ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Сабиров, Ахат Халимович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ"

На правах рукописи

САБИРОВ АХАТ ХАЛИМОВИЧ

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Тюмень - 2010

004606261

Работа выполнена в Российском Онкологическом Научном Центре им. H.H. Блохина РАМН

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор Заслуженный деятель науки РФ ГОУ ВПО ТюмГМА Росздрава

доктор медицинских наук, профессор Заслуженный деятель науки РФ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО «Ханты-Мансийская государственная медицинская академия ХМАО-Югры»

доктор медицинских наук, профессор ФГУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии (НЦАГиП) им. В.И. Кулакова Росмедтехнологий

Бычков Виталий Григорьевич

Барышников Анатолий Юрьевич

Янин

Владимир Леонидович

Коган Евгения Александровна

доктор медицинских наук, профессор РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН

Кадагидзе Заира Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУ МНИОИ им. П.А. Герцена Росмедтехнологий

Защита состоится «25» июня 2010 г в 10 час. на заседании диссертационного совета Д 208.101. 02 при ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Росздрава» по адресу: 625023, г. Тюмень, ул. Одесская, 54.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия Росздрава».

Автореферат разослан А 2010 г

Учёный секретарь диссертационного совета

С.А. Орлов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) является серьезной медицинской и социальной проблемой для большинства развитых стран мира. Несмотря на значительные достижения молекулярной биологии и генетики последней четверти века в понимании биологии и клиники заболевания, а также кардинальные изменения в подходе к лечению, проблема продолжает оставаться высоко актуальной.

В Тюменской области в 2008 году в структуре злокачественных заболеваний опухоли молочной железы находились на втором месте (11,2%). При этом, заболеваемость по сравнению с 2004 годом выросла на 5,21% (с 46,65% до 51,86% соответственно). Удельный вес больных с 1-2 стадиями процесса остался на прежнем уровне (67,2% в 2004г, против 68,0% - в 2008г). Также на прежнем уровне осталась смертность от РМЖ (20,98% -в 2004г., против 20,06 в 2008г.).

К настоящему моменту сообщается более чем о ста факторах прогноза, дающих представление о биологическом поведении опухоли. Для предсказания клинического течения опухолевого процесса, ответа на лечение и исхода РМЖ большое значение придается маркерам, определяемыми иммуногисто-химическими методами.

Одними из первых вошедших в клиническую практику клеточных маркеров были рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), роль которых в канцерогенезе гормонозависимых опухолей доказана большим количеством исследований (Семиглазов В.Ф. и соавт., 1992). Определение РЭ и РП в ткани опухоли сейчас рассматривается как обязательное условие для успешного гормонального лечения РМЖ (АИгес! Б.С. ег а1., 1998; Бернштейн Л.М., 2000; Семиглазов В.Ф., 2001). Эффект гормональной терапии зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: ее эффективность составляет около 10% при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50% при РЭ-положительных опухолях и около 75% при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП. Тем не менее, известны случаи

резистентности к гормональной терапии больных с РЭ- и РП-положительными опухолями, поэтому гормональный статус опухоли оказывается не всегда достаточным показателем гормональной чувствительности РМЖ (Летягин В.П., 2004).

Важная роль в канцерогенезе РМЖ принадлежит ростовым факторам, таким как EGFR - эпидермальный фактор роста, VEGFR - сосудистый эндоте-лиальный фактор роста и мутационному статусу.

Ведущим фактором в механизме злокачественной трансформации клеток, в биологическом поведении уже возникших опухолей является усиление проли-феративной активности опухолевых клеток. Для выявления особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей человека широко используется анализ экспрессии антигена Ki-67, который экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла и отражает величину пролиферативного пула опухоли (Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000).

Рак молочной железы характеризуется диссеминацией раковых клеток гематогенным путем уже на ранних стадиях заболевания. Поэтому помимо местного лечения (хирургическая операция и лучевая терапия), больным проводится системная химиотерапия и/или эндокринная терапия в адъювантном режиме. За последние 40 лет реальная польза от системного адъювантного лечения в плане улучшения показателей выживания без признаков заболевания и общего выживания была подтверждена многочисленными рандомизированными испытаниями (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group /EBCTCG/). Однако так как рак молочной железы является гетерогенным заболеванием, вопрос о том, целесообразно ли назначать адъювантную химиотерапию всем больным, или только больным с высоким риском развития системного заболевания при первом выявлении, остается открытым.

Существующие на сегодняшний день способы оценки степени риска у больных, страдающих раком молочной железы, неэффективны и недостаточны.

Значимость отдельных вышеперечисленных маркеров, выявляемых имму-ногистохимическим методом, остается спорной. Требует уточнения прогностическая роль иммуногистохимических методов в оценке эффективности проводимой терапии и определении прогноза течения болезни после проведения противоопухолевого лечения. Также актуальным является разработка новых неинвазивных методик (ПЦР, ИСА), которые отвечают этим запросам.

Цель исследования

Выявление экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, экспрессии онкобелка НЕ11-2 (сегЬВ-2) и антигена Ю-67, ЕОРЛ и УЕОБИ, молекулярно-генетического статуса и определение диагностической значимости этих маркеров для прогноза клинического течения рака молочной железы, оценки эффективности проводимого спецлечения и полноты излеченности больных РМЖ.

Задачи исследования:

1. Определить молекулярно-генетический статус больных РМЖ по парафинированным образцам тканей и по плазме крови.

2. Изучить содержание и уровень экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в клетках рака молочной железы и выявить клинико-морфологические особенности течения заболевания с различными гормональ-но-рецепторными фенотипами опухоли.

3. Определить концентрацию метаболитов эстрогена (2-гидрокиэстрон, 16а-гидроксиэстрон), и их соотношение.

4. Определить экспрессию онкобелка НЕ11-2 и антигена К1-67 в клетках рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами.

5. Определить сывороточный уровень ЕОБЯ и ЬУЕОРЯ-165.

6. Оценить диагностическую и прогностическую значимость комплексного изучения молекулярно-генетических и молекулярно-биологических маркеров у больных раком молочной железы.

Новизна исследования. Впервые проведено комплексное изучение кли-нико-морфологических характеристик клеток рака молочной железы: содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, онкобелка НЕЛ-2, антигена К1-67, уровня ЕвРЯ, ЬУЕСРЯ-165 с применением высокочувствительного и специфичного иммуногистохимического метода и определения концентраций этих белков в сыворотке крови.

Показана корреляция и практическая значимость уровней РП и РЭ, ЕСРЯ и ЬУЕОБК-165, НЕК-2/пеи, определенных иммуногистохимическим и имму-носорбентным методами.

Определена важная роль ЕвРЯ и ИУЕОРЯ-165 в канцерогенезе РМЖ. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона, повышение уровня БОРЯ и ЬУЕСРК-165, НЕ11-2/пеи и высокого уровня индекса пролиферации Кл-67 в клетках рака молочной железы является важным предсказательным фактором низкой эффективности противоопухолевой гормональной терапии и может рассматриваться как показатель неблагоприятного прогноза клинического течения рака молочной железы.

Выделены группы риска больных РМЖ, учитывая все выше перечисленные маркеры.

Практическая значимость исследования. Предложена программа комплексного лабораторного иммуногистохимического, иммуносорбентного и молекулярно-генетического исследования клеток рака молочной железы, которая включает: определение содержания и уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов, онкобелка НЕ 11-2 и антигена Кл-67, определения уровня ЕвРЯ, ЬУЕОР11-165 и молекулярно-генетического статуса больных РМЖ для формирования прогноза клинического течения рака молочной железы и отбора групп пациентов для проведения адекватной гормональной и химиотерапии. Выделены группы пациентов с опухолевыми фенотипами, обладающими неблагоприятными прогностическими и предсказательными характеристиками.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. С увеличением возраста больных РМЖ экспрессия рецепторов половых гормонов увеличивается, экспрессия НЕЯ-2/пеи - уменьшается.

2. Индекс пролиферативной активности Кл-67 выше при низкой степени дифференцировки опухоли, при отсутствии РЭ, РП в опухолевых клетках, при гиперэкспрессии НЕЯ-2/пеи.

3. При любом гистологическом варианте опухоли имеется гиперэстрогене-мический синдром и дискордантность соотношения 2-ОНЕ/16а-ОНЕ.

4. Выраженность гиперэстрогенемии и эстрогенового дисбаланса сильнее при низкой степени дифференцировки опухоли, при отсутствии РЭ, РП на поверхности опухолевых клеток, при гиперэкспрессии ШЖ.-2/пеи.

5. Чем выше степень дифференцировки опухоли и сильнее экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона, тем ниже выраженность молекулярно-генетических изменений, выявляемых по парафинированным образцам опухолевой ткани и по плазме крови.

6. Выраженность молекулярно-генетических изменений, выявляемых по парафинированным образцам опухолевой ткани и по плазме крови, существенных различий не имеет независимо от стадии РМЖ, изменяется при проведении специального лечения, и может служить критерием оценки эффективности проводимой терапии и маркером излеченности больных РМЖ.

7. С уменьшением степени дифференцировки опухоли, с увеличением ее пролиферативного потенциала уровень экспрессии рецепторов ростовых факторов (ЕОРЯ, ЬУЕОР11-165) увеличивается.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены: Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005); Всероссийской конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005); Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2005); IX Международной конференции «Высокие технологии восстановительной медицины: профессиональное долголетие и качество жизни»

(Сочи, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов» (Москва, 2007); Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008); Всероссийской конференции «Актуальные аспекты паразитарных заболеваний в современный период» (Тюмень, 2008); на съезде онкологов Армении с международным участием «Молекулярная онкология» (Ереван, 2008); на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); на IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008); III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009); на научно-практической конференции онкологов Поволжья «Молекулярные аспекты рака молочной железы» (Казань, 2009); на научно-практической конференции онкологов Тюменской области «Гиперпластические процессы в органах женской репродуктивной системы» (Тюмень, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия злокачественных новообразований» (Москва, РОНЦ, 2009); совместном заседании обществ анатомов, гистологов, эмбриологов и онкологов Тюменской области (Тюмень, 2010); на научно-практической конференции с международным участием «Наноонкология - 2010» (Москва, 2010); на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитогенетики, лаборатории клеточного иммунитета, отделении биотерапии НИИ Клинической онкологии РОНЦ им Н.Н. Блохина РАМН (Москва, 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу патологоанатомического отделения Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедрах онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевого лечения, патологической анатомии, гистологии Тюменской государственной медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 работ, из них 15 ста-

тей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 204 страницах, включает введение, обзор литературы, материалов и методов, шести глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводы, практических рекомендаций и библиографический список использованной литературы. Работа иллюстрирована 39 рисунками и содержит 43 таблицы. В библиографическом списке приведено 266 источников (100 отечественных и 166 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. При выполнении настоящего исследования в обследуемую группу были включены 200 пациенток маммологического отделения Тюменского областного онкологического диспансера (гл. врач к.м.н. А.Г. Синяков), которым был впервые установлен диагноз РМЖ I-II б стадии и проведено адъювантное лечение. Всем пациентам проводилось комплексное обследование: осмотр врача-онколога, выполнение рентгенографического и ультразвукового исследования молочных желез. Для выяснения характера новообразования молочной железы выполнялось цитологическое исследование (тонкоигольная аспирационная биопсия) и гистологическое исследование (трепан-биопсия или операционный материал).

Средний возраст пациентов на момент постановки диагноза составил 55±7,6 лет. У подавляющего большинства (у 130 из 200) пациентов, отмечался инвазивный протоковый РМЖ, что составило 65,0% (табл. 1). Вторым по частоте встречаемости РМЖ явился инвазивный дольковый РМЖ (у 50 из 200 пациентов, что составило 25,0%). Слизистый РМЖ отмечался у 7 (3,5%) пациентов. В 2 (1,0%) случаях был диагностирован тубулярный РМЖ; в 2 (1,0%) случаях - медуллярный; в двух случаях (1,0%) - папиллярный. Другие формы РМЖ составили 3,5% (у 7 из 200 пациентов). Соотношение различных гистологических форм РМЖ соответствует аналогичным данным ВОЗ (WHO, 2003). Практически с одинаковой частотой РМЖ обнаруживался в правой (48,9 %) и левой (51,1%) молочных железах.

Приготовление парафиновых блоков, срезов, окрашивание препаратов гематоксилином-эозином по стандартной методике и последующая верификация диагноза проводились специалистами патолого-анатомической лаборатории Тюменского областного онкологического диспансера. Распределение больных по стадиям представлено в табл. 2.

Таблица 1.

Частота встречаемости гистологических форм

рака молочной железыФорма РМЖ Число больных %

Инвазивный протоковый 130 65,0

Инвазивный дольковый 50 25

Слизистый 7 3,5

Тубулярный 2 1,0

Медуллярный 2 1,0

Папиллярный 2 1,0

Другие формы РМЖ 7 3,5

Всего 200 100,0

Таблица 2.

Распределение больных по стадиям

Стадия Число больных (п=200)

ТШ0М0 (I) 51 (25,5%)

ТШ1М0 (II а) 49 (24,5%)

Т2И0М0 (II а) 47 (23,5%)

Т2ШМ0 (II б) 53 (26,5%)

Всего 200 (100,0%)

Иммуногистохимическое определение экспрессии РЭ, РП, К1-67 и НЕЫ-2 в ткани опухоли

Иммуногистохимическое определение РЭ, РП, онкобелка ШЖ.-2, антигена К.1-67 проводилось в лаборатории морфологических исследований патолого-анатомического отделения Тюменского ООД. Иммуногистохимическое выявление экспрессии рецепторов половых гормонов и с-егЬВ-2 проводили в срезах фиксированной в формалине и залитой в парафин ткани согласно стандартной методике. Использовали моноклональные антитела к антигену Кл-67 (клон ЯТИ -К>67-ММ1, производство фирмы ]\тоуосаз1га), антитела к белку рецептора эстрогена (клон Ш5, производство фирмы БАКО), к белку рецептора прогестерона (клон РаЯбЗб, производство фирмы БАКО) и набор БАКО НегсерЯез! для детекции с-егЬВ-2/НЕ11-2.

Подсчет результатов иммуногистохимического анализа проводился с использованием следующих критериев:

- для рецепторов половых гормонов определяли опухолевые клетки со слабо, умеренно и интенсивно окрашенными ядрами. Выраженность экспрессии оценивали в баллах от 0 до 300 по шкале Н-счёта, используя следующую формулу:

Н = ЗхА + 2хВ + 1хС, где, А - доля сильноокрашенных ядер (в процентах), В - доля умеренно окрашенных ядер, С - доля слабоокрашенных ядер опухолевых клеток.

- для анализа гиперэкспрессии НЕ11-2 использовались критерии разработанные компанией БАКО: 0 баллов - окрашивание отсутствует или окраска менее 10% опухолевых клеток; 1+ балл - неполное окрашивание клеточной мембраны, окрашено более 10% опухолевых клеток; 2+ балла - полное окрашивание мембраны, слабое или умеренно выраженное окрашивание более 10% опухолевых клеток; 3+ балла - полное сильное окрашивание мембраны опухолевых клеток.

- для анализа пролиферативной активности подсчитывали среднее количество К-67-положительных клеток в ткани опухоли.

Определение EGFR и hVEGFR-165 в сыворотке крови Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич» метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.

