Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность соматотропина свиньи: идентификация и характеристика форм гормона, их спектр и содержание в онтогенезе

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность соматотропина свиньи: идентификация и характеристика форм гормона, их спектр и содержание в онтогенезе"

Раба:« выполнена в охде» гений инхэнэрии Института мэзакупярнэй биадзгвв в генетика ЛИ УССР и лабвратараи геве-икв Украи acoro научно-вссдедаветельсшгг института свино-аодогла

Еаучннй руовэдвтгпь: докгар бизлзги ческах наук C.C.Uaxsia

/

Официальные ошалеата: дэктзр биа лаги ческах наук

Ведущая зргазЕзацзя - Украинский каучнэ-исслвдогахельсклй внстатут жвзэздэюдсгга, г.Харыоа

я часов на аасгдавяв Сшциазшзврэваязэга cásese 2 016.II.01 Идсилута юзю^улярнзй биогагии в генетика АН УССР

С диссертацией южна ознакомиться в библиотеке Института ювкудяряой бвэлзгаа в гегетакл АН УССР.

Н»ф.Сгарэдуб

кандидат биологических наук В.Л.Гдазкэ

ю адресу: Кива-КЗ, угиЗаболэгяаго, 250.

Автореферат разосдая "Д? "¿pf&^rf. 1992 г

Учёная секретарь Свецаалазарованюгэ совета кандидат баалэгичесЕВх нау

ОЬьдЯ ДАШХЗЕ£0Ш1А РАБОТЫ.

1.1. Актуздькзоть теак. а йосдйдзэанйяд рост к разв»:::??. .'гзодигзшкх згэезе ыезго асе где зансазлэ кзучеяпе ежа:: спит г - 2в£Когэ пзжлелгкднзгз регузяхзра рззтз " ааугкньз: ззовзв о .и* за лева синтезируеызгз клетками передней зэдй

Значение этой теыы для се льскохззяйстзенньзс наюгЕьк, в чаемзигя для свиней, в наемжее время олредзлязгея ¡тег.-,!«-разработка таких, азвых методических пздхэдзв для излучения ьг- • зотнкх с высокой энергией роста как создание трзясгеянкх свиней, применение препаратов рекоибинаятнзгз соыатотрэпияа, разработка ¿етэдзв раннего прогнозирования продуктивности и оценки гедзти-105 требует хорошей изученности как саызгз сзкатотрзпина, так а механизмов реализации его эффектов.

5 последние годы внимание исследователей привлекает гетерогенность соыатзтрзпинэ, изучение которой, как полагает, из кет аяеоти ясность в понимание ызлекулярных механизмов действия этого полидункцизнальнзгз хориона. МнзЕествеаньв дораы соиатзтрзли-на збнаруьены как в гипофизах, так и крэви шхзгих видзв хивзт-ных. Они отличается рядзы физико-химических характеристик, овз-лзгичеекзй активностью, но их молекулярная природа и £йзиэзпги-чеекзе значение аз многих случаях остается неизвестный^. а пзл-кэ2 керв это откосится и к сэыатзтрэаину свиньи: виеазЕзся си--денпя не позволяет сделать выводы о .природе раздай;® внкъ^едкь-д оубфракаий этого гзрмзна ( Згб&^ег «¿г. . вестнз лись, что они различаются электрэфзретическзЕ подлинностью, изззлеЕгрическикк и чеэие и, 'зззазккэ, ааваэкгвдзтша! езотавзы. Принципиальны» в изучении гмерзгеяязсти езивтзтрзп;— на является вопрос о прзвехзкдениа егз ¡¿эры: либо они зОрз^гт-ая з результате посттраясляциокных мэди^зкаднг дзигнпрукех

ррак гэргзЕе (ззаизана прегэризна), либо оаи яашштся прадух-таиз разных гензв гзризна рэсха.

Драайчеош на взучеи вапрэс а ге тора ганво ста соыатэгра-льеь ж дззрастнзы аспекта, хзтя, как яаы вредотавзшзтся, Ев раг-

гтзпах актзгенеза ызгут дзвсхвзвать разяш фзрмы гэпызне, :;ыашЕЕ ЕездаЕаювув фазаздэгасгскуэ Еапразлэнносгь.

