Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АТФазный комплекс ферментов MUSCA DOMESTICA L. в норме и под влиянием регуляторов роста и развития

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АТФазный комплекс ферментов MUSCA DOMESTICA L. в норме и под влиянием регуляторов роста и развития"

% -Л

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени В. И. ЛЕНИНА

Специализированный совет К 053.01.01

На правах рукописи

КОЗЛОВА Елена Владимировым

АТФазный КОМПЛЕКС ФЕРМЕНТОВ Musca domestica L. В НОРМЕ II ПОД ВЛИЯНИЕМ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА II РАЗВИТИЯ

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в Московском ордена Лешгаа и ордена Трудового Красного Знамени педагогическом государственном университете им. В. И. Ленина.

доктор биологических паук, профессор ФИЛИППОВИЧ 10. Б.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор РОСЛЛВЦЕВА С. Л.

кандидат биологических наук ЛЕКАРКИНА Т. 11.

Ведущая организация: Всесоюзный паучно-исследователь-CKiiii институт химических средств защиты растений.

Защита состоится г. в ...... часов

на заседании специализированного совета К 053.01.01 по присуждению ученой степени кандидата паук в Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени педагогическом государственном университете имени В. И. Ленина по адресу: Москва, ул. Кибальчича, д. 6, кори. 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИГУ им. В. И. Ленина, 119435, Москва, Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан «...£......г.

Научный руководитель:

Ученый секретарь специализированного совета

А. П. ОЖИГОВА

PfC-'r П'М

- ХАРАКГЕВ1СТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Насекоше характеризуются-практически —"полным набором ферментов АТФазного комплекса, как и другие представители'животного мира. Кроме того, в силу своеобразия метаболических процессов, протекающих в их организме, насекомые обладают уникальной К^-АТФазой v" Hanrahan, Phillips , 1982; Harvey et al. , 1983; Wiecíorek, Gnatsy , 1985). Среди фер тентов АТФазного комплекса наиболее полно изучена нэ+,К+-АТФаза { Anetee, Bowler,1984; Uoore, Scudder , I98S; Lebovitz, et al. , 1989). Однако, до сих пор не прослежено изменение активности этого фермента в онтогенезе насекомых; исключение составляют лишь данные о возрастных изменениях уровня иа+,К+-АТФазно" активности в кишечнике саранчи Locusta migratoria ( Peacock , 1973?. Онтогенетические закономерности, касающиеся других ферментов АТФ-. азного комплекса, в литературе отсутствуют.

Представляет интерес исследование эндокринной регуляции деятельности ферментов АТФазного комплекса в связи с мембранной гипотезой механизма действия стероидных и ювенилышх гормонов (ЮГ), сводящейся к изменению метаболической активности генома путем модификации внутриклеточной концентрации ионов. Не вызывает сомнении, что активность Ыа+,К+-АТФазы у насекомых находится под контролем горфогенетичаских гормонов ( экдизона и ИГ ). Однако имеюицюоя об этом данные носят фрагментарный характер ( Ilenchuk, Davey, 1987; Shelby et al., 1989), а гормональная регуляция активности друтих АТФаз у iiaceicoMix практически не изучена.

: Сведений об участил АТФаз в развитии резистентности насо!:с.т"г: к инсектицидам в литературе пока обнаружить не удается, но много-.численные данные о том, что инсектициды класса пиретроидов оказывают на ферменты АТФазного комплекса непосредственное влияние, взаимодействуя с натриевыми каналами престпгпптических мембран ( sat-• telle, Ya^onoto , 1988), а фосфороргоничсские соединения ( £0С ) и карбаматы - непосредственное, изменяя улзихо-химпчесгае cbo/:"t:/j участков мембран в силу наличия у атомов фосфора и азота гидрофобных заместителей (Панасенко и др., 1983 ), не исключают вероятности, что выработка биохимических механизмов резистентности затрагивает измоненпя в функционировании не только метаболических ферментных систем, но и АТФазного комплекса энзимов.

