Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гистохимический иммуноферментный метод и реакция латексаагглбтинации в иммуердиагномтике адево- герпесвирусных инфекций

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Гистохимический иммуноферментный метод и реакция латексаагглбтинации в иммуердиагномтике адево- герпесвирусных инфекций"

ГОСУДАРСТВЕННАЯ КОМИССИЯ СОВЕТА МИНИСТРОВ СССР ПО ПРОДОВЭЛЬСТЕИЮ И ЗАКУПКАМ

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ КМ. К. И. СКРЯБИНА

Вз правах рукописи

ТРИ®Ш0В ЕалериЛ Дмитриевич

ГКСТОЛОИЧЕСКИЛ ИММУВОйгМЕНТЕЫИ МЕТОД И РЕАКЦИЯ ЛАТЕКСАГГЛЕТИНАЦИИ В ИММУВОДКАГЮСТИКЕ АДЕВЭ-И ГЕРШХЖРУСШХ ШКЗШЙ.

оасаоб - вдрусодогая

Автореферат диссертация на соискание ученок степени казддата биологичмких наук

Москва 1990

Работа выполнена в Московской ордена Трудового Красного

Знамени ветеринарной академии ни. К. К. Скрябина.

)

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук КАРЕЛИН В. Е

Официальные оппонент

Доктор биологкчесгас наук, профессор ВОРОНИН Б. С.

Кандидат бпологичеаза наук j^>Eîoa\ А. Ф.

Ведущая организация - Всесоюзный Ордене. Ленина научно-

исследовательский институт экспериментальной

ветеринарии m Р. Я. Ковалев.

Защита состоится '_"_1990 г.

в часов на заседании специализированного совета К-120.36.05 по присуааению ученой степени кандидата наук в Ыэскогсков ветеринарной академии им. К. 'А. Скрябина по адресу: 109472, Москва, ух Академика Скрябина, 23.

С диссертацией модно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослал "___10аО г.

Ученый секр^арь специализированного совета Федосеева Т.Е

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Развитие промышленного животноводства обострило проблему так называемых "малых вирусных инфекций" крупного рогатого скота, к которым относятся заболевания, вызываемые аденовирусами (АдКРС), вирусом'инфекционного ринотрахеита (вИРТ), вирусом парагриппа-3 (ПГ-З), рота- и тогавирусами. Высокая конта-гиозность, разнообразие путей передачи инфекции, экономический ущерб, наносимый этими заболеванями - все это потребовало разработки методов их диагностики и профилактики. АдКРС и вИРТ играют значительную роль в этиологии инфекционных заболеваний крупного рогатого скота в условиях промышленного животноводства Заболевания, вызываемые аденовирусами, приводят к снижению привесов и часто служат "входными воротами" для других инфекций. Вирус ИР7 вызывает тяжелые респираторные заболевания животных, а также способен передаваться через сперму быков-производителей, являясь одной из причин абортов и яловости коров.

Принятые в практике ветеринарии методы иммунодиагностики АдКРС и вИРТ не могут в полной мере удовлетворить потребности современной ветеринарной вирусологии и эпизоотологии.

Необходимость разработки новых методов обнаружения вирусов во внешней среде отражена в задании 22Н1 всесоюзной научно-технической программы 0. 74. 05 на 1985-1990 г.

Цель работы состояла в разработке -методов обнаружения антигенов АдКРС и вИРТ и антител к ним на основе гистохимического им-муноферментного метода (гИФМ) и реакции латексагглютинации (РЛА). В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи исследования:

1. Разработать метод выделения и очистки в препаративных количествах основного структурного белка АдКРСЗ - гексона как антигена, перспективного для иммунодиагностики АдКРС. Выбрать схему иммунизации и получить гипериммунные сыворотки к гексону и вирио-нам АдКРСЗ и вИРТ.

2. Разработать гИФМ обнаружения антигенов АдКРС и вИРТ в инфицированных клетках, провести его сравнение гИФМ с традиционными методами (иммуноферментный анализ - ИФА, реакция иммунофдуорее-ценшш - РИФ) обнаружения вирусных антигенов и с методом обнаружения вирусной ДНК в инфицированных клетках (точечная молекулярная гибридизация - тМГ) и изучитиь возможности использования гИФМ в качестве метода экспресс-диагностики вирусных заболеваний, вызываемых АдКРС и вИРТ.

о

- -

3. Разработать метод обнаружения антител к АдКРС и бИРТ на основе реакции латексагглотинации (РЛА) с использованием окрашенных полиакролеиновых латексов и провести сравнение PJÎA с ИФА, реакцией непрямой гемагглютинации (РИГА) и реакцией нейтрализации (РН).

4. Разработать основы технологии производства РЛА-диагности-кума для обнаружения антител к вИРТ.

Научная новизна работы: Разработан и применен метод выделения и очистки гексона АдКРСЗ на основе гидрофобной и эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий получать очищенный гексон АдКРСЗ в препаративных количествах.

Разработан гистохимический иммуноферментный метод обнаружения антигенов АдКРС и вИРТ в инфицированных клетках. Проведена оптимизация техники постановки анализа и интерпретации результатов.

Разработан способ получения латексных частиц, сенсибилизированных антигенами АдКРС и вИРТ. Разработан метод обнаружения антител к АдКРС и вИРТ в сыворотках крови животных на основе реакции латексагглютинации.

Практическая ценность работы: ГИФМ может использован для экспресс-диагностики и ускоренной лкаг^остики АдКРС и вИРТ.

Метод обнаружения антител к АдКРС и вИРТ на основе реакции латексагглютинации рекомендован Главным управлением ветеринарии Государственной комиссии по продовольствию и закупкам СМ СССР к практическому использованию в ветеринарной практике. Разработана технология изготовления РЛА-диагностикума и подготовлена нормативно-техническая документация на его изготовление.. Материалы исследований внедрены в учебный процесс и на их основе проводятся практические занятия на' курсах повышения квалификации ветеринарных специалистов Московской ветеринарной академии.

. Апробация работы: Основные•положения диссертации изложены на конференциях молодых ученых МВД в 1987, 1988 и 1989 г., на отчетных научных конференциях МВА в 1987 и 1989 г. , на конференции мо-

лодых ученых социалистических стран б Г.Братислава (ЧССР.) в 1983 г., на Всесоюзном семинаре руководителей вирусологических отделов областных и республиканских ветеринарных лабораторий (г. Косино Моск. обл.) в 1989 г. и в 1990 г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 5 статей, имеется положительное решение на выдачу авторского свидетельство.

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 116 страницах, включая введение, обзор литературы, материалы и методы собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и приложения. Список использованной литературы включает 104 источника. Работа содержит 16 таблиц и 8 рисунков.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Объектом исследований были культуры клеток МОВК, Не'= и Тд, инфицированные АдКРС и вИРГ и культуральные жидкости инфицированных клеток, клетки носоглоточных срывов экспериментально зара-женнных АдКРС и вИРТ телят, гиксриммунные антисыворотки против АдКРС и вИРТ, сывогх^кй крови экспериментально зараженных телят и полевые сыв.г,-ро1ки крови КРС.

3 работе были использованы методы аффинной и гидрофобной хроматографии, гель-фильтрации, высокоэффективной жидкостной хроматографии, электрофореза в полиакриамидном геле, иммуноэлектро-фореза. Обнаружение вирусных антигенов проводили с использованием гистохимического иммуноферментного метода, реакции иммунофлуорес-ценции, твердофазного ИФА и иммуно з ле кт рофоре в а. Обнаружение антител к исследуемым вирусным антигенам проводили с использованием реакции латексагглютинации,. реакции непрямой гемагглютинации, твердофазного ИФА, реакции преципитации в геле и реакции нейтрализации.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Выделение и очистка гексона АдКРСЗ.

В литературе имеются указания на перспективность использования гексона аденовирусов в качестве антигена в иммунодиагностике аденовирусных инфекций.

Ранее сотрудниками лаборатории генной инженерии МВА было показано, что гексон АдКРСЗ может быть выделен из экстрактов инфицированных клеток или из культуральной жидкости инфицированных клеток методами гидрофобной хроматографии на фенил-сефарозе (ГХЗС) и ионообменной хроматографии. В наших исследованиях была использована ГХ$С, однако доочистку препарата гексона проводили методом зксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эВЭЖХ). Содержание гексона в получаемых препаратах определяли методами ИФА и имуноэлектрофореза.

Количественные характеристики использованного метода выделения гексона АдКРСЗ приведены в таблице 1.

Таблица 1

Количественные характеристики метода выделения гексона АдКРСЗ.

Препарат* Кол-во Гексон Очистка ' Процент

белка(мг) (мг) (раз) выхода

1 • 7840 20,5 1 160

2 20,4 17,3 333 87

3 17,0 17,0 363' 78

* 1 - исходная культуральная жидкость

2 - концентрат фракций после ГХ<К

3 - препарат гексона после эВЭЖХ

По своим характеристикам использованный метод выделения гексона АдКРСЗ не уступал описанным ранее и позволял получать прак-

гическк чистый препарат гексона АдКРС с высоким выходом.

Получение гипериммуниых антисывороток против

гексона АдКРСЗ, вирионов АдКРСЗ и вИРТ.

Выделенный гексон АдКРСЗ использовали для иммунизации кроликов и получения гипериммунных антисывороток по разработанной s лаборатории схеме иммунизации. Титр антител, определенный в РПГ составлял 1: 64 - 1:128.

Антисыворотки против вирионов АдКРСЗ и вИРТ имели титр антител против вирионоз АдКРСЗ в РПГ 1:32-1:64, в реакции нейтрализации - 1:320-1:640, а в ИМ 1:100 ООО - 1:200 ООО. Титр антител против вирионов вИРТ составлял в РПГ 1:4-1:8, в ИФА 1:25000-1:50000. Титр полученных антисывороток в РН составлял lî 80-1:160.

ИФА для определения антигенов АдКРСЗ и вИРТ.

Для обнаружения антигенов АдКРСЗ были разработаны две схемы ИФА - конкурентный и "сэндвич". При использовании в .качестве стандарта очищенного гексона АдКРСЗ чувствительность конкурентного ИФА составляла 25 нг/мл, а "сзндвич"-метода - 5 нг/мл.

Разработанный ИФА для обнаружения антигенов вИРТ в варианте "сэндвич" имел чувствительность 0,05-0,1 мкг/мл при использовании в качестве антигена очищенных вирионов вИРТ. Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными о 'низкой чувствительности "сэндвич"-метода при обнаружения вИРТ.

Чувствительность ИФА для обнаружения АДКРСЗ в пересчете на инфекционность вируса в образцах составила 10 ТЦД50/мл, что позволило обнаруживать АдКРСЗ практически во всех образцах лизатов инфицированных ?->тох и культуральной жидкости в ходе опыта. Чувствительность ИФА для обнаружения вИРТ составила ю'- 10 ТЦД50 /мл, и оказалась недостаточной для исследования всех образцов, поскольку такие значения титров инфекционности наблюдаются на поздних стадиях инфекции, рри проявлении цитопатического действия на (++) - (+++).

- 6 -

гИФМ для обнаружения в инфицированных клетках

антигенов АдКРС вИРТ.

исследования по разработке гИФМ были направлены на создание метода, который можно было бы применять при массовых обследованиях с использованием более доступной, чэм ааидин-биотиноьаа , систем детекции.

Учет результатов реакции осуществляли с помощью светового микроскопа, считая специфичэски окрашенные клетки иг общего количества 400 -500. Положительная реакций проявлялась в ввдо красно-бурого цитсплазматического и (или) внутриядерного окрашивания на обвдзм светлом фоне. В качестве контроля использовали препараты неинфицированных клеток, а также нормальную сыворотку кролика в тех же разведениях,что и иммунные сыворотки.

В клетках носовых смывов положительными считал:: пробы, в которых в поле зрения микроскопа обнаруживали 10 и более окрашенных клеток.

Разработку гИФМ проводили в нескольких модельных система: 1) МОВК - АДКРС1; 2) ЮВК -АдКРСЗ; 3) ШВК -вИРТ; 4) ТБ - АДНРС7; б) ТБ - вИРТ; 6) НеЬа - А(35;

Динамик/ роста числа специфически окрашенных в гИ<Ш ¡'.легок ИМ в инфицированной АдКРСЗ культуре изучали при низкой (2-5 тцдео/ 10*кл) и высокой (Б-10 ТЦЦ50/кл) мнокественностях заратэ-ния. Одновременно изучали: динамику роста числа специфически светящихся клеток в РИФ, динамику накопления гексока АдКРСЗ в лига-тах инфицированных клеток и культуральной жидкости методом ИФА, динамику накопления аденовирусной ДНК методом тМГ, проявление ци-топатического действия вирусов.

Были поставлены опыты по сравнению сроков обнаружения окрашенных теток в г№№ со сроками проявления ЦПД в инфицированных клетках вирусов. •

Исследовали, кроме гомологичной системы МЗВК-АдКРСЗ две гетерологичные: Не1л - А<35 и ТБ - АДКРС7.

Динамику роста числа клеток МОВК, инфицированных вИРТ и выявляемых в тИФй сравнивали с динамикой проявления ЦПД вИРТ при высокой и низкой мнокественостях заражения. Одновременно проводили сравнение с результатами метода тМГ для выявления ДНК вИРТ в

инфицированных клетках.

В результате этих опытов было показано, что ГИФЫ позволял обнаруживать инфицированные клетки на более ранних cpcstax после варииэния, чем РИФ, значительно раньше (на 12 -40 часов) проявления ЦПД. В условиях высокой множественности заражения, сроки обна-ру*>ния вирусной ДНК метолом тМГ незначительно опережали сроки обнаружения вирусных антигенов в гИФМ, тогда как в условиях низкой множественности заражения различие сроков обнаружения составляло 40 часов в пользу Tiff.

Были проведены лабораторные испытания гИ$М обнаружения вИРТ и АдКРС в клетках носоглоточные смывов экспериментально зараженных телят. ,'

Результаты обнаружения АдКРС в клетках носоглоточных сшвов экспериментально зараженных животных приведены в таблице 2.

Из таблица 2 следует, что гИ$М позволяет обнаруживать антигены АдКРС в гомологичной и гетерологичной системах в клетках носоглоточных смывов экспериментально зараженных животных. Эффективность обнаружения АдКРС использованными методами по сравнению о вирусоввдедениом составила: тМГ - 96*. гИФМ - 84Х и РИФ - 50Х.

При обнаружении гчтигенов АдКРС в клетках 62 носоглоточных смывов экспериментально зараженных животных совпадаедасп результатов определений составила 96%.

В таблице 3 представлены результаты опыта по обнаружению антигенов вИРТ в клетках носоглоточных смывов экспериментально зараженных животных в сравнении с результатами метода тЫГ и вирусо-выделения.

Из таблицы 3 следует, что гИФМ позволяет обнаруживать вИРТ в клетках носоглоточных смывов экспериментально зараженных животных, Эффективность обнаружения вИРТ гИФМ составила Ô8Z, а методом тМГ - 100Х па сравнению о методом вирусовыделения на культуре клеток.

Таким образом, гИФМ позволяет обнаруживать вирусные антигены в инфицированных клетках как в случае моноинфекции, так и при сметанной инфекции, отличается высокой чувствительностью, специфичностью, простотой постановки анализа и интерпретации его результатов и может быть использован в качестве метода экспресс-диагностики аденовирусных и ИРГ-инфекций крупного -югатого скота

Таблица 2.

Сопоставление методов обнаружения АДКГО в клетках носоглоточных смывов экспериментально зараженных животных.

.Но. Вирусы, Методы I Дни после гаршюния

которыми . -----------------------------------------

проводили СКдо

варажение вар.) 3 4 5 б 7 8

?МГ - + - + 4 + + 1. АДКРС7 ГЖЫ - ч ■ + + + + + РИФ.....-

АдКРСЗ тмг - + + +

2. + ГШМ - + + + - - + ЙРТ РИФ - + + и.о. А + * +

АДКРСЗ ТМГ - + + + + + + а + гим! - - + + н. о. +

АДКРС7 РИФ --- + + *_

тМГ

4. конгроль ГИФМ РИФ

* н. о. - не определяли.

Таблица 3.

• Сопоставление (.методов обнаружения вИГТ в клетках носоглоточных смывов эксперимента»но зараженных животных.

N0. Методы Дни после заражена

. 0 3 ■ 6 7 10

(до зар.)

зараженные -

73 тУШ н. 0. + + + *

тЫГ н.о. + + + +

74 гУ№ - +

ТМГ - + + + +

78 гШ1 - * и.о. +

ТМГ - + + + +

80 ГММ - + 4 + *

ТМГ - +

81 гкш - + + + +

ТМГ + + + +

контроль

82 гШ1 - - - у - -

ТМГ - - - -

83 гит - - н.о. -

ТМГ - - - -

* н.0. не определяли.

РЛА для серодиагностики заболеваний вызываемых АдКРС и вИРТ.

В качестве исследуемых антигенов были использованы: культу-ральные жадности клеток МЗВК, инфицированных АдКРСЗ. АдКРСУ и вИРТ (К. Ж. АдКРСЗ, К. X. АДКРС7, К.К. вИРТ); очищенные вирионы АдКРСЗ и ВИР (в. АдКРСЗ и в. вИРТ); гексон АдКРСЗ (гек. АдКРСЗ); лиэат клеток ШВК, инфицированных вИРТ (Л.К.вИРТ);

Контроль активности антигенов осуществляли в ИФА.

Выли получены стабильные по физико-химическим свойствам и обладавшие иммунохимической активность» конъюгатов ПАЛ-К. Я. АдКРСЗ (I). ПАЛ-К Л АдКРС? (П), ПАЛ-К. Я. ВИРТ (Щ), ПЛЛ-гек. АдКРСЗ (IV), ПАЛ-Л. К, вИРТ (V), которые в дальнейшем будут обозначаться римскими цифрами, указанными в скобках.

На первом этапе исследований были изучены параметры РЛА в сравнении с параметрами ИФА в модельной системе. Длл этого были использованы конъюгаты IV и V.

Было проведено сравнение РЛА и РИГА при обнаружении антител ,к АдКРС. и* вИРТ. Для этой цели попользовали конгюгаты 1, II, III и V и РНГА-диагностикуш для серодиагностики АдКРС и вИРТ.

В итоге исследований параметров РЛА в модельных системах было установлено, что при обнаружении антител к АдКРС чувствительность РЛА превосходит чувствительность ИФА в 10-100 раз, а при обнаружении антител к вИРТ чувствительность РЛА сопоставима с чувствительность ¿Ш и в 10-50 раз превосходит по чувствительности РИГА. Специфичность наблюдаемых взаимодействий была подтверждена в опытах по ингибировани» взаимодействий в РЛА, ИФА и РИГА.

В таблице 4 представлены результаты обнаружения серополоки-телъны? животных штодами РЛА, РНГА, ИФА и РН в ходе одного иа опытов по экспериментальному заражению телят АдКРС 1 и 2 серологических групп и вИРТ. Сравнение результатов, серологических исследований 40 проб сывороток, взятых от экспериментально зараженных животных показало что между значениями титров сывороток, определенными в РЛА, РН, ИФА, РНГА наблюдается прямая коррелят ция. Коэффициенты корреляции для значений титров сывороток оказались равными: РЛА / ИФА - 0,99; РЛА / РНГА - 0,96; РЛА / РН -0,85.

- Ii-

Таблица l.

Количество серополояительйых тавотных, определяемых методами РЛД, TITA, ИФА к РИ по дю»м в условиях экспериментального ваослоэния. *

Вирус Методы №и после заражения

Б 10 16 20 25

ГЛА 3 9 8 10 10

ИФА 1 7 10 10 10

АдКРС РНГА 3 9 10 10 Iii

РН - 8 - 11 11

РЛА 3 7 7 7 б

ИФА 1 6 7 > 6 6

вИРТ РНГА 1 б 6 5 б

РН - 4 - в в

* Примечание: АдКРС было гаражако 12 {6+6). а в UFT - 9 животных. (-) - исследования не проводили;

На основании результатов лабораторных исследований бит: определены условия и разработана методика проведения анализа, разработаны технические условия производства РЛА-диагностикума на вИРТ. Метод серодиагностики вИРТ с использованием реакции латок-сагглютияации был представлен на межведомственные ¡«эмиссионные испыт'г.шя по программе, утвержденной ГУБ Госагропрома СОСР. Результаты межведомственных комиссионных испытаний РЛА-диагностику-ма приведены в таблице Б.

Кс-тод серологической диагностики вИРТ в РЛА успешно прошел межведомственную комиссионную проверку . Было рекомендовано псовести широкие производственные испытания диагностикума.

Таким образом, РЛА является специфичным, чувствительным, быстрым методом обнаружения антител к АдКРС и вИРТ проста в постановке и может быть использована как в лабораториях, так и непосредственно в полевых условиях.

Технология изготовления компонентов диагностикума.

В итоге проведенных исследований была разработана технология получения РЛА-диагностикума для обнаружения антител к вИРТ,

Процесс изготовления РЛА-диагностикума включает в себя следующие стадии:

- приготовление антигена на основе лизата клеток, инфицированных вИРТ и контроль его активности в ИФА или ДОТ-ИФ/-,

- приготовление конъюгата латекса с полученным антигеном*,

- получение отрицательной сыворотки и гипериммунной сыворотки против вИРТ и их контроль в ИОД и РН;

- приготовление рабочих растворов;

- расфасовка и лиофилизация прег. фатов конъюгата и сывороток с последующей проверкой их активности в РЛА;

- компоновка наборов;

Отличительной чертой данной технологии является то. что в процессе производства используются реактивы и препараты, производство которых налажено в СССР.

Латексныэ конъпгаты могут быть лиофилизеганы без потери активности. Сохранность конъюгатов в суспензии более 2-х лет, а в диофилизованном состоянии - более года без потери активности.

На "сновании результатов всех проведенных исследований

предложена схема компоновки набора для серологической

Таблица 5.

Обнаружение антител к вИРТ- в сыворотке крови экспериментально зараженных животных в РЛА в сравнении с РИГА, ИФА и РН по итогам межведомственной комиссионной проверки. *

N0. Значения титров антител к вИРТ в сыворотках крови

телят --------------------------------------------.---------

до заражения 18 сутки после заражения

РН РИГА РЛА ИФА РН РИГА РЛА ИФА

73 0 1:128 1: 160 1: 200 1: 4 1:256 1:160 1:400

74 0 1:256 1: 160 1:200 -о 1:256 1: 320 1:200

75 0 1:32 1: 40 0 1:4 1:256 1:640 1:400

73 1:2 1:64 1: 20 0 1:8 1:128 1:80 1:200

80 0 1:16 1: 40 0 1:2 1:128 1:640 0

82 0 1:32 1: 40 0 0 1: 16 1:20 0

83 0 1:64 1: 20 0 0 . 1:32 1:20 0

84 0 1:16 1: 40 0 0 1:16 1:40 0

* Животные N0.73, 74, 75, 78, 80 опыт, Ыо.82, 33,.84 - контроль.

диагностики вИРТ в реакции латексагглютинации. В состав набора входят:

- конъюгат латекса со специфическим антигеном - 1 флакон;

- 10-ти кратный концентрат рабочего буфера - 1 флакон-,

- бычий сывороточный альбумин - 1 ампула;

- специфическая положительная сыворотка - 1 ампула;

- контрольная отрицательная сыворотка - 1 ампула;

Полученные в настоящей работе результаты показывают, что гИФМ и РЛА могут быть использованы для иммунодиагностики заболеваний,' вызываемых АдКРС и вИРТ. Разработанные методы обладают высокой чувствительностью и специфичностью, простотой постановки и интерпретации результатов. Проведение исследований этими методами не требует высокой квалификации персонала.

Важной особенностью гИФМ и РЛА является возможность их использования в одном пакете для ранней диагностики АдКРС и вИРТ-инфекций. Как следует из результатов работы, вирусные антигены могут быть обнаружены в гИФМ на 3 день после начала заболевания, а антитела к ним в РЛА на 5-10 дни.

Таким образом, гИФМ и РЛА являются перспективными для практического применения методами иммунодиагностики адено- и герпес-вирусных инфекций крупного рогатого скота и расширяют арсенал >'-э-тодов иммунодиагностики вирусных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика ^'чистки гексона АдКРСЗ из культу-ральной жидкости инфицированных клеток с последовательным использованием гидрофзоиой хроматографии на фенил-сефарозе и эксклюзи-онной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Метод позволяет получать гексон АдКРСЗ высокой чистоты с выходом 787. от исходного содержания гексона в культуральной жидкости.

2. Разработан гистохимический иммуноферментный метод (гИФМ) обнаружения антигенов АдКРС и вИРТ, позволяющий обнаруживать антигены АдКРС и антигены вИРТ в инфицированных клетках. Проведено сравнение гИФМ с другими методами обнаружения вирусов в инфициро-

ванных клетках: реакцией иммунофлуоресценции (РИФ), твердофазным иммуноферментным анализом (ИФА) и методом точечной молекулярной гибридизации. Установлено, что гИФМ является более чувствительным методом обнаружения вирусных антигенов, чем РИФ и ИФА и не требует для постановки специального оборудования. Метод апробирован на полевом материале, показана возможность использования гИФМ для иммунодиагностики АдКРС и вИРТ.

3. Разработан метод серологической д-иагностки АдКРС и вИРТ на основе реакции латексагглютин-.чии (РЛА). Проведено сравнение РЛА с применяемыми в настоящее время методами серологической диагностики АдКРС и вИРТ н?, «снове ИФА и РИГА. Показаны преимущества РЛА, . заключающеея в более высокой чувствительности и специфичности, пустоте постановки и интепретации результатов. Метод усп^1"^ прошел межведомственные комиссионные испытания и рекомендован для серологической диагностики ИРТ.

4. Разработана технрлогия получения РЛА-диагностикума и выпущена опытная партия "Набора для серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота в реакции латек-еагглютинации". Главным управлением ветеринарии утверждены методические указания и инструкция по применению набора. Получено положительное решение на выдачу авторского свидетельства на способ получения латексного диагностикума.

Сведения о практическом использовании полученных автором научных результатов.

Метод серологической диагностики вируса инфекционного ринотрахеита в реакции латексагглютинации прошел межведомственные комиссионные испытания и рекомендован к промышленому производству. Подготовлены и утверждены методические указания по применению реакции латексагглютинации (Утверждены приказом начальника ГУВ Госагропрома СССР 5 апреля 1989 г.), метод включен в стандарт СЭВ в области ветеринарии. (Протокол совещания специалистов стран-членов СЭВ по согласованию стандартов СЭВ в области ветеринарии. Приложение 2. Раздел 3.8. с. 20-23. Москва. Июнь 1990 г.).

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1. Шлиакролеиновые датексы в . качестве иммунореагентов. / Лукин Ю. Е, Трифонов Е Д. , Туркин С. Л, Зубов Е П. // Труды института / Моск. химико-технол. ин-т им. Д. И. Менделеева. -1985. -Вып. 135. -С 88-92. МХТИ. -1985. - вып. 135. -с. 88-92.

2. Сопоставление методов обнаружения аденовирусов крупного рогатого скота о-го серотипа в зараженной культуре перевиваемых клеток почки теленка (ЮВК). / А. а Калшная, Е Д. Трифонов, М. И. Зильберман, Каледин а. с. , Каре.лин ЕЕ. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. -1988. -N10. -С. 45-48.

3. Трифонов Е Д. Получение гипериммунных сывороток к аденовирусу 3-го серотипа крупного рогатого скота // вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. / Моск. вет. академия ИМ. К. И. Скрябина. -1988. -С. 74-75.

4. Трифонов В. Д. Обнаружение аденовирусов в зараженных клетках. // Вопросы ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. / Моск. вет. академия им. К. Л Скрябина. -1988. -С. 75-76.

5. Трифонов ЕД. Сравнительное изучение различных методов обнаружения антител к АдКРС и вИРТ. // Доклады ВАСХНИЛ. -1990. -N.6. - С. 59-63.

"СЗЛПА" 19#>г. Зак96/ тир. /ОО