Определение метаболитов эстрогена в моче больных РМЖ Определение концентраций метаболитов эстрогена в моче проводилось иммуносорбентным анализом при помощи иммуноферментного набора ES-TRAMET 2/16 ELISA. Набор основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. 20НЕ1 и 160НЕ1 в моче обнаруживаются в форме 2-глюкуронида и 3,16-глюкуронидов, соответственно, и требуют удаления Сахаров перед тестированием, для распознавания моноклональными антителами. Для высвобождения эстрогенов от глюкуроновой кислоты и от сульфата используют смесь ферментов Р-глюкуронидазы и арилсульфатазы, выделенных из улитки Helix pomatia (смесь «Глюсулаза»). В ходе анализа при подготовке образцов, аликвоту мочи разводят в соотношении 1 / 20 буфером, содержащим ферменты, и инкубируют до полного расщепления. Затем смесь ферментов нейтрализуется, и полученный раствор используется непосредственно для анализа. Антиген Ki-67 определяли иммуногистохимическим методом с использованием специальных тест-систем фирмы Daco.

Определение мутационного статуса онкогенов Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялось из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секве-нирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130x1. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон) 560 кодон, АРС (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13кодон+17кодон, р53 (5 экзон) 175 кодон, р53 (6 экзон), р53 (7 экзон) 248 кодон, р53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16 (табл. 3). На рис. 1-11 приведены примеры секвенограмм.

Последовательность олигонуклеотидов

Ne Название Последовательность 5'-3' Длина Мол. масса OE Количество пмоль мкг

1 К- rAsl21/A ATgACTgAATATAAACTTgTggTA 24 7477 3,5 12240 91,5

2 K-rAsI2I/b CAAgATTTACCTCTATTgTT 20 6119 3,5 16400 100,4

3 Ex 11 forward СТА TTT TTC CCT TTC TCC CC 20 5958 3,5 20010 119,2

4 Ex H reverse ГАС CCA AAA Agg TgA CAT gg 20 6221 3,5 14650 91,1

5 APC 1309F gCA gAT TCT gCT AAT ACC CTg CAA 24 7359 3,5 13360 98,3

6 APCI309R CACTgCTggAACTTCgCTCACA 22 6717 3,5 15260 102,5

7 BRAF1F ГСА T AATgCTTgCTCTgATAggA 23 ^7116 3,5 13740 97,8

8 BRAF1R ggCCAAAAA TTT AA TCAgTggA 22 6854 3,5 13190 90,4

9 p53-5-Aex TAgCTCgCTAgTgggTTgCAg 21 6555 2,4 10630 69,7

10 p53-5-Bex gggCAACCAgCCCTgTCg 18 5548 3,5 18710 103,8

11 p53-6-Aex TTGCCCAGGGTCCCCAGGCCTCTGATTC 28 8555 3,5 12730 108,9

12 p53-6-Bex ACTGCTCACCCGGAGGGCCACTGACAAC 28 8591 3,5 11710 100,6

13 p53-7-Aex ggCCTCATCTTgggCCTgTg 20 6178 2,2 11110 68,6

14 p53-7-Bex CCAgTgTgCAgggTggCAAg 20 6285 3,5 15560 97,8

15 p53-8-Aex GCCTCTTGCTTCTCTTTTCCTATCCTGAG 29 8790 3,5 12830 112,8

16 p53-8-Bex TCTGAGGCATAACTGCACCCTTGGTC 26 7984 3,5 12890 102,9

гена р53 (обратный праймер).

содержащий замену в 157 кодоне (ОТС-ТТО) приводящую к замене аминокислоты валин на лейцин.

Рис. 3. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 6-го экзона гена р53 (прямой праймер).

Л С А С А А А С А С Т Т Т Т С С А СА Т А С Т С Т С С Т С в

3 * 8 5 Т 33

Рис. 4 Фрагмент секвеннограммы 6-го экзона гена р53 (прямой праймер) содержащий замену в 215 кодоне (АСТ-СОТ) приводящую к замене аминокислоты серии на аргинин.

дс<1 л т с лт - .и-л с т <; л .л« л с т с сл<; ассатсатсасастс о ааоастссас

Рис. 5. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 7-го экзона гена р53 (прямой праймер).

А С С А т С А Т С А С А С Т ССААСАСТ С С А О

Рис. 6. Фрагмент секвеннограммы 7-го экзона гена р53 (прямой праймер) содержащий инсерцию Твв, после 257 кодона, приводящую к вставке аминокислоты триптофан на 258 позицию.

Рис. 7.Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 8-го экзона гена р53 (обратный праймер).

ATT CT CTT ССТ CTGTGCGCCGGTCT СТ ССС

tit : 1 CI7 се]

С G 3 1 С

Рис. 8. Фрагмент секвеннограммы 8-го экзона гена р53 (обратный праймер) содержащий замену в 283 кодоне (СвС-ТСС) приводящую к замене аминокислоты аргинин на цистеин.

Рис. 9. Секвенограмма гипервариабельного участка 1-го экзона гена К-газ. (обратный праймер). А- норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 1-го экзона гена К-газ. (обратный праймер). Замена в 13 кодоне (ООС-вАС), приводящая к замене аминокислоты глицин на аспарагиновую кислоту. А С АСТР А А А Т С

Рис. 10. Секвенограмма гипервариабельного участка 15-го экзона гена В-га/ (прямой праймер). А - норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 15-го экзона гена В-га/(прямой праймер). Замена в 600 кодоне (ОТО-САв), приводящая к замене аминокислоты валин на глутаминовую кислоту.

с T T TTC т т т т л

А Б

Рис. 11. Секвенограмма гипервариабельного участка 16-го экзона гена АР С (обратный праймер). А - норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 16-го экзона гена АРС (обратный праймер). Замена в 1309 кодоне (GAA-САА) приводящая к замене аминокислоты глутаминовая кислота на глутамин.

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных включал использование средних значений в группах (М±т), параметрических и непараметрических критериев достоверности различий р (критерий хи-квадрат, точный метод Фишера, критерий Манна-Уитни), показателя корреляции г. В ряде случаев для сравнения нескольких показателей использовался регрессионный анализ. При проведении статистического исследования использованы лицензионные программы Microsoft Excel 2002 пакета Microsoft Office XP и STATISTICA 6,0. Различия считались значимыми при р<0,05, что соответствует 95%-ной вероятности безошибочного прогноза.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Клинико-морфологнческне особенности исследованных случаев РМЖ

На сегодняшний день известно большое количество клинических и морфологических прогностических признаков для РМЖ. К ним относят: возраст пациентов, размеры опухолевого узла, наличие метастазов и количество пораженных лимфатических узлов, степень злокачественности опухоли. Проведено исследование клинико-морфологических особенностей рака молочной железы.

С помощью корреляционного анализа по Спирмену была выявлена обратная взаимосвязь между степенью злокачественности РМЖ и возрастом пациентов. Коэффициент корреляции по Спирмену между показателями «средний возраст пациентов» и «степень злокачественности» составил г = -0,89 (р<0,05).

Пациенты с опухолями с различной степенью злокачественности статистически достоверно отличались друг от друга по показателям: «множественности (> 1) метастатического поражения лимфатических узлов» (р = 0,01) (таб. 4). Чем выше степень злокачественности РМЖ, тем чаще поражались метастазами 2 и более лимфатические узлы (р = 0,01).

Таблица 4.

Частота встречаемости различных форм рака молочной железы

различной степени злокачественности в зависимости от стадии РМЖ

Степень дифференцировки Стадия РМЖ Итого

ТШОМО ТШ1М0 Т2К0М0 Т2И1М0

Высокодифференцирован-ный РМЖ (в1) (п=24) 7 5 8 4 24

Умереннодифференциро-ванный РМЖ (02) (п=64) 16 14 18 16 64

Низкодифференцирован-ный РМЖ (йЗ) (п=112) 28 30 21 33 112

Всего 51 49 47 53 200

У пациентов обследуемой группы встречались опухоли различных размеров. Минимальный размер выявленной опухоли составил 0,4 см, максимальный - 13 см. В ряде случаев при поражении всей молочной железы или воспалительной форме РМЖ определить размер опухоли не представлялось возможным.

С помощью коррелляционного анализа по Спирмену было обнаружено, что размер опухоли кореллировал с возрастом пациентов (коэффициент корреля-

ции по Спирмену р = 0,4). У пациентов пожилого возраста достоверно чаще (р <0,05) встречались опухоли крупных размеров.

Прямой зависимости между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и размерами опухоли не выявлено (коэффициент корреляции по Спирмену р = 0,16;). Не установлено взаимосвязи между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и возрастом обследуемых пациентов.

Гиперэкспрессия НЕ 11-2 в ткани опухоли больных РМЖ При оценке экспрессии НЕ11-2/пеи установлена прямая зависимость с возрастом больных. Экспрессия выражена сильнее в группе больных до 49 лет и до 59 лет, в дальнейшем с возрастом она снижается (табл. 5). Частота гиперэкспрессии НЕЛ-2 составила 56,5% в группе больных до 49 лет и 23,9% в группе больных более 55 лет. Эти показатели оказались статистически достоверными (р=0,05)(табл. 5, 6, 7).

Таблица 5.

Зависимость гиперэкспрессии онкобелка НЕ11-2 при РМЖ

от возраста пациентов- Возраст пациентов НЕ11-2 Итого

0 баллов 1+ баллов 2+ баллов 3+ баллов

п % п % п % п % Абс. %

<49 лет 14 26 16 32 19 38 20 43 69 34,5

50-55 лет 10 18,5 10 20 24 48 16 35 60 30,0

> 55 лет 30 55,5 24 48 7 14 10 22 71 35,5

Всего 54 100 50 100 50 100 46 100 200 100,0

При изучении связи гормонального статуса опухолевой ткани с экспрессией НЕЛ-2/пеи выявлено, что у больных с рецептор-положительными опухолями

гиперэкспрессия НЕЯ-2/пеи ниже, чем при отсутствии рецепторов половых гормонов (таб. 5). В группе больных с РЭ+РП+ опухолях частота гиперэкспрессии НЕ 112 составила 22,8%, тогда как в группе РЭ-РП - 67,1%.

Таблица 6.

Экспрессия рецепторов половых гормонов и гиперэкспрессия онкобелка HER-2 при РМЖ

Рецегггорный фенотип опухоли Гиперэкспрессия HER-2

0 баллов 1+баллов 2+баллов 3+баллов

п % п % п % п %

РЭ+РП + 30 55,5 31 62 9 18 9 19,5

РЭ + РП- 9 16,5 5 10 7 14 7 15

РЭ-РП + - - 2 4 5 10 4 8,5

РЭ-РП- 15 28 12 24 29 58 26 57

Всего: 54 100 50 100 50 100 46 100

Таблица 7.

Распределение больных РМЖ в зависимости от стадии и экспрессии HER-2/neu

Стадия РМЖ HER-2/neu (0) HER-2/neu (1+) HER-2/neu (2+) HER-2/neu (3+) Итого

T1N0M0 10 12 16 10 48

T1N1M0 9 10 15 14 48

T2N0M0 19 13 9 6 47

T2N1M0 7 13 17 20 57

Итого 45 48 57 50

Пролиферативная активность опухолевых клеток Пролиферативная активность опухолевых клеток снижается с увеличением возраста больных. При изучении связи индекса Ki-67 с экспрессией HER-2/neu установлена прямая корреляция между экспрессией двух маркеров (табл. 8).

Таблица 8.

Среднее значение уровня экспрессии антигена КЗ-67 в клетках рака молочной железы с различными НЕК-2-фенотипами

Экспрессия НЕ11-2

0 баллов 1+ баллов 2+баплов 3+ баллов

Среднее значение индекса Кл-67 (%) 33* 29* 49* 56*

Всего п = 54 п= 50 п =50 п =46

Примечание: *- статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).

У пациентов с опухолевыми фенотипами НЕ11-2 (2+) и (3+) уровень экспрессии Ю-67 в РМЖ был статистически достоверно выше в сравнении с пациентами, опухоли которых не экспрессировали онкобелок НЕЛ-2 (фенотипы НЕЯ-2 (0) и (1+)).

Следующим этапом было сравнительное исследование индекса Ю-67 в опухолях с различным РЭ и РП фенотипами (табл. 9). Уровень пролифератив-ной активности (индекс Кл-67) клеток РМЖ с фенотипом РЭ-РП- был статистически достоверно выше, чем в РМЖ с фенотипом РЭ+РП+ (р<0,01; тест Манна-Уитни). Аналогичные отличия были выявлены между группами пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ-РП+ и РЭ+РП+ (р<0,05; тест Манна-Уитни). Эти результаты позволяют в целом характеризовать РЭ- РП - и РЭ-РП+ опухоли, как имеющие неблагоприятный прогноз заболевания. Средние значения уровней экспрессии антигена К.1-67 в группах пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ+РП+ и РЭ+РП-; РЭ-РП+ и РЭ-РП - не имеют между собой достоверных различий (р > 0,05; тест Манна-Уитни).

Индекс К>67 отрицательно корреллировал с уровнем экспрессии РЭ (коэффициент корреляции по Спирмену г = - 0,47; р < 0,01) и РП (коэффициент корреляции по Спирмену г = - 0,44; р < 0,05). Таким образом, чем выше был уровень экспрессии (НВсоге) РЭ и РП, тем ниже отмечалась пролиферативная активность клеток РМЖ.

Уровень экспрессии антигена Ю-67 в опухолях с различными РЭ/РП фенотипами

Фенотип РМЖ

РЭ+РП+ РЭ+РП- РЭ-РП+ РЭ-РП-

Среднее значение антигена 30*±14 36±13 48*±19 52*±18

Всего, п 79 28 11 82

Примечание: *- статистически достоверное отличие (р<0,01; р<0,05; тест Манна-Уитни).

В процессе нашего исследования в зависимости от уровня экспрессии РЭ, РП в РМЖ пациенты были разделены на группы с отрицательной (НБсоге меньше 10 баллов), слабоположительной (НБсоге от 11 до 99 баллов) и положительной (НБсоге больше 100 баллов) экспрессией рецепторов стероидных гормонов. Средние значения индекса пролиферации Кл-67 в РМЖ с различным уровнем экспрессии РП представлены в табл. 10.

Таблица 10

Среднее значение индекса Кл-67 в клетках рака молочной железы

с различным уровнем экспрессии рецепторов прогестерона РП- отрицательный РП- слабоположительный РП- положительный

Среднее значение индекса Ю-67 (%) 46±6 30±2* 23±4

Всего п = 110 п = 30 п = 60

Примечание: *- статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни).

Опухоли со слабоположительной экспрессией РП отличались от опухолей с положительной и отрицательной экспрессией РП по экспрессии антигена Кл-67 (%) (р < 0,05). Уровень экспрессии антигена Кл-67 в РМЖ увеличивался обратно пропорционально уровню экспрессии РП. При положительной экспрессии РП Кл-67 составил в среднем 19-27%, при слабоположи-

тельной экспрессии РП уровень Кл-67 составил 28-32%, при отрицательной экспрессии РП уровень Кл-67 составил 42-52%.

Таким образом, стоит отметить, что РП- слабоположительные РМЖ характеризуются не только высокой экспрессией онкобелка НЕ 11-2, но и также повышенной экспрессией антигена Ю-67.

Таблица 11.

Распределение больных РМЖ в зависимости от стадии и значения индекса Ю-67

Стадия РМЖ Уровень экспрессии антигена Ю-67

<30% 31-50% 51-70% >70%

ТШОМО 10 15 15 11

ТШ1М0 9 10 13 17

Т2М0М0 18 12 10 9

Т2ММ0 8 10 15 20

Как видно из данных (табл. 11), даже в опухолевых образованиях менее 2 см,

даже если нет метастазов в регионарные лимфоузлы, четко прослеживается высокий уровень пролиферагивной активности опухолевых клеток, при стадии ТШОМО экспрессия К-67 >70% - у 11 пациенток, что сопоставимо со значением Кь67 в группе больных с Т2И)М0, что является свидетельством высокой агрессивности опухолевых клеток даже при опухолевых образованиях малых размеров.

Уровень гормональных рецепторов и метаболитов эстрогена при РМЖ

Экспрессия ЭР значимо зависит от возраста больных РМЖ. Можно выделить три возрастные группы пациентов по выраженности экспрессии ЭР: минимальная экспрессия у лиц в возрасте до 49 лет, умеренно выраженная экспрессия в возрасте 50-59 лет и высокая экспрессия ЭР у больных в возрасте 6069 лет. Содержание в опухолевых клетках ЭР увеличивается с возрастом больных.

Экспрессия ПР не отличается столь чёткими закономерностями, как содер-

жание в опухоли ЭР. При изучении эстроген-зависимых опухолей репродуктивных органов была показана важная роль, которую играет метаболическое окисление эстрогена при гормоночувствительных заболеваниях. 16-гидроксилированные соединения являются более эффективными эстрогенами, эти значительные изменения могут иметь важное гиперэстрогенные последствия, которые могут иметь отношение к этиологии опухолей репродуктивной системы, и, в особенности, рака молочной железы. Соотношение 20НЕ1/16оЮНЕ1 может быть новым вспомогательным биомаркером определения риска развития рака молочной железы. Этот биомаркер может предоставлять аналитическую основу для разработки новых фармакологических и диетологических стратегий.

Установлена зависимость между концентрацией метаболитов эстрогена от степени дифференцировки опухоли (табл. 12), ее рецепторного фенотипа (табл. 13), пролиферативной активности (табл. 14) и экспрессии НЕ11-2/пеи (табл. 15).

Таблица 12.

Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 (а ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1)/16 (а ОНЕ-1)

Высокая степень дифференцировки 2,8 7,2 1/2,6

Средняя степень дифференцировки 4,6 13,5 1/2,9

Низкая степень дифференцировки 5,1 20,8 1/4

У всех больных РМЖ, независимо от степени дифференцировки опухоли, наблюдаются повышенные концентрации обоих метаболитов эстрогена и их дискордантное соотношение (преобладание «агрессивного» 16 (а ОНЕ-1) над физиологическим «хорошим» 2 (ОНЕ-1)). При этом, чем выше степень злокачественности опухоли, чем ниже ее степень дифференцировки, тем выше кон-

центрация метаболитов и сильнее дискордантность соотношения 2 (ОНЕ-1)/16 (а ОНЕ-1). При изучении связи гормонального фенотипа опухоли с концентрациями метаболитов эстрогена выявлено, что при гормонопозитивном статусе опухолевой ткани (РЭ+РП+) средние концентрации метаболитов ниже, чем при гормононегативном фенотипе (РЭ-РП-) (табл. 13). Дискордантность соотношения 2 (ОНЕ-1)/16 (а ОНЕ-1) также сильнее выражена при гормоноотрицатель-ном фенотипе опухоли.

Таблица 13.

Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от гормонального фенотипа опухоли

Гормональный фенотип опухоли Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 (а ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (а ОНЕ-1)

РЭ+, РП+ 2,7 6,8 1/2,5

РЭ-, РП- 4,2 19,6 1 /4,6

Из данных табл. 13 видно, что чем выше экспрессия патологического онко-белка НЕЯ-2/пеи, тем отчетливее нарушение гормонального статуса больных РМЖ, выше концентрации метаболитов эстрогена и выше преобладание 16 (а ОНЕ-1) над 2 (ОНЕ-1).

Таблица 14.

Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от стадии РМЖ

Стадия РМЖ Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 (а ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1У 16 (а ОНЕ-1)

ТШОМО .2,9 7,5 1/2,6

ТШ1М0 4,9 143 1/2,9

Т2К0М0 53 19,7 1/3,7

Т2ШМ0 5,8 24,7 1/4,2

Независимо от стадии РМЖ, наблюдается гиперэстрогенемический синдром с преобладанием «а1рессивнош» метаболита эстрогена. При этом, чем выше стадия процесса, тем эти нарушения сильнее.

Изучение уровня метаболитов эстрогена в зависимости от экспрессии НЕК-2

Степень экспрессии НЕЫ-2/пеи Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 (а ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (а ОНЕ-1)

1+ баллов 2,3 4,9 1/2

2+ баллов 3,9 9,6 1 /2,6

3+ баллов 6,1 20,8 1/3,4

Таблица 16.

Изучение уровня метаболитов эстрогена в зависимости от значения индекса пролиферативной активности Кд-67

Значение индекса Й-67, % Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение Концентрация 16 (а ОНЕ-1), среднее значение Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (а ОНЕ-1)

0-35 2,1 4,5 1/2,1

36-50 3,2 8,4 1/2,6

51-75 5,4 19,2 1/3,5

Выше 75 6,0 22,7 1/4,3

При анализе взаимосвязи активности опухолевых клеток с гормональными изменениями, выявлено, что чем выше индекс пролиферативной активности клеток, тем большие изменения происходят в эстрогеновом статусе больных РМЖ - выше средние значения метаболитов эстрогена и более выражена дискордантность их соотношения (табл. 16). Поэтому, всем больным необходимым и патогенетически обоснованным является назначение Индинола - фи-тонугриента, содержащего высокоочшценный ивдол-3-карбинол. Индинол является противоопухолевым и противовирусным средством. Проведенные эксперемен-тальные исследования (В.И. Киселёв, А.А. Ляшенко, 2005) показали, что препарат обладает следующими свойствами: - нормализирует метаболизм эсградиола и ин-гибирует синтез 16а-щдроксюстрона, обладающего выраженными канцероген-

ными свойствами, - ингибирует образование эстрогеновых рецепторов, снижая их количество на тканях-мишенях, - индуцирует избирательный апоптоз опухолевых клеток, - нейтрализует действие ростовых факторов, стимулирующих развитие оцухолей молочных желез.

Мутационный статус больных с РМЖ по парафиновым образцам тканей

Следующим этапом исследования стало изучение происходящих молеку-лярно-генетических изменений, происходящих при РМЖ. Изучалась выраженность этих нарушений в зависимости от гистологического варианта опухоли, рецепторного статуса, пролиферативной активности. Оказалось, что при изучении операционного и биопсийного материала большее количество мутаций наблюдается у больных с низкодифференцированными опухолями. При этом наиболее часто встречаются мутации генов р 53 в 7 экзоне, к-гаэ, Е-кадхерин. Чем выше пролиферативная активность опухолевых клеток по индексу Кл-67, тем больше количество генетических нарушений в опухолевых клетках (табл. 17).

Выявлены различия молекулярно-генетических изменений у больных различными стадиями РМЖ Изменения у больных РМЖ I стадией сопоставимы с изменениями у больных РМЖ со Па, Иб стадиями. При этом, у больных со Па стадией (ТШ1М0) с пораженными регионарными лимфоузлами молеклярно-генетические изменения выражены сильнее по сравнению с больными Па стадией без поражения лимфоузлов. Мутации гена р 53 в 7 ех, К-гаБ, Е-сасШепп встречаются чаще у больных РМЖ независимо от стадии, но необходимо обращать внимание на морфологический вариант опухоли, степень ее дифферен-цировки, индекс пролиферативной активности Кл-67 и содержание свободно-растворимых форм ЕСРЯ и УЕОБК

Таблица 17.

Распределение больных с выявленными мутациями различных генов в зависимости от степени дифференцировки опухоли (п=200)

л Я

о. ю о

о X

я ■е-

а а.

со

ДНК вд1 УД2 нд3 Кол-

(п=24) (п=64) (п=112) во мутаций

5 экзон 6 12 24 44

р53 6 экзон 9 14 89 76

7 экзон 16 36 112 156

8 экзон 8 19 44 80

С-кИ 12 код он 0 4 24 28

В-гаГ 15 кодон 4 18 20 40

АРС 4 8 16 28

К-гав 12,13 ко доны 0 20 64 80

Е-кадхерин гиперметилирование 10 12 44 64

р16 гиперметилирование 0 12 32 44

Итого 49 155 469

К.1 -67 0-35% 18 7 -

36-50% 4 32 20

51-70% 2 18 59

>70% . 7 33

Тримечание: 1 - высокодифференцированный РМЖ; * - умереннодифференцированный МЖ;3 - низкодифференцированный РМЖ.

Таблица 18.

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ в зависимости _от стадии (п=200)

ТШОМО ТШ1М0 Т21М0М0 Т2М1М0(п=53) Кол-во

(п=51) (п=49) (п=47) мутаций

5 экзон 9 12 9 14 44

6 экзон 24 27 27 34 112

р53 7 экзон 40 41 40 43 164

8 экзон 16 17 15 23 71

:-кй 12 кодон 6 7 6 9 28

1-гаГ 15 кодон 7 12 9 15 42

0>С - 3 - 5 28

[.-газ 12,13 ко-доны 17 23 19 25 84

асШепп Гиперметилирование 13 18 15 20 66

16 Гиперметилирование 7 13 9 15 44

1того 139 173 149 203

Таблица 19.

Молекулярно - генетический статус больных РМЖ с различным гормональным и НЕШ/пеи фенотипами

РЭ-, РП-, РЭ +++, РП +++,

HER2/neu (3+) HER2/neu (-)

(п=82) (п=79)

5 экзон 12 4

р53 6 экзон 36 24

7 экзон 82 52

8 экзон 24 16

C-kit 12 кодон 20 20

B-raf 15 кодон 24 16

АРС 4 12

K-ras 12,13 кодоны 72 56

Е- гиперметилирова- 60 44

кадхерин ние

р16 гиперметилирование 16 8

Итого 350 252

Ki-67 0-35% 4 45

36-50% 10 27

51-70% 43 7

>70% 25 -

Из данных (табл. 18, 19) видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных РМЖ с низкой степенью дифференцировки опухоли (469 мутаций). При этом преобладают мутации генов р 53 в 6, 7 ех (104 случаев у больных с низкодифференцированным РМЖ) и Е-кадхерин (44 случаев у больных с низкодифференцированным РМЖ). Индекс пролиферативной активности Ki-67 большее значение (>70%) имел также у больных с низкодиф-ференцированными формами РМЖ (112 случаев). У больных с гормоно-чувствительными вариантами опухолей (РЭ+, РП+) выраженность мутационных нарушений по сравнению с гормоно-негативными фенотипами значительно слабее (табл. 13). Таким образом, мутации генов р 53, Е-кадхерин, К-ras чаще выявляются при рецептор-отрицательном и HER2/neu (3+) фенотипе.

Уровень ЕСЕЛ. и ЬУЕСИ1-165 в сыворотке крови больных РМЖ

Средняя концентрация ЕОРЯ и ИУЕОРРМбЗ в сыворотке крови составила 0,9 6т1о1/ш1 и 147,9 р^ш1 соответственно. Также установлено, что независимо от степени дифференцировки опухоли, имеет место гиперэкспрессия рецепторов факторов роста (ЕвЕК., ЬУЕСРЯ-1б5). Однако прослеживается прямая зависимость выраженности гиперэкспресии РЭФР от пролиферативной активности клеток и происходящими при этом молекулярно-генетическими изменениями (таб. 20). Как видно из данных таблицы, у больных с низкодиф-ференцированными формами РМЖ уровень ЕвРИ, Ь\/ЕОР11-165 значительно превышает нормативные пороговые значения (ЕСР11=Зб,7 Апо1/т1, ЬУЕСРК-165=168,0 р^ш1).

Таблица 20.

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ в зависимости от экспрессии ростовых факторов (ЕСРИ, ЬУЕСРК-165 (до лечения)

!ысокая степень диффе-енциров-

и_

Средняя степень диффе-енциров-

и_

Гизкая степень диффе-енциров-и

р53 5

эк-зон

р53 6

эк-зон

р53 7

эк-зон

112

р53 8

эк-зон

С-кй

В-

гаГ

АРС

К-

гаэ

Е-

кадхерин

р16

ЕСБК (N=0-9,5 йпо1/ш1) ЬУЕОРЯ-

165 (N=0-120 р^т!) ЕОРЯ 10,8 ЬУЕОРК-165 130,0

15,4 ЬУЕОРЯ-165 145,7

"еспГ™

36,7 ЬУЕСРК-165 168,0

Оценка эффективности проводимой терапии и полноты излеченности больных РМЖ после проведения противоопухолевого лечения

Считая, что под воздействием специального противоопухолевого лечения, должны происходить качественные и количественные изменения мутационного статуса (выраженность должна уменьшиться или исчезнуть вовсе), мы изучили молекулярно-генетический статус больных РМЖ по плазме крови при помощи неинвазивных методов после проведения противоопухолевого лечения (табл. 21, 22).

Таблица 21.

Молекулярно-генетический статус больных в зависимости от экспрессии ростовых факторов (Евт, ЬУЕСИЫбБ) (после 4-х курсов АПХТ)

Р53 р53 р53 Р53 С- В- АРС К- Е- р16 ЕОРЯ

5 эк- 6 эк- 7 эк- 8 эк- ХдХ гав кадхерин (N=0-9,5 йпо1/т1)

зон зон зон зон ЬУЕСРЯ- 165 (N=0-120 р^ш1)

Высокая - - - - - - - - - - ЕОРЯ 9,8

степень ИУЕСРЯ-

диффе- 165 =

ренциров- 130,0

ки

Средняя - 1 21 7 1 6 - 11 10 - ЕОРЯ

степень 12,6

диффе- ЬУЕОРЯ-

ренциров-ки 165 = 138,3

Низкая - 23 56 21 1 19 - 51 26 - ЕОРЯ

степень 15,7

диффе- ЬУЕОРЯ-

ренциров-ки - 165 = 147,2

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ (после 4-х курсов АПХТ+Индинол)

р53 5

эк-зон

Р53 6

эк-зон

р53 7

эк-зон

р53 8

эк-зон

С-кк

В-

АРС

К-

гаэ

Е-

cadherin

р16

Таблица 23.

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ в зависимости от экспрессии ростовых факторов (ЕСРИ, ЬУЕСРК-165 (после 6-и курсов АПХТ)

р53 5

эк-зон

Р53 6

эк-зон

р53 7

эк-зон

р53 8

эк-зон

В-

гаГ

АРС

К-

гаэ

Е-

кадхерин

р16

1ысокая степень дифференцировки

,редняя стенень дифференцировки

1изкая степень дифференцировки

Молекулярно-генетический статус больных РМЖ (после 6-и курсов АПХТ+Индинол)

р53 р53 р5 р53 С- В- АР К- Е- р16 ЕОРЯ

5 6 3 8 кй С гаБ ка (N=0-9,5

эк- эк- 7 эк- дх Йш1/т1)

зон зон эк-30 н зон ер ин УБвРЯ (N=0-120 р^т!)

Высокая ЕвРЯ 9,3

степень ЬУЕСРИ-

диффе- 165=101,0

ренциров-

ки

Средняя - - 7 1 - 1 - 3 3 - ЕОРЫ

степень 10,9

диффе- ИУЕОР11-

ренциров-ки 165 =117,7

Таким образом, после проведения 4-х курсов ПХТ наблюдается отсутст-

вие мутаций у больных высокодифференцированными формами РМЖ (табл. 23,24). Т.е. этим больным дальнейшее проведение курсов противоопухолевого лечения будет необоснованным. У больных же с более низкодифференциро-ванными опухолями мутационные изменения в клетках сохраняются, т.е. молекулярная ремиссия не достигнута, и отменять ПХТ, даже при удовлетворительной клинико-инструментальной картине, нельзя.

При анализе изменений, произошедших после проведения 6-и курсов ПХТ, наблюдается уменьшение количества мутаций в генах, а также снижение уровня БвРЯ, ИУЕОР11-165 у больных с низкодифференцированными опухолями. Таким больным рекомендовано продолжение специального лечения хи-миопрепаратами, с контролем через каждые 2 курса ПХТ, до достижения молекулярной ремиссии.

При анализе молекулярно-генетического статуса больных РМЖ, которые с адъювантной полихимиотерапией получали Индинол, видно, что выраженность его изменений (нарушений) меньше, чем у больных, получавших просто АПХТ по схеме РАС. При этом наблюдается не только качественно-

количественное улучшение молекулярно-генетического статуса (в виде уменьшения количества мутаций), но и снижение уровня ростовых факторов в крови больных, что также является признаком улучшения состояния клеток.

В связи с тем, что в настоящее время нет достоверных маркеров оценки эффективности адъювантной терапии, исследование молекулярно-генетического статуса (мутации в онкогенах, К-67, ЕвРЯ, УБвРЯ, метаболитов эстрогена - 2(ОНЕ-1), 16а (ОНЕ-1), РЭ, РП, НЕ11-2/пеи и гистологического типа опухоли) должны рассматриваться как маркеры оценки эффективности проводимого специального лечения, а также маркерами полноты излеченно-сти, а в необходимых случаях - маркерами коррекции проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

1. Степень морфологической дифференцировки рака молочной железы корреллирует с экспрессией молекулярно-генетических маркеров (р<0,01).

2. Низкодифференцированные опухоли имеют наибольшее число мутаций (469 мутаций), по сравнению с неоплазиями с высокой дифференциров-кой. При этом преобладают мутации генов р53 в 6 и 7ех кодонах и гена Е-кадхерин.

3. Больные с I стадией РМЖ имеют молекулярно-генетические нарушения, сопоставимые с нарушениями больных РМЖ со Па, Пб стадиями.

4. В опухолевых клетках больных РМЖ с низкой степенью дифференцировки более высокая пролиферативная активность, определенная по экспрессии антигена Кл-67. В плазме крови этих больных повышен уровень белков ЕСРЯ и УЕСРЯ.

5. После проведенного хирургического и адъювантного химиолучевого лечения, наблюдается снижение числа мутаций в генах и корреляционное снижение уровня БвРЯ, УЕСИЯ в плазме крови.

6. При отсутствии рецепторов эстрогена и прогестерона на поверхности опухолевых клеток наблюдается более агрессивное течение заболевания. У

пациентов с такими фенотипами опухолей достоверно чаще (р<0,05) встречаются метастазы в регионарные лимфатические узлы.

7. Низкий уровень экспрессии рецепторов прогестерона в клетках рака молочной железы сочетается с высокими уровнями экспрессии антигена Кл-67, патологического онкобелка (ШЖ.-2/пеи). Установлена прямая коррелляцион-ная связь между отсутствием рецепторов эстрогена, прогестерона, гиперэкспрессией НЕ11-2/пеи (3+) и более высокой пролиферативной активностью опухолевых клеток.

8. Максимальная экспрессия онкобелка НЕЛ-2 в клетках опухоли является независимым фактором прогноза клинического течения рака молочной железы, связана с высоким метастатическим потенциалом опухоли и характерна для гормон-негативных фенотипов рака молочной железы.

9. Все больные раком молочной железы имеют нарушение гормонального фона в виде гиперэстрогенемии: повышение уровня метаболитов эстрогена, дискордантность соотношения 16а (ОНЕ-1) и 2 (ОНЕ-1) метаболитов эстрогена. Установлено, что чем злокачественнее опухоль (низкая степень дифферен-цировки, высокое значение индекса пролиферативной активности К1-67, отсутствие рецепторов эстрогена и прогестерона на поверхности опухолевых клеток (РЭ-, РП-), гиперэкспрессия НЕЯ-2/пеи (2+,3+)), тем данные нарушения выражены сильнее.

10. Рецептор-отрицательные и НЕ11-2/пеи (3+) фенотипы опухоли РМЖ имеют более неблагоприятный мутационный статус, чем рецептор-положительные и НЕ11-2/'пеи (-) фенотипы.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для определения прогноза клинического течения рака молочной железы необходимо комплексное иммуногистохимическое определение уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона в сочетании с выявлением уровня экспрессии онкобелка НЕЛ-2 и антигена Кл-67 в

летках рака молочной железы. Также считаем необходимым определение [олекулярно-генетического статуса больных РМЖ по парафинирован-ым образцам и по плазме крови в процессе лечения с целью определе-ия эффективности проводимого специального лечения и полноты изле-енности больных РМЖ.

2. При изучении уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестеро-а в клетках рака молочной железы следует обращать особое внимание на пухоли, не имеющие рецепторы эстрогенов и прогестерона или содержащие олько рецепторы прогестерона, а также те, в которых независимо от уровня кспрессии рецепторов эстрогенов отмечается снижение уровня экспрессии ецепторов прогестерона, т.к. фенотипы рака молочной железы характери-ующиеся набором неблагоприятных факторов (РЭ-, РП- либо РЭ-, РП+, НЕЯ-/пеин-н-, К1-67 более 50%, умеренная и низкая степень дифференцировки пухоли, мутации гена р 53 в 7 экзоне, повышенные концентрации ЕСР11, ТЮРЯ, дискордантность соотношения метаболитов эстрогена и их выражен-ость) обладают более агрессивным злокачественным течением и являются еблаголриятными в контексте прогноза клинического течения и ответа на пециальное лечение (в т.ч. гормонотерапию), что требует проведения поли-имиотерапии в адьювантном режиме даже при начальных стадиях РМЖ (I г), независимо от объема проведенного хирургического лечения.

3. Рекомендовано изучение молекулярно-генетических изменений при по-гощи неинвазивных методов исследования в ходе специального лечения. При аступленш молекулярной ремиссии продолжение дальнейшего лечения не елесообразно. При сохраняющейся генетической нестабильности, даже при роведенш стандартного объема лечения, специальное лечение должно про-одиться далее с оценкой через каждые 2 курса ПХТ до достижения молеку-ярной ремиссии.

4. При выявлении нарушения гормонального фона у больных РМЖ с гапе-рэстрогенемией и преобладанием 1ба (ОНЕ-1) метаболита эстрогена, опреде-

енного по моче тестом ЕБТОДМЕТ, необходимым и патогенетически обос-

нованным является назначение ингибиторов эстрогена - препаратов на основе индол-3-карбинолов - Индинол.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б., Матвеева О.Н., Чебышева Е.В., Липская О.В. Иммуномодулятор Ликопид в комплексной терапии онкологических больных // Тюменский медицинский журнал. - 1999. - № 3. - С. 28.

2. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б., Матвеева О.Н., Чебышева Е.В., Липская О.В., Карамышева М.Я. Сопутствующая патология у онкологических больных // Тез. Международного симп. «Медицина и охрана здоровья-1999», 24-27 ноября 1999 г., Тюмень, 1999. - С. 178.

3. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б., Федоров Н.М., Бузолин Д.В., Старцев С.А. Иммунологические аспекты клинической онкологии /Методические рекомендации для врачей. - Тюмень, 2000. - С 32.

4. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б. Распространенность и структура иммунопатологических синдромов у онкологических больных // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2000. - № 3. - С. 52-53.

5. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б. Паллиативная помощь и медико-социальная реабилитация онкологических больных // Тюменский медицинский журнал. - 2000. - № 2. - С. 39-40.

6. Чернецова Л.Ф., Сабиров А.Х., Зотов П.Б., Федоров Н.М., Старцев С.А.Иммуномодулятор Ликопид в паллиативной терапии онкологических больных (методические рекомендации для врачей). - Тюмень, 2000. - 24 с.

7. Верхозина Н.В., Гусева Е.В., Сабиров А.Х., Кондакова Л.Д. Физиотерапия в лечении онкологических больных // Мат. юбилейной конф., посвященной 55-летию онкологической службы Тюменской области. - Тюмень, 2001.-С. 147-148.

8. Липская О.В., Сабиров А.Х., Старцев С.А., Торопыгин П.Ю. Восста-эвительное лечение онкологических больных после получения специализи-званного лечения в онкодиспансере // Мат. юбилейной конфер., посвященной 5-летию онкологической службы Тюменской области. — Тюмень, 2001. — С. 18-150.

9. Сабиров А.Х., Кормина О.С., Алехин И.Е., Белохвостов A.C., Муста-i 0.3. О возможности ДНК-диагностики в онкологии // Онкология: теория и зактика. - 2004. - № 4. - С. 46-47.

10. Сабиров А.Х., Кормина О.С., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Мустаев .3., Изгейм В.П., Нямцу A.M., Барышников А.Ю., Бычков В.Г.Корреляция гкоторых иммунологических, иммуноферментных и молекулярно-:нетических маркеров в диагностике опухолевого роста/Всероссийская кон-еренция «Новые отечественные противоопухолевые препараты» 23-24 фев-1ля 2005г.- М„ 2005. -С. 37-41.

11. Сабиров А.Х., Бычков В.Г., Сергиев В.П., Крылов Г.Г., Труханова .С., Барышников А.Ю., Зуевский В.П., Каленова Л.Ф., Леонтьев Д.И., Вели-анина О.С., Хадиева Е.Д., Вакулина О.Э., Асаинов P.P. Экологическая онко-эгия: стратегия профилактики опухолевых болезней в нефтегазовом регионе. Груды Международного форума по проблемам науки, техники и образовали. /Под ред. В .П. Савиных, В.В. Вишневского. М., 2005. -Том 3. -С. 11-14.

12. *Сабиров А.Х., Кормина О.С., Барышников А.Ю.Иммунологические аркеры CD38, CD50, CD95 в мониторинге опухолевого роста и их коррелята с другими молекулярно-биологическими маркерами. // Российский биоте-шевтический журнал. -2005. - №2 - С.34-37.

13. Сабиров А.Х., Кормина О.С., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Мустаев .3., Изгейм В.П., Нямцу A.M., Барышников А.Ю., Бычков В.Г. Иммунологи-гские иммуноферментные и молекулярно-генетические маркеры в диагно-•ике опухолевого роста./ Международный симпозиум «Молекулярные меха-

низмы регуляции функции клетки» 12-16 сентября 2005г. Тюмень, 2005,- С. 289.

14. Сабиров А.Х., Кормина О.С., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Мустаев О.З., Изгейм В.П., Нямцу A.M., Барышников А.Ю., Бычков В.Г. Описторхоз в Сибири - канцерогенный гельминтоз /Международный симпозиум «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» 12-16 сентября 2005г. Тюмень, 2005. -С. 288.

15. Велижанина О.С., Сабиров А.Х., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Кри-вощеков А.П., Мустаев О.З., Барышников А.Ю., Липская О.В. О возможностях ДНК-диагностики в оценке канцерогенной опасности среди работников газодобывающего предприятия./ Всероссийский симпозиум с международным участием «Канцерогенная опасность в различных отраслях промышленности» 6-7 декабря 2005г. Екатеринбург, 2005. - С. 80-82.

16. Велижанина О.С., Сабиров А.Х., Алехин И.Е., Хасанова Г.Р., Бычков В.Г., Крылов Г.Г., Мустаев О.З., Барышников А.Ю. Методологические аспекты превентивной онкологии при описторхозе населения гиперэндемичных очагов Западной Сибири. /Всероссийский симпозиум с международным участием «Канцерогенная опасность в различных отраслях промышленности» 6-7 декабря 2005г. Екатеринбург, 2005,- С. 94-95.

17. Бычков В.Г., Сабиров А.Х. Экологическая онкология: стратегия профилактики опухолевых болезней в нефтегазовом регионе (Западная Сибирь)/ Международный форум по проблемам науки, техники и образования. 59 декабря 2005г. М„ 2005.-Том 3. -С. 119-126.

*18. Сабиров А.Х., Нямцу A.M., Нямцу Е.Л., Велижанина О.С. Скрининг злокачественных новообразований. // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - №2.-С. 24-26.

19. Сабиров А.Х., Нямцу A.M., Нямцу Е.Л., Велижанина О.С.Скрининговые исследования в онкологии. // Сайт РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН «Вместе против рака» март 2006г. www.wpr.ru.

*20. Сабиров А.Х., Нямцу A.M., Изгейм В.П., Велижанина О.С. Опреде-гние метастазов в регионарных лимфатических узлах при помощи полиме-ззной цепной реакции. // Онкоурология - 2006. - №4,- С. 11-13.

21. Нямцу A.M., Нямцу E.JL, Сабиров А.Х., Велижанина О.С., Алехин I.E., Хасанова Г.Р., Жукевич М.А. Реабилитация онкологических больных. // айт РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН «Вместе против рака» июнь 2006г. ww.wpr.ru .

22. Грибоедов М.Н., Нямцу A.M., Нямцу E.JL, Сабиров А.Х. Экстренная ккология. // Сайт РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН «Вместе против рака» июнь 306г. www.wpr.ru.

*23. Бычков В.Г., Крылов Г.Г., Сергиев В.П., Суховей Ю.Г., Сабиров .X. «Описторхоз как модель изучения пролиферации и дифференцировки гволовых клеток печени».// Аллергология и иммунология.- 2007.-Т.8. -№1. -. 104-105.

24. Григоренко Т.Б., Шайн А. А., Сабиров А.Х., Симонов А. В., Федоров . М., Алехин И. Е., Хасанова Г. Р., Важенина А. А., Антонов М. В.Новые эдходы к лечению рака молочной железы, осложненного ВПЧ 16, 18 типов./ ез. Международного симпозиума. «Новые отечественные противоопухолевые эепараты» 24-26 март 2007г. М„ 2007,- С. 31-32.

*25. Бычков В.Г., Сергиев В.П., Сабиров А.Х., Крылов Г.Г., Хадиева Е.Д., ычкова Т.В. «Молекулярно-генетические подходы в паразитологии (на при-ере описторхоза)»// Медицинская паразитология и паразитарные болезни.-307.- №2,- С. 3-6.

26. Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн A.A., Важенина A.A., Антонов [.В. Молекулярно-генетический статус больных с фиброзно-кистозными мас-шатиями. Стратегические подходы превентивной онкологии. /Материалы сероссийской научно-практической конференции по интервенционной мам-ологии. М.: «Сан-пресс», 2008.- С.121-125.

*27. В.Г. Бычков, Г.Г. Крылов, А.Х. Сабиров, В.П. Зуевский, Е.Д. Хадие-ва, А.К. Жанбеков «Динамика клеточных преобразований в печени при экспериментальном описторхозе»// Медицинская паразитология и паразитарные болезни,- 2008,- №3.- С. 4-12.

28. Сабиров А.Х., Бычков В.Г., Шайн A.A., Федоров Н.М., Крылов Г.Г., Гадевич В.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий на фоне описторхоза в процессе лечения индинолом.// Тюменский медицинский журнал.- 2008.-№4. - С.39-41.

29. Сабиров А.Х., А.Ю. Барышников, Федоров Н.М., Важенина A.A., Антонов М.В. Молекулярно-генетические изменения у больных с диффузными формами мастопатий и методы их коррекции / Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия», М., 2008. -С. 56-57.

30. Сабиров А.Х., Шайн A.A., Федоров Н.М. О возможности молекуляр-но-генетического тестирования онкологических больных /Восьмой съезд онкологов Армении. Ереван, 2008. -С. 85-87.

31. Сабиров А.Х., Шайн A.A., Федоров Н.М., Важенина A.A. Об использовании препарата «Промисан» в таргетной терапии онкологических больных. / Конференция онкологов Поволжья. Сборник тезисов. Казань, 2008. -С. 76-78.

*32. Бычков В.Г., Сабиров А.Х., Крылов Г.Г., Хадиева Е.Д., Жанбеков А.К. Гисто и морфогенез эпителия в печени// Морфология. 2008. - №3.- С. 2627.

*33. Сабиров А.Х., Бычков В.Г., Крылов Г.Г. «Современные технологии превентивной онкологии в гиперэндемичном очаге описторхоза»//Аллергология и иммунология,- 2008.- Т.9.- №3. -С. 326-327.

