Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гидрофобные свойства CF0F1-АТФазы, L-амилазы и пероксидазы растений

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гидрофобные свойства CF0F1-АТФазы, L-амилазы и пероксидазы растений"

КАЗАХСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ и* АЛЬ-ОАРАЕИ

на правах руганной УЛК 577.15

Гончарова Ахга йздинировна

ГЩОЮБШЕ СВОЙСТВА СГсП-АТЗазы, <1- АМИЛАЗЫ И ПЕРОКСЭДАЗЫ РАСТЕНИИ

03.00.0-1-бзгешпшя

Автореферат диссертации га соискание учЗноа степени кандидата биологических паук

Ахыаты, 1994.

Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики растений Института ботаники HAH PK

Научный руководитель: доктор биологических наук. проф.

Иващенко А. Т.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, проф.

Сеитов ас.

кандидат биологических наук, Богуспаез К. К.

Еэдупда организация: Институт молекулярной биологии и

биохимии иы. Ы. А. Айтхожина.

Заадта состоится " ^ "ШаММу&Ь г. в '/учас. && шт. на заседании специализированного Ученого совета 1,4 /А. 01.13. при биологическом факультете Казахского государственного национального университета ил Аль-ааргби. г; Алиаты,- 480121, _пр, Аль-Фараби,- 71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета -Автореферат разослан ¿У" сЩ^Ш 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Г)

кандидат биологических наук Шалахметова Т. М.

Актуальность проблемы. Одним ив важных направлений современной биоэнергетики является исследование структурной организации, механизма функционирования и регуляции активности энерго-пресбразуювдх ферментовССкулачев Е П.,1989)

Исследование свойств ферментных систем, сопрягающих медду собой реакции освобождения и накопления энергии, ведется во >яюгих направлениях. Одним из них является кзюпеняэ каталитических свойств ферментов посредством физиологических регуляторов. а Ч11слу таких физиологических, регуляторов сопрягающего фактора хлоропластов и митохондрия относятся неорганически? анионы, двухвалентные катионы и спирты( Ивагээнко А. Т. ,1982;Тиэпа d9 Воггег-Риуоп а1. ,1984; РапеГзку, 1987). Эти соединения осу-езэствляю? в клетках разнообразную и значительную регуляцию физиологических функций на различных структурных уровнях и многие механизмы этой регуляции в достаточной степени до сих пор не выяснены. В связи с этим необходимо посвятить исследование . гидрофобным взаимодействия« спиртов с АТОсинтазой и в частности с АТФазой хлоропластов. Систематическое изучение влияния алифатичеккх спиртов на АТФазу в мембраносвязанном и растворимом состояниях позволит выявить возможные количественные закономерности регуляторного действия спиртов.

В настоящее время гидрофобные свойства ферментов слабо исследованы ввиду сложности их определения. В тс же время необходимость изучения этих свойств диктуется тем,что функционирование подавляющего большинства фэрментов определяется гидрофобными свойствами.

Кногке физиологически активные соединения оказывает регу-ляторное влияние на фермэнты посредством гидрофобных взаимодействия. Это тоже обуславливает необходимость выяснения механизмов взаимодействия ферритов с этими соединениями.

Кзстоясая работа пссЕяцена выяснению роли гидрофобных Е&аиыодействкЯ в регуляцки ферментативной активности "к уста-

новленизо возкояньсс корреляций мэгду структурой ферментов и их фнзико-хкшческиш свойствам:!.

Цель и задачи исследований. Целью настсяцэй работы явилось исследование гидрофобных сеойств ферментов с известной аминокислотной последовательностью ( АЛ ), а, именно, СРсР1 -АТФазы, еС -амилазы и пероксидазы высших растений и выявление взаимосвязи между структурой этих ферментов и их физика-химическими характеристиками (индексом обшей гидрофобности молекулы и гидрсфсбностью на один аминокислотный сстатаок - АКО), а таклзэ выявление общих закономерностей е регуляции гидрофобных свойств ферментов, принадлежащие различным классам (пщролаз и оксидоредуктаз).

Для достижения поставленной цели потребовалось решить следующие задачи:

- исследовать ' влияние одноатомных спиртов и рН на активность СРсР! АТСааи хлор'опдастов различных растений

- провести в сравнительном-плане исследование А'ГФаэной активности мембраносвязанного и растворимого сопрягающего фактора хлоропластов для различных объектов при действии одноатош-ных спиртов ■ . .

- проанализировать АП каталитических субьедшшц А и В (СЕА к СЕВ) СРоР1-АТ!1азы хлоропластов из различних источников

- исследовать влияние одноатомиых спиртов на активность «¿-амилазы растений

- исследовать действие спиртов на активность персксидазы

- выявить возможные закономерности в действии спиртов на гидрофобные свойства изучаемых ферментных систем

Научная новизна. Е данной работе используется подход, основанный на изучении и сопоставлении гидрофобных характеристик ферментов, с одной стороны, и особенностей АП, обусловливающих

проявление этих гидрофобных характеристик, исследуемых ферьген-тов, с другой стороны.

В работе выявлены корреляции кезду количественными характеристиками гидрофобных взаимодействий спиртов с АТФазой хяо-ропластов, цианобактерий и потюфобно-гидрофильннми показателями АП СЕД и CEE Показано, что консерЕативш» участки АЛ СЕВ в большей степени ответственны за гидрофобные свойства фермента.

Проведенное в представленной работе сравнительное иссле-доз£ни& гидрофобных свойств 3 ферментных систем у растенкГ. позволило выявить некоторые обсие ааконом?рносхи рсгуляторного действия органически:: соединений на ферментативну» активность. Кроме того,были установлены определенные корреляции ыеладу структурой ферментов в их гидрофобные свсйствс&га.

Теоретическое а практическое значение. Раскрыгне в работе законожрнссти регуляции активности исследуемых ферментов являются теоретической основой для понимания механизмов влияния эндогенных регуляторов на функционирование ключевых ферментов метаболизма растешгй. Они ногут быть применены для целенаправленного поиска средств регулирования активности широкого ряда ферментов.

Апробация работы. Ресультаты исследований Сили представлены на: IV Вгесоетной конференции молодых ученых по физиологии растительной клеткиС Минск, 1090); Всесоюзном совещгапГМэлеку-лярнь» механизмы и регуляция энергетического сСмена" ( фдаяо, 1990); Конференции молодых ученых Raa ГУ им. а М. Кирова ( Алиа-Aia,199l); 20th Maotlrff of the FEBS. - Budapest,-1CS0. ;CaxnosH-умс- "Btochemcal garjotics of plants*91"(София,Болгария, 1931).

Дупликации. По результатам исследований опубликоЕзко ' 10 -раЭот.

i - 4 -Структура и обьем рабо-гы. Диссертационная работа состоитиз введения, 3 глаз, заключения выводов и списка литературы. Работа изложена на • Í32 страницах машинописного текста и содержит 30 рисунков, 3 таблиц. Список литературы содержит 20% ссылок на работы отечествэнных к зарубежных авторов.

Объекты и методы исследования: В представленной работе исследовалось влияние одноатомных спиртов на каталитическую активность некоторых ферментов с известной АГЬ CFoFl-ATïeab!, cL -амилазы, пероксидазы у ряда растений.

При исследовании влияния одноатомных спиртов на АТСазную активность CF1 и CFoFl использовались проростки следукяцих высших растений:пшеницы (Triticum aestivim) .кукурузы (Zea hiirays), табака (Nicotiana tabaccum),конских бобов ( Vicia faba).B опытах использовали 10-20 дневные проростки,выращэнные в почве в условиях теплицы при освещении 5000 лк. Такте в, эксперименте использовались представители цианобактерий Anabaena и Synecho-cocous, выраженные на питательной среде.

При исследовании влияния одноатоыных спиртов на активность c¿ -амилазы использовались S дневные этиолированные про-рощэнные зерна: пшеницы (Tri ti сии acstivum), ячменя ( Horde tin vulgare) и риса ( Orysa sativum ). Прорацаванке проводилось в термостате при 37 С, в чалках Петри.

Для определения активности пероксидазы использовали коммерческий препарат пероксидазы корней хрена

Субхлоропластные частицы ( СХЧ ) получали путем озвучивания (10.сек) хлоропластов, выделенных методом дифференциального центрифугирования ( Пононарзнко С. В., 1935). Растворимую АТО-азу хлоропластов экстрагировали из озвученных СХЧ по методу

Кштса (Yonis et. al. ,1977) о некоторыми »юдификациямг. Активность АТФазы определяли по скорости отщепления Sa от АТй. Содер-тание несргшшческого фосфора определяли колориметрически по обргаовачию фосфомолкбденозого комплекса (Gentses et. al. ,1921).

■i. -аьялазную активность определяли колориметрически на СО-26 "Ломо" при 620 нм (Гильмадоз К К ,198 ) по колкчзству нерасЕггп-леаюго крахмала. Берокскдазную активпость измеряет спектрофо-?'¡метрически, по изменению оптической плотности продуктов реакции, образовавшиеся при окислении гваягала за определенной про-ыеауго:: времени( Bergmeyer, 1977), на СФ-25 "Дою" при длине волны 470 nu.

'-^тематическая обработка полученных результатов проводилась на компьютере фирмы IBM PC/AT - 285 по программам раз- '

»

работанным в лаборатории.

РЕЗУЛЬТАТЫ К ИХ ОБСУЖДЕНИЕ:

?.. Влияние спиртов и рН на активность CF1 АТСезы хлороп-ластоз высших растений.

Установлено,что одноатокныэ спирты Е десятки раз увеличивают старость гидролиза АТФ сопрягавшим фактором хлоропластов (Уггьяя А. Н. , 1980; Anthon, Jsgendorf, 1983). Сравнительное изучение зависимости АТФазной активности CF1 нескольких обьектов, различающихся по первичной стругауре, от рН позволяет оценить значение этих отличий в проявлении оптимума рН и влияние на него гидрофобных взаимодействий, имеющие место при гидролизе АТО в присутствии одноатомных спиртов.

Поскольку одноатомны-? спирты взаимодействуют с гидрофобными участками СП и могут изменять положение ионизируемых групп фермента,изменяя его конформащго, необходимо изучить действие- спиртов на рН-зазисимссть АТСазной активности CF1.

Результаты, подучешшз по влиянию рЕ на АТйазную активность CF1 различных объектов, изученных в присутствии спиртов. свидетельствуют о ток, что одноатомныэ спирты ( метанол, этанол, просакол, бутанод) не изменяли ра-оптинум АТйазиой активности. Даннш по влияния спиртов на рЕ-заапсимссть АТСзз-

Рес 1. Еъшйис рН на АТСазвуа активность CF1 шзсеицы е присутствии штшюла - 1; зтаноха - 2; пропакола - 3; буггяола

В опытах ксподьгованы спирты в концентрациях, вызывагада: максимальный сткмуедзуюпий зйект АТ5азной активности CF1. Та-образом,ясно, что /¿КО субьедшшц CF1, .взаимодействующие со :пиртами,"не влияют на состояние ионизированных групп, определяющее рН-завискмоеть ciepwairca В то аз вреыя концентрации эта-зола, вызывавшие максимальную стимуляцию АТЕазной активности JF1 пгенжщ, TaOaica, конских бобов была различишь Еозыояно,

чю тэ AI'O CE.J СЖ CFî: по которым рассмотренные оОьзсты отличаются, могут опрсдела1* отличия по степени активации А7Ф-

хлоропластом сднеатокнши спиртами и по ю: концгнтрзвди, которой происходит ьссирллзная стимуляция АКззпсй аягив-•хстк.

layzm образом, су^лгоуй полученные ланпш, «ояао заключить. что скорость гидролиза АТФ растворимой АТйазой хгоро-с-^етои ппенкщ:, ячменя, кукурузы, табака и гороха ызлеимальнз

пои pli s.о без спиртов и г ¡a npvicyrcTBEi. Следог-г.тельно, роль' v> црофобных ъаачмодейотвлй s определении оптимума рН лТСазнсй Е: :-;'i3EOOTK HF1 г^загтагелька.

П. Влияние однсато!лних спирте:-, ко сктиекость АТйазы хло-ропластсв тшеглз ргатений.

К чкслу соеякаэкий, зйективно изменяю®:): активность фер-откосятся ояпоато«шэ епиргы, которые и использовались ? да&юй работа для оценки . гкйоофобных свойств набранных фер-1г5»тшх систем.

Коследования по влиянии одноатомкых спиртов ча активность хлоропластом проводили на пшенице, кукурузе, конских бобах » табаке, а тата двух видах ци?лобактер;;3, которые были ззяты в глчестне возмсзтчх предпзственнжоз хлоропластисго гэ-

Кз получе^ьи результатов видно, что исследуете спирты ст":чул-гъоЕалм активность АТЗозы у всех испсль?оваин:а обьек-тсз. Установленцы? я'я каждого спирта концентрации, в которых сг.лрт максимально активирует активность ки: CFi. .так и СХЧ для различных объектов позволили сделать следухвде заключения.

Концентрации спиртсз, катек-чально активирующие активность Феркеь??., не доказддо значительное о?л?вй при «разнешш дан-

цых для растЕорккогс к мэ^ЗраносвязанЕого состояния ДТйазного кошлекса. Причем, это кайлн)деш:э распространяется на все обь-екгы - пнэннду, кукурузу, конские бобы, тайак. Следовательно , это ещё раз подтверждает ранее высказанное предположение о тем, что действие спиртов не зависит от того, в каком состояния находится формант - ые&ЗранссвязанЕом или растворимом.

Далее были проанализированы полученные опт;шалъпно концентрации спиртов ыекцу сакгами объектами. Е результате чего можно прийти к заююченшз о тем, что показатели для пшеницы и кукурузы практически не отличались ыэзду собой (ни у СР1, на у СХЧ). Вероятно, зто объясняется принадлежностью этих двух высиди растений к одному семейству - злаковых. Что ззз касается табака и конских бсСоз, здесь были обнаруиэны отличия в оптимальных концентрациях спиртов как между этими двумя обьекгаш, так и при сравнении их со злаковыми.

СИ, выделлшкз из Ь'упесЬссоссиз и АпаЬаепа по своим гидрофобные свойствам были близка кехщу собой, ко обнаруживали различия по ергша-шаэ с бысеиыи растениями.. Ддн АпаЬаепа и Эу-песЬсзсоссиз характерны иаягтшьЕО акгявирушде концентрации спиртов Солзе низкие,: чем таковые для выгшнх 'растений. . • Если спирта! вашшдейстЕуагг с гидрофобные участками ка-талктичсского и регуялторкого цептрсЕ, то вполне возиозлио предполо;?лгь, что гидрофобные участки фзрагента, сходные у СР1 из АпаЬаепа к Зупесйососсиз, претерпели значительные изменения в процессе эволюции, что находит подтверждение в установленных ранее отличиях СК1 из АпаЬаэпа и ЕупэсЬоссссиз от СП высших растений при -сравнении основных каталитических характеристик.

Одной из наиболее часто Естрочающихся характеристик гидрофобных свойств фермента является зависимость ¡¿езду концентрациями спиртов, в которых они максимально активируют фермент (

либо ингибирузт его на 50£) С н коэффициентам распределения ( Р ) спиртов в слетев октанол-зода.

Были установлены тша;э зависимости для всех обьектоЕ попользованных в работе. Таблица 1.

Таблица 1. Уравнения лккеЯчых зависимостей мэтау лога-шфмачя оптимальные активирукда концентраций спиртов и гогарифмаг® коэффициентов распределения спиртов в сксте-!.<е сктанол-Бода.

Название объекта 1УрзлненЕо линейной вавксиизсти козф. кор. .'

СП ! 1в1/С - 0,84 1г Р - 0,48 : й - 0,9951

пшеьиЦа СХЧ ! 1*1/С - 0,79 1г Р - 0,48 ! к - 0,990!

СИ ! 1г1/с - 0.79 1г Р - 0,46 : и - 0,9321

¡кукуруза - СХЧ ! 1г1/с - 0,82 Р - 0,48 1 к - 0,9811

СИ 1 15Г1/С - 0,77 1г Р - 0,23 ! Я - 0,3741

табак СХЧ : 1е1/с - 0,74 18 Р - 0,31 ! й « 0,9651

СИ ! 1г1/с - 0,90 Р - 0,42 : к - 0,9901

колские -бобы СХЧ 1 1е1/с - 0,83 1и Р - 0.48 в - 0,9931

Апа&аепа С ИНГ. ) ! 1«г1/С - 0,88 1£Г Р - 0,42 - 0,9061

ЗупесЬссоссин( инг. ) 1С1/С - 0,70 1г р - 0,52 р. - 0.987!

Анализируя и сравнивая полученньгэ эависиъгэсти необходимо отметить,-что достаточно высокий показатель ( а ) из уравнения

1г1/с - а 1г р - ь

( где а - степень чувствительности молекулы фермента на воздействие гидрофобного соединена) найицдается для всех изученных объектов, что свидетельстйует о вцрокоП степени чувствительности молекулы Фермента, в данном случае речь вдет об АГСазе ( СТ1 и СХЧ ) на вэздеЯстзмэ гид»»

фобного соединения.

Коэффициент ( b ) КЗ получэнянх з^гаийамаЯ, юзат с-тужить мерой гидрофобных ceoêcx-з форьенгг я харгкгоршуе-г концентрацию, при которой гшшегячёсксе ееодакеане с козСфйичь..-том Р, равным единице вызывает ьтегеальнуэ ст/л/уяято йккгс-ности. Сравнив подученные завжтгости для CF1 и СХЧ изученных объектов s h-ожо заключать, что и зто? показатель свидотельст-вует о незначительной изггэйчивоегл гидрофобных свопств сопря-гакщэго фактора хлоропластов да псодедозанных объектов.

Физический смысл кзэйЕйцдаагсл а к b с уравнениях позволяет использовать их как кадсчзс'/зеншй параметры регуляторних свойств ферментов. .

3. Дньззз гидрофобных чаракгеркстж АЛ основных каталати-чеckzx суСъвдшшц АТЗазного комплекса.

В сзчги с поставленной в работе целью было целесообразно обнаружить ассшянь» корреляции между некоторыми физико-химический; АН АТСазы хлороплаетов(а, .именно, гн-д-эдаок iiûSfiii гй^?£'4с5есоти югекулы и глдрофэбностью- на одяа АКО камайдкзскпс субьедЕниц фершнта) и изученная: пифЭ-чССйл-д qr-oicTBai/ii.

В аспекте бш раасиэтрэны АД двух основ-

ных ко?алт;ччекя>: субьединиц СЕВ к СЕА АТЯазного комплекса у оЗьекгоз, использованных в рс-зсто. На основании составленной в лабораторий программы были посчитаны показатели индексов обсей гидр0ф0б£сс;ти и гидроггсбности на один АКО для АЛ СЕВ и СЕА.

дад."ыэ представлены в таблицах 2,3. фи составлении программ использовались индексы гидрофебности аминокислот, приведенное в работе Kyte J. S Dcolittle R. ( 1332).

При сравнении АЛ СЕА и СЕВ кз^зшх объектов с и друт:тх

Таблица 2.

Похазатег.: индекса обарЯ гидрофобное?» ( I. К. ) ч гидрофсб-пости на 1 АКО для jß -субьединицн, а такзта eô консервативных я вариабельных участков.

объекты i I. H. молекулы! I. IL ;

i i 1 консер. участ. ! Eap!í£6. участков!

Anabaena ¡ -39,0(-0,03)1 11,1 ! -50,1 !

Synochccoc-Î -51,3(-0,11) I 2,1 ¡ -53,9 !

cus I » J 1 i

шсенйца ! -4б,2(-0,09)! 10,8 ! -57,0 - !

табач ! -8,00(-0,02)¡ 16.2 1 -24,2 i

кукуруза I -33,7(-0,03)! 8,2 ! -40,9 . !

Таблица а

Показателе Пядокса cfrss гндрофСвости ( I . H. ) и гидрофоб-

ности на 1 АКО для c¿ -субьеджпщы, а тшсяэ eö консервативных

я вариабельных участгаз.

обьэкты ! I. iL молекулы! i

i i 1 t нонсер. участ. ! вариаб. участков !

Anatasna ! -54,1(-0,11)i -6,1 ! -48,0 ;

Synechcccc-! 25,8(0,05) ! 0,9 ! 24,9 !

C!1S ! » • • 1

пшеница ! -29,0(-С,С6)1 -13.1 -15,9 !

табак ¡ -24,G(-0.C5)¡ -10,7 ! -13,9

кукуруза i -48,7(-0,1) ¡ -7.7 ! -Ü.0 i

растительных объектов) были выделены консервативные и вариабельные участки в последовательностях CEA и СЕВ. Для гсаждого сОьекта были посчитана индексы обнзэй гидрофобкости и гидрофоб-ности на один АКО для всех зэнсерватпЕных участков и для вариабельных.

Полученные ивдшсоы обкзй гкдрофобности СЕВ и CEA сопрягающего фактора хлоропластов изученных объектов демонстрирует преобладание в АЛ этих субьедянкц гидрофильных аминокислот. Еа это указывает отрицательное значение индексов общей гидрофобнос-тн как CEA, так е СЕЗ у всех объектов. Исключение составляет лига CEA Synechococcus, для которой 1шдекс сбгцей гидрофобности субь-единицы составляла положительную величину, что говорит о преобладании в её последовательности гидрофобные ¿КО. Результаты по изучешпз обдай гидрофобности консервативных и вариабельных участков, представленные ь таблице 2,3 для СЕВ к CEA свидетельствует о то«, что у СЕВ для всех ойьеетов консервативные участки гидрофобии, о чей говорят пелокительные значения индексов оОя^й гидрофобности зтех участков. Для вариабельных ке участгав отмечается гидрофильность, сб атом свидетельствует отрицательные значения обоей гидрофобности. Что касается CEA,то здесь очевидно, что и коасерззгивнь» к вариабельные участки - гидрофильны по индексу общей гидрофобности участка. Причем вариабельные участки более гидрофильные, чей консервативные.

Таким образок, анализ всех эткх данных no CEA и СЕВ для изученша объектов, дает основание предположить, что регулктор-ное действие органических рагугворителей аезюжьэ осуществляется ва уровне СЕВ сопрягахеегс фактора хлоропластоь. Это в сю» очередь сочетается с мненкек с том, что каталитический к регу-ляторккй центры ATФазного комплекса, по «нешш ряда авторов рагг.олохгкы, именно. на CES.

ляторный центры- А7<"азпого коупеоксй, ■ по ¡я: нг»:а ряда авторов расположены, тютю, • па СГВ. ■

- Кроме того,' ногао прэдпололгть, что консервативные участки СЕВ в большей степени ответственны за гидрофобные взаимодействия, а, следовательно, л за гидрофобные свойства фермента Еоз-шжга, что именно эти участки пр:поа?аат участие з регуляции АТФзлиой активности органичесгаоли соединениями.

дальнейшие исследования: были обоснованы предпололвнзем о возможности вычислить суш/арную гидрофобность количества соединения, которое взаимодействует с гидрофобными участгса'с! з АП фермента.

Знал концентрацию, в которой соединение, максимально стимулирует активность фермента (или кнгпбирует его активность на 50%), а тагав зная степенз гидрофобнссти этого соединения,' вы-ратлкную коэффициентом распределения спирта мелду оетанолси и водой, стало 303Ш.1Н0 определить количество соединения с определенной суммарной степенью гидрофобности ( С? ), взаимодействующее с гидрофобным участком АН фермента.

Эти величины были вычислены для всех изученных объектов. ■ При аналззо полученных данных следует отметить то, что показатель CP для Есех псследуснък спиртов изменяется в определенных пределах в ряду от »¡этанола к гептанолу. Он уеэлич,!-Еается с ростом углеводородной цепочки спирта, а, следовательно, с ростом его молекулярной iscch.

Эти изменения псгЛлкзитехыга одинаковы для всех объектов из высших растений. Более того, привлечение других объекте-", митохондриальной АТ55азы , 5' -нукдеотидазы, Na, К-АТСазы, фрук-тозо-1,5-бисфссфат?.зы растений псзгслилн заметить те :ш саыыэ законошрнссти. Это дает возможность предполсямь суизствава-ниэ определенных закономерностей е расскатриваэгюм явлении,, а

Далее ш попытались обнаружить возможные корреляции ыеаду ■доказателен CP и молекулярной массой спиртов. Такие корг: "..'.дии были выявлены, о чем свидетельствуют полученные уравнения линейных зависимостей между С? и íi, а также посчитанные на их основакм! коэффициенты корреляции. Для пыеницы такая ssbkcz?-мссть описывалась следующими уравнениями:

СХЧ CP - 0,07 М - 0,5 R - 0.Q7Ó

CFÍ CP - 0,05 М + 0,3 R - 0,531

Аналогичные рассчеты были сделаны для всех изученных объекты.

А. Гидрофобные свойства c¿-амилазы пкеницы, ячмоня к риса. Важно выяснить, может ли подчиняться изменение активности других ферментных систем тем же закономерностям, что и исследованная. хлоропхастная ATflte&a и обусловлено ли sto гидрофобными свойствами ферментов.

Ыатеркалом для дальнейшего исследования послужила <¿ -амилаза (3.2.1.1.) - относящаяся такжз как ц ATfetaa к касссу гидралаз, но ут к другому иодклзссу - гвдролизусщеиу глико-зильные соединения.

В данном эксперименте использовалась Л -ашзваа, выдглгч:-.ная из растений с известными АЛ : риса, ячменя и пгвеница j; бглю изучено влияние•4 одноатоыных спиртов: метанола, этанола, пропадала и бутаяола на активность выделенного фермента. Все исследуемые одноатомные спирты ингибпровали активность <L - амилазы у высших растений. Для яого чтобы проанализировать гидрофобные свойства изучаемого фермента использовалась показатели концентраций спиртов, в которых" ош гагибирую? активность форинта н". 50 X. Вило показано, что для всех трех объектов кочцочтра-ции спиртов, в которых они на 50 x иы-кСирокивд активность

- 15 -

амилаз значительно не отличались."

Поскольку существует определенная зависюясть мезду концентрацией спиртов, при которой онл иягкбируют активность фермента и их гидрсфсбноетып,- оцениваемой по коэффициенту расп-родления ме.тду сктанолом и зодсй, были установлены тшгавыэ зависимости для изучаемых обьегсгов. На рис. 2 изображена зависимость для <£■ -амилазы ппеяицы.

£//Г

0,5"

Рко 2. зав!-гсю.{ссть шяду готари&гаш концентраций спиртов, ан-

гкбгфукцих актгшкость ^--акшазы псешщы на 50 % и коэффициентами распределения сштетов в снстекэ с:стансл-вода. нетано.т- 1; зтзлол-2; прспгнол-З; бутанол-4-

Полученные ззеисюжсти ошгеыЕалнсь следующая уравнениями: шэзн.ща 1д1/С - 0,62 1е Р - 0,31. К - 0,985 ячмень 1^1/С - 0,52 1е Р - 0,35 й 0,972 рис 16-1/С - 0,44 1гг Р - 0,30 й - 0,918

Проведенные на <к. -амилазе, выделенной из 3 высших растения эксперименты показали тдяфицпрущэе действие спиртов па активность фермента В отличие от АТСазы сшфта тольга кнгиби-ровали активность С -амилаз.

Анализ уравнений дает основание утверждать, что модифици-

ру;с~^е действие органических соединений на аотивность <=£ -амилазы, зависит от гвдрофооных свойств фермента, хотя и в кт-»ъ;:эй степени, чем у АТйазы хлоропластов. Однако, Оолее низкие значения показателя < а ) из уравнений, даит основание считать, что степень чувствительности -анадаз на воздействие гидрофобных соединений более низкая, чей у сопрягающего фактора хлоропластов.

у X -аанлазы большого числа изофоры усложнило исследования но анализу /Л иолэкул -амилаз из взятых объектов и не позволило провести подробных Езйлодепий, аналогично сделанным для АТСазы хлоропластов.

Однако, были вычислены показатели суммарной гидрофобности количества каадого спирта, вааимодействувдэго с гидрофобные участком фермента. Эти показателе СР подчинялись теи же взко-ноызрностяи, что и у АТЗаз высаих растений, АТФазы митохондрий, и т. д., т. е. показатель СР кэданялся для исследованных спиртов в определенных пределах и уБеяггчшался с ростом молекулярной ¡¿ассы спирта. Такаэ были посчитаны зависимости ыежду С? и К ( молекулярной массой спиртов) и вычислены коэффициенты корреляции из этих зависимостей.

пшеница СР - 0,06 И - 1,06 Й - 0,935

ячмень СР - 0,12 И - £.03 К - 0,040

рис СР - 0,12 Ы -г 3,50 Я - О.ВЗЗ

Результаты свидетельствует о довольно высокой корреляции между СР и К спиртов.

Это подтверждает ваше предположение о супрствоваяии определенных закономерностей в регулятораом действии органических соединений на каталитические- свойства фгржятов посредством гидрофобных взаимодействий.

4. Влияние одноатомных спиртов на активность пероксидззы корней хрена.

С целью подтверадения роли гидрофобных взаимодействий з регуляции активности ферментов была' использована пероксидаза ( 1.11.1.7.), - фермент, относящийся к классу оксидоредугсгаз, катализирующих окисление перекисью водорода разлганых органических соединений.

Гидрофобные свойства пероксидазы практически не изучены, хотя они представляют большой интерес для выяснения ти регуляции активности фермента гидрофобными соединениями.

Поскольку известно, что гидрофобные свойства фермента мсгао оценивать с помощью ряда одноатомных спиртов, было изучено влияние этих соединений на каталитическую активность 'Пе-роксидазы хрена.

Установлено, что с повышением концентрации спиртов не наблюдается фазы активации фермента в отличие от мембраносвязан-ных энзимов, а отмечается усиление ингибирсвания катализа. Для каждого из использованных- спиртов ( метанол, этанол, пропанол, бутанол) были установлены концентрации С , в которых они на 50% ингибировали активность.

Ые.кду концентрациями ( 0 ) и коэффициентами распределения ( Р ) спиртов в системе октанол-вода выявлена зависимость, определяемая уравнением: 1/С - 0,40 1г Р - 0,48

Эта линейная зависимость изображена на рисунке а

Подобно -амилазе, рассмотренной в предыдущем разделе однсатомные спирты угнетали активность пероксидазы. На основании низкого значения показателя ( а ) перед 1е Р равного 0,40 можно заключить, что чувствительность молекулы пероксидазы на воздействие гидрофобных, соединений незначительна

ijP

Рис. 3. Зависимость шжду логарифмами концентраций спиртов, ингибирующих активность пероксвдазы на 50% и коэффициентами распределения спиртов в системе оетанол-вода. ¿¿этанол-1¡ зтанол-2; пропанол-3; Оутааол-4.

воздействие гидрофобных соединений незначительна.

Это дает основание предположить, что гидрофобные свойства пероксвдазы в иеяыпой степени, чей у других изученных нага ферментов определят; её регудяторные характеристики.

Анализ АН Еерокс;удеи vz корнгГ. хрзна повволил вичксдать индекс оОдеЯ гкдрофобностл ыолггулы ( и на один АКО), который составил отрицательную величину в был равен -67,91-0,22 на сдай АКО ). Это указывает ва преобладание в АН пероксидааы корвгй хрена гидрофильных аишюкиолат.

При расчете показателя CP для пероксвдазы были обнаружены те хе закономерности, что в для других ферментных систем, описанных выше.

Установлена линейная вавясшюсть CP и молекулярной

кассой J Ü ) спиртов и сосчитан коэффициент корреляции. Л&сь-ная зависимость выражалась следукщш уравнением:

CP - 0.18 У - 5,1

Я - 0,<?S7

ГНЕО^Н:

1. Активность ЛТСазы хлоропластов шшнлцы, кукурузы, табака и конских бобов в растворимом и мембраносвязанном состояниях модифицируется одноатомкыми спиртами посредством гидрофобных взаимодействий. Установлены зависимости между концентрациями ( С ), в которых спирты вызывает кагаимальный отполирующий зффект и коэффициентами распределения спиртов в системе октанол-всда ( Р ). Выявлены линейные зависимости между произведением (. СР ) активирующие концентраций спирта на коэффициент распределения в систем октакол-зода и молекулярными массами спиртов.

2. Активность растворщяэй АТЯазы бактерий АлаЬавпа л Бу-песЬососсиз модифицируются одноатомкыми спиртэш подобно АТФа-зе хлоропластов высших растений посредством гидрофобных взаимодействий. Установлены количественные закономерности модифицирующего действия спиртов на АТЗазную активность фермента.

3. Одноатсшые сшфты шюгскратяо повышает; АТЗазную зк-тиеность растворимого фактора хлоропластов ( СР1) пшеницы, кукурузы, табака и гороха без изменения оптимума рН (рН 8,0), что свидетельствует об отсутствии влияния гидрофобных взаимодействий на рН-зависимость фермента.

4. Выявлены корреляции иелду голичественньии характеристиками гидрофобных взаимодействий сшфтов с АТЗазой хлоропластов, циансбактерий и гидрофобно-гидрофильными показателями аминокислотных последовательностей субьединиц А и Е Показано, что консервативные участки аминокислотной последовательности СЕВ з большей степени, чем вариабельные ответственны за гидрофобные свойства сопрягающего факктсра хлоропластсв.

5. Активность об -амилазы пшеницы, ячменя и риса мсд;'£иии-

роЕалзсь одноатомными спиртами посредством гидрофобных взаимодействий. Выявлены коррелятивные связи, между гидрой .'Оными свойствами спиртов, их молекулярной массой и концентрациями спиртов, в котрьос они вызывают определенный модифицирующий эффект на ферментативную активность.

6. Активность пероксидазы хрена ингибкровалась одноатом-ныии спиртами посредством гидрофобных взаимодействий. Установлены закономерности ьодкфицируищего действия спиртов и выявлены коррелятивнье,.связи между гидрофобными свойствами спиртов и их действувдши концентрациями.

7. Гидрофобные взаимодействия играют существенную роль в проявлении активности меыбраносвязанных н растворимых ферментов. Регуляторные возможности ферментов за счет гидрофобных взаимодействий можно оценивать количественно с помощь» одноатомных спиртов.

СПИСОК РАБОТ .ОПУБЛИКОВАННЫХ Ю ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Иващвнко А. Т., Поношренко С. В., Токсабаевг Г. А., Дда-келова О. А., Яровых А. Е Регуляция спиртами АТФазной активности сопрягающего фактора хлоропластов и митохондрий растений.// в кн. Ботанические' исследования в Казахстане. Альза-Ата. -Наука. -198Г -С. 107.

2. Токсабаева Г. А., Ивадонко А. Т.. Гончарова А. К Гидрофобные свойства А?Фазы митохондрий каллусной ткани и корней гороха. //В кн. Тезисы докл. Всесоюз. конфер. но биотехнологии злаковых культур. -Алма-Ата -19га -С. 32.

3. Квагенко А. Т.. Повоиаренко 'С. Е , Гончарова А, Е £&ух-валеетные металлы модифицируют, активность субхлоропласткых частиц гороха. //В кн. еизиолого-генетическиэ основы повышения

- 21 -

Алма- Ата. -1йука. -1983. -С. 87-88.

4- Гончарова A. R Регуляция одноатоаныкя спкр'Ггхш каталитической активности пероксидазы _ зрела. // Тезисы конференции ¡.юлоднх ученых.-Минск.-1990.-С.

5. Toksobasva G. А., Karpenjuk Т. А., Gonchar-ova А. V. ,Ропо-raranko S. V.,, Ivaschonko А. Т. Hydrophobic properties of chlo-roplast coupling factor of high plants.//20th testing of tha FEES. -Budapest. -1990. -P. 329.

6. Ivaschenko A. T., Karpenjuk T. A., Ponomranko S. V., Goncharova A. V., Gabdulkhaeva В. B. , Zakarlna A.A .ATP syntb^sp as a biochemical marker of a genomes of nucleus, cliloroplasts and mitochondria.//Slrposlum " Biochemical gonotics of plants' 91. -Bulgaria -Sofia. -1991. -P. 17.

7. йзноыаренко С. E , Гончарова А. В., карпенж Т. А., Ива-сэнко д. Т. Влияние одноатомных спиртов и рН на свойства ATSaau хлоропяастов различных растений. //Сизтологкя и биохимия культурных растений. -1991. -Т. 23. -N. б. -С. 598-601.

8. Карпенкк Т. А., Пзномаренко С. В., Гончарова А. R Сравнительный анализ физико-химических свойств ATСазы хлоропластов растений. //Известия АН PR. Серия бгслогическая. -1992. -N. 4. -с.

9. Иваненко А. Т., Карпенюк Т.Д., Шномаренко' С. В., Утеу-лян К. Р., Гончарова A. В. , Габдудхазва Б. R , Закарина А. Э. Эволюционное изменения свойств АТФ-синтетазы хлоропластов,- митохондрий и бактерий. // Лурпал эволюционной биохимии и физно-ЛОГИИ. -1992. -Т. 28. -N. 3. -С. 287-2S7.

10. Ивапзнко А. Т., Карпенш Т. А., Пономаренко С. В., Утеулин К. Р.Гончарова А. В., Закарина А. Э., Токсобаева Г. А.. Каталитические и структурные свойства"АТСсинтагы хлоропластов,митохондрий и бактерий. // Тезисы дскл. 5 конф. биохим. Средней Азии и Казахстана. -Ташкент. -1991. -С. 180

- 22. -

ГОНЧАРОВА АЛЛА ВДАДИШР-К£Ш. "Ос1вдиаерг1 CFoFl-ATtoa, еб-шдьааза жэне пэрогавд^гзныц гндрофобтьк ^сиеттер!".

ЦОРТЫЕДЫ. Буг жуглыста белпл1 ажодладодак ретшзн: СГоР1-АТ2аза хлоропластар, cL -аыавазалар гэнэ пероксидазалар ориалат^ш уп феркентпк скстеыаннц гвдрофобтьк касиетл зергтеледь Бкдай хм repi, ?емек1 «вне т. б. ссиад1кгер1 ybih CFoFl-АТФазаныц есерш ен, зюгары дарекеге дей1в иугюйтет1п( неиесе оны 50% теыеидете-спирттердщ концентрашкларыньщ пзне октанол-су куйесшде-п спирттердщ таралу козффицяеоттер! ( Р ) арасындагы байлакыс бехпледген. Eip шгынан АТЗозаньщ непап катализдн: субб1рл1-гшщ ашшдьрдовдф; рет катарыы ( АРК) анш^ауга жургтлгеп авалю вэве эксперимент Сараеыпда алшган ферменттердш гидро-фобтш; швгадецелер1 ке£51р керсеткютер араоында корреляциялар тутызады. Вул яургшдтсв оергтеулерде царастыршш отырган ос1ьм1кгерд1ЦвС-агдш1заскшн пероксадазасы гидрофобтык; оайладыс аркылы бцшоады спиргтермев байлаиысып курылысын езгертедЦио-дафващшанады). Спирттердщ белгш взгергк1ЕТ1к( юдификаци-ялыюееерш тугнзатын гцдрофзбтьи касиеттер1 явне олардын шле-кухаеж ааесаса кен концевтрацкясы арасындагы корредятивтж байдаякс шоэфздды. Сонкиеа ¡гагары сатыдагы еснеиктер кураш-нда 'сездесены iro фершнттщ гидрофобтык яасиеттер1не xypnai-лген сашстырыаеы верттеулер оргавихахык косылыстардыа, Фермеи-тахивпк агаивтшкке pern есершщ шш зандыш^гарып анык,-тауга нгомадик берд!.

QDHCHARQYA ALU VLADIMIROVMA. " The hydrophobic properties of CFoFl-ATPase, .¿-amylase and peroxidase of plants".

RESUME:

In present work the hydrophobic properties of 3 enzyme

system with known amino-acid sequences, nairely CFoFl-ATPase of chloroplasts, «¿'-amylase and peroxidase were investigated. The dependence between the concentrations of alcohols *hich mostly activate CFcFl- AT Pase (.or inhibit it by 502) C, and partition coefficients ( P ) of alcohols in octanol-water system for wheat, corn, tobacco, horse beans and two types of cyanobacteria, namely Anabaena and Synechococcus have been established. Coirputer analysis of AS of basic catalytic subunlts of ATPase, from one-sice, hydrophobic characteristic of enzyme, obtained in the course of experiments, from the other side, have brought about the correlations between a nunber of indices. It has been demonstrated that c6-amylase of wheat, barley and rice, as well as peroxidase of horse-radish roots were codified by mono-atomic alcohols by means of hydrophobic properties, molecular weights and concentrations cf alcohols, which evoke a certain modifying effect, have been established. Thus the executed coirparative study of hydrophobic properties of 3 enzvmss of superior plants resulted in establishment of some general conformities of regulative action of organic conpounds or. enzyme activity. • ■