Исходя из вышеизложенного, весьма перспективным продстамяет^! 'исследование своеобразия АТФазного комплекса ферментов у насско-

мых, изучение воздействия морфогенетических гормонов С экдизона и ЮГ ) и других регуляторов роста на активность АТФаз, что открывает дополнительные возможности для более глубокого понимания гормональной регуляции обмена веществ у них и управления их ростом и развитием, способствует расширению представлений о многообразии видов активного транспорта ионов в клетке. Особый интерес вызывает вопрос об участии АТФаз е выработке устойчивости к инсектицидам у насекомых, резистентных к тс-гл или гашм их группам.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы явилось изучение своеобразия АТФазного комплекса формантов и динамики активности 1.та+,К1-;Мд2+-;Са2+- и Са2+,1^2+-АТФаз в онтогенезе комнатных мух, исследовазше воздействия экзогенных морфогенетических гормонов { эгдазоиа и ЮГ ) и регуляторов роста на активность перечисленных ферментов, а тага:е выяснение их роли в выработке насекомыми устойчивости к инсектицидам.

Дяя достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Идентифицировать индивидуальные АТФазы в общем гомогенато имаго комнатных мух при помощи изменения ионного.состава и использования специфических ингибиторов. Установить оптимальные условия работы каздого конкретного представителя АКазного комплекса, определить его субклеточную локализацию.

2. Исследовать динамику активности 11а+,1С!'~;Ь'ф2+-;Са2+- и Са2"*,Ысу2+-АТ5аз в онтогенезе комнатных мух.

3. Изучить воздействие экзогенных морфогенетических гормонов

( эг.дпзона и ЮГ ) и других регуляторов роста на активность Па+,К+-; Щ^-,0,а2+- и Са^.Мс^-АТОаз.

4. Провести сравнительный анализ активности на"1',К4-;',[о2"1-; С'а2+~ и Са^+.И^'-АТФас у чувствительных и резистентных к инсектицидам С ФОС, карбаматы и пиретроиди ) рас комнатных г,ух.

5. Дзть характеристику некоторг..: физико-химических свойств На^.К^'-АТСазы у имаго чувствительных и резистентных к ФОН рас

комнатных мух. • '

Научная новизна работы,. Впервые,идентифицирован комплекс индивидуальных АТ£аз у комнатных .глух л установлено наличие у них уникальной К^'-АКази. Исследована дшюмпкя активности иа+.К*-;',^24-; Са2"*- и Са^'.Ц^'-АТ'Газ в онтогенезе комнатных мух и изучено' влияние экзогенных стероидных к' полггазопрокопдннх -ормонов и других . регуляторов роста на их активность.

Исходя из результатов исследования активности иа+,К{'-АТФазн у чувствительной и резистонтных к различным инсектицидам С ФОС,

■ . - 3 -

карйаматы, шгретроида ) рас комнатных мух предложен hobll": биохимический способ оценки состоязпгя резистентности у насекомые. Впервые сформулирована концепция о роли На+,К+-АТ0азы в выработке насекомыми устойчивости к различным инсектицидам.

Практическое значение работы. Исследование гормональной регуляции активности На+,К+-;/^'г5ЧСа2+- и Са2+,Г.^2+-АТЗаз у лоп-натных мух на различнее фазах их развития' позволило установить связь гормонального•дисбаланса с регуляцией обмена веществ, роста л развития, что необходимо учитывть при разработке новых методов борьбы с вредными насекогшил.

Исходя из различий з уровне активности Ila+,ICf-ATía3ij у чувствительных и резнстонтпйх к разллчнь , группам инсектицидов рас комнатных мух, предложен новый биохимический способ тестирования устойчивости насекомых к ядам, что существенно для разработки проблема резистентности и практических рекомендаций дли применения химических средств запзты растений от насекомых-вро-дителей,

Апробзпия работы. Патвриалц диссертация дотсладнволлсь па 7-ом совещании "Состояние проблош резистентности вредителей и возбудителей болоопзл рпстоииД к пшчзскаа средствам эар&гга п ое преодоление" ( Рига, IS38 ), на 10-ом съезде Всесоюзного энтомологического общества ( Ленинград, 1939 ), на Ленинских чтениях 1.21Г7 им, В.И.Ленина ( апрель, 1990 ).

По материалам диссертации опубликовано 4 prvV1-

ты.

Структура п объем рэбота. Диссертация состоит из взе.'.елл. ..; обзора литературы ( глава I ), оовегащего степень гзуч.мшосгл, пути гормональной регуляции и влияние рзэлпг:пе: ксенобиотиков па АТОазшй комплекс ферментов насека.'*::; отпсаипл объектов и мэго-' дов асслодогаипя ( глава 1 ); изложения " обсугэдоиия получали::.: экспериментальных результатов С гласи 3-5); езключэшш; школ.. и списка .пторатусч ( Г6Г> сенлох ), ?-ц$ога изло zona un TGI or нпцо машинописного текста и включает 14 рисунков и 9 тпблкц,

СКСПЕ-ПР.^НТАЛЫЙЯ ЧАСТЬ катерна :п и методы исследо^чпч.

Все исследования зола па различных 'фт.зах раззиллл :::;. лллллл мух .Mu? о a 'dorsoaticii .выращенных з инсектарии ВГ-П-ГЛ'-'СЗР v г, 'Ъс-кнп ),

Идентификацию и изучение субклеточной локализации АТФазного комплекса ферментов доводили у имаго второго дня развития.

Исследование динамики активности На+,К+-;М^-;Са^+- и Са^", М}^+-АТФаз в процессе развития комнатных мух проводили на эмбриональной, личиночной, куколочной и имагинальной фазах развития.

Для получения данных о воздействии экзогенного экдистерона и ЮГ-Ш использовали предкуколок первого дня развития, куколок и имаго 3-го дня развития.

Изучение влияния дифгорбензурона ( дишлина ) и его аналогов вели на личинках комнатних мух 5-го дня развития.

Сравнительное исследование активности Иа+,К+-;Мз-^+-;Са^+- и Са^.Мс^-АТФаз у чувствительных и резистентных к различным инсектицидам рас комнатные мух проводили на имаго 2-го дня развития.

При исследовании гормональной регуляции активности АТФаз предкуколкам, куколкам и имаго комнатных мух путем шгьекции или топикально вводили гормоны - экдистерон С I мкл 0,215 мМ раствора гормона, приготовленного на 7%-ном спиртовом растворе из расчета ' 5 мкг на г веса тела) и ЮГ-Ш С 0,5 мкл 75 мМ раствора гормона, приготовленного на 50^-ном водном-растворе ацетона из расчета 10 мкг на особь ). При исследовании влияния ингибиторов синтеза хитина на активность Па+,К+- и Са^+.М^-АТФаз диету личинок комнатных мух обрабатывали 0,001$-шм водным раствором дифторбензурона ( ди-милин ), 0,00004#-иым' раствором пентахлортрифторазурона ( эйм ) и 0,00008уб-1шмп растворами тетрафтордихлорбензурона ( номолт ) и три-фторбанзурона ( алсистин ),. соответственно. Для выяснения механизма гормональной индукции активности АТФаз имаго комнатных глух' 3-го дня развития за час до инъекции экдистерона или топикального нанесения ЮГ-Ш и в том , и в другом случае вводили водный расвор актиномицина Д ( 3,9 мкг/г веса тола ) и пуромицина (2,6 мкг/г • веса тела). «

Активность АТФаз, глюкозо-6-фосфатазы и бчтуклэотидазы определяли спектрофотометрически по мат >ду Лоурп-Лопеса ( Lowry, Lopes ,1946 ).

Активность сукцинатдегидрогеназы определяли спектрофотоматри-чески по методу Ещенко и Вольского ( 1982 ).

Перевод дшатриовой соли АТФ в имдазольную форму осуществляли'по методу Anstee a. Bowler ( 1984 ).

Субклеточные фракции гомогената имаго комнатных мух разделяли методом диффере1щиального центрифугировали. Чистоту получен-

них .фракций конторлировали определением активности'ферментов-маркеров: глюкозо-6-фосфатазы, 5^гуклеотидазы ( фракция микросом ) и сугадшштдегидрогеназы < митохондриальная фракция ).

Содержание белка в пробах определяли по методу Лоурп ( Ьо-„1-у эt а1., 1951 }.

Частичную очистку За+,К4'-ЛТ?ази из чувствительной и резистентной и фталофосу рас комнатных мух проводили по модифицированному методу Еолднрзва { Болдырев и др., 1931 ).

.Молекулярную ?.лдссу !1а+,1С!"-АТ'Эазы определяли методом гельфиль-чрац'.^! 'зрэз ссфадоу.с я -ТОО»

х'азультаты и их обсугд-'тпэ. '■Т^пттй^ко^тг^тсе.^отгу'етггоп костатиц.: мте. Проведение комяяе-:;сною г.сслэдо.-лшш АТоз с использованием лтлбиторного и ионного гаатаза ттоззолало тгдснтгглгпщрог'ать у комнатных мух весь сп&ктр кн-.¡Т.га'Т'г/'пл.'^'хс АТЗаз, для др7гях видов пасскошх, а изшпо .

'.Ух.

:со

л анионную АТ'азу С гнс.1 ;. ГГ"

гЬ

гсо

10

п

ш

17

т

71

га

Втс.1. Трлзапь форктатлвкоЗ акт;::г:сс?:га а'ьЛГь-АТ;^зи (I), СП), К*-ЛТ:аои СО, Пп^-ЛТ^азы (17), За^Г^-АГЗвэи (7), ПСО^-Л! (71) и С1~-АТФазц (711) у я:саго пух,

По осп ордотз* •- сдельная активность АТЗаз в ькг иеоргачн. веского (|оо::аха на цр и г:лс,

По оси абсцдбс -- ндонтл^тцтрэвзннко АТ5азы Опрэдолонло опт:п.'лльпих условий фугапщонпроватм йаядоЗ из

25 50 75 100

Ш

25 50 75 100

У

725 50 7§ 100"

10

I

А

С

25 50 100

1У '

£И

25 5Ь 76 100

71

711

50 7? 1'00

25 50 75 100

На+.К+-АТФазы,

ииивдолемпа аншанииги «а-.д—л^чяои-и/, щ-АТФаЗЫ Ш)»

-АТФазы(Ш), Са2+-АТФазы (17), Са2+,1,{п24-АТФази (У), НСОо^-АТФазы (Ух) и С1""-АТФазы (III) в субклеточных фракциях имаго

Рис.2. Распределение активности

комнатных мух 2-го дня развития. Условные обозначения: А - относительная удельная активность, равная отношению выхода активности во фр лсциях Щ к выходу белка во фракциях {%). С - содержание белка во фракциях (?£); слева направо - ядра, митохондрии, микросомы, цитозоль.

идентифицированных АТФаз позволило установить уровень АТФазной активности, присущей различным ионным насосам у комнатных мух. Наиболее, активны анионнад НСОд-стимулируемая АТФаза, Оа^-АТФаэа и М^-АТФ-аза, на среднем уровне находится активность На+ .К4"-;Са2+,и '

П

А

5

А

I

К^-АТФаз. Анионная С1~-стимулируемая АТФаза обладает наименьшей аК-

ТЙВНОСТЫО,

При исследовании субклеточной локализации АТФаз установлено, что На+,К+-;К+-;Са^+- и Са^4",М^+-АТФазы обладают наибольшей активностью 'в микросомах и преобладают в них количественно. Мс^+-АТЗша и анионная АТФаза характеризуются высокими значениями удельной актив ности кар в митохондриях, так и в микросомах, но в первых-их содержание в два раза выше, чем в последних ( рис.2 ).

Полученные данные свидетельствуют о том, что каждый из ферментов АТФазного комплекса комнатных мух характеризуется своим уровне;.'; активности и локализацией в субклеточных структурах. Зто определяет; ся разйообразием и объемом выполняемых игл функций, а также соответствует метаболическим и регуляторным процессам в организме насекомых на-определенной фаза развития.

Активность Па4",K*-;ffg^-;Ca2+- и Са*^.Ма2+-АТФаз в онтогенезе комнатных мух. Согласно литературным данным, из идентифицированного нами комплекса ЛТСаз только Ha+,K+-;!.'a2+-;Ca2+- :i Са ,M^.2+-AT3>-азы опосредуют действие морфогенетических гормонов и являются'юте-нью для инсектицидов разных групп и поколений ( Панасешсо и др., 1983; Ilencbuk, Davey ,1987; Shelby et al., 1989; Sattelle, Yomonoto , 1988). Поэтому следующим необходимым этапом нашей работы стало выяснение закономерностей изменения активности наиболее функционально значимых АТФаз в онтогенезе комнатных мух ( рис.3 ). Проведенные ис~ • следования показали, что уровень активности IIа+,К+-;Мо,;(>."•'- :: Са24",Мд2+-АТ£аз фазоспецпфлчон и связан с критически?ti точками раз-■ вития насекомых, когда в их организме осуществляются такие процессы, как линька, метаморфоз, питание и репродукция. Как правило, активность изученных АТФаз повышается в период, интенсивного питания и в период формирования репродуктивной системы. Лйночггые процессы и периода метаморфоза сопровождается снижение" i активности практически - всех индивидуальных АТФаз.

Сопоставление' полученных нами экспериментальных результатов с литературными данными о титрах стероидных ( Sdanok, DenHger ,1987; Bainbridgo, Bovmer, 1988) И ювенильных ( Sakural , 1984; Bogus et al. , 1988) гормонов позволило установить положительную корреляцию мевду изменением активности АТСаз у комнатных мух и титром ювенильных гормонов н$. протяжении всего цикла.развития, а также титром экднстероидов на фазе имаго, что может свидетельствовать об зндокргаг-ком контроле активности ла+,К+-;Мд?+-;Са2+- и Ca2+,',ía2+-ATi5a3 в он-• тогенезе насекомых. '

По оси абсцисс: дни и фазы развития комнатных мух; по осп ординат: активность ЛТФаз ( в ыкг неорганического фосфата на да белка в час).

Гормональная регуляция активности АТФаз у комнатных аятс. Для проверки предположения о гормональной регуляции активности lía*1''IK+-;Mg2+-;Ca21"-; и Са^.Мд^-лК-аз было исследовано влияние . '' экзогенных гормонов ( окдистороиа и ЮГ-ffi) на активность' перечислен- '• них ферментов у комнатных мух конца .«ичиночного возраста, у куколок \ начала возраста к у имаго 3-го дня развития. '! .

В результате проведенных экспериментов показано как цротивойо- '.' лонное, так и. сдионаправлошгоо• действие окдистерона и ИГ-Ш на активность АТйаз, а такие установлено, что характер их. взаимодействия на- • '• ходится в тесной взаимосвязи л зависимости от фазы развития насекомых и природы самих экзогенных гормонов. Исследования по гормональной. •

• Таблица I.

Исследование механизма индукции активности

и у имаго комнатных мух

после обработка ИГ—III и окддстэрсногл

Варианты опыта

"НаТК^-АТОаза

Г

Мд2+-АТйа.эа I Са2*-АТОаза ! Са^.Мд^-АТйаза -1-—1---—-!--

I_Л I

I И !

I П

Контроль

ича

'ЮГ-Ш + акимомишш'Д ' ЮГ-Ш + цуроккшм

Контроль

Экдистерон

Экднстерон + актинсмжпи Д

Экдисгерсн + цуроьпчрш

36,84+0,75 181,45+3,63 250,29+5,58 35,03+0,87

'1.01,75+2,06 +176,2 236,25^1,25 +30,2 286,£6+6,10 +И,5 7Э ,68+1,99 +172,7

23 ,'91+0,48 -35,1 131,73+2,51 -27,4 191,22+4,28 -23,6 9,96+0,23 -71,6

34,5^0,64 -6,2 156,59+2,81 -13,7 203,24+4,56 -18,8 10,5259,27 -70,0

36,62+0,83 • . - 229,13+3,58 261,16+6,70 - 38,06+0,96

124,07+3,51 +266,1 371,65+6,77 +62,2 365,62+8,75 +40,0 56,75+1,61 +49,1

10,03^0,19 -72,6 173,91+2,38 -24,1 238,18+5,06 -8,8 3,31+0,07 -91,3

6,55+0,10 -82,1 268,77+5,25 +17 „3 222,77+5,92 -14,7 21,69+0,46 -43,01

I

О !

Примечание: I - са:гиЕность фермента (вьтиена' а мкг неорганического фосфата на мг белка в час) Ц - антиззгоовашо 'или ингкбироваше фермента (в %)

регуляции ферментов АТФазного комплекса комнатных мух позволяют сделать вывод о том, что мембранная гипотеза механизма действия стероидных и ювенильных гормонов не лишена оснований, так каг нами не только подтверждена исключительная отзывчивость На+,К+-АТФазной системы комнатных мух к воздействию экдасерона и ЮГ-Ш, но и впервые показана индукция активности этими гормонами Мд2+-;Са2+- и Са2+, Мд2+-АТФаз.

Осуществлено-исследование механизма гормональной индукции активности На+,К+-;Мд2+-;Са2+- и Са^.М^-АТФаз ( таблица I ) у шага комнатных мух 3-го дня развития с использованием ингибитора тран-сляцго! пуромицкна и ингибитора транскрипции - актиномицина Д. Оно по* зволило установить, что стимуляция активности изученных ферментов как экдистероном, так и ЮГ-Д1 осуществляется на транскршщионно-трансляциннном уровне.

При изучении влияния димилина и его аналогов, вызывающих силь-ше сдвига в молекулярных механизмах синтеза хитина, установлено, , что они в большинство своем ингибируют активность На+,К+-АТФазы ' ( таблица 2 ), что, вероятно, снижает интенсивность активного транспорта в клетки Н-ацетилглюкозашна, являющегося субстратом хп-тинсинтетазы.

; ' Таблица 2.

Влияние димилина и его аналогов, на активность На+,К+- и Са^.М^-АТФаз

личинок комнатных мух ;

Фермент^ на+,К+-АТФаза ! • Са + ,Мо2+-АТФаза

Варианты опыта. ' ! I ! 1 " ■ ■ ! П ! . ! I I ■ ! П

Контроль Димилин 18,7+0,37 15,09+0,31 . -19,3 ♦ 12,61+0,22 . 27,00+0,68 +12,7

Алсистин -- Э1Ьл Номолт 14,06+0,22 20,32^0,31 10,58±0.17 -24,8 +8,7' 43,4 28,46+0,80 46,'75+1Д2 30,6910,83 +18,8 ' +95,1 +28,1

Примечание: Г - активность фермента (.выражена в мкг ( , • неорганического фосфата на мг белка в чай )

И - активирование или ингибирование фермента ( в- % ) . ,

' 2+ р.

Активность Ca , М^ +-АТФазы возрастала под влиянием ингибиторов синтеза хитина, что, видимо, приводило к уменьшению внутриклеточной концентрации Са2+ и к снижению уровня линочного гормона. Полученные к.лш экспериментальные данные согласуются с одной из Пшотез механизма действия ингибиторов синтеза хитина, рассматривающей мембраны в качестве их .возможных мишеней ( Cohen , 1987 ).

Роль Иа*.К*-АТФазы в выработке насекомыми устойчивости к инсектицидам. Всестороннее исследование биологических мембран в последние года, а также появление достаточно перспективной концепции о том, что мембраны принимают участие в адаптации организма, т.е. являются структурами, которые в первую очередь отвечают на изменения среда приспособительной реакцией, положило начало изучению роли различных мембранных структур в возшшговении и поддержании резистентности насекомых к инсектицидам П-го поколения. Из литературы известно, что различные ксенобиотики ( ФОС, карба-маты, хлорорганичаские соединения и пиретройда), воздействуя на организм насекомых в той или иной мере затрагивают деятельность ферментов АТФазного комплекса. С целью выяснения возможной роли, Ма+,К+-;М92+-;Са2'*'- и Са2+,!,^2+-АТ0аз в механизмах выработки ус-" тойчивости насекомых'к инсектицидам нами проведен сравнительный анализ активности перечисленных АТФаз у чувствительных и резистентных к различным инсектицидам ( ФОС, карбаматы и ппротроидн ) рас комнатных мух. Полученные результаты ( табл.3 ) однозначно указывают на повышение уровня Иа+,К+-АТФазной активности у все:. . резистентных рас, которое составляет для пиретроидов в среднем_ 5&% от контроля, для ФОС - 140#, для мекарбенила ( карбаматы ) -445?. Активность M^-jCa2*- и Са2+,Мд2+-АТФаз тггибиро валясь всеми этими группами инсектицидов.

Результаты опытов по изучению влияния инсектицидов на активность На+,К+-;1"02+-;Са2+- л Са2+,'.'^2+-ЛТ?аз выявляют не только универсальность действу, пиретроидов, карбаматов i. ТСС на различные АТФазы: они также показывают, что активность ферментов АТФазного комплекса у'резистентных рас определяется природой ионного насоса, хишческой структурой инсектицида и особенностями его взаимодействия с биологический мембранагят, в которых локализованы эти ферменты. Кроме того, по отношению к расам, устойчивым к ФОС тт пи-ретроидам,'ясно1 выступает корреляция между увеличением активности Па+,К+-АТФазы и определяемым токсикологически показателем резистентности, что позволило обосновать биохтапчеспиЯ способ оцепгл сос-.толштя резистентности насекомых к шгсектпцидам;

Таблица 3.

Активность На+,1С+-ЛТФази у чувствительных резистентных рас комнатных мух

Фермент Варианты опыта

иа+,К*-Атааза

П

ГЬтротройди Перметрин з

Е

Нвошшамнн з Е

Катзбаматн Ь'екарбенил 3

Е "

ФОР Малатион 5 Р.

Фталофос з и

Хлорофос ¡з

Е "

Этафос 3

и

28,68+1,81 47,81+2,39

27,22+1,09 38,98+1,95

29,75+1,90 42,84+2,20

28,17+1,89 62,00^2,91

29,73+1,90 87,23+5,15

28,17+1,89 58,03+3,77

29,75+1,90 71,16+1,78

+66,7 +43,2

+44,0

+120,1

+193,2

+106,7 +139,2

Примечание: 8 - чувствительная раса •

II - резистентная раса 1,П - см. табл.2.

Исследование физико-химических характеристик выделенной и частично очищенной *Га+,Кч"-АТФазы из имаго чувствительной и ро: -гстен-тной к фталофосу рас комнатных мух осуществлено наш для тЬго, чтобы выявить наличие или отсутствие сдвигов в их значениях, что могло бы в какой-то Мере объяснись причины повышения активности форыонта у резистентных рас комнатных мух. Полученные.результаты.с полной '■.

0,1 0,5 % 1,0.

Рис.4 Определение Км па+,К+-АТФазы^по lía4" I - чувствительная раса ' П - paca¿ резистентная к фталофосу

I - чувствительная раса П - раса, резистентная г. 'Т-гало'Тпсу

опрэделенностью свидетельствуют о том, что константы Михаэлпса (Км) На+,К+-АТФазы ( рис. 4 и 5 ) по АТФ и На+ у чувствительной и резистентной рас очень близки ( 0,9092 и 0,9072 мГ.1, 9,75 и Р 27 мМ соответственно ). Молекулярную массу фермента определяли методом гельфильтрацни через сефадекс 'о -200. Свободный объем колошей (Уо) составил 52,5 мл, а объем элюции На+.К^АТФазы (Уо) - 82,5 га. Значение".относительной молекулярной массы, рассчитанное по эмпирической формуле для сефадекса а-200 1£ Мс = 6,698 -0,987 Уэ/Уо С Детерман,- 1970 ), оказалось одинаковым у обеих рас и равно 140000 Да. Это указывает на то, что причиной вспышки активности

:1а+,К+-АТ0азн в ответ на воздействие фталофоса является изменение количества форманта в организме насекомых. Следовательно, механизм возникновения резистентности следует связывать с транскрипционным и трансляционным уровнями регуляции синтеза данного фермента.

ВЫВОДЫ

1. В гомогенате имаго комнатных мух идентифицировано шесть индивидуальных АТФаз: 'Яа+,К+-;?.*92+-; Са2} - ;1Г;Са'' ,.Мд2+- и анионная АТЗазн. Пять последних обнаружены у комнатных мух впервые. Для как-■дога фермента выявлены оптимальные условия реагацш и субклеточная локализация. ■ '

2. Исследование динамики активности на+,1Сь-;Мо2+-;Са2''"- и Са2"'1", ьЦ^-АТФаз в онтогенезе комнатных мух показало, что уровень активности исследованных АТФаз фазоспецифичол и связан с критическими точками развития насекомых, такими как линька, метаморфоз и репродукция. '

3. Сопоставление динамики активности 11а+,К+-:1,1а2+-:Са2+- и Са ,1"."о -АТФаз в онтогенезе комнатных мух с данными о титрах стероидных и ювенклышх гормонов у насекомых показало, что в течение всего щита развития активность АТФа„ коррелирует с титром ювешшь-ного гормона, а на фазе шаго с титром стероидных гормонов, что свидетельствует об эндокринном контроле активности.этих ферментов.

4. Исследование влияния экзогенного зкдистерона и ЮГ-Ш на активность На+,К"|'-;1.192+-;Са2+- и Са2+,Мд2+-АТФаз комнатшх мух свидетельствует о том, что проявление гормонального.эффекта находится в тесной зависимости' от фазы развития насекомых и' общего состояния обменных процессов у шЬс, ,

5. Из^овде механизма гормональной индукции- 11а+,К+-;Мс]2+^-; Са2+-п Са^,Мд2+-АТФаз у имаго комнатных мух с применением актпно-1.плр:на Д п луроыитпша продемонстрировало, что' регуляция синтеза

АТФазного комплекса ферментов у комнатных глух осуществляется на трансляционно-транскрипционном уровне.

6. Обнаружено различное влияние димиляна и яго аналогов на активность' HaJ .К*- и Са^.Мд^-АТФаз, сводящееся к пнгибированию

Ка+,К+-АТФазы и активированию Са2+,М<^2+-АТФазы, что, по-видимому, сопровождается изменением ионного состава среды вследствие нарушения активного транспорта ионов из-за возникающего гормонального дисбаланса.

7. Сравнительное исследование активности на+,1С+-;М92','-;Са2+- и Са2+,!'92+-АТ$аз у чувствительной и резистентных к ФОС, карбаматам

и пнратропдам рас комнатных мух свидетельствует о существенной ак-тнвацш! Па^.К^-АТФазн на фоне интнбироЕания других АТФаз, что позволяет сделать заключение об универсальности влияния инсектицидов разных групп на ферменты АТФазного комплекса насекомых и, следовательно, о сходстве механизмов их действия, а также об участии отдельных АКаз в формировании резистентности у изученного тест-объекта.

8. Сравнение физико-химических характеристик частично очищенной 1?а+,1С+-АТ5азы чувствительной и резистентной к фталофосу рас комнатных мух позволяет утверздать,'что способность быстро восстанавливать нарушаемый инсектицидами ионный баланс, уменьшал чувствительность мембран нерзных клеток к ксенобиотикам, у резистентных насекомых обеспечивается позитивной регуляцией синтоза фермента на трснскрлпциокно-трансллциогаюм уровне.

Список опубликованных работ по материалам писсерТлштл:

1. Кутузова Н.М.,11ашина Т.Н., Кявотенко Е.Ю., Козлова З.В., 5ам IlroK Хай. Спектрофотомстрическое определение активности хптиназы, трегалазы, тирозина?,ялотрансферазы и АТФазы в го-могенатах iraceicoMiix //■ Метода анализа белков и нуклеиновых кислот в тканях к cjranax насекомых. ¡'етодичзгкие разработки. ?.!., »ПИ! т. Б.И.Лешша - -1989.- Ч.2.- С.41-М.

2. Кутузова Н.М., Коннчов A.C., Козлова 3.3., Иванова Г.Б., Филиппович О.Б. Сравнительное исследова.чпо активности н ач',К+-АТ<Згазы у чувствительных п резистентных рас имзго комнатных мух li гороховой тли // Тезисы докладов 7-го совещания "Состояние проблемы резистентности вредителей и возбудителей болезной растений к химически средствам защиты и ее преодоление. Рига, В!ПЕ!ЭР;

■ IS8S.- С.73. ;

3. Ко зло за 2.В., Кутузова Н.!,!., Филиппович Ю.Б., Черепанова 33.'.!.

Влияние экзогенных гормонов на активность АТФазного комплекса ферментов комнатных мух // Деп. в ВИНИТИ. 13.II.90,- Я 5692-В90.- 18 с, 4. Козлова Е.В., Кутузова Н.М., Филиппович Ю.Б. Исследовало активности АТФазного комплекса ферментов в онтогенезе комнатных мух // Деп. в ВКШТИ. 14.11.90.- * 5726-В90,- 10 с.