*34. Сабиров А.Х., Бычков В.Г. Новые подходы в превентивной онкологии в гиперэндемичном очаге описторхоза.// Российский Биотерапевтический журнал, 2009. -№1.-Т8.-С. 81-86.

*35. Сабиров А.Х., Федоров Н.М., Шайн A.A., Важенина A.A., Бычков .Г. Подходы к превентивной маммологии.// Российский биотерапевтический урнал, 2009. -№1.-Т.8.-С. 94-97.

36. Сабиров А.Х., Шаназаров H.A., Федоров Н.М., Шайн A.A., Гадевич .В., Важенина A.A., Барышников А.Ю., Бычков В.Г., Нечай E.H., Барышни-эв А.П., Кислый Д.Г., Антонов М.В. Стратегические подходы превентивной оологии./ Радиология - наука и практика. Материалы 3-го Евразийского ра-гологического форума. Астана, 2009. -С. 33-37.

37. Шаназаров H.A., Сабиров А.Х. Нанотехнологии в медицине./ Радио-эгия - наука и практика. Материалы 3-го Евразийского радиологического орума. Астана, 2009. -С. 51-59.

*38. Шаназаров H.A., Сабиров А.Х., Сироткина С.М. Роль эпидермально-) фактора роста и его рецептора в канцерогенезе, молекулярные механизмы < действия.// Российский биотерапевтический журнал, 2009. Т 8.- 4,- С. 85-90.

39. "Сабиров А.Х., Шаназаров H.A., Синяков А.Г., Федоров Н.М., Сидо-)в Е.В., Велижанина О.С., Гадевич В.В. Первый опыт применения молеку-[рно-генетических маркеров в оценке лечения рака желудка.//Медицинская 1ука и образование Урала, 2009. -№4. -С. 43-45.

*40. Шаназаров H.A., Сабиров А.Х., Синяков А.Г, Симонов A.B., Райков .С., Сидоров Е.В., Велижанина О.С. Значимость молекулярно-генетических аркеров в лечении больных раком желудка// Российский биотерапевтический урнал, 2010. - № 1,- С.56-60.

*41. Сабиров А.Х. Гистологические, иммуногистохимические и молеку-фно-генетические маркеры при раке молочной железы на фоне описторхоз-эй инвазии// Медицинская наука и образование Урала, 2010. -№1. -С. 82-84.

*42. Налетов A.A., Сабиров А.Х., Важенина A.A., Антонов М.В., Симо-зв A.B., Велижанина О.С., Сироткина С.М. Современные методы диагности-

ки злокачественной трансформации клетки //Вопросы онкологии. -2010. -Т.56.-№2,- С. 35.

* - публикации в журналах, рекомендуемых ВАК

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

РМЖ рак молочной железы

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

мтДНК митохондриальная ДНК

ПЦР полимеразная цепная реакция

ПДРФ полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

ТР53 супрессор опухоли

П.о. пар оснований

ИГХ иммуногистохимия

Ki 67 индекс пролиферативной активности клеток

РП рецептор прогестерона

РЭ рецептор эстрогена

EGFR рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР)

VEGFR рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста

2 (ОНЕ-1) функциональный метаболит эстрогена

16а (OHE-1) агрессивный метаболит эстрогена

Her-2/neu продукт онкогена сегЬВ-2 семейства рецепторных тирозин-киназ

п объем выборки

р уровень значимости статистического критерия

АПХТ адъювантная полихимиотерапия

ИСА иммуносорбентный анализ

РЭФР рецептор эпидермального фактора роста

ЭФР эпидермальный фактор роста

FISH флюоресцентная гибридизация in situ

ДАБ диаминобензидин

САБИРОВ Ахат Халимович

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология 14.01.12 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Подписано в печать 24.03.2010 Формат 60x84/16. Печ. л.2,0. Печать ризограф. Тираж 100. Зак. №273.

Типография ООО «Печатник», лицензия ПД № 17-0027 Тюмень, ул. Республики, 148 корп. 1/2. Тел. (3452) 20-51-13, тел./факс (3452) 32-13-86

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Сабиров, Ахат Халимович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Факторы риска развития рака молочной железы.

1.2. Экспрессия HER-2/neu в клетках рака молочной железы. 13 Рецепторы стероидных гормонов и их роль в развитии

РМЖ, клинико-прогностическое значение.

Маркер пролиферативной активности Ki-67 в раке молочной железы.

1.5. Роль ростовых факторов в канцерогенезе РМЖ.

1.6. Клеточное строение и морфогенез РМЖ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Характеристика обследуемой группы пациентов.

2.2. Молекулярно-генетическое исследование.

2.2.1. Выделение геномной ДНК.

2.2.2. Полимеразная цепная реакция ДНК.

2.2.3. Рестрикционный анализ.

2.2.4. Метод гель-электрофореза.

2.2.5. Определение нуклеотидной последовательности ДНК (секвенирование).

2.3. Иммуногистохимическое определение.

2.4. Иммуносорбентное исследование в модификации ELISA.

2.4.1. ИФА диагностика сывороточных EGFR и VEGFR.

2.4.2. ИСА для определения сывороточного уровня Her-2/neu.

2.4.3. ИСА для определения уровня метаболитов эстрогена ESTRAMET 2/16 ELISA.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфологические, клинические и прогностические характеристики рака молочной железы в обследованной группе пацинетов.

3.2. Иммуногистохимическое определение содержания рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках рака молочной железы.

3.3. Иммуногистохимическое определение экспрессии онкобелка HER-2 в клетках рака молочной железы.

3.4. Иммуногистохимическое определение экспрессии антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы.

3.5. Изучение уровня метаболитов эстрогена.

3.6. Изучение мутационного статуса больных с РМЖ по парафинированным образцам тканей и по плазме крови.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ"

Актуальность проблемы

Рак молочной железы (РМЖ) является серьезной медицинской и социальной проблемой для большинства развитых стран мира. Несмотря на значительные достижения последней четверти века в понимании биологии и клиники заболевания, а также кардинальных изменений в подходе к лечению, проблема продолжает оставаться высоко актуальной.

В Тюменской области в 2008 году в структуре злокачественных заболеваний опухоли молочной железы находились на втором месте (11,4%), уступая лишь опухолям трахеи, бронхов, легкого (15,06%). По распространенности в женской популяции первое место уверенно за опухолями молочной железы (20,3%). При этом, заболеваемость по сравнению с 2004 годом выросла на 5,21% (с 46,65% до 51,86% соответственно). Удельный вес больных с 1 -2 стадиями процесса остался на прежнем уровне (67,19% в 2004 г., против 67,99% - в 2008 г.). Также на прежнем уровне осталась смертность от РМЖ (20,98% - в 2004 г., против 20,06% в 2008 г.).

Одними из первых, вошедших в практику клеточных маркеров, были рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), роль которых в генезе гормонозависимых опухолей доказана большим количеством исследований (Семиглазов В.Ф. и соавт., 1992). Определение РЭ и РП в ткани опухоли сейчас рассматривается как обязательное условие для успешного гормонального лечения РМЖ (АНгес! Э.С. е1 а1., 1998; Бернштейн Л.М., 2000; Семиглазов В.Ф., 2001). Степень эффективности гормональной терапии также существенно зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: ее эффективность составляет около 10 % при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50 % при РЭ-положительных опухолях и около 75 % при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП. Тем не менее, известны случаи резистентности к гормональной терапии больных с РЭ- и РП-положительными опухолями, поэтому гормонально-рецепторный статус опухоли оказывается не всегда достаточным показателем гормональной чувствительности РМЖ (Летягин В.П., 2004).

Не вызывает сомнения тот факт, что эстрадиол индуцирует синтез факторов роста, рецепторы которых, например, рецептор эпидермального фактора роста, имеют сходство с некоторыми онкобелками. В их число входит мембранный гликопротеид HER-2/neu, являющийся членом семейства тирозинкиназных рецепторов и одним из самых перспективных маркеров для предсказания возникновения рецидивов заболевания, появления метастазов, резистентности к химио- и гормонотерапии РМЖ.

Важная роль в канцерогенезе РМЖ принадлежит и другим ростовым факторам, таким как EGFR - эпидермальный фактор роста, VEGFR - сосудистый эндотелиальный фактор роста и мутационному статусу.

Ведущим фактором в механизме злокачественной трансформации клеток, в биологическом поведении уже возникших опухолей является усиление пролиферативной активности опухолевых клеток. Для выявления особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей человека широко используется анализ экспрессии антигена Ki-67, который экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла и отражает величину пролиферативного пула опухоли (Пожарисский K.M., Леенман Е.Е., 2000).

Рак молочной железы характеризуется диссеминацией раковых клеток гематогенным путем уже на ранних стадиях заболевания. Поэтому помимо местного лечения (хирургическая операция и лучевая терапия), больным проводится системная химиотерапия и/или эндокринная терапия в адъювантном режиме. За последние 40 лет реальная польза от системного адъювантного лечения в плане улучшения показателей выживания без признаков заболевания и общего выживания была подтверждена многочисленными рандомизированными испытаниями (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group /EBCTCG/) (265,266). Однако так как рак молочной железы является гетерогенным заболеванием, вопрос о том, целесообразно ли назначать адъювантную химиотерапию всем больным, или только больным с высоким риском развития системного заболевания при первом выявлении, остается открытым.

Существующие на сегодняшний день способы оценки степени риска у больных, страдающих раком молочной железы, низкоэффективны и недостаточны.

Значимость отдельных вышеперечисленных маркеров, выявляемых иммуногистохимическим методом, остается спорной. Требует уточнения прогностическая роль иммуногистохимических методов в оценке эффективности проводимой терапии и определении прогноза течения болезни после проведения противоопухолевого лечения. Также актуальным является разработка новых методик (ПЦР, ИСА), которые отвечают этим запросам.

Цель исследования

Выявление экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, экспрессии онкобелка HER-2 (сегЬВ-2) и антигена Ki-67, EGFR и VEGFR, молекулярно-генетического статуса и определение диагностической значимости этих маркеров для прогноза клинического течения рака молочной железы, оценки эффективности проводимого спецлечения и полноты излеченности больных РМЖ.

Задачи исследования:

2. Изучить содержание и уровень экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в клетках рака молочной железы и выявить клинико-морфологические особенности течения заболевания с различными гормонально-рецепторными фенотипами опухоли.

3. Определить концентрацию метаболитов эстрогена (2-гидрокиэстрон, 16а-гидроксиэстрон), и их соотношение.

4. Определить экспрессию онкобелка НЕК-2 и антигена Кь67 в клетках рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами.

5. Определить сывороточный уровень ЕОБК и ЬУЕОРК-165.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. С увеличением возраста больных РМЖ экспрессия рецепторов половых гормонов увеличивается, экспрессия НЕК-2/пеи - уменьшается.

3. При любом гистологическом варианте опухоли имеется гиперэстрогенемический синдром и дискордантность соотношения 2-ОНЕ/16а-ОНЕ.

7. С уменьшением степени дифференцировки опухоли, с увеличением ее пролиферативного потенциала уровень экспрессии рецепторов ростовых факторов (ЕвРЯ, ЬУЕОРР-165) увеличивается.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное изучение клинико-лабораторных характеристик клеток рака молочной железы: содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, онкобелка НЕК-2, антигена Кл-67, уровня ЕОРЯ, ЬУЕОР11-165 с применением высокочувствительного и специфичного иммуногистохимического метода и определения сывороточных концентраций этих белков. Показана коррелляция и практическая значимость уровней РП и РЭ, ЕСРЯ и УЕОРЯ, ЫЕЯ-2/пеи, определенных иммуногистохимическим и иммуносорбентным методами.

Определена важная роль ЕОБЯ и ЬУЕОРК-165 в канцерогенезе РМЖ. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона, повышение уровня БОРЯ и ЬУЕСР11-165, НЕК-2/пеи и высокого уровня индекса пролиферации К1-67 в клетках рака молочной железы является важным предсказательным фактором низкой эффективности противоопухолевой гормональной терапии и может рассматриваться как показатель неблагоприятного прогноза клинического течения рака молочной железы. Выделены группы риска больных РМЖ, учитывая все выше перечисленные маркеры.

Практическая значимость работы

Предложена программа комплексного лабораторного ммуногистохимического, иммуносорбентного и молекулярно-генетического исследования клеток рака молочной железы, включающая определение содержания и уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов: эстрогенов, прогестерона, онкобелка НЕЯ-2 и антигена Кл-67, определения уровня БОРЯ, VEG.FR и мутационного статуса для формирования прогноза клинического течения рака молочной железы и отбора групп пациентов для проведения адекватной гормональной и химиотерапии.

Выделены группы пациентов с опухолевыми фенотипами, обладающими неблагоприятными прогностическими и предсказательными характеристиками.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены: Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005); Всероссийской конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005); Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2005); IX Международной конференции «Высокие технологии восстановительной медицины: профессиональное долголетие и качество жизни» (Сочи, 2006); IX съезде Всероссийского научнопрактического общества эпидемиологов и паразитологов» (Москва, 2007); Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008); Всероссийской конференции «Актуальные аспекты паразитарных заболеваний в современный период» (Тюмень, 2008); на съезде онкологов Армении с международным участием «Молекулярная онкология» (Ереван, 2008); на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); на IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008); III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009); на научно-практической конференции онкологов Поволжья «Молекулярные аспекты рака молочной железы» (Казань, 2009); на научно-практической конференции онкологов Тюменской области «Гиперпластические процессы в органах женской репродуктивной системы» (Тюмень, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия злокачественных новообразований» (Москва, РОНЦ, 2009); совместном заседании обществ анатомов, гистологов, эмбриологов и онкологов Тюменской области (Тюмень, 2010); на научно-практической конференции с международным участием «Наноонкология - 2010» (Москва, 2010); на совместной научной конференции лаборатории экспериментальной диагностики и биотерапии опухолей НИИ ЭДиТО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН, лаборатории медицинской биотехнологии, лаборатории фармакоцитогенетики, лаборатории клеточного иммунитета, отделении биотерапии НИИ Клинической онкологии РОНЦ им H.H. Блохина РАМН (Москва, 2010).

- 12

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Сабиров, Ахат Халимович

выводы

2. Низкодифференцированные опухоли имеют наибольшее число мутаций (469 мутаций), по сравнению с неоплазиями с высокой дифференцировкой. При этом преобладают мутации генов р53 в 6 и 7ех кодонах и гена Е-кадхерин.

4. В опухолевых клетках больных РМЖ с низкой степенью дифференцировки определяется более высокая пролиферативная активность, определенная по экспрессии антигена Кл-67. В плазме крови этих больных повышен уровень белков ЕСРЯ и УЕОБЯ.

5. После проведенного хирургического и адъювантного химиолучевого лечения, наблюдается снижение числа мутаций в генах и корреляционное снижение уровня ЕОР11, УБОРЫ в плазме крови.

6. При отсутствии рецепторов эстрогена и прогестерона на поверхности опухолевых клеток наблюдается более агрессивное течение заболевания. У пациентов с такими фенотипами опухолей достоверно чаще (р<0,05) встречаются метастазы в регионарные лимфатические узлы.

7. Отсутствие экспрессии рецепторов прогестерона в клетках рака молочной железы сочетается с высокими уровнями экспрессии антигена Кл-67, патологического онкобелка (НЕК-2/пеи). Установлена прямая коррелляционная связь между отсутствием рецепторов эстрогена, прогестерона, гиперэкспрессией НЕЯ-2/пеи (3+) и более высокой пролиферативной активностью опухолевых клеток.

8. Максимальная экспрессия онкобелка НЕК-2 в клетках опухоли является независимым фактором прогноза клинического течения рака молочной железы, связана с высоким метастатическим потенциалом опухоли и характерна для гормон-негативных фенотипов рака молочной железы.

9. Все больные раком молочной железы имеют нарушение гормонального фона в виде гиперэстрогенемии: повышение уровня метаболитов эстрогена, дискордантность соотношения 16а (ОНЕ-1) и 2 (ОНЕ-1) метаболитов эстрогена. Установлено, что чем злокачественнее опухоль (низкая степень дифференцировки, высокое значение индекса пролиферативной активности Кл-67, отсутствие рецепторов эстрогена и прогестерона на поверхности опухолевых клеток (РЭ-, РП-), гиперэкспрессия НЕК-2/пеи (2+,3+)), тем данные нарушения выражены сильнее.

10. Рецептор-отрицательные и НЕК-2/пеи (3+) фенотипы опухоли РМЖ имеют более неблагоприятный мутационный статус, чем рецептор-положительные и НЕК-2/пеи (-) фенотипы.

- 172

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Также считаем необходимым определение молекулярно-генетического статуса больных РМЖ по парафинированным образцам и по плазме крови в процессе лечения с целью определения эффективности проводимого специального лечения и полноты излеченности больных РМЖ.

2. При изучении уровня экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона в клетках рака молочной железы следует обращать особое внимание на опухоли, не имеющие рецепторы эстрогенов и прогестерона или содержащие только рецепторы прогестерона, а также те, в которых независимо от уровня экспрессии рецепторов эстрогенов отмечается снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона, т.к. фенотипы рака молочной железы характеризующиеся набором неблагоприятных факторов (РЭ-, РП- либо РЭ-, РП+, НЕЯ-2/пеи+++, Кь67 более 50%, умеренная и низкая степень дифференцировки опухоли, мутации гена р 53 в 7 экзоне, повышенные концентрации БвРЯ, УЕОРЯ, дискордантность соотношения метаболитов эстрогена и их выраженность) обладают более агрессивным злокачественным течением и являются неблагоприятными в плане прогноза клинического течения и ответа на специальное лечение (в том числе, гормонотерапию), что может требовать проведения полихимиотерапии в адъювантном режиме даже при начальных стадиях РМЖ (I ст), независимо от объема проведенного хирургического лечения.

3. Рекомендовано изучение молекулярно-генетических изменений при помощи неинвазивных методов исследования в ходе специального лечения. При наступлении молекулярной ремиссии продолжение дальнейшего лечения не целесообразно. При сохраняющейся генетической нестабильности, даже при проведении стандартного объема лечения, специальное лечение должно проводиться далее с оценкой через каждые 2 курса ПХТ до достижения молекулярной ремиссии.

4. При выявлении нарушения гормонального фона у больных РМЖ с гиперэстрогенемией и преобладанием 16а (ОНЕ-1) метаболита эстрогена, определенного по моче тестом ЕЗТЯАМЕТ, необходимым и патогенетически обоснованным является назначение ингибиторов эстрогена — препаратов на основе индол-3-карбинолов - Индинол.

- 174

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Сабиров, Ахат Халимович, Тюмень

1. Аничков Н.М. Биологические и клинико-морфологические аспекты учения о метастазировании злокачественных опухолей // Мед. Акад. Журнал. 2003. - Т.З. №1 - С. 3-13.

2. Азимов Ф.Х. Холангиоцелюллярный рак особенности диагностики и лечения). // Практическая онкология, 2008. Т.9. - №4. -С. 229-235.

3. Баранов C.B. Репаративная регенерация и имплантационный рост опорных тканей на фоне динамики морфо-функционального состояния печени при описторхозе: Автореф. дис.канд. мед. наук. Тюмень, 2009.-С. 23.

4. Аникеева Н.В. Роль рецепторов эстрогенов, прогестерона, андрогенов, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 в прогнозе рака молочной железы. Москва 2006, РГБ.

5. Бассалык Л.С. (под ред.) Рецепторы стероидных гормонов в опухолях человека.-М: 1987.

6. Бернштейн Л.М. Внегонадная продукция эстрогенов (роль в физиологии и патологии). СПб.: Наука, 1998.-174 с.

7. Бернштейн Л.М. Гормональный канцерогенез. СПб.: Наука, 2000,- 199 с.

8. Бернштейн Л.М. Современная эндокринология гормонзависимых опухолей//Вопросы онкологии.- 2002.- Т.48.- №4.- С. 496-503.

9. Бит-Сава Е.М. Клинические и генетические аспекты наследственного рака молочной железы: Автореф. дис.канд. мед. наук. СПб. 2005.-20 с.

10. Бруевич Т.С. Бластомогенность продуктов переработки нефти. М.: «Медицина», 1980. 272 с.

11. Буслов К.Г. Роль полиморфизмов генов репарации ДНК в формировании предрасположенности к раку молочной железы: Дис.канд. мед. наук СПб, 2006. 77 с.

12. Бычков В.Г. Частота злокачественных опухолей в условиях г.Ханты-Мансийска. // Вопросы онкологии, 1977. Т. 23. - № 7, С. 58-61.

13. Бычков В.Г. Описторхоз в гиперэндемичном очаге и проблема канцерогенеза: Автореф. дис.докт. мед. наук. М, 1988. — 49 с.

14. Бычков В.Г. Описторхоз и рак печени у населения гиперэндемичного очага. Новосибирск: ВО «Наука», 1992. — 175 с.

15. Бычков В.Г., Гиновкер А.Г., Худякова В.В. Мутагенные факторы среднего Приобья. /Ежегодная конференция европейского общества по мутагенам внешней среды: XIV: Тезисы докладов, Москва, 1984.-С. 85.

16. Бычков В.Г., Ярославский В.Е, Гиновкер А.Г. Клинико-морфологическая структура суперинвазивного описторхоза. // Мед. Паразитология и паразитар. болезни 1984. № 5. - С. 13-16.

17. Вакулина О.Э. Морфо-функциональные параллели состояния печени и регенерации скелетных тканей при описторзхозной инвазии (клинико-экспериментальное исследование): Автореф. дис.канд. мед. наук. Тюмень, 2008. 18 с.

18. Вишневский В.А., Тарасюк Т.П. Диагностика и хирургическое лечение рака проксимальных печеночных протоков (опухолей Клатскина) // Практическая онкология, 2004. Т.5. № 2. - С. 126-134.

19. Возный Э.К., Бяхов М.Ю., Горб А.И., Кривенко Э.В. и др. Степень васкуляризации опухоли как прогностический фактор- неэффективности неоадъювантной полихиотерапии при раке молочной железы // Вопр. онкологии.- 1992,- Т.38, N 7.- С.818-823.

20. Волченко H.H. Морфологические факторы прогноза при раке молочной железы // Российский онкологический журнал. 2000. № 3. С. 49-53.

21. Гелыдтейн В.И. Возникновение и прогрессия экспериментальных опухолей печени //Практическая онкология, 2004. — Т. 5. №2.-С. 126-134.

22. Гелыптейн В.И., Чипышева Т.А., Демидов Л., Поляков Б. Эволюция гиперпластических очагов в печени крыс при воздействии диэтилнитрозамина // Вопр. Онкологии, 2006. № 13. — С. 3-7.

23. Грикурова Н.К. Исследование нуклеиновых кислот сыворотки крови и асцитной жидкости при злокачественных опухолях: Автореф.дис.канд.мед.наук. Л., 1984.-16 с.

24. Даниленко В.И. Системный анализ морфогенеза рака молочной железы: Автореф. дис.док.мед.наук. М., 1983. -40 с.

25. Дедов И.И., Мельниченко Г.А., Фадеев В.В. Эндокринология. -М.: Медицина. 2003,- 432 с.

26. Долгих В.Т. Опухолевый рост. М. «Медицинская книга. НМГА, 2001. 81 с.

27. Захарцева Л.М., Воробьева Л.И., Манжура Е.П. Морфологические иммуногистохимические критерии прогноза при раке эндометрия// Онкология-2001.-Т.З.-№4. -С.252-256.

28. Заридзе Д.Г. (ред.) Канцерогенез М., 2004. — 574 с.

29. Зиннатуллина Г.Ф. Определение факторов прогноза течения рака молочной железы на основании молекулярно-генетических исследований: Дисс. .кан. мед. наук. УФА, 2007.-115 с.

30. Инг Нэнси Г., О'Мэлли Берт У. Суперсемейство рецепторов стероидных гормонов: молекулярные механизмы действия//Молекулярная эндокринология. М.: Медицина, 2003 .-С. 191208.

31. Каленова Л.Ф. Хроническая описторхозная инвазия -хронический стресс // Научный вестник Тюменской медицинской академии. Тюмень, 2002. № 7-8. С. 73.

32. Камерон И.Л., Пул Т.Б. (ред.) Трансформированная клетка / перевод с анг. В.И. Струка, Е.А. Баглея, С.А. Пащенко. Киев. Наукова Думка, 1985.-384 с.

33. Карселадзе А.И. Некоторые основополагающие понятия онкоморфологии в свете достижений современной молекулярной биологии. // Архив патол., М. «Медицина», 2009. Т. 71. вып.5. — С. 1720.

34. Кеннеди K.P. Экологическая паразитология (перевод с английского под ред. K.M. Рыжикова и О.Н. Бауера). М. «Мир», 1978. — 230 с.

35. Киселев В.И., Муйжнек Е.Л. Общие принципы профилактики метастатической болезни и сенсибилизации опухолей. М., 2007.- 128 с.

36. Киселев В.И., Киселев О.И. Этиологическая роль вируса папилломы человека в развитии рака шейки матки: генетические и патогенетические механизмы// Цитокины и воспаление, 2003,- Т. 2.- № 4. -С. 31-38.

37. Коган Е.А. Молекулярно-генетические основы канцерогенеза. // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2002.-Т. 12. №3.-С 32-36.

38. Коган Е.А. Опухолевый рост. Патология/ Под ред. М.А. Пальцева, B.C. Паукова. М.:ГОЭТАР-МЕДИА, 2008. Т.1 - С. 221-226.

39. Коган Е.А., Угрюмов Д. А. Соотношение процессов пролиферации и клеточной гибели в немелкоклеточном раке легкого с железистой дифференцировкой на разных стадиях опухолевой прогрессии//Архив патологии. -2002. -Вып. 1-С. 33-37.

40. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. // Биохимия, 2000. — Т.65. — вып. 1 С. 5-33.

41. Копнин Б.П. Нестабильность генома и онкогенез. // Молекулярная биология, 2007. Т. 41. - № 2. С. 369-380.

42. Коршунов А.Г., Шишкина JI.B., Голанов A.B. Пролиферативные маркеры в менингиомах: иммуногистохимическое исследование и анализ прогностической значимости//Архив патологии.-2002,-Вып. 64.- №1.-С. 29-33.

43. Крутовских В.А. Роль нарушений межклеточных щелевых контактов в генезе рака и других патологических состояний. // Архив патологи, 2000. Т.62. - вып.1. - С. 3-7.

44. Кузьмин C.B., Липатов Г.Д. Канцерогенная опасность в различных отраслях промышленности. Сборник научных трудов Всероссийского симпозиума», 6-7 декабря 2005г. Екатеринбург, 2005. -35 с.

45. Летягин В.П. Первичные опухоли молочной железы. М.: «Миклош», 2004.- 332 с.

46. Лихтенштейн A.B. Генодиагностика рака: проблемы, достидения и перспективы. // Российский биотерапевтический журнал, 2007. Т.6. -№1.-С. 5.

47. Майстренко H.A., Шейко С.Б., Алентьев A.B., Азимов Ф.Х. Холангиоцелюллярный рак (особенности диагностики и лечения). // Практическая онкология, 2008. Т. 9. - № 4. - С. 229-235.

48. Манзюк Л.В. Холангиоцелюллярный рак печени / Руководство по химиотерапии опухолевых заболеваний под ред. H.H. Переводчиковой. Практическая медицина, 2005. С. 248-249.

49. Мушкамбаров А.Н., Кузнецов С.Л. Молекулярая биология. М.:МИА, 2003.-544 с.

50. Новик A.A., Камилова Т.А., Цыган В.Н. Введение в молекулярную биологию канцерогенеза. М. ГОЭТАР-МЕД, 2004. 224 с.

51. Овчаров Е.А., Долгинцев В.К. Мамонов Ю.П., Борш Е.Е. Многофакторная модель заболеваемости с временной утратой трудоспособности нефтяников Западной Сибири. // Тюменский мед.журнал, 2000. № 1. - С. 37-39.

52. Озерецковская H.H., Бычков В.Г., Скареднов Н.И. Клинико-морфологическая классификация описторхоза. // Мед. Паразитология и паразит. Болезни, 1985. № 5. - С. 8-11.

53. Пальцев М.А. (ред.) Введение в молекулярную медицину. М.М., 2004. 496 с.

54. Пальцев М.А. Заболевание органов пищеварения при хроническом описторхозе. Новосибирск, 1996. - 171 с.

55. Пальцев М.А. (ред.) Молекулярная медицина: достижения и перспективы. // Молекулярная медицина, 2004. № 4. - С. 3-8.

56. Пальцев М.А., Коган Е.А. Молекулярная патология: проблемы, достижения и перспективы. // Матералы III пленума Президиума Российского Общества патологоанатомов, 2007. № 3 (61). -С.3-8.

57. Пальцев М.А (ред.) Патология. М., 2007. Т. 1. - 280 с.

58. Пальцев М.А., Киселев В.П., Муйжнек E.JI. Молекулярные мишени в профилактике и лечении гиперплазии и рака предстательной железы. М., 2009.-484 с.

59. Пожарисский K.M., Леенман Е.Е. Значение иммуногистохимических методик для определения характера лечения и прогноза опухолевых заболеваний//Архив патологии. -2000.-Вып. 5.-С. 311.

60. Полак Дж., Ван норден С. Введение в иммуногистохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987.-С. 34-98.

61. Полякова В.А. Современная гинекология. Тюмень, 2004.604с.

62. Принципы, правила и процедуры, используемые МАИР при оценке риска канцерогенности для различных факторов. // Вопросы онкологии, 2007. Т. 53. - № 66. - С. 621-641.

63. Розен В.Б. Основы эндокринологии: 3-е издание. М: Изд-во МГУ, 1994.-384 с.

64. Рыбников В.И. Описторхоз как вероятный фактор риска заболевания раком женских половых органов. / Акутальные проблемы описторхоза. Томск, 1986.-С. 105-106.

65. Рыбников В.И. Эпидемиология рака женских половых органов в Западной Сибири. Томск: Изд. ТГУ, 1987. - 199 с.

66. Сейц И.Ф., Князев П.Г. Молекулярная онкология. JI.M., 1986. -352 с.

67. Семиглазов В.Ф., Веснин А.Г., Моисеенко В.М. Минимальный рак молочной железы.СПб.: Гиппократ, 1992.- 240 с.

68. Семиглазов В.Ф. Современные подходы к гормонотерапии рака молочной железы как отражение патогенеза заболевания//Вопросы ОНКОЛОГИИ.-2ОО 1 .-Т.47.-С. 195-199.

69. Соловьева A.B. Хронический описторхоз и беременность. Руководство для врачей. М. ГОЭТАР-МЕДИА., 2007. 128 с.

70. Справочник Видаль. Лекарственные препараты в России. М.: АстраФармСервис. 2006.-268 с.

71. Трапезников H.H., Соловьев Ю.Н., Шингарова Г.Х. Методологические вопросы изучения онкогенеза. М., 1988. — 207 с.

72. Упоров A.B., Семиглазов В.Ф., Пожарисский K.M. Иммуногистохимическое изучение клеток рака молочной железы с использованием различных маркеров пролиферации//Архив патологии.-2000.-Вып.2.-С.26-30.

73. Упоров A.B., Цырлина Е.В., Пожарисский К.М.//Вопросы онкологии-1998-№3 .-С.316-324.

74. Урываева И.В. Репликативный потенциал гепатоцитов и стволовые клетки печени. // Известия академии наук. Серия биологическая, 2001. № 6. - С. 728-737.

75. Хансон К.П. «Ген erbB2 (HER2/neu): от открытия до клинического использования» // Вопросы онкологии.-2002.-Т.48.-№2.-С. 137-145.

76. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. 2 изд. М., 2002. 536 с.

77. Хамидуллин Р.И., Вылегжанин Н.И. К вопросу о связи между описторхозом и первичным раком печени. // Казанский мед. журнал, 1977. -№1.- С. 67-69.

78. Херрингттон С., Макги Дж. Молекулярная клиническая диагностика. Методы. М.: «Мир», 1999.- 558 с.

79. Хрущов Н.Г., Фактор В.М., Урываева И.В., Чернышова Э.В. Стволовые кроветворные клетки в интактной и регенерирующей печени взрослых мышей. // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1977. №2. — С. 209-210.

80. Щлычков A.B., Дроздов В.Н., Черба А.Р. Опыт успешного лечения висцеральной патологии при ассоциированном описторхозе в эндемичном очаге инвазии. / Российский съезд врачей -инфекционистов: IV: Материалы. Санкт-Петербург, 2003. С. 440-441.

81. Щипков В.П., Кривошеина Г.Н. Общая и медицинская генетика. М. «Академия», 2003. — 256 с.

82. Шайн A.A. Общая онкология. Тюмень.: «Поиск», 2003. Т.1. -310 с.

83. Шайн A.A. Рак органов пищеварения. М.: «Скорпион». 2000. 386 с.

84. Шайн A.A. Онкология. Тюмень: «Академия», 2004.-544 с.

85. Шайн A.A., Рыбка А.Г., Собянина Т.А. Влияние описторхозной инвазии на скорость роста опухоли в эксперименте // Актуальные проблемы описторхоза. — Томск, 1985. С. 77-79.

86. Шашова Е.Е. Ферменты метаболизма эстрогенов и их рецепторы при раке молочной железы: Автореф. дис. .канд.мед.наук.Томск, 2007.-20 с.

87. Широкий В.П. Сывороточный HER-2/neu у больных первчным раком молочной железы: Автореф. дис. .канд.мед.наук. М., 2007.-22 с.

88. Цырлина Е.В., Бернштейн JI.M. Рецепторы гормонов как основное звено гормонотерапии опухолей/ Гормонзависимые опухоли: Материалы IX Всероссийской конференции. /Под ред. К.П. Хансона,- 185

89. В.И. Чиссова. СПб. -2002. -С.82-86.

90. Юдаев Н.А. (под ред.) Биохимия гормонов и гормональной регуляции. М., 1976.- 380 с.

91. Agoff S.N., Swanson Р.Е., Linden Н., Hawes S.E., Lawton T.J. Androgen receptor expression in estrogen receptor-negative breast cancer. Immunohistochemical, clinical, and prognostic associations//Am. J. Clin.Pathol-2003-Vol. 120 (5).- P.725-731.

92. Al-Ahwal M.S. HER-2 positivity and correlations with other histopathologic features in breast cancer patients—hospital based study//J.Pak.Med.Assoc-2006.-Vol. 56(2).-P.65-68.

93. Albain K.S., Allred D., Clark G.M. Breast cancer outcome and predictors of outcome: are there age differentials?//Natl. Cancer Inst. Monogr-1994.-Vol. 16.-P. 35-42.

94. Ali I.U., Campbell G., Lidereau R., Callahan R. Lack of evidence for the prognostic significance of c-erbB-2 amplification in human breast carcinoma//OncogeneRes. -1988.-Vol. 3(2).-P. 139-146.

95. Allred D.C., Harvey J.M., Berardo M., Clark G.M. Prognostic and predictive factors in breast cancer by immunohistichemical analysisV/Mod. Path. -1998-Vol.l 1.- P. 155-168.

96. Almasri N.M., A1 Hamad M. Immunohistochemical evaluation of human epidermal growth factor receptor 2 and estrogen and progesterone receptors in breast carcinoma//Breast Cancer Res.-2005.-Vol.7(5)-P.598-604.

97. American Joint Committee on Cancer Stading New York. -Springer - Verlag, 2005. - P. 1-150.

98. Bai X.Z., Masters J.R., O'Donoghue N. et al. Prognostic markers in clinically localised prostate cancer//Int. J. Oncol.- 1999.-Vol. 14.-P. 785791.

99. Bhamapravanti N., Thamavit W. Animal studies on liver fluke investation, dimethylnitrosamin and bile duct carcinoma (letter). // Lancet. — 1978. Vol. 1. - № 8057. - P. 206-207.

100. Bhamapravanti N., Thamavit W., Vajra Sthrira S Liver changes in hamsters infected with a liver fluke of man, Opisthorchis viverrini // Amer. J. Trop. Med. Hyg., 1978. - Vol. 27. - №4. - P. 787-794.

101. Bartlett J.M.,Going J.J., Mallon E.A., et.al. Evaluating HER-2/neu amplification and over-expression in breast cancer//J. Pathol.-2001-Vol. 195(4).-P. 422-428.

102. Bartlett J.M., Forsyth A. Detection of HER-2 gene amplification by fluorescence in situ hybridization in breast cancer//Methods Mol. Med.-2006. -Vol. 120.-P. 309-322.

103. Barlett J.M., Going J.J., Mallon E.A. et al. Evaluating liER-2/neu amplification and over-expression in breast cancer//J. Pathol.- 2001.-Vol. 195(4).-P. 422-428.

104. Beato M., Chalepakis G., Schauer M., Slater E.P. DNA regulatory elements for steroid hormones//J. Steroid Biochem.- 1989.- Vol. 32(5).- P.737-747.

105. Berger J., Wagner J.A. Physiological and therapeutic roles of peroxisome proliferator-activated receptors//Diabetes Technol.Ther.- 2002.-Vol. 4(2).-P. 163-174.

106. Bernoux A., de Cremoux P., Laine-Bidron C et al.Estrogen receptor negative and progesterone receptor positive primary breast cancer:pathological characteristics and clinical outcome//Breast Cancer Res. Treat-1998-Vol. 49(3).-P. 219-225.

107. Bjorkhem-Bergman L., Torndal U.B., Eken S. et al. Selenium prevents tumor development in a rat model fur chemical carcinogenesis // Carcinogenesis, 2005.-P. 125-131.

108. Bose S., Mohammed M., Shintaku P., Rao P.N. HER-2/neu gene amplification in low to moderately expressing breast cancers: possible role of chromosome 17/HER-2/neu polysomy//Breast J.-2001 .-Vol.7(5). -P.337-344.

109. Braun N., Papadopulos T., Muller-Hermelink H.K. Cell cycle dependent distribution of the proliferation-associated Ki-67 antigen in human embryonic lung cells//Virchows Arch.B.Cell.Pathol.-1988.-Vol. 56.-P. 25-33.

110. Bruno S., Darzynkiewicz Z. Cell cycle dependent expression and stability of the nuclear protein detected by Ki-67 antibodies in HL-60 cells//Cell. Prolif. -1992.-Vol. 25- P. 31-40.

111. Brys M., Wojcik M., Romanowicz-Makowska H., Krajewska W.M. Androgen receptor status in female breast cancer: RT-PCR and Western blot studies// Cancer Res.Clin.Oncol.- 2002.- Vol. 128(2).-P. 85-90.

112. Cboi B.I., Han J.K., Hong S.T. et al. Clonorchiasis and cholahgiocarcinoma: etiologic relationsip and imaging diagnosis // Clinical Microbiology Reviews, 2004. Vol. 17, №3. - P. 540-552.

113. Chariyalertsak S., Chariyalertsak S., Ruangvejvorachi P. Immunohistochemical detection of estrogen and progesterone receptors inprimary breast cancer//Asian Pac.J. Allergy Immunol.-1998.-Vol. 16(4).-P. 161-166.

114. Chelsky D., Ralph R., Jonak G. Sequence requirements for synthetic peptide- mediated translocation to the nucleus//Mol. Cell. Biol.-1989-Vol. 9.-P. 2487-2492.

115. Chen Y.Y., Schnitt S.J. Prognostic factors for patients with breast cancers 1cm and smaller//Breast Cancer Res Treat.-1998.-Vol. 51(3).-P. 209-225.

116. Choi D.H., Kim S., Rimm D.L. et al. Immunohistochemical biomarkers in patients with early-onset breast carcinoma by tissue microarray//Cancer. J-2005.-Vol. 11(5).-P. 404-411.

117. Clary B., Jarnigan W., Pitt H. et al. Hilar cholangiocarcinoma // Gastrointest., 2004. Vol. 8. - №3. - P. 298-302.

118. Cobleigh M.A., Tabesh B., Bitterman P. et al. Gene expression and prognosis in breast cancer patients with 10 or more positive lymph nodes//Clin. Cancer Res.- 2005 .-Vol. 11.-P.8623-8631.

119. Coscun H.S., Altinbas M. et.al. HER2 expression in Turkisch breast cancer patients from a single center// Breast Cancer. -2000. -Vol.11. -P. 41.

120. Costarelli L., Piro F.R., Fortunato L. Hormone-dependence and C-ERBB2: relationship between estrogen receptor expression, estrogen-regulated proteins, and C-ERBB2 in breast carcinoma//Suppl Tumori.- 2005.-Vol. 4.-P. 171.

121. Costarelli L., Piro F.R., Fortunato L. Predictive variables of lymphatic metastasis in breast carcinoma with a diameter below 2 cm//Suppl Tumori-2005.-Vol. 4.-P. 172.

122. De Groen P.C., Gores G.J., LaRusso N.F. et al. Biliary Tracts Cancers//N. Engl. J. Med., 1999. Vol. 341. -№> 18. -P. 1368-1378.

123. Dingwall C. Transport across the nuclear envelope: enigmas, and explanations//Bioessays.-1991 -Vol. 13.-P.213-218.

124. Dinny J.Graham, Christine L. Clarke. Physiological action os progesterone in target tissues// Endocrine Reviews. -Vol. 18. №4. -1997- P. 502-514.

125. Dotzlaw H, Alkhalaf M, Murphy LC. Characterization of estrogen receptor variant mRNAs from human breast cancers//Mol. Endocrinol. 1992-Vol. 6(5).-P. 773-785.

126. Duchrow M., Gerdes J., Shluter C. The proliferation -associated Ki-67 protein: definition in molecular terms// Cell. Prolif.-1994.-Vol. 27.-P. 235-242.

127. Duchrow M, Schmidt MH, Zingler M, Anemuller S, Bruch HP, Broil R. Suppression of cell division by pKi-67 antisense-RNA and recombinant protein// Cell. Physiol. Biochem. 2001.-Vol. 11(6).-P. 331-338.

128. Duffy MJ. Biochemical markers in breast cancer: which ones are clinically useml?// Clin. Biochem.-2001.-Vol. 34(5).-P. 347-352.

129. Du Manoir S., Guillaud P., Camus E. et al. Ki-67 labelling in postmitotic cells defines different Ki-67 pathways within the 2c compartment//Cytometry. -1991.- Vol.12.- P.455-463.

130. Edwards B.K., Brown M.L., Wingo P.A. et al. Annual Report to the Nation on the Status of Cancer, 1975-2002, Featuring Population Based Trends in Cancer Teatment / J.N.C.I., 2005. - № 9. - P. 1407-1427.

131. Elledge R.M., Osborne C.K., Oestrogen receptors and breast cancer//Brit.Med.J. -1997. -Vol.314. -P. 1843-1844.

132. Factor V.M., Radaeva S.A., Thorgeirsson S.S. Origin and fate of oval cells in dipin-induced hepatocarcinogenesis in mice // Exp. Toxicol Pathol., 1993. Vol. 45. - P. 239-244.

133. Farnsworth W.E. Roles of estrogen and SHBG in prostate physiology// The Prostate. -1996. -Vol.28. -P. 17-23.

134. Fehm T., Maul H., Gebauer S. et al. Prediction of axillary lymph node status of breast cancer patients by tumorbiological factors of the primary tumor//Strahlenther Onkol. 2005.-Vol. 181,- P. 580-586.

135. Ferlay J., Bray F., Pisani P., Parkin D.M. Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide//Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and Female genital organs. Ed. By Tavassoli F.A.- 2003-TARCPress, Lyon.

136. Fitzgibbons P.L., Page D.L., Weaver D., Thor A.D. et al. Prognostic factors in breast cancer. College of American Pathologists Consensus Statement 1999//Arch. Pathol. Lab. Med.- 2000.-Vol. 124 (7).-P. 966-978.

137. Fonatsh С, Duchrow M., Rieder H. Assignment of the human Ki-67 gene (MK 167) to 10q25ter// Genomics-1991 .-Vol. 1 l.-P. 476-477.

138. Fuqua S.A. Where is the lesion in hormone-independent breast cancer?//J. Natl. Cancer Inst.-1992.-Vol.84.-P.554-555.

139. Gerdes J., Lemke Н., Baish Н et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-assosiated human nuclear antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67//J. Immunol.- 1984,-Vol. 133.-P. 1710-1715.

140. Gerdes J., Shwab U., Lemke H et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation/Ant. J.Cancer.-1983.-Vol.3l.-P. 3-20.

141. Hall R.E., Clements J.A., Birrell S.N., Tilley W.D. Prostate-specific antigen and gross cystic disease fluid protein-15 are co-expressed in androgen receptor-positive breast tumours//Br. J. Cancer.- 1998.- Vol. 78(3).-P. 360-365.

142. Hang D.H., Salto-Tellez M., Chin L.L. Tissue microarray study for classification of breast tumors//Life Sci.-2003.-Vol. 73 (25).-P.3189-3199.

143. Heidebrecht H.J., Buck F., Haas K. et al. Monoclonal antibodies Ki-S3 and Ki-S5 eield new data on the "Ki-67" proteins // Cell Prolif. -1996. -Vol.29. -P.413-425.

144. Henderson B.E., Feigelson H.S. Hormonal carcinogenesis //Carcinogenesis. 2000.-Vol.21. (3).-P. 427-433.

145. Hiipaka R.A., Liao S. Molecular mechanism of androgen action//Trends in Endocrinol. Metab-1998. -Vol.9. -P.317-324.

146. Hilakivi-Clarke L. Estrogens, BRCA1, and breast cancer//Cancer Res.-2000.-Vol. 60 (18).-P. 4993-5001.

147. Hiort O., Naber S.P. et al. The role of androgen receptor gene mutations in male breast carcinoma//J. Clin. Endocrinol. Metab.-1996.-Vol. 81(9).-P. 3404-3407.

148. Hlupic L., Jakic-Razumovic J., Bozikov J. Prognostic value of different factors in breast carcinoma//Tumori.-2004.-Vol. 90 (l).-P. 112-119.

149. Honma N., Sakamoto G., Akiyama F., Esaki Y. et al. Breast carcinoma in women over the age of 85: distinct histological pattern and androgen, estrogen and progesterone receptor status//Histopathology -2003.-Vol.42(2).-P. 120-127.

150. Ing N.H., Tsai S.Y.,Tsai M.J. Progesterone and estrogen. In: Gwatkin R.B.L.,ed. Genes in mammalian reproduction. New York: Wiley-Liss.-1992.-P. 271-291.

151. Jansen R.L., Hupperets P.S., Arends J.W. et al. MIB-1 labelling index an independent prognostic marker in primary breast- 193 cancer//Brit. J. Cancer.-1998.-Vol.78.-P.460-465.

152. James J.J., Evans A.J., Pinder S.E. et al. Bone metastases from breast carcinoma: histopathological radiological correlations and prognostic features//Br. J. Cancer.- 2003.-Vol.89.-P.660-665.

153. Jensen M.L., Kiaer H., Andersen J. et al. Prognostic comparison of three classifications for medullary carcinomas of the breast//Histopathology.- 1997.-Vol. 30(6).-P. 523-532.

154. Kato S., Masuhiro Y., Watanabe M. et al. Molecularmechanism of a cross-talk between oestrogen and growth factor signaling pathways//Genes Cells.- 2000- Vol.5 -P.593-601.

155. Kettyle W.M., Alky P.A. Endocrine Pathophysiology.-2001.-Binom Publishers,N-Y.-P.241.

156. Keshgegian A.A., Johnston E., Cnaan A.et al. Bcl-2 oncoprotein positivity and high MIB-1 (Ki-67) proliferative rate are independent predictive markers for recurrence in prostate carcinoma//Amer. J. Clin. Pathol.-1998.-Vol. 110-P. 443-449.

157. Kim H.J., Cui X., Hilsenbeck S.G., Lee A.V. Progesterone receptor loss correlates with human epidermal growth factor receptor 2 overexpression in estrogen receptor-positive breast cancer//Clin. Cancer Res.-2006.-Vol.12-P. 1013-1018.

158. Knudson A.G. Hyman cancer genes / Genes, Chromosomes, and Neoplasia. / Eds. F.E. Arrighi et al. N.Y.: Press Raven, 1981. P. 453 - 462.

159. Knudson A.G. Mutation and cancer // Proc. Nat. Acad. Sci., 1971.-Vol. 68.-820-823.

160. Koda M., Sulkowski S., Kanczuga-Koda L. Expression of ERalpha, ERbeta and Ki-67 in primary tumors and lymph node metastases in breast cancer//Oncol.Rep.-2004.-Vol. 1 l(4).-P.753-759.

161. Kronqvist P., Kuopio T., Nykanen M., Helenius H. Predicting aggressive outcome in T1N0M0 breast cancer/ZBr. J. Cancer-2004.-Vol. 91 (2)-P. 277-281.

162. Kun Y., How L.C., Hoon T.P. Classifying the Estrogen receptor Status of Breast Cancer by Expression Profiles Reveales a poor Prognosis Subpopulation Exhibiting High Expression of the ERBB2 Receptor//Hum. Mol. Genet.-2003.-Vol. 69(3). P. 387-399.

163. Kurokawa H., Arteaga C.L. Inhibition of cerbB receptor (HER) tyrosine kinases as a strategy to abrogate antiestrogen resistance in human breast cancer // Clin. Cancer Res. -2001. -Vol.7 (12 Suppl.). -P. 4436-4442.

164. Lamovec J., Bracko M. Metastatic pattern of infiltrating lobular carcinoma of the breast: an autopsy study// J. Surg. Oncol.- 1991.- Vol. 48 (1).-P. 28-33.

165. Liehr J.G. Hormone-associated cancer: mechanistic similarities between human breast cancer and estrogen-induced kidney carcinogenesis in hamsters//Environ. Health Perspect.-1997.-Vol. 105.-P. 565-569.

166. Lin V.C., Thai W.C., Eng A.S. Distinct molecular Pathways Mediate Progesterone-Induced Growth Inhibition and Focal Adhesion/ZEndocrinology. 2003-Sept. 11. -P.237-250.

167. Magaud J.P., Sargent I., Clarke P.J. et al. Double immunocytochemical labeling of cell and tissue samples with monoclonal anti-bromdeoxyuridine//J. Histochem. Cytochem. -1989. -Vol.37. -P. 15171527.

168. Maier W.P., Rosemond G.P., Goldman L.I. A ten year study of medullary carcinoma of the breast//Surg.Gynecol.Obstetric.-1977.-Vol.144(5).-P. 695-698.

169. McGuire W.L. Steroid receptors in human breast cancer//Cancer Res-1978.-Vol. 38.-P. 4289-4291.

170. Mochen C, Giardini R., Costa A., Silvestrini R. MIB-1 and S-phase cell fraction predict survival in non-Hodgkin's lymphomas//Ceil. Prolif-1997-Vol. 30(1).- P.37-47.

171. Moinfar F., Okcy M., Tsybrovskyy O. et al. Androgen receptors frequently are expressed in breast carcinomas: potential relevance to new therapeutic strategies//Cancer-2003.-Vol. 98(4).- P. 703-711.

172. Mora G.R., Tindall DJ. Activation of androgen receptor// Prostate Cancer. Biology, Genetics, and the New Therapeutics//Eds L.W.K.Chunget et al-Totowa; New Jersey 2001.-P.219-239.

173. Munoz de Tor o M.M., Maffini M.V., Kass L., Luque E.H. Proliferative activity and steroid hormone receptor status in male breast carcinoma//J. Steroid Biochem.Mol. Biol.- 1998.-Vol.67(4).-P.333-339.

174. Murphy C.E., Carder P.S., Landsdown H.R., Speirs V. Steroid hormone receptor expression in male breast cancer// Eur. J.Surg. Oncol.-2006.-Vol. 23(1).-P. 44-47.

175. Nakaj ima M., Sawada H., Yamada Y. et al. The prognostic significance of amplification and overexpression of c-met and c-erbB2 in human gastric carcinomas.// Bid.-1999.-Vol.85.-P. 1894-1902.

176. H.Nakanishi H., Oshawa M., Naka N. et al. Immunohistochemical detection of bcl-2 and p53 proteins and apoptosis in soft tissue sarcomas: their correlations withprognosis.//Oncology.-1997.-Vol.54.-P.23 8-244.

177. Nicholson R.I., McClelland R.A., Gee J.M. et al. Epidermal Growth factor receptor expression in breast cancer: association with response to endocrine therapy/ZBreast Cancer Research and Treatment.-1994.-Vol. 29.-P.l 17-125.

178. Nixon A.J., Neuberg D., Hayes D.F., Gelman R. et al. Relationship of patient age to pathologic features of the tumor and prognosis for patients with stage I or II breast cancer//J.Clin.Oncol.-1994.-Vol.l2(5).-P.888-894.

179. Nizze H.,al-Thobhani A.K., Terpe H. Steroid hormone receptor status and other immunohistichemical prognostic markers in benign and malignant diseases of the breast//Zentrabl Chir. -1998. -Vol.123. -Suppl.15. -P.14-18.

180. Nordstrom B., Strang P., Bergstrom R. et al. A comparison of proliferation markers and their prognostic value for women with endometrial carcinoma//Cancer (Philad.).-1996.-Vol. 77. -P. 1041-1052.

181. Parkin D.M., Bray F., Ferlay J., Pisani P. Estimating the world cancer burden: Globocam 2000//Int. J. Cancer.-2001.-Vol. 94.-P. 153-156.

182. Papantoniou V.J., Souvatzoglou M.A., Valotassiou VJ.et al., Relationship of cell proliferation (Ki-67) to 99mTc-(V)DMSA uptake in breast cancer// Breast Cancer Res.-2004.-Vol. 6(2).-P. 56-62.

183. Pasquali R., Vicennati V., Gambineri A., Pagotto U. Hormones and pathophysiology of obesity//Eat.Weight Disord.- 2001.-Vol. 6.-P.9-20.

184. Perez E.A. HER-2 as a prognostic, predictive, and therapeutic target in breast cancer.//CancerControl.-1999.-Vol.6.-P.233-240.

185. Persons D.L., Tubbs R.R., Cooley L.D. et al. HER-2 fluorescence in situ hybridization: results from the survey program of the College of American Pathologists//Arch. Pathol. Lab. Med.- 2006.- Vol.130.- P.325-331.

186. Pich A., Margaria E., Chiusa L., Candelaresi G. et al. Androgen receptor expression in male breast carcinoma: lack of clinicopathological association//Br. J. Cancer.-1999.-Vol.79.-P.959-964.

187. Prati R., Apple S.K.Histopathologic characteristics predicting HER-2/neu amplification in breast cancer//ZBreast J.-2005.-Vol.l 1.-P.433-439.

188. Robertson J.F., Cannon P.M., Nicholson R.I., Blarney R.W. Oestrogen and progesterone receptors as prognostic variables in hormonally treated breast cancer//Int. J. Biol. Markers. -1996. -VoL. 1 (1).- P.29-35.

189. Rochefort H., Platet N., Hayashido Y., Derocq D. et al. Estrogen receptor mediated inhibition of cancer cell invasion and motility: an overview// Steroid Biochem. Mol. Biol. -1998.-Vol. 65 (l-6).-P. 163-168.

190. Rose D.S., Maddox P.H., Brown D.C. Which proliferation makers for routine immunohistology? A comparison of five antibodies//J. Clin. Path.-1994. -Vol. 47.-P. 1010-1014.

191. Roskell D.E., Buley I.D. Traditional and estsblished indicators of prognosis and treatment success//Methodes Mol. Med.- 2006.-Vol.120.- P.79-89.

192. Ross J.S., Fletcher J.A. The HER-2/neu oncogene in breast cancer: prognostic factor, predictive factor and target for therapy .//Stem Cells.-1998.-Vol. 16-P. 413-442.

193. Rubin J., Jarden Y. The basic biology of HER-2/neu // Annals of oncology. -2001.- Vol.12.-P. 9-13.

194. Rusiecki S.A., Holford T.R. et al. Breastcancer risk factors according to joint estrogen receptor and progesterone receptor status//Cancer Detect.Prev-2005.-Vol. 29(5).-P.419-426.

195. Santen R.J., Manni A., Harvey H., Redmond C Endocrine treatment of breast cancer in women//Endocr.Rev.- 1990.-Vol.1 1(2).- P.221-265.

196. Scawn R., Shousha S. Morphologic spectrum of estrogen receptor-negative breast carcinoma//Arch. Pathol. Lab. Med.-2002.-Vol.126.-P. 325330.

197. Schonk D.M., Kuijpers H.J., van Drunen E., van Dalen C.H. et al. Assignment of the gene(s) involved in the expression of the proliferation-related Ki-67 antigen to human chromosome 10//Huin.Genet.-1989.-Vol.83(3).-P. 297-299.

198. Schlatter L.K., Howard K.J., Parker M.G., Distelhorst C.W. Comparison of the 90-kilodalton heat shock protein interaction with in vitro translated glucocorticoid and estrogen receptors//Mol Endocrinol.- 1992,-Vol. 6.-132-140.

199. Selim A.G., El-Ayat G., Wells C.A. Androgen receptor expression in ductal carcinoma in situ of the breast: relation to oestrogen and progesterone receptors//J. Clin. Pathol.- 2002,- Vol. 55(1).- P. 14-16.

200. Sengupta S., Wasylyk B. Physiological and pathological consequencesof the interactions of the p53 tumor suppressor with theglucocorticoid, androgen, and estrogen receptors//Ann.N-Y.Acad.Sci.-2004.-Vol. 1023 -P. 54-71.

201. Sholzen T., Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown//Cell Physiol.-2000.-Vol. 182.-P. 311 -322.

202. Silver P.A. How proteins enter the nucleus//Cell.- 1991.- Vol. 64.-P. 489-497.

203. Siddigue M.M., Balram Ch., Fiszer-Maliszewska L. et al. Evidence for Selektive Expression of the p 53 Codon 12. Polymorphs: Inplication in cancer Development./ Cancer Epidemiology Biomarkers and Prevention, 2005.-№9.-P. 2245-2252.

204. Sjogren S., Inganas M., Lindgren A. et al. Prognostic and predictive value of c-erbB2 over expression in primary breast cancer alone and combination with other prognostic markers.//J. Clin. Oncol.-1998.-Vol.16.-P.462-469.

205. Slamon D.J.,Godolphin W., Jones L.A. Studies of HER-2/neu proto-oncogen in human breast ovarian cancer.//Science.- 1989.-Vol. 244.-P. 707-712.

206. Slamon D., Pegram M. Rationale for trastuzumab (Herceptin) in adjuvant breast cancer trials//Semin. 0ncol.-2001.-Vol.21 .-P. 13-19.

207. Tsai S.Y., Carlstedt-Duke J., Weigel N.W. Molecular interactions of steroid hormone receptor with its enhancer element: evidence for receptor dimmer formation//Cell.- 1998.-Vol. 55.-P. 361-369.

208. Van Dierendock J.H., Keijzer R., van de Velder C.J. et al. Nuclear distribution of the Ki-67 antigen during the cell cycle: comparison with growth fraction in human breast cancer cells//Cancer Res.- 1989.-Vol. 49.-P. 29993006.

209. Van Oijen M.G., Medema R.H., Slootweg P.J.et al. Positivity of the proliferation marker Ki-67 in non-cycling cells//Amer. J. Clin.Path.- 1998. -Vol. 110.- P.24-31.

210. Verheijen R., Kuijpers H.J.H.,van Dier R.et al. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related antigen. Localization in mitotic cells and association with chromosomes//J. Cell Sci. -1989 Vol. 92. -P. 531540.

211. Watanapa P., Watanapa W.B. Liver Fluke-associated cholahgiocarcinoma // Br. J. Surg. 2002. - Vol. 89. - Aug. - P. 962-970.

212. Wang D., Konifhi J., Koshiyama M. et al. Expression of c-erbB2 protein and epidermal growth factor receptor endometrial carcinomas. Correlation with clinicopathological and steroid receptor status // Cancer-1993-Vol 72. -P.2628-2637.

213. WHO. Pathology and Genetics of Tumors of the Breast and Female genital organs. Ed. By Tavassoli F.A.-2003.-IARCPress, Lyon.

214. Xu L., Bai Z.H., Xu R.C., Yan H. et al. Expressions of Her-2, EGFR, PS-2 and ER in breast cancer and their clinical implications// Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.-2006.-Vol. 26.-P. 231-233.

215. Yue W, Santen RJ., Wang JP, Li Y. Genotoxic Metabolites of estradiol in breast: potential mechanism of estradiol induced carcinogenesis// J. Steroid Biochem.Mol.Biol- 2003. -Vol. 86(3-5). -P. 477-486.

216. Yamashita H.m, Yandj Y., Nishio M. Immunohistochemical evaluation of hormone receptor status for predicting response to endocrine therapy in mestatatic breast cancer //ZBreast Cancer.-2006.-Vol. 13(1).-P. 7483.

217. Yamauchi H., Steams V., Hayes D.F. When is a tumor marker ready for prime time? A case study of c-erbB-2 as a predictive factor in breast cancer// J. Clin. Oncol.-2001.-Vol. 19(8).-P. 2334-2356.

218. Zarghami N., Grass L., Diamandis E.P. Steroid hormone regulation of prostate-specific antigen gene expression in breast cancer // ZBr. J. Cancer.-1997.-Vol. 75(4). -P. 579-588.f)

219. Zhou D., Battifora H., Yokota J., Yamamoto T. et al. Association of multiple copies of the c-erbB-2 oncogene with spread of breast cancer // Cancer Res.-1987.-Vol.47.-P. 6123-6125.

220. Zhou D.J., Ahuja H., Cline M. J. Proto-oncogene abnormalities in human breast cancer: c-ERBB-2 amplification does not correlate with recurrence of disease // Oncogene.-1989.-Vol. 4.-P. 105-108.

221. Zhu L., Loo W.T., Chen C.W., Chow L.W. Possible predictive markers related to micrometastasis in breast cancer patients //Oncol.Rep.-2006.-Vol. 15. -P. 1217-1223.

222. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Tamoxifen for early breast cancer, an overview of the randomised trials.// Lancet 1998, 351.-P. 1451-1467.

223. Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group (EBCTCG). Polychemotherapy for early breast cancer: an overview of the randomised trials. //Lancet 1998, 352. -P. 930-942.

Информация о работе

Сабиров, Ахат Халимович
доктора медицинских наук
Тюмень, 2010
ВАК 03.03.04

Диссертация

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ, ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИХ ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы