Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гликосфинголипиды аорты человека и их взаимодействие с липопротеидами низкой плостности

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гликосфинголипиды аорты человека и их взаимодействие с липопротеидами низкой плостности"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ Н\УК Кардиологический научный центр.

На правах рукописи

МХ_:/-ЛЛЕНКО Нр1:ка Александровна

глжссикголлшду лорта -хелозекл ¡1 их взлжщдейстеие С лшогтротеидамя низкой платности

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена ь лаборатории биохимии липидсв и простагландиноа Института экспериментальной кардиологии Кардиологического научного центра РАМН

Научный руководитель: кандидат химических наук

Н.В.Проказооа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.А.Ткачук

кандидат химических наук, Г. И. Музя

Ведущее учреждение: Институт биоорганической химии

км. M. М. Шемякина РАН .

Защита состоится

1993 года в ___ часов

на заседании Специализированного ученого совета К 001.22.02 в Кардиологическом научной центре РАМН по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул. , д. 15а.

С диссертацией ыохно ознакомиться в научной библиотеке Кардиологического научного центра РАМН

Автореферат разослан

1993 года.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Т.И.Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАК'ГЕРИСТККА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания остаются главной причиной смертности в экономически развитых странах. Большинство сердечно-сосудистых заболеваний является следствием атеросклероза магистральных артерий. Ключевым событием в развитии ате-рос::леротического поракения является прогрессирующее накопление ляпэдов ь 'ветках к мезсыеточно?.! пространстве интимы сосудоз (Smith, 1976: McC-ill, 1988). В основном накапливается холестерин и его зфнрн (small, 1938). Считается, что внутриклеточный холестерин накапливается в результате захзата клетками (юдафздтоованннх дшюпротеидов низкой плотности (ЛШ), поскольку перегруженные холестерином клетки in vitro удается получить лишь с помощью искусственно модафацкровапш лНП (Brown and Goldstein, 1S33). Предполагают, что модификация ЛИП in vivo монет происходить кепос-рэдстзежо в мегклетэчнсм пространстве сосудистой стенки (Steinberg, 198S). Попытки выделить модифицированные ЛНП из пораженной атеросклерозом аорты привели к обнаружения в межклеточном пространстве интикн целого спектра холестерин-содерка^их частиц, которые способны вызывать накопление холестерина в мзкрофзгах и приводить к образованию пенистых клеток в культуре (Henchikov, 1989). Эти частицы неоднородны по составу и структуре, достаточно сильно отличаются от ЛНП плазмы (Hoíf, 1979; Yla-Herttuala et al., 1987). Несмотря на имеющиеся данные, указывающие на цроисховдение внеклеточных липидных частиц из липопротеидов низкой плотности (Smith, 19SO; Shaikh, 1988), механизм формирования этих частиц и их роль в атерогенезе пока не известны. Изучая механизм накопления липидов при атеросклерозе, основное внимание традиционно уделяют

метаболизму, холестерина, значительно меньше изучен метаболизм других липидоз, особенно минорных. Однакб, в последнее время пол-шлись работы, показывающие, что при атеросклерозе человека и экспериментальных животных происходит более чем 10-кратное увеличение содержания гликосфинголипидов (ГСЛ) в ткани сосудов (МикЫп, 1939; Нага, 1991). Имеющиеся литературные данные о способности ГСЛ модульфовать рецепторопосредовакный захват ЛНП клетками (Р111рот1оь, 1981), позволяют предположить, что накапливающиеся в сосудистой стенке ГСЛ могут участвовать в процессе модификации липопротендов и/или в фэрмырованш аортальных внеклеточных лкпидных частиц. Однако, до.сих пор идентификация гликосфинголипидов аорты человека проводилась на уровне тонкослойной хроматографии, а локализация избыточных ГСЛ в стенке аорты и возможность их участия в модификации.ЛНП были не изучены. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение роли гликосфшголипвдов в атерсгенезе, и в частности, влияния ГСЛ на метаболизм ЛКГГ. В задачи исследования входило: I) выделить основные ГСЛ аорты человека и установить их .структуру; 2) определить состав и содержание ГСЛ липидныг частиц, выделенных из межклеточного пространства атеросклеротической интимы; 3) исследовать характер взаимодействия ЛШ с ганглиозидами, накапливающимися в атеросклеротической аорте человека.

Научная новизна работы. В работе впервые определена химическая структура основных ГСЛ аорты человека. Установлено, что глюкозил-церамид, лактозилцерамид, глоботриаозилцерамид и глоботетраозил-церамид являются основными нейтральными гликосфинго липид ами аорты. Установлено, что основным ганглиозидом аорты является гемзтозид

(ганглиозид Кроме того, в аорте обнаружены ганглиозилы СК.,,

С3?1г- св3' отг

Впервые исследованы содержанке н состав ГСЛ аортальных внеклеточных липидкых частиц двух типов (обогащенных эфирами холестерина и обогащенных свободным холестерином). Установлено, что содержание ГСЛ в частицах обоих ткпоз превышает их эдгржакие в клетках интимы и б лнпопротеидах низкой плотности. Обнаружены различия в г ликосфинголнгшдно.ч составе частиц разных типов. Показано, что доля клеточных ГСЛ (три- и тетрагексозилцеранида) выше в аортальных лшшдных частицах, обогащенных свободным холестерином, чем в частицах, обогащенных эфирами холестерина. •

Впервые показано, что взаимодействие ганглкозидов с ЛНП приводит к изменению конформации гпоЗ, а также к сляяпию (агрегации) липопротеидных частиц. Обнаружено, что модифицированные ганглиози-дами ЛШ активно захватываются макрофагами и стимулируют этарификацию холестерина.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные в работе данные расширяют представление о процессах развитая атеросклероти-ческого поражения. Обнаруженные различия в гликолипидном составе внеклеточных липидных частиц, обогащенных зфир&чн холестерина и обогащенных свободным холестерином, могут отражать различные пути 4 - формирования, этих частиц и указывают на клеточное происхождение чзстиц, обогащенных свободным холестерином. В работе показано, что ггнглиоздды аорты способны вызывать модификацию ЛНП, а, следовательно, накопление ГСЛ, происходящее в атеросклеротической аорте, можэт приводить к прогрессированию патологических изменений. Это предполагает поиск путей коррекции нарушений гликолипидного соста-

sa в сосудах-человека.

Апробация работы. Основные результаты работы были дожжены на Всесоюзном симпозиума по биохимии лшидов ( Алма-Ата, 1937); Всесоюзном симпозиуме "Реконструкция, стабилизация и репарация мембран" (Благовещенск, 1989); на XX республиканской научной юбилейной конференции молодых медиков Грузии (Тбилиси, 1991); ка 8 международном симпозиуме по атеросклерозу ( Рам, Сиена, 1939). Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов, обсуждения результатов, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая 21 рисунок и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ Аорты 40-60-летних мужчин, умерших внезапно, вследствие инфаркта миокарда, были взяты асептически через 1,5-3 часа после смерти. Жировая и.соединительная ткани и адвентиция были отделены, а интимальный и медиальный слои взяты для исследования. Гликосфин-голшиды "экстрагировали из гомогената ткани согласно Проказовой (1961)". rirttTpawiiMP ГСЛ и ганглиознда разделяли с помощью ионоб-менно* хроиатогрвфим на ДЭДЭ-сефадексе А-25 в ацетатной форме (Ohaeiii, 1960). Разделение нейтральных ГСЛ и ганглиозидов на индивидуальное комнавмин проводили с помощью высокоэффективной жид-кастно* хроматограф» на хроматографе Altex 334 (США) (Holms,

1982). Количественное определение ганглиозидов во фракциях проводили по содержанию сиаловой кислоты (Svennerholn, 1963). Количество нейтральных ГСЛ определяли с помощь» анализа на сфингозин (Oalevey et al., 1977). Ферментативный гидролиз ганглиозидов ней-раминидазой из Vibrio cholerae (Koch-Light, АНГЛИЯ) проводили ПО методу (Balasubrananian, 1971). Качественное и количественное определение углеводов в виде триметилсилиливых эфяров метилглико-зидов проводили ГЗХ на хроматографе Руе-Ю4 (Англия) , внутренний стандарт - маннит (Свилей, 1975). Масс-спектры кетиллнровачных гликосфинголипидов снимали на масс-спектрометре И-80А; (Hitaohi, Япония) (Rose, 1933). хН-Я1.(Р-спектры растворов ГСЛ снимали в дей-тдроди?,'.етилсулурсксиле на импульсном фурье-спектрофотометре ш-500 (ьги1сег,ФЕГ) (Daorowski, 1980).

Аортальные внеклеточные липиднне частицы были лйезно предоставлены для анализа др. Xruth H.s. из Национального института здоровья (СП1А). Экстракцию суммарных липидов частяц проводили по ?oich et al. (1957). Холестерин и эфиры холестерина разделяли тон. ко сложной юхзматографлей на пластинах silioa gei £о (Horok, ФРГ) я количество липидоз в хрсматогрЕфгееских зонах определяли сканирующей денситометрией (iíurawski et al., 1974). ГСЛ аортальных частиц . экстрагировали согласно Дятлосицксй (1980) и разделяли на нейтра-лыше ГСЛ и гангдиозида ионсСкенной хроматографией (Ohashi, 1980). ^г^тпэльппе ГСЛ и гзнгдксзадч разделяли ъ* индг^ЭДУельЕке аскяо->:сн-п: r/-coKc?'J-'I^Kr:'-rp;io.i тонкослойно.* лрсчатогрг^-.зЗ, с затем прс-ъоэкл 'л хо^асгьэнное скапфуздзЗ денсктс^этр::«.!

Ur.du »г al., i97-').

^«лкхотеивн плотности (ЛШ) лз хрози здороетх

доноров последовательным ультрацентркфугированн&м (Lindgren, 1975). Концентрацию ЛКП ъ полученшх препаратах определяли по содержанию белка, которое измеряли методом Лоури в модификации Пет-

TJR

терсонэ . Мечение ЛКП "I проводили иодмонохлоридным методом в модификации Bilhsimer с соавторами.. Меченные тритием ганглкозиды получали тритиевнм обменом (Shevchenko et al., 1931) совместно с сотрудшшами йститута молекулярной генетики Ш СССР. Комплексы ЛНП с ганглиозвдами получали, инкубируя смесь в физиологическом растворе 0,5 часа при 37°С. Комплекс выделяли ультрацентрифугированием в солевой плотности (1,071г/мл, 45000 об/мин). Спектры поглощения и оптическую плотность исследуемых образцов измеряли на спектрофотометре Shimaazu 210UV, используя кварцевые кюветы 5x5 мм. Светорассеивание и спектры флуоресценции измеряли в 5x5 мм кварцевых кюветах под прямым углом на спектрофшоориметре Hitachi-300О. Для оценки пространственной липвднзелкозой организации ЛНП-ганглиозидных комплексов использовалось явление индуктивно-резонансной миграции энергии возбужденного состояния триптофанклов на гидрофобный флуоресцентный зонд пирен (Добрецов, IS80). Захват ЛНП и ЛНП-GMj макрофагами измеряли, как описано в работе (Goldstein, 1979). Включение [14с]-олеата в эфиры холестерина и триглицервды определяли согласно (Goldstein, 1983).

' РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУВДЕНИЕ Гякосфшголитда аорты человека. Содержание ганглнозидов и нейтральных гликоа^нголшшдов в образцах аорты, полученных от лвдей, умерших от инфаркта миокарда, составляет соответственно 0,025 и 0,035 мг в I г сырой ткани. Сушарные гликосфинголипиды аорты

подвергали ионобменной хроматограф® на шш-сефадексе для разделения нейтральных гликосфинголипидов и ганглиозидоз. Затем с помощью ВЭЯХ из этих фракций были выделены главные гликосфинголипид-ные компоненты аорты человека. Указанным способом было получено пять основных ганглиозидных фракций (таблица I). Количественное определение соотношения углеводных компонентов, образовавшихся в результате кислотного метанолиза этих ганглиозидов, сравнение хро-матографической подвижности исследуемых ганглиозидоз и продуктов их ферментативного, гидролиза нейраминидазой с подвижностью стандартных ГСЛ позволило заключить, что основным ганглиозидом аорты человека является гематозид (ганглиозид Я13), кроме того в аорте присутствуют ганглиозиды С!^, сб3, со1а, . Ткань аорты содержит

Таблша I. Состав и мольные соотношения углеводных компонентов ганглиозидов, выделенных из аорта человека.

Фракция ТИП ганглиозида Содержание, % от суммы* Углеюдные компоненты"

01с ва1 ваШАс НеиАс

I с«3 67 1.00 1.15 - 0.99

II си, 2 1 .00 1.85 0.85 0.89

III сз. 8 1 .00 1.10 - 1 .80

IV 19 1.00 1.96 0-92 2.04

7 4 1 .00 2.06 1.20 3.04

* - определено по опаловой кислот-, ошибка ± 2-35? - определено ГЖХ, ошибка = 5?;

Таблица 2. Соотношение компонентов в смеси нейтральных гликосфинголипидов аорты человека

Фракция Тип гликосфинголипида Содержание, % от сушш*

А1 ИоСег 4

, А2 ЪасСег 10

АЗ йЪОзедСег 57

А4 СЬОве ,Сег 4 29 '

* Определено по содержанию сфингозина, ошибка определения ± 1-2%.

еще ряд минорных компонентов, которые не удалось выделить в количествах, достаточных для установления структуры. Колоночной хроматографией на силикагеле суммарные нейтральные гликолилиды аорты были разделены на четыре фракции ( табл.2). Качественный анализ ГЖХ углеводов в виде триметилсилиловых производных метилгликозидов показал, что глшюлшшд фракции А1 содержит только глюкозу, гликолилиды фракций А2 и АЗ - глюкозу и галактозу, а фракция А4 - еще и галактозамин . Далее гликолилиды фракций А2-А4 подвергали метилированию и их структура была исследована с помощью ыасс-спектрометрии. Для установления мест замещения в углеводных остатках все метилированные гликолилиды были превращены в ацетаты частично метилированных полиолов, смесь которых анализировали с помощью комбинированной ГЖХ-масс-спектромвтрин. Конфигурацию глико-

8

зндной связи в гликолипидах определяли с поэдыэ 1К-®.<Р . Полученные данные позволили заключить, что гликосфинголипиды, выделенные кз аорты, представляют собой глюкозилцерамид, лактозилцера-мид, глоботриаозилцерамид и глоботетраозилцерамид. Помимо указанных гликолипидов в аорте присутствуют еще два минорных более полярных гликолишда, которые не были идентифицированы из-за их низкого содержания.

Еирнокислотный состав зсех гликолипидов аорты отличается высоким содержанием насыщенных кислот, хотя в количественном отношении сильно варьирует от фракции к фракции (тебл.З).

Таблица 3. Жирнокислотный состав ганглиозидов и нейтральных гликосфжголшшдов аорты человека ( % от суммы ).

Хирная Фракция (гантлиозид) Фракция (гликосфинго липид)

кислота I II III IV V А1 А2 АЗ А4

С«3 СЩ СБ3 й01а СТ1Ь СХсСег ЬасСег СЬ0зе3Сег СЪОзе^Сэг

С1б:0 15 49 26 36 26 42 40 34 14

С18:0 16 16 45 28 39 7 9 13 22

С13:1 28 о>2 8 14 9 - - - -

С22:0 13 21 8 10 3 8 12 22 6

о 24:0 28 5 7 12 2** 42 39 33 56

С24:1 - 9 6 - - - - — —

Определено по ГЗХ, охпбка определения г

Состав и "содержание гликосфшголшшдов аортальных холестеркн-содержащих частиц. Б межклеточном пространстве атеросклеротической интимы обнаруживают лшшдвые частицы двух типов: липидные капли и многослойные лигосомы. Мы исследовали гликосфкнголипиды частиц, которые были выделены из трех различных аорт, и охарактеризованы доктором Kruth H.s. как внеклеточные липидные капли, обогащенные эфграми холестерина, плотностью меньше 1,01 г/мл (частниц Д1) и мультиламеллярше тельца, обогащенные свободным холестерином, плотностью от 1,03 до 1,05 г/мл (частицы Д7). В аортальных липидных частицах нами были идентифицированы основные ганглиозиды gm3> od^, GT1fe. Во всех образцах онэ составлял более 80S общего количества ганглиозидов. Закономерности в различиях содержания GD3 и GT1b в исследованных частицах обнаружено не было. Нейтральные ГСЛ аортальных частиц бая представлены глпсозящерамвдом (моноГЦ), лакто-зилцерамидом 0®Щ), гяэботрваоаалцерамидрм (триГЦ) и глоботетрао-зилцерамвдоы (тотраЩ). Содержание ГСЛ в аортальных ляпвдннх частицах показано в таблице 4. Поено видать, что содеркшхв суммарных ГСЛ во воех образцах аортальшх частиц (кроме Д1-1) в 3-4 раза выше, чем в лиовротеядвх низкой плотности и в клетках гиюрохас-•гического слоя жнтвмы. Таким оораэом, при развитии атвросклероти-ческого пораяенжя сосудастой стенки ГСЛ могут накашиваться в составе аортальных внеклеточных лигадннт частац. Аортаяьные частицы одного типа имеет блпкое соотвовенве остванх гявюофвголшн-дов. Во всех часяцах Л. обогящппнт ai, esa» 80* составляет моноГЦ. в часящах Д7, мовоГЦ носа» оаюшюв глососфкголшид, однако его доля аначнтвлыю манию, а доля слота ГСЛ вше.

ю

Таблица 4 •' Содержание ГС.1 2 аортальных лшэдных частицах

(кнолъ/моль холестерина).

тип а частиц моноГЦ дагц триГЦ тетраГЦ г8нгл. суммарные ГСЛ

Д1 6,6±0,7 0,8±0,3 0,3*0,1 0,2±0,I 0,4±0,I 8,3il,3

I 80% 10% 3% 2% 5%

Д7 18,4±2,7 4,8±0,8 0,6i0,I 2,3±0,3 3,2±0,4 29,3±3,0

6336 16% 2% 8% 10%

Д1 24,0±2,5 2,7±0,4 0,6±0,I 0,6±0,I 0,9±0,2 28,8±2,0

II вз% 10% 2% 2% 3%

Ж? 17,6±2,0 5,2±0,6 I,4±0,2 3,4±0,3 5,8±0,7 33,4±2,7

53% 16% 4% 10% 17%

ш 33,8±5,0 3,5±0,4 I,5±0,3 i,e±o,3 I,2±0,4 4I,6±5,0

III 81 % 8% 4% 4% 3%

Д7 13,9*2,2 4,8t0,5 3,4±0.5 4,I±0,5 S,4±0,7 37,S±5,3

505 13% 9% 11% 17%

ЖП 4,4±0,5 2,5i0,3 I,2±0,3 0,7±0,2 I,5±0,3 I0.3±I,3 "

-',35 24% ■2% 7% 14%

КЛЗТКИ I штили

юр;<"а Г:/0 h/o 2,3±G,3 24% 5,7i0,6 49% 3,I±0,3 27% II,6±I,0

Сляька 3,4±0,5 следы 1,7±G,2 2.0i0.3 I,2±C,2 8,3-0,9

4 41.Я <;2% 20% 24% 14% i i

Данные лргдстйвлэш з вт-у>е среднего ¿рех определений ± е-гЕСздартн^я Oiciöica измерения.

ггнтл. - суммарные ггнтлюзиды. н/с - не обнаружено.

Кроме того, содержание ганглиозндов в частицах Д7 в 5-3 раз Еыше, чем в частицах Д1, выделенных из той не аорты.

Таким образом, полученные нами данные показывают, что исследованные аортальные частицы Ж и Д7 отличаются составом гликосфин-голипидов как от лшюпротеидов низкой плотности, так и друг от друга. Это указывает на различные пути формирования частиц Д1 и Д7. Например, более высокое содержание клеточных ГСЛ (три- и тетраГЦ) в частицах, обогащенных свободным холестерином, монет говорить в пользу клеточного происхождения таких частиц.

Мы предположили, что ГСЛ, накапливающиеся в межклеточном пространстве атеросклеротической аорты, могут участвовать в модификации ЛНП в сосудистой стенке. Поэтому мы исследовали взаимодействие липопротевдов низкой плотности с ганглиозндаии (кислыми ГСЛ). Взаимодействие ЛНП с ганглнозвда&я в растворе. Способность ЛНП связывать, экзогенные ганглиозиди изучали, инкубируя липопротеиды с радиоактивномотеиными ганглиозидами, а затем отделяя несвязавзиеся' ганглиозиды цантрифугарованием. Было показано, что при центрифугировании, приывяяемом для выделения ЛНП, ганглиозиды оседают на дао пробирки. Посла. совестной инкубации с лшопротеидами часть ганглиозндов всшывает, связываясь с липопротевдными частицами (рис.1). Количество ганглиозндов в образующемся комплексе пропорционально их концентрации в инкубационной смеси без тенденции к насыщению во всем диапазоне изученных концентраций (рис. 2). Мы не обнарухыи значительных разяп* в связывании лшопротеидами ганглиозндов развой структуры.

Золя раЭиооктибности, %

12 з »

номер фракции (верх — Эно) ЕИ сиз 9В сиз + лнп

рис.1 Распределение [Зн]-си3 по высоте проСирзда после центрифугирования в растворе НаВг (¿=1.071 г/мл).

го«-лиоэиа 6 комплексе о ЛНП, мсль/мсмь апсВ

сиз Си|

рис.2 Связывание ганглиозидов с ЛНП. Комплексы выделены флотацией в солевой плотности.

Увеличение концентрации ганглиозидов приводит к образовании нефло-твруицих в данных.условиях частиц. Аналитическое центрифугирование лшюпротевд-ганглиозидных комплексов показало, что флотирующие частицы при этом увеличивают свою гидратированную плотность, о чем говорит снижение коэффициента флотации ( табл.5). При взаимодействии ЛНП с ганглиозидами наблюдается изменение параметров собственной флуоресценции ашВ. Интенсивность триптофановой флуоресценции ЛНП падает с ростом концентрации ганглиозидов в растворе (рис.3), а максимум флуоресценции смещается в длиноволнозую область (рис.4). Это указывает на изменение конформации бежа ЛНП, которое может происходить под действием ганглиозидов как в липопротеидной частице, так и при агрегации или слиянии ЛШ и образовании новых липопротеид-подобных частиц .

Таблица 5. Флотационные свойства ЛИП-вц.,, кодялексоз

Концентрация Доля нефлотирущего Коэффициент флотации

00, а О-КМ) белгг.з ( % от су!лш ) 8£1,063

0 0 4,7

оО 4.,2

100 25 3,7

200 47 " 3,0 '"

* - р < 0,00?

•и

рис.З Зависимость интенсивности тркптофаноьой Флуоресценции лнп от концентрации ганглиозидов gd1 а (о ) и gm3 ( ■ ).

X , нм

mm'

SS5

50 100 ISO MO

концеипрация ган-лиозиЭа, мкМ

230

рис.4 Смещение максимума флуоресценции триптофанЕ-оь Ш1 ъ

присутствии ганглиозидов GD1a ( О ) И 0.43

\

Выделение липопротеид-ганглиозидннх комплексов иетодои гель-фильтрации. Образование новых крупных липидных частиц при взаимодействии лшопротеидов низкой плотности и ганглиозидов моено проследить по изменению профиля элюции ЛНП. На рис.5А показано, что липопротенды низкой плотности элюируются одним симметричным пиком. После инкубации ЛНП с ганглиозидом см3 на хроматограмме появляется пик, соответствующий крупным частицам, элюирующимся в свободном объеме колонки. Увеличение концентрации он^ в инкубационной смеси сопровоадается значительным увеличением шка У0 и уменьшением пика, соответствующего ЛНП (рисЛВ.С.о). Аналогичные изменения профиля элюции ЛНП вызывает и ганглиозид По дан-

ным электронной микроскопии частицы, элюирущиеся в свободном объеме, представляют собой крупные лшшдные капли, диаметр которых иироко варьирует от 40 до 200 нм. Частицы способны образовывать агрегаты, размер которых достигает 400 нм.

Было обнаружено, что сфкнгомие.чнн не вызывает подобной агрегации ЛНП. Интересно, что ганглиозиды в исследованных концентрациях не вызывали агрегации липопротеидов высокой плотности. Изменение конфорнгщш апоВ в частице ЛНП под действием ганглиозидов. В данном случае липопротеЕД-гштлиозидныэ комплексы получал!' инкубацией ЛНП с ггнглиозидаш, предварительно иммобилизованными на пластике. При это;.'. .ЛНП такие связывачи молекулы ганглиозидов, однако агрегации липопротеидных частиц не происходило,что позволило применить флуоресцентный метод, разработанный для оценки погруженности апоВ ь лклвдную фазу частицы ЛНП ( Добрецов и соавт., 1980). В основе метода леютт явление индуктивно-'резонгнсной

3 2 1

0

4 3 2

1

1 9 18

2 1

А А без GM3 V. / \ vt U V 1 1 --У , , --, , ,

i . В i ^ ... , 0.5m M GM3

. С ImM GM3

... . 1 - D J 1 . 1.5mM GM 3

' Е 0.5mM GM3 без А H П

РИС

20 40 60 80 . номер фракции

.5 Гельфнльтрация• Ж1-ом3 комплексов на сефарозе 4B-CL.

миграции энергии возбужденного состояния триптофанилов- на флуоресцентный зонд, помещенный в липидное ядро ЛНП ( в данном случае пирен). Эффективность тушения флуоресценции зависит от расстояния меаду донором и акцептором энергии, а значит, от глубины погруженности триптофан® в липидную фазу ЛНП и конформации апоВ. Предварительная оценка доступности триптофанилов тушению пиреном показала (рис.6), что если в ЛНП 10055 триптофанилов доступны тушителю, то после инкубации ЛНП с ганглиозидами - лишь 8056. Зависимость тушения флюоресценции триптофанилов' аров от концентрации пирена в ЛНП и. ЛИИзм^ хорошо описывается уравнением Штерна-Фольмвра (рис.7). Это позволяет рассчитать.коэффициент пропорциональности а, зависящий от положения триптофанилов по отношению к поверхности липидной фазы. В результате были получены следующие коэффициенты пропорциональности: 0.94 ± 0.01 для ЛНП; 1.16 ± 0.06 и 1.29 ± 0.13 для ЛНП-ом3 с различным содержанием ганглиозидов. Сопоставление этих коэффициентов с теоретической зависимостью величины а от глубины погруженности триптофанов в липидную. фазу

ЛНП (Добрецов, 1986), показало, что в ЛНПЧЗМ., триптофанилы погру-

3 о о

жены в липидное ядро в большей степени (15 ± 2 А и 23 ± 6 А), чем о

в нативных ЛНП (7 ± 2 А), причем степень погруженности пропорциональна содержанию ганглиозидов в комплексе. Поскольку погружение бежа в липидную фазу сопровождается уменьшением доступности триптофанилов пирену (рис.6), можно заключить, что при погружении

аров под воздействием сы, происходит структурная перестройка бел-

3 о

г.а с образованием доменов с характерным размером более 37 А (1,2

радиуса Фврстера).

-в-АНП х АНП-сиЗ (50икМ) -•- ЛНП-СМЗ (100и«Н)

рис.6 Тушение гшреном флуоресценции триптофана в ЛКП и ЛИНзм^ комплексах. Пересечение оси ординат в точке 0.75 означает доступность всех триптофанклов ЛИТ тушители (Добрецов, 1339).

ЬСМГ/Т-О-/!)))

к [пирен]. М

-е- АНП -»г АНЛ-СИ/МинЫ) АНЛ-СМ,(100и.Ы)

рис.7 Зависимость степени тушения флуоресценции ЛНП и ЛКЕНзмэ пиреном от концентрации пиренз в логарифмических координатах.

Биологические свойства ЛШ1-гаш\лиозидных комплексов. Изменение физико-химических свойств ЛНП под воздействием гаыглиозвдов шкет влиять на метаболизм люгапротеидов. В таблице 6 приведены дашие, которые показывют, что прединкубация [1251]-ЛНП с гвнглиозидом СМ3 приводит к увеличению захвата липопротекдов макрофагами. Захва? Ш1 клетками растет с увеличением концентрации гаьтлиозидов в ку-льтуральной среде. Захват ЛШ-сыэ комплексов не подавлялся избытком ацетиллированншс ЛБП, что говорит, о поступлении ЛКП-ск3 в клетку не через скэвендаер-рецептор. Липопротеиды низкой плотности, црединкубированные с ганглиозидом си3, оказались способны стимулировать этер^Екацию холестерина в макрофагах мши (табл. 7). Кроме того, они вызывали увеличение включения [14С]-олеата в трп-глицерида. Мы предполагаем, что описанные эф|екты могут быть связаны с фагоцитозом крупных липидных частиц, образующихся при взаимодействии ЛНП и ганглиозидов.

Таблица 6. Елиялке ганглиозида й'Л^ на захват ЛНП перитониальныки макрофагами мши.

ОЬЦ [1251]-ЛШ

(мхМ) (мкг апоВ/мг кл.Селка)

0 ■ 1,3 * 0,/

10 » 0,5

го 2,1 ± 0,5

50 3,5 ± 0,6' •

* - р<0,005.

Таблица 7. Влияние ганглиозида си^ на ЛШ-опоскдонаннуа зтерификащпо холестерина к синтез триглнцеридов макрофагами мши.

лнп (ккг апоВ/мл) Включение [14С]-олеата з ЭХ ТГ (пкмоль/мг кл.белка)

ЛНП (300) ЛНП-са3 (100) ЛКП-Ш3 (200) ЛНП-«М3 (300) 0,03 ± 0,01 3,6 ± 0,8 0,15 ± 0,03 10,1 ± 0,2 0,14 ± 0,07 11,0 ± 0,8 0,22 ± 0,07* 29,3 ± 2,7*

* - р<0,005.

выводи.

1. Нейтральные гликосфинголшшды аорты человека представляет1 собой глюкозилцерамид, лактозилцерамид, глоботриаозилцерамид и глоботетраозилцерамид. Основным - ганглиозидом является гематозид (ганглиозид си^). В аорте таете присутствуют ганглиозиды ем.,. СВ3> СБ1а, СТ.,.

2. Соотношение ГСЛ/холестерин в аортальных внеклеточных липидных частицах выше, чем в липопротеидах низкой плотности, а следовательно, аортальные частицы могут слукить локусом внеклеточного накопления ГСЛ при атеросклерозе. Внеклеточные липидные частицы, обогащенные эфирами холестерина, и частицы, обогащенные свободным холестерином имеют различный состав гликосфшголипидов. Частицы, обогащенные свободным холестерином, имеют относительно

высокое содержание глоботри- и глоботетраозидцерамида, что монет указывать на клеточное происхождение этих частиц.

3. При взаимодействии лшгапротеидов низкой плотности и гакглиозидов аорты происходит изменение конформации аров в липо-протеидной частице и/или слияние (агрегация) ЛНП. Модифицированные ганглиозвдами ЛНП эффективно захватываются макрофагами и симулируют этерификацию холестерина.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ "

1. Проказова Н.В., Михайленко И.А., Преображенский С.Н., Иванов В.О., Шевченко В.П., Репин B.C., Бергельсон Л.Д. Влияние ганглиозидов на рецепцию липопротеинов низкой плотности. Биологические мембраны, 1988, т.З, стр. 463-471.

2. Проказова К.В., Михайленко И.А., Гладкая Е.М., Когтев Л.С., Орехов А.Н., Бергельсон Л.Д. Гликосфинголипиды аорта человека. Биоорганическая химия, 1986, т.12, стр. I405-I4I3.

3. Мазуров A.B., Проказова Н.В., Михайленко И.А., Мухин Д.К., Репин B.C., Бергельсон Л.Д. Адгезия и активация тромбоцитов на поверхности, покрытой ганглиозидом GDj. Доклады Академии наук, 1987, Т.269, стр. 1274-1277.

4. Prokasova N.Y., fíikhailenko I.A., Preobrazhensky S.N., Ivanov V.O., Pokrovsfcy S.N., Timoíeeva K.Û., Martinova M.A., Repin V.S., Bergelcon L.D. Interection oí gangliosides with plasma low density lipoproteins. Glycoconjugate J-, 1986, v. 3, pp. 273-286.

5. Prokazova H.V., Orekhov A.N., to&hin D.N., Mikhailenko I.A., Kogtev L.E., Golov&nova N.K., BergelBon L.D..The gangliosidee of adult bur.an aorta: intima, media and plaque. Eur. J. Biochem.,

1S87, v.167, pp. 349-352.

6. Prokazova N.Y., Mukhin D.N., Orekhov A.N., Vasilevskaya 7.V., Mikhailenko I.A., Bushuev Y.N., Bergeisen L.D. Neutral glycolipi&s of atherosclerotic plaques and unaffected human aorta tissue. Eur.J.Biochem... 1909, v.180, pp.167-171.

7. Mazurov A.V., Prokazova N.Y., Mikhailenko I.A., Huihin D.H., Repln Y.S., BergaIcon I.D. Stimulation of platelet adhesion arid activation by ganglioside GD3 adsorbed to plastio. BBA, 1983, v.963, pp. 167-171.

8. Orekhov A.N., Tertov V.V., Mukhin D.N., Mikhailenko I.A. Modification of low density lipoprotein by desialylation causes lipid accumulation in cultersd calls. BBRC, 1989, v.162, pp. 206211.

9. Mikhailenko I.A., Dubrovskaya S.A., Korepanova O.Y., Morozkin A.D., Prokazova N.Y., Bergelson I.D. Interaction of low density lipoproteins with gangliosides. BBA, 1991, v.1035, pp. 299-305.

10. Prokazova U.V., Mikhailenko I.A.,- Bergelson L.D. Ganglioside GM3 stimulates the uptake and processing of low density lipoproteins by macrophages. BBRC, 1991, v. 177, pp. 582-587. •

11. Prokazova N.V., Mikhailenko I.A., Mukhin D.N., Orekhov A.N., Bergelson L.D. The glycosphingolipicLs- of human atherosclerotic aorta. 8th International symposium on atherosclerosis, Rome, Italy, October 9-13, 1988, Abstracts p. 697.

12. Prokazova N.Y., Mikhailenko I.A., Mukhin D.N., Orekhov A.N., Bergelson L.D. The glycosphlngolipids of human atherosclerotic aorta. 8th International symposium on atheroaolerosiB. Satellite meeting. Biology of the arterial wall."Interaotion in the

23

arterial wall and atherosclerosis", Siena, Italy, October 7-3, 1988, Abstracts p. 301.

13.Михайленко K.A., Проказова К.Б., Репин Л.Л. Ганглиозиды аорты человека и их роль в рецепции ЛНП. Всесоюзный симпозиум по биохимии липндов. Алма-Ата, 1937, октябрь, стр. 160.

14. Михайленко И.А., Василевская В.В., Проказова К.В. Влияние ганглиозидоБ на структуру и Функции липопротеидов низкой плотности. Всесоюзный симпозиум "Реконструкция, стабилизация и репарация мембран". Благовещенск, 1989, стр.82.

15. Мухин I.K., Михайленко И.А. Нарушения в гликолипидном составе аорты человека и их роль в атерогенезе. Материалы республиканской научной юбилейной конференции молодух медиков Грузии. Тбилиси, 1991, 15-20 февраля, стр. 239-240.