2 азгэл, всоледэзанй! разлачаых стэрзк гетэрогзанватв сг-«агзхрзввга свиньа дззззлат яучаэ дэнвиать прокосы, ивацие I аснзвв рзсга I разлагая аваогних.

1.2. Цепь, и задачи исследававкя. Осйзвезй цагьз данной ра-озты явдвзтся изучение гетврэгеннзсгв сзиатзтровянз саанга.

£ частные задача азэдиза:

1. Выделить юнаыераыг формы сзватэгрэпава свинье.

2. Изучить фигита-хиыичэские свойства юнаызргшс фзри сзкахэграшша свинья с цзльв выяснения прирзды па различай. '

3. ¿деЕгвфыцароЕать агрегирззандьэ фзрщ соаатогрэсЕЕв свиньи £ препаратах г экстрактах гвпзфизвв.

4. Изучать спектр фори свыатзтрэпина 2 препаратах а экстрактах излученных иг гяпзфизав свиней разных этадэв агтэгеваза, определить отнзснтельнзе содераание изноиэрных форм гор-

мзее.

Изучить сздеркааие иатричнэВ РНК для саыатотрэпинв х гяпзфвзах свиней разных сзадий развитая) как один иг пахазате-лев интенсивности синтеза самататрэпина.

1.3. Научдая нзвизна работы. Впервые а результате лрепара-ткензгз электрофореза препарата сзматзтрзпина свинки аыдехвжа

четыре мономерные формы гормона и изучены их некоторые физико-химические свойства.

Показано, что форма 3 соматотропина свиньи с иопекулярной массой 26 Щв представляет собой гликозилированный соые-тотропин, углеводным компонентом которого является ß-глыкозэ в ли £>-ыаяяээа.

Обнарукены агрегированные формы соматотропина свиньи с молекулярной массой 80-100 кДа и 45-60 вДа.

Впервые изучен спектр мономерных и агрегированных форм соматотропина свиньи в возрастном аспекте. Показано, что спектр ыономерных форм гормона имеет возрастную зависимость, определено их относительное содеркание в препаратах и экстрактах гипофизов.

Впервые изучено содержание матричных РНК для соматотропина в гипофизах свиней разных стадий развития. Показано, что в гипофизах плодов и новорождённых поросят содеркится значительно больше матричной РНК для соматотропина fio сравнению с 9-ти и 4-х месячными кивотными, что предполагает соответствующий более высокий уровень синтеза гормона.

1.4. Практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют представление о процессах лежащих в основе роста

и развития еивотных, и могут быть учтены при создании ileoej-продуктивных трансгенных свиней и препаратов, стяну ли рувц;;х posa кйвогяых.

1.5. Апробация работы. Основные полоеенея диссертации доложены: на конференции молодых ученых и специалистов, пзсгя-ценнзй памяти Бондаренко A.C. (Полтава, IS86), на Л Всесзсз-кой конференции по гатогенетикэ седьсЕохозягсглеангас zísотньд (Лен;:нград-Пуыкин, I9S3), на Ьсесзанзг ганферекиs югздкх

ученых "Современные методы исследований 2 свиноводстве" посвященной ЬО-летию Полтавского научно-исследовательского института свиноводства (Полтава, I99Q).

1.6. Публикация результатов исследований. По теш диссер-

>ч

тации 'опубликовано 2 статьи в 6 тезисов.

1.7. Структура и объем работы.! Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и-методов исследований, результатов собственных исследований и их збсукдения, заклычения и выводов. Список литературы включает 354- наименований, из них 128зарубекных. В работе содержатся 5 таблиц, 25 рисунков.

2. МАТЕРИАЛЫ И МКТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе использовали гипофизы свиней {Jus Serofü, ) круп-аэй белой прроды четырех возрасшэ-в: плод свиньи 90-Ш0 дневного возраста, новорождённые. поросята, 4-х и 9-Ш-ти месячные свиньи. Гипофизы отбирали сразу после убоя и заморавдвали в аидкоы азоте.

'Получение препарата обогащенного соматотропином производили фракционированием экстрактов гипофизов оульфатом аммония по метод? tetis * . (1961).

Экстракты гипофизов готовили путём гомогенизирования ткани в 0,051« t/^Otf с последующим центрифугированием при 35000 ^/мзн. (Мартыненкз Ф.П., Сахно Т.О., 1975).

Тотальную PHtt из гипофизов получали по методу Мйигег£А а€ . (1976).

Выделение ллаэыидяой ДНК проводили согласно процедуре ¿itiifat« Ootg J, (1972) с последующим р'авновесным центри-дгарзваазеи в градиенте хлористого цезия с бромистым этидием.

Расщепление ДНИ эндонуклеазами рестрикции лрэвэдяли в услэвияг согласно рекоиендациям фиры-изготовителей. Для выделения фрагмента длазмиды pßCH 1 . (зонд гена горыэна роста) использовали электрофорез а агарозноы геле (Ыаниатис Т. и др., 1984). .

Мечение ДНК ^Р-изотопоы производили методом нин-транслг-ции а с использованием фрагмента Нленоза ДНй-лолимеразк с. сЖ' (МаниатисТн др., 1984). Гибридизацию нуклеиновых кислот о мачее-ной пробой проя>дили на нитооцеллшшзных мембранах согласно рекомендациям фирмы IkMlamMfü.(1985).

... -

Иыыу но детекции соыатотропина осуществляли с помощью реакции преципитации в геле методом двойной радиальной имнувэдиффузяи лэ ^хтерлони. использовали вксокослецифическув антисшэротку к сома-тотропину свиньи предоставленной Галочкиным В.А., секгэр иииунэ-бизтехнологии, ШШФБиП. Для биотестврованья сэматззрэлина гапэяь-зовали иетод увеличения массы "тела гшюфизэктомирэаанных крыс.

Концентрацию белка определяли двумя способами: с лектро фотометрически по Изчетозу Г.А. (1971) и до мзмду &гвс/£оге( (1976). "

лзяцэятрадию яуклеяяолых кйслог определяли спекгрэфьтэиет-ри чески а ыкг/ид по формуле С=Арт*50 (для ДНК) и (дд*

• ч - • *

РНК). '

Ионообменнув хроматографию белков проводили г колзд» с DE5Z -целлюлозой и яа хроматографе системы FPIC- с лсязльзэагнвем колонки Uluto Q 5/5 (РблгшйЫсь ).

Электрофорез белков выполняли а пластинах полжаяралша»-ного геля тремя методами: I. Диск-электрэфорез до ilsypepy (1371); 2. Электрофорез в присутствии PS-л(шстак и.Е. я др., 1ЭЭЭ);

3. Электра форе з по Oj&rh JJ, (1969). Окрашивая да бел-

ков в гелях производили Кук ас си ярко-сишш И-250 (Гааль Э. и др.

> ' „

та) я сер-збреяиеи (ßwaWoH а. , MJ., 1984). Скаяирова-

аие звектрофореграмм осуществляли на лазерной денситометре UUro-Scan XL ;.

изоэлвнтрофовусировавие белков производили в пластинах

пэлиакридамидного resa no прописям фирмы-изготовителя амфоли-

тоа - р/л Хвйу-Надур (Эстония), t. >

Зыявпвняе в идентификацию углеводных компонентов белков производили с шшодьв реакции тзрмокения агглютинации эритроци-тоз лекинамя (Дуцик М.Д. я др., 1981) и реакцией преципитации

V -V • ...

глякэяротевдов л геле.

Амяномсломай состав определяли с помощью аминокислотного анализатора АД&-Я8 (93ФР). Пробы гидролизоваля 5,?Mï/ce при Ц}°С а ааккууш- S запаянных ампулах в течение 24 часов.

Для определения А'-концевых аминокислотных остатшв ncnoi говели реакции с дансялхюрадом с последующим гидролизом белка i хроматографией дансильных производных.

Выявление остатка .фосфорной кислоты в белках проводили со:

ласно рекомендациям Филиппович Ю.Б. с со авт. (1982).

. . - . -

3. РВЗ-ДЖАТЫ СЮБСТЖНЙЫХ ИСйВДО ВШЩ и их ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Быазление мнзвествешшх форм соматотропина свияьв.

молекулярная масса известных пяти субфракций гормона, по; рода различий которых не установлена, соответствует его монэме; ho.'îj заргангу ( SeUte^t^м. t.4-a¿.1 //лг.). Нз первом этапе работ;

Рис.1, гель-фильтрация препарата эбэгацённэгэ сэыатзтрэппнзи на се^адекса Г-Юо

\

1

•й

-5

Рис.2. Диск-эле ктрэ форе з препарата иэноыера сэыитэтрэпина свиньи в ПАдГе, рН 8,9. I ... -5 - компонент препарата э ... - 5 - "кислые" аинздпш кэылэненты

стояка задача получения препарата мономера соматотропина свиньи, проведения его физико-химического анализа и идентификации форм гормона. Предполагался такае поиск агрегированных фора соматот-сзпина свиньи.

3.1.1. Получение препарата мономера соматзтропина свиньи.

Для получения препарата мономера соматотропина свиньи использовали серию экстракций гипофизов по методу (1961) а последующей гель-фильтрацией на колонке с сефадексом Г-ШО, азс.1. Отбирала фракции с молекулярной массой 22* 4 «5а соответствовавшей мовомернои форме' гормона, материал которой по данный электрофореза более чем на 80^ представлял собой очищенный сома-тзтрэпин и хзрошэ реагировал с антисывороткой к соматотродину свиньи в реакции двойной радиальной иымунодиффузии по методу Ух-тэрлзни с образованием одной полосы преципитации.

Для биологического тестирования сзаатотропина препарат подвергали дополнительной очистке на колонке с ДЕ52-целлвяозай в 0,01М трис-форыиатном буфере с использование!) градиента концентра циичМ^. Выделенный высокзочищенный соматотропин обладал активностью гормона, роста, как определено с помощью теста увеличения массы тела'у гипофизэктэмированных крыс.

3.1.-2. ®изию-хиы»ческая характеристика препарата ызнзмэра соыатзтропина свиньи.-

гехрзматзграфвя препарата мономера соматотропина свиньи на гефадексе Г-ЗЭО не выявила егз геторогенности. На кривой элюиро-эзавя выделяла я одая пза с из пекулярной массой '¿¿г 4 вДа.

Диск-электрзфзрзз в ШАГе при рН разделяющего геля 8,9 об-езруезл гзтерзгеяносгь препарата. йаряду с основным компонентом,

обладающий сравнительно низкой злектрофоретической подвижностью, выявляется четыре минорных, три из которых имеют высокую скорость миграции в геле. Соотношение компонентов было следующим: основной составлял 56-65%, минорные- 6-7%, Ю—1255, 19-23%, 0-5%. Диск-электрофорез при рН разделяющего геля 4,0 выявил только один компонент со слабой электрофоретичсакой подвиеностье. В целом результаты электрофоретвчестго анализа препарата в недзнатурирувщих -условиях полностью совпадают с данными опубликованными М.

Ы аС. (1982), рад.2,

»■•V- 1

йзозлектрофокусирование препарата в пластинах полиакрилаыид-ного геля в диапазоне рН 9,0-4,0 также обнаружило пять яэыпонен-' тов с изоэлектрическими точками (ИЗТ) основного рН 7,70 $0,05), минорных рН 7,6 (^0,05), рН 6,35\* 0,05), рН 6,30 (т0,05), рН 5,60 0,05). Значение ИаТ компонентов препарата мономера соматотропи-

г _ *

на близки значениям ЙЭТ гормона и его субфракций определённым другими авторами. ШТ соматотропина. свиньи по

(1962) составила рН 6,3, тогда как М- , (1981,1982)

> . - . " ' \ ... . приводит следующие данные: ШТ основного.компонента - рН 7,6, минорных - рН 7,7, рН 5,8 и двойного - рН 6,4. В изолированной последним автором "кислой" субфракции соматотропина обнаружено'ещё три слабоокрашиваеыых компонента о ИЭ'Г оюло рН 5,0. Очевидно, определённое сходство нашего препарата и препарата гормона полученного $с.(\1ечсгМ\ по числу и ИЪТ компонентов за исключением комлокс-ь-тов с рН около 5,и.

Ионообменная хроматография препарата на ДЕ52-цвллюлозе х трис-форниатной системе (рН 8,0) в ступенчатом градиенте концентрации элюирующего буфера по схеме предложенной М.

. (1982) позволила разделить его на четыре фравэди, причём ха-

- О к. • '

р актер соевой элюирзвания бил подобен хэй какую получил указан- • автэр при ¿ракциэнированив вксокза чищенного соматотропинв

СВЕЕТЕ. ■

Злектросорез препарата мономера саматэ тропина свиньи в ирисутстввг и*-лга% обнаруккл основной исполнительный компонент с молекулярное массой соответственно 22 и 26 «Да. Выявлялся такке слабый компонент с молекулярное массой-23 кДа.

Значительное сходство характера фракционирования и декодерах фи эй ко -химических свойств нашего препарата и сопато тропина полученного ^¿¿е^егМ.а£. 11979, 1982) привело к мысли, что многокомпонентно сть препарата ыонзмера соматотропина свиньи хотя бы отчасти является следствием существования нескольких мономерных форм гормона роста, соответствующих формам, обнаруженным

3.1.8. Идентификация компонентов препарата мономера соматотропина.

Для идентификации компонентов препарата мономера соматотропина был проведен препаративный электрофорез гормона в ПАдГе при. рН 8,9. Основной и минорные компоненты элюировали из геля электро-алкшей, диализовали против . и концентрировали. Полученные, образцы использовали для иммунодетекции с использованием высокоспе-ш; ¿к чес кой антясывэротки к соматотрояину свинье.

Были получены следующие результаты: компоненты 1,2,4 и 5 препарата мономера соматотропина свиньи реагировалис антителами к со-ыатотропину, образуя одну полосу преципитации; компонент.3 не реагировал с аятисыворотю й. Картина вэаимораспзховешш полос преципитации позволила сделать заключение, что компоненты препарата I, в 2 имеют одинаковые или очень близкие антигенные детерминан-

ш - .

ты я являются формами соматзтрзпина свинья. Кзмизнеят 5 препарата не реагировал с антисывзрзткоа и был иденти^пцирзван как прз-лактин свиньи. Зтзт вывод.был сделан пз результатам 'определения егз ызлекулярнза массы (23 кДа) и электрофоретичеокзз пэдвижнзст;;.

3.1.4. Агрегирзванные^зриы сзмахотропина свиньи. При излучении препарата мономера соиаютролпнз сзияьи в фракциях 2 и 3 гель-фальтрации, рис. I, выходил материал с узле-кулярнзй массой сззтветствекнз 80-100 ада и 45-60 ьДа, кзтзрып при анализе электрз^эреззи а иииунздетекциеа збнаруаивал присутствие соматзтрзпина, чтз лззвзлилз сделать вкззд з наличии з препаратах гормона агрегированных $зры гормона с молекулярной массой 80-Ш0 и 45-60 вДа. Такие агрегирзвашше ¡ррмы сзиэтзтрзпзнэ присутствуют и в экстрактах гаязфиьэз свиней: пра их гель—¿идьтрацли на кривой элюирзвания збнарукиваются лака с тэеоя гг мзлекулярнзй массой, материал которых реагирует с аятвсыззрзткэз к сэматзтрз-пину.

3.2. Характеристика идентифицированных ызнзиерннх форм соиатотропинз свиньи. Установлена молекулярная масса идентифицированных но ноу аров горазна. Доминирующая форма соиатотрзпина (компонент I препарата) а форма 2 (компонент 2), как определена электрофорезом пз у/г&г^-,

М. (1969;, имели молекулярнуи масс^ 22 ада, ¿зраы 3 и 4 (соответственно вомпоненты 4 и 5 ) зюлз 26 1йа. Выявляемую Озлез высэкую мзлекулярную массу фора 3 и 4 пз сравнению с оснзвнзй нельзя объяснить тем, чтз какая-либо за них является двухцепзчеч-ным вариантзм нативного гораона, образованным расцеплением белка по одной пептиднзй связи,так как разрушение дисульдйдных связей не приводило к образованию двух пздилептидов и сравнительно нзз-

■ - II кэй молекулярной массой.

Проведено сравнение аминокислотного состава основной и минорных $орн гормона, определены //-концевые аминокислотные остатки.

По аминокислотному составу основная и форма 2 соматотропина не различались, табл.1, Не различались мевду собой такке и формы 3

'Ч

л 4 соматотропина. Однако, обнаружены заметные различия между соыа-тэтропинами формы I а 2,с одной стороны,и формы 3 и 4,с другой. Гак горны 3 и 4 содерЕали больше гистидина и меньше фенилаланина и лизина. Обнаруживается тенденция к увеличению аспарагиновой и глута-лияовэа аминокислот в гидролизатах форм 3 и 4 по сравнению с основной'и формой 2.

. . Таблица I.

Аминокислотный состав (число останов) идентифицир&вая-ных форм аоматотрзпина свиньи.

Аминокислотный : „_Формы, соматотропина____■

остатки : . 1-' ■ г - г : 3 : 4

. 17,00 • Г?,70 18,90 18,30

' ТЩ/г ' 4 П, 15 , 0,90 _ 11,20 9,80

13,2) ; 14, 90 ■ 15,05 12,19

¿52«. 2ь,90 25,23 , 28,40 27,23

Л-о 9,83 э,аз 8,30 .9,00

Ма, ! 16,25 18,10 17,75 18,30

Уй£ У,20 7,60 "'8, а 9,43

3,29 3,60 3,95 4,96

5,23 6,40 8,05 9,13

¿г«. . а>,ш . • 23,95 19,00 19,62

7,30 • .6,60 "б,55 "б, 30

го 11,50 11,90 6,23 7,20

- "4,83 . "4,04 6,15 .6,65

V ;. ; п,оо * 9,69 . 8,23 7,72

II,Ю 9,44 11,30 13,98

Определенна У-концевого аминокислотного остатка далз следующие результаты: основная форма сэматотропина и форма 2 имели на У-конце фенилаланин, формы 3 и 4 - лейцин.

Таким образом, между формами гормона I и 2 а формами а а 4 существуют определённые различия,-относящиеся,, очевидно, к первичной структуре молекул. Можно яредлолэкпть, что кроме- уае кяо-норовакного гена гормона рэста кодирущего доминирующую форму соматотрзпина и форму 2 в геноме свиньи присутствует ещё эдин, имеющий, по сравнению с первым, ряд нуклвзтидяых зам?н, ответственный за синтез форм 3 и

Увеличенное отнодвние отрицательно зарякенньк аминокислот к до ланите явно заршенным в экстрактах ¿оран соматзтропана 3 а 4 могло бы объяснить их большую по сравязаив с основной электрофо-ретическую подвижность, нэ не ыэгет объяснить более высокую скорость миграции формы 2 и 4 по отношении, соответственно, к форма и I и 3. Одной из причин этого макет являться фосфарилирование белка. Для проверки этого предполокения было проведено определение остатка фосфорной кислоты в образцах,' содержавших идентифицированные формы-соматотропиьа, которое' Ьднакэ дала отрицательные результаты.

Известно такзе, чтэ высокая скорость миграции в геле некоторых вариантов соматотропина мокет быть связана с апеллированием У-концевого аминокислотного остатка и. /УЛ> ).

ч

Однанэ, в идентифицированных нами формах соыатзтрэпина //-концевая аминокислота не блокирована ацетилом, так как была способна реагировать с даней лхлоридом при определении ^-концевогэ аминокислотного остатка. Возможно, что имеет место дезамидировааие соматотропина, приводящее к образованию вариантов гормона с узе-

13 - ;

*

личенной скоростью миграции.

Более высокая so сравнению с основной формой соматотропина молекулярная масса форы 3 и возможно, результат не различий или не только различий в их первичной структуре, а следствие гли-кэзикйсования белка. Для проверки этого предположения проведен анализ препаратов идентифицированных форм на присутствие углеводов.

Были получены результаты, которые свидетельствовали, что в препарате формы 3 соматотропина присутствовали остатки. £)-глюкозы ала й-ыакноаы, в препарате формы 4 - возможно наличие сиаловых кислот или аминоСахаров, имеются остатки лактозы. Ь-глюкозы или ü-ыаннозы. ато даёт основание полагать, что формы 3 и 4 соматотропина свиньи, очевидно, гликозилированы, причём, в случае, если углеводный компонентом формы 4 является сиаловая кислота, имеющая значительный отрицательный, заряд, то эта форма должна обладать более высовзй эдр«3!рофоретической подвижностью, чем форма 3, что и наблюдается upa jasaктрофорезе в ПМГе при pü 8,9.

Были получена прямые доказательства, чуо форма 3 соматотропина свиньи гликозилирована. В реакции преципитации наблюдали слабые, но достаточно отчётливые полосы, образованные лзктином с формой 3, что свидетельствовало о наличии у этого варианта гормона углеводного компонента, остатка D-глюкозы, или D-манназы. Образец формы 4 соматотропина свиньи в такой реакции не образовывал преципитаты.

Обнаружение углеводного компонента в форме 3 соматотропина дзет дополнительное подтверждение предположению о существовании в геноме свиньи ещё одного гена гормона роста, отличающеюся от клонированного. Ом основано на том, что У-связанное глишзилирова-н;;е белка, как правило, требует присутствия последовательности

Тбг ), которая не кодируется известным геном. Такая ситуация,- например, характерна для соматотропина человека, где гликозилированный гормон является продуктом-вариантного гена.

3.3. формы соматотропина свиньи в оитогенезе.

3.3.1. Изучение спектра форм сомэтотрэлина в лрепаре-■ • •■. тах мономера гормона полученных в s гипофизо! свиней разного возраста.

Проведено изучение спектра молекулярных форм гормона в препаратах мономера соматотропина полученных иа гипофизов свиней 4-х возрастных групп: плод 90-Ю0 дневного возраста, новорождённые поросята, 4-х и 9-ти месячные кивотныз. Представлялось, что на таких контрастных по физиологическому состоянии этапах развития ïioî"ут действовать разные формы соматотропина.

Из 2Э-40 гипофизов каждой группы животнаг суммарно были получены препараты мономера соматотропина в проведен анализ электрофорезом и лзозлектрэфокусирз-ванием. Оказалось, что если в препаратах из гипофизов свиней 9-ти и 4-х месячного возраста на электрофоре граммах обнаруживались основная и три минорные формы соматотропина составляйте соответственно ■ 68%, 7%, 2.2$ и и-3$ всего мономера в образце» то во всех препаратах, полученных из галэфи-зов новорокдёшшх поросят и плодов, в пределах чувствителшости метода окрашивания гелей серебрением, "кислые" минорные формы не выявлялись, основная фораа составляла 92-95% мономерного соматотропина, фориа 2 - 5-8/5. Подобные результаты были получены и ¡.pz анализе препаратов изоэлектрзфокусированием. Сравнение суммарна препаратов соматотропина, полученных отдельно от кенсних г иуксгь^ особей изучаемых групп кивотных не выявило качественных различий.

Представленные результаты свидетельствуй о том, что наличие в препаратах мономера тормоза "кислых" шторных çopn не азлагтся

следствие« модификаций дативного белка связанных с процессом выделения, прослеживалась чёткая зависимость спектра форм

от Еограстз кизотного. Очевидно, эти £,ормы гормона существуют в гипофизах >и V,V«? .

а.о.2. изучен;® спектра к относите лшо го содержания форм саааютрояина в экстрактах гипофизов свиней разного возраста.

"Спектр форм соматотролина в экстрактах гипофизов изучаемых групп животных определяли путём фракционирования белков экстрактов электрофорезом в 11ААГе при рН 8,У и выявления зон соответствующих-формам гормона, ¡¿аркёром для этого служил образец препарата мономера гормона, который использовался для ямыу-нодