо-

вательскоы института удобрений и агропочвоведенвя им. Д.Н. Прянишникова. Азот вносили в форме СаОЮд^ дробно. Количество азота, внесенное в сосуд, к урожаю составляло при недостатке азота 0,2 г, а при высоком его уровне 1,5 г.

Для получения ферментных экстрактов замороженные в ид-ком азоте образцы разрусали растиранием их в ступке. Экстракцию проводили двумя взсовьми частями буфера следующего состава: в случае очистки ИЗ - 5ыМ трис- НС1 с рН 7,4, 2мМ ЭДТА, 2м« 2 - меркаптоэтанола; в случае очистки Фд-ГОГАТ - 5СМЛ ка-лиМ>оо1атньй буфер с рН 7,5, ЮСМ..1 КС1, Бы Л ЭДТА, 0,1^ 2 -меркаптоэтанола.

2. Методы исследования.

■ Определение активности глутаминсинтетазы проводили методом Эллиота ( '£1ИоМ ,1953), основанно.л на количественном измерена; ^--глутамллглдроксамата ( /- ГТК), и трансфераз-нш методом ( ¿¿ос/т'/псгл^ Х970).

Определение активности глута'латдегидрогеназц проводили спектро^отометрнчоски по образованию НАД4" (Гильманов, 1981).

Определение активности НАЛН-ГОГАТ проводили спектрофэто-метрическям методом, по образованию НАД* .( ЯННе^ Stoe/tn7a/?J 1972).

Активность Фд-ГОГАТ определяли по образованию / -глута-мата по ь-.етоду ( 1980).

Определение актаьп^т:; КР проводили по Мульдеру ( Ермаков, 1987).

2а единицу активности принимали количество фермента, ка-талиэирувдее образование 1мкаоля определяемого вещества за 15 минут. Удельную активность вцрагали числом единиц активности на I мг белка.

. АпалдткчеамЯ электрофорез проводили в 7,5,? полиакрил-амидном геле по методу Дэвиса ( , 196<1).

Молекулярную мчссу олигомера 1С определяли методом гель-фильтрации на колонке с Тауо/>еог1 - Нй'бб.

Молекулярную массу мономера 1С определяли методом элек-. трофореза в 10%-и полиакриламидном геле в присутствии доде-цилсульфата натрия ( ¿?$Ього, 1959).

Белок определяли по методу Лоури ( о2. , 1951).

Содергание ам-.'иака определяли по Несслеру в модифика-

- 5 -

дин Любимова (Любимов и др., 1968).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛКД0ВА1Ш

I. Ксслсдовлнпе глутащшстштетазы пз листьев гееннгтц.

Из литературных данных известно, что в листьях плениш присутствует весьма активная ГС. Стрейт и Келлер ( SSrf/Y , fetZer 11983), а затем Е.В.Быкова (1987) показали наличие двух фортл ГС, которые были идентифицированы ими как штозоль-ная ГС I и хлоропластная ГС П, составляющие, по дашщл СтреЛ-та и 'Роллера, соответственно В% и 92* от обпей актавнэоти. Поскольку более углубленные исследования в этом направлении не проводились, нами была предпринята работа по очистке ГС из листьев пшепицы и исследованию физико-химических и кинетических свойств наиболее активной формы -ГСП, полученной нами в гомогенном состоянии.

1,1. Выделение гл.утаминсиятетазы из листьев шгенпга.

Очистка глутачинсинтетазы из листьев шегашы представлена в табл. I.

Таблица I

Очистка глутаминсинтетазы из листьев пшеницы

С^т I Общий ; Активность ¿Вы^од. ¡Степень

очистки • {белок,мг; иония, Сдельная,; % ¡очистки i i ед. ! ед/мг ; j

1. Исходный экстракт

2. Высаллваниа (i/H1)2S04

от 0 до 30? насыщения

3. Ионнообмеиная хроматография на ÄEAE-Toyepearc - 650 M

4. Гель-фильтраиля

На Тоуо/зсаг?-AWSS-

'.С 32,00 7650

253,00 6300

9,50 5240

2,45 2400

7,2

25,0

551,0 991,0

100,0 1,0

83,0 3,5

68,5 76,5

31,0 137,0

зо <;э

Номера фракций

Рис.1. Про'иль элюшш белков с колонки ДШ-/Ьуо-рыг?. Элюшш трис-ацетагом: 1-белок, 2-кониентрачия элгента, З-активностьГС

Экспериментальные данные показывают, что предложенный способ очистки позволяет получить гомогенный фермент с удельной активностью 991 ед/мг белка. Степень очистка 137,выход 31!?.

На рис. I приведены результаты ионнообменной хроматографии. Первш пиком выходит 1С 1, активность которой составляет С.» от общей активности фермента. Фракция сильно загрязнена балласишли белками и в дальнейшей работе не использовалась. Второй пик активности, составляющий 94? и содерхаидаЯ 1С П, собирался и использовался для дальностей очистки. В грубом экстракте присутствует низкомолекулярный ингибитор 1С, для удаления которого необходимо проводить гель-фильтрацию на сефа-дексе Г-25 или продолжительный диализ.

1.2. Свойства, структура и кинетические характеристики . хлоропласиной глутамннсянтатазы из листьев пшеницы.

Свойства.

1С П листьев пшениш инактивируется в ьрасутствиа щеренных концентраций солей металлов, однако проявляет стабильность в присутствии органических солей с высокой ионной силой (табл. 2). Такая "чувствительность" 1С П к присутствию солей металлов и в то юз время переносимость высокой ионной силы органических солей является ее характерной особенностью.

Таблица 2

Влияние ионов солей на активность глутаминсинтетазы из хлоропластов шенпцы

Концентрация соли, ;д Время ! инкуба- ! иии, ! час. ! • Относительная активность , % ст контроля

КС1 1 \ КаС1' 1 | :¥Г2 ТОЕС-НС1 1 Трис-| цитрат j Трис-ацетат 'тт ¡Имида-; зол-НСI ! iLv.ii ца- !зол- !пптрат ! 1.м;!;;а-! зол-!аиетат

I 16л 108 88

0,25 2 100 52 44 - - - - - -

ч .3 48 32 0 - - - - - -

I 30 38 120 _ - - - - _

0,50 2 14 24 36 - - - - - -

3 7 5 'о - - - - - -

I Г 20 28 132 92 100 132 90 89 86

1,00 2 '■'. 12 2 24 87 98 132 80 85 76

3 3 0 0 85 93 120 75 82 73

х) Измерения не проводились.

Молекулярная масса олигомера была определена методом гель-фильтрации и составила 500 ООО Да.

Молекулярная масса мономера определена методом электрофореза в полиакриламидиом геле в присутствии додецплсульфата натрия и составила 63 ООО Да. .

Кинетические характеристики хлопопластной ГС листьев пше-

нппы.

Кинетические характеристики активности фермента определяли гидроксаматнш методом в присутствии Мд2+ (рН смеси 7,4). Била исследована зависимость активности ГС П от температуры. При 15 мин. инкубации максимальная активность наблюдалась при 40°С. Зависимость активности ГС П от времени инкубации имеет линейный характер в пределах от 0 до 15 минут. Оптимальное значение рН реакционной смеси для работы фермента равно 7,4. Зависимость активности ГС от концентрации в реакционной смеси имеет линейный характер в пределах 0 - 0,05 мг/ил.

11а рис. 2 представлена зависимость скорости реакции ГС от концентрации глутамата. Как видно из графика, эта зависимость характеризуется наличием положительной кооперативности.. Ииги-бирования избытком субстрата не наблюдается. Значение равно 7,7i.il, что близко к значению К,1^" для корне" псе ниш -7,2;».! (Быкова, 1587) и ГС корней тикви - 6.2\и (Голова и др., 1984).

Зависимость активности фермента от концентрации гидроксил-амина (ркс.З) характеризуется наличием положительной кооперативности и ингибированием избытком субстрата при концентрации гидроксиламина более 5л.1. Величина К^3* равна .

Рис. 4 иллюстрирует зависимость активности ГС П от концентрации АТ5 при постоянной концентрации равной 15ыМ, Величина для АТС равна 0,2Ш. При концентрации АТ5 выше 2мМ наблюдается субстратное ингибирование , что характерно для большинства растительных ГС при высоких концентрациях АТ5.

1.3, Регуляция активности глутаминсинтатазы хлоропластов листьев пшеницы аминокислотами.

Из литературных данных известно, что активность ГС высших растений ингибируется аминокислотами, для синтеза которых используется амидный или аминный азот глутамина (Евстигнеева,

ГС П листьев ппеншш в координатах Михаэлиса-Мектен (А), .Лайнун-вера-Берка (Б) и график Хилла (В)

ность ГС П листьев шеншш в координатах лихаэлиса-ментен (А), Лайнуивера-Еерка (Б) и график Хилла (В)

[ATi) ,!.«

Рис.4. Влияние AT? на активность 1С П

листьев паеницы в координатах Удха - элиса-Ментен (А), Лайнуквера-Берка (Б) н график Хилла (В)

I

»-» о

[3]

Рис. 5. Влиянгз а'.шнокислот на активность ГС листьев паешшы при ненасышаю-ией 8 (.¿Л (сплошная линия) и насыщающей 80 кй (пунктирная линия) концентрация глутамата: 1,1 -гли-. пин;2,2-аланин;3,3-аспарагин;4,4-аспарагиновая кислота

Пушкин, 1983). Наибольший ингибиругсяЯ э^акт на ГС из корнзП гкенппн оказывают аспарагиносая кислота и асларагип. Глишш п аланин так не ингибируют фермент (Быкова, 1937). Исходя из этих сведения, для изучения регуляции аминокислотами ГС П листьев пиеницы нами в работе были выбраны те га аминокислоты, которые оказывала ингибирувщпй эффект на ГС корней пиеницы.

Влияние аминокислот на активность ГС П при насыщайтей 80мМ и ненасыщающей &.;'.! концентрациях глутамата представлено на рис.5, из которого видно, что. исследованные аминокислоты ингибируют фермент; наибольший пнгибируюэдй эффект показывает аспарагиновая кислота. Ингибпрую^пй эффект аминокислот усиливается при ненаскщаю-дой концентрации глутамата, что, по-видимому, свидетельствует о наличии конкуренции мезду аминокислотами и глутаматом за связывание с активным центром фермента. Полученные результаты близки к результатам опытов Е.В.Быкозой (1987), полученных для корней пшеницы.

2. Исследование ферпедоксинзависимой глутаматсинтазы из лг.атьев пшеницы.

Литературных данных о свойствах Фд-ГОГАТ пшеницы практически кет, за исплзочониом работа ( Ые"?, У^-у, 1987), где определены некоторые свойства частично очищенного препарата Од -ГОГЛГ. В связи с этим нами была проведена работа по очистке Эд-ГОГАТ из листьев пшглглы и на полученном препарата определен ряд кинетических характеристик.

2.1. Выделение (Ьерредоксинзависимой глутаматсинтазы из лисгьяг гг.'енипн.

Результаты очисгки Фд-ГОГАТ из листьев пшеницы представ-ле'ны в табл. 3.

Таблица 3 Очистка Фд-ГОГАТ из листьев пиеницы

Стадия очистки

! Общий ! Активность

! <5££0К/ ! Общая, Сдельная, мг ед I ед/мг

Выход,1Степень % |ОЧИСТКИ

4

5 ! 6

Т. Исходный экстракт

1140,0 71,8 0,063 100 1,0

2. ¿б^/г/гемре .

Оф^О^оЗО/Г £~£>.г ¿>'77 7о

МС^/фё'А'//??

- 12 -

Продолжение таблицы 3

I_! 2 ! 3 ! 4 ! 5 ? 6

3. Препапат после инкубации в течение 3 суток при 4° С 456,0 71,5 0,157 100 2,5

4. Длинная хроматография на АН-глутамат-сефа-розе 13,6 10,7 0,787 15 12,5

Как видно из таблицы, в результате этой прицедуры достигается степень очистки 12,5 раз с выходом по активности 15?.

2.2. Кинетические характеристики ферредоксинзавясиу.ой глутауатсннтазы листьев гпиенипы.

Для Од-ГОГЛТ листьев пшеницы били определены оптимальные условия для протекания реакции. Установлено, что зависимость активности Фд-ГОГАТ от концентрации белка в реакционной смеси имеет линейный характер в пределах 0 - 5мг/мл. Показано, что зависимость активности фермента от временя инкубации косит линейный характер вплоть до 60 мин. Оптимум рН для действия ферментов - 7,5. Фермент максимально активен при 40°С.

На рис. 6 представлена зависимость скорости реакции Фд - . ГОГАТ от концентрации глут-мина. Значение К^315 в 1,2м!<!. Рис.7 иллюстрирует зависимость активности Фд-ГОГАТ от концентрация 2-оксоглутарата. Белачина К^2 для 2-оксоглутарата равна 0,55и.'Л. Кривые, насыщения Фд-ГОГАТ листьев пае гады для обоих субстратов подчиняются гиперболической зависимости, что характерно для большинства растительных Фд-ГОГАТ.

3. Регуляция Ферментов ассимиляции азота у пшеницы.

3.1. Активность Ферментов , первичного усвоения азота в различных органах шившим в процессе вегетягтии.

Прлменавие азотных удобрений является надежнш способом, повышения уровня белка в зерне ери одновременном повышении урожайности (Павлов, 1967; Минеев, Павлов, 1981). Однако известно, что с повышением дозы удобрения коэффициент использования азо-

Удельная активность,ед/мг о о м

• • V

Ю СП е-1 ,

£ Удельная активность,ед/мг

о * о

[ 1 л

1.) £1 (1

? * >1 1

[0 ► л

* :■< г >

г; >-1

::> ; "

а> м

И

\ - и ;;

1 01

К}' I о

г;

•ч С) Ь'

'К В №

м .1. И

<"Г Г1

' 1 н (Б

(0 гл й

й

га

3"

о

I

ё ь

ч

0 ■о

У

1

- Е1 -

та растением снижается, и значительная часть удобрения ел; источником загрязнения почвы и воды. Кроме того, в этих а ловиях большие количества нитратов накапливаются в вегета-. ной массе, что свидетельствует о том, что растение не мою полностью усваивать поступивший в него.азот. Установлено, оптималъпш является дробное внесение удобрений частично i посеве, частично в период цветения и начала формирования зерна.

Поскольку эффективность усвоения растениями неоргани1 ких форм азота определяется уровнем активности ключевых ф« ментов ассимиляции азота можно предположить, что дробное i сение оптимальцих доз азота позволяет поддерживать в расте такой уровень активности, который обеспечивает его эффект! пое усвоение.

В связи с этим, было проведено исследование активно« Ферментов, катализирующих последовательные реакции усвосш нитратов и затем аммиака: HP, ГС, Фд-ГОГАТ и ГДГ в наземт вегетативных и репродуктивных органах яровой ппеницы "Мое» екая i ö" при недостаточной и высокой обеспеченности азотом Oin эг.сперименты проводились совместно с сотрудниками Всос ног научно-исследовательского института удобрений и агроп поведения им. Д.Н.Прянишникова А.Н.Павловым, С.В.Кирнос л Е.Н.Черновой.

Изменение активности ферментов ассимиляции азота в ор пах лсендцы в процессе вегетации, а тагам активность ферме топ ассимиляции азота в колоса ппенииц в фазе молочной спа сти на недостаточной и оптимальной дозе азота представлены таблицах 4 и 5, соответственно..

Сравнение активностей HP, 1С и ГДГ в различных органа пшеницы позволяет сделать заключение о наличии прямой завл< мости активностей ферментов, катализирующих реакции ассими. иия неорганического азота, а такхе Фд-ГОГАТ от дозы минер; »ого азота, внесенного з почву.

При недостатке азота активность всех исследованных фе] тов на протяжении вегетации была практически на порядок ни; чем при его высокой дозе. Как видно из полученных данных, ; ноэ внесение высокой дозы азотных удобр.ний не приводит к j россии синтеза ключевых ферментов азотного обмена, а, елод<

-à./ e Vi^P^ciil'l' С.) дизв азота

Орган Т" " " "Т i i Фазы вегетаии и

tВариант! t i куцение ¡начало труб| сесоэт.на j котощение ¡ кования j трубкования ¡ *u-JulueiülB (Формирование зерна i ¡молочная ¡спелость

I ! 2 ! 3 i 4 • ! 5 ! Ь 7 ! 8

Активность KF, s^g.^Jih.

Листья i 2 0,12 2,28 0,12 0,54 0,42 3,60 7,62 3,30 0,06 0,90 0,006 0,240

Стебли 1 2 _*) 0,06 0,16 0,48 0,30 0,31 0,72 Активность 1С, ГоЩ^гЙст. 0,18 0,54 0,018 0,120'

Листья 1 2 3,37 20,52 5,35 51,74 121,02 128,88 474,25 1925,10 21,72 258,89 12,23 334,37

Стебли I '■Z - 3.44 57,59 114,89 23,21 33B.0I 1308,10 6S.54 ' 26,04 523,26

Продолжение таблиды 4.

.Листья

Стебли

Листья

Стебли

1

2

1

2

1

2

1

2

0,17 1,05

Активность бд-ГОГАТ.У^У^ЩВ

3,19 0,50 0,34

3,76 5,56 4,17

0,34 1,03 3,11 3,45

Активность ГДГ,

2,37 25,63

14,06 193,32

1,64 11,14

16,73 144,61

28,79 172,18

10,61 83,45

26,95 423,54

0,12 4,82

1,35 2,39

13,47 159,19

54,15 378,05

0,05 1,37

0,31 1,97

6,13 98,64

93,48 498,47

0

1

^Измерения не проводились

гельно, процесс усвоения пшеницей азота при такой 1 ¿лнолиг.ы происходит в течение всей вегетации достаточно интенсивно.

Максимальная активность ферментов в листьях и стио^х наблюдается в период середшш трубкованил и начала kojiu.lcii.hi тшшш. Активность всех ислледованних ^«рмангов оцшгишно коррелирует с дозой азота как в листьях, так и в дтаолнх. ни ■ рост активности ферментов в варианте на ьысокоЛ доэв а.шга рошо соответствует результатам С.В.Кирмос с соавт. (№8), но казавших, что увеличение уровня азотного питания иол^о.чит к увеличению урожая и Зелковиотости зерна паешиш. 11;.а ич.'.иши •■ нии уровня азота от низкого до высокого масса зерна и.наелась более чем в четыре раза.

Данные таблицы 4 позволяют сделать заключение, чш асси-:.-:!:ляц::я неорганического азота в реакциях, катализируемых Н!', р;, ГДГ, осуществляется как в листьях, так и в стеблях рчсте-нлй, а интенсивность процесса изме!шется в течение вегет!п:;ы.

Активность НР, кроме стадии колошения, б ила вше в .мьль ях, чем в стеблях, в то время как активность ГДГ была вше ь стеблях. ГС, активности которой в период начала колошения Ли ла на порядок выше, чем активность ГДГ, и на два поряпка,чем активность Фд-ГОГАТ, в начале вегетации била более акгиыш в листьях, а в конце - в стеблях.

Таблица 5

Активность (ферментов ассшилншш азога в колола г-чниш ъ .¡азе молочной спелости на недостаточной (. фиант I) и оптг'лальной (вариант 2) дозе азота

Активность

и а ь о, о

Чешуя I 0,006 20,75

2 0,012 196,43

Зерно I 0,018 111,84

2 0,078 662,22

229,41 1,30

7,80 0,10

53,43 0,18

41,02 О

Из дашшх таблицы 5 видно, что в фазе молочной спелости :<1!1"н активность исследуемых ферментов в колосе (чепуи и зерна), как и в вегетативных органах, била выше в случае высокой цпчи опота. В зерне по сравнению с чепуями активность исследу-дмнх |орментов была выше п 2-3 раза. В чешуях и зернах наиболее высока активность ГС. А.Н.Павловы.! с соавт. (1981) было нпклранп, что зерновки пшопицы в фазе молочной спелости способны к первичному усвоению минерального азота - нитратного п ам-монвЛного. Таким образом, при усилении потока неорганического а:»отл в колос нет опасности накопления нитрат.ов в зерне.

Следует отметить, что как при недостатке азота, так и при и,.с-';;:м»1 азотной нагрузке активность № и Фд-ГОГАГ в вегетатпв-ннх органлх пшеницы на протяжении вегетации бвла значительно ни-,), чем активность ГС и ГДГ. Следовательно, при усвоении ппота растением активность НР может ограничивать поток аммонийного азота в систему его ассимиляции, а активность Фд-Г'ОГАТ - ограничивать синтез глуташиювой кислоты в тандеме репшгий ГС/Фд-П)ГАТ.

3.<2. Ферменты ассимиляции аммиака у ппеницы и регуляпия их синтеза.

¡1ами била поставлена задача изучить вопрос о координации регуляции синтеза ГС и ГОГАТ как системы ферментов, катализи-¡■'Учих последовательно реакции, обеспечивающие клетку глута-'.•(Ч!'.\1 и глутаматом. До настоящего времени этот вопрос не был ¡н-.о-оцотн, хотя априорно эта система всегда рассматривается !"и: действующая коордшюрованно.

Как уже отмечалось выше, ГС/ГОГАТ цикл в последние годы рассматривается как тандем ферментов, играющий ведущую роль в ассимиляции растениями аммг .ка. Однако, тлеются данные, что при высокой концентрации аммиака у растений его ассимиляция происходит с участием ГДГ. Например, в созревающих колосьях (Курнос и др., 1988) роль ГДГ становится очень ванной. Е.Д. ¡пунцов! с соавт.(1986) показали, что увеличение концентрации лг.'чония в корнях и листьях пшенипы приводит к снижению'активно чти 1С, особенно в корнях, и увеличению активности ГДГ.

В свяпи с этим в задачи работы вх^дпло исследование ин-: иги синтеза I" и *д-1СГАТ в проростках пшеницы при инфиль-

рации ряда азотсодернаадх соединений для шме.нишш 11

аличии согласованности ц регуляции их слтии.и

Данные по влиянию азотсодержащих соединен:!.! на синтез IЬ* ГОГАТ приводятся в таблице 6.

Гибл.ша о

Влияние нитрата, аммония, глута\'лта и х'лутимшш на синтез ГС и 1д-Г0ГАТ

хЬильтрируемое соединение, сспоэишш 6 ч.

Относительная активность,% т

Относи МЛЬН.лп у Ч*-- V иаи ыпно^и,,

ГС

I

Фд-ГОГАТ

№

;■.(-)и] Л?

1{2° 1Ш3

(НН4)(12Р04

Глутамат

Глута\'.ии

^>0

(Ш14)!1/04 Глутамат Глу. .ил

100 128 93

125 136

100

200

126 274 239

Л и

ь я

с т

1С0 170 112 146 120

Корни

нет активности

то же

и

100 У:) 03 114 114

100

151 114 247 223

¡00 132 О ¡IV

гл;

Н«Т Й1и.1з

Ц|»и'| л то

Результаты опии с ин$л1 ль грацией в проростки шзншш ¡п;-ганических форм азо*а, а также глута-шна и глугсчата, , что в листьях наиболзо высокая удельная активность II- и •ГОГАТ наблюдается при инфильтрации глутамата и глутимина. ;ильтрацая аммония в листьях сникает активность 1С. Урмими. -ГОГАТ во всех вариантах опытов выше, чем в контроле. Ми даолагаеы, что глутамат а глутшшх, являясь наилучший суб--атаьш для синтеза ряда аминокислот и других азотсодержащих динений, способствуют интенсификации азотного обмана и, в : числе, синтеза ряда ¡ярмвитов. Таким ооразслд, их до..отвио, оятно, не является специфичным в качестве инд/кторов сшсге-исследуемых ферментов. Однако, полностью исключать сиена-

п

г»

)'ИЧность действия какого из инфильтрированных метаболитов псе ж: нельзя.

Чтобы уточнить причину увеличения активности ферментов при ин(пльтраили азотсодержащих метаболитов были поставлегш «нити с ин1>ильтрчцией этих метаболитов сошестно с ингабитора< ми синтеза белка. Получанные данные позволяют заключить, что ичент место индукция синтеза, а не активирование этих ферментов. Так, активность листьев при инфильтрации глутамата в при сутотши! хлирам^еникола ниже на 50,'Î по сравнению с опытами бе хлорам ¡«Никола, lia основании данных об ингибировашш синтеза l'J листьев хлорачфениколом можно предположить, что он осущест вляс.тся на 70 S рибосомах хлоропластов,

ИндуиироганныН синтез ад-Г0ГЛт листьев такжо сильнее инг бирузтсн хлорамрсниколом, чем циклогоксимидом, следовательно этот фермент синтезируется в хлоропластах, что согласуется с дашиии для 1'Д-Г0ГАТ из других растений ( eJ а?. , 197

Wallsçrove étal , 1972; Si/zi/À/et al , 1981 ). -

.'[„тачие согласованности в индукции синтеза 1С и Од-ГОГАТ локализованных в хлоропластах, позволило бы с большей опреде-.'¡ешюстьп говорить об этих последовательных реакциях как о ме тл'о,..!чсском проиоссе, управляемом уже на уровне синтеза фер-¡лпмтного белка. Однако, полученные нами данные для ГС и Фд-!'чгдт листьев гшенццы не позволяют сделать такой вывод. Крои того, во всех вариантах опытов уровень активности Фд-ГОГАТ на 'и?-! иогядка ниже активности РГ ( табл. 4,5).

Опиты с инфильтрацией метиоиинсулъфоксимина показали, Ч1 j'1'jt ингибитор, специфичный для ГС, не ингибирует 1Ш гд-ГОШ пи ИАЛИ-ГДГ.

В L ВО Д Ы

1. Разработан метод очистки глутаминсинтетазы из хлоро^ пластов листьев пшеницы, позволяющий получить гомогенный при электрофорезе в ПААГ фермент с удельной активностью 991 ед/м! балка и выходом

2. Рпервые изучены физико-химические и кинетические харг ТШ1ИСТИКИ глутаминсинтетазы хлоропластов листьев пшеницы. Оп-I iлона молекулярная масса олигомера и мономера глутаминсин-■¡■'¡■ггмп из улоропластов листьев пшеницы 500 ООО и 63 ООО Да,

• • и-гиПТСТРИНПО.

3. Установлено, что зависимость активности хчгутяииноин-и-■ тазы от концентрации субстратов - глутамата, гидрокси./шмимп и АТФ - имеет негиперболический характер.

4. Обнаружено наличие в грубом экстракте листыш шишшии низкомолекулярного ингибитора глутамина..:тетази, a ïaïuw *ыа«-тивация хлоропластной глутаыинсинтетазы в присутствии умеренных концентраций MgCI2, HaCI, KCl и стабильность фермента в присутствии органических солей с высокой ионной силой.

5. Разработан метод, позволяющий получить частично очищенный препарат ферредоксинзависимой глутаматсинтазы из листья пшеницы с удельной активностью фермента 0,787 од/'мг белка и выходом 15%. Зависимость активности фермента от концентрации гл7тамина и 2-оксоглутарата имеет гиперболический 1арактор.

6. В результате проведенных исследований показано, что дробное внесение оптимальных доз азотных удобрений увели -чивает примерно на порядок активность нитратредуктази, глута-минсинтетазы, глутаматдегидрогеназы и ферредоксинзависимой глутаматсинтазы на протяжении вегетации.

7. В репродуктивных органах - чешуях и зерне - и [.азе молочной спелости обнаружена высокая активность глутаминоиитита-зы и глутаматдегидрогеназы и низкая -нитратредуктази и ммти-доксиНзависимой глууаматсиитазы.

8. Выявлено, что активность нитратредуктази и фег>редок--синзавискмой глутаматсинтазы намного ниже активности i 'г/ттла.ч синтета _ во всех наземных органах растоний пшенипы на всох стадиях развития.

9. Согласованности в индукшш синтеза глутаминсинготани и (ферредоксинзависимой глутаматсинтазы азотсодорладими сисда-нениялп не обнаружено.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1, Ким Э.Э., Быкова Е.В., Евстигнеева З.Г., Кретович и.',. Ферменты ассимиляции атака у пшеницы и регуляция их син-т-'и Прикл. биохи;.;. и микробиол.-1990. -Т.26, ,ï3.-C.334-370.

2. Ким Э.Э., Соловьева H.A., Сидельникова Л.И., Евсп неева З.Г., Кретович В.Л., Чернова E.H., Кирнос С.Н., ihnj-лов А.Н. Активность ферментов первичного усвоении неирыиц ческого азота в различных органах пшеницы в процессе ьигаи-

кии // Нрикл.биохим. в микробиол. -1991.-Т.27, КЗ.-С.428-432.

3. Ким Э.Э., Евстигнеева З.Г. Влияние различных азотсодержащих соединений на активность ферментов ассимиляции азота в проростках пшеницы Ц Сб. :Повшегае устойчивости в продуктивности зерновых культур. Алма-Ата, "Наука", 1991, о. 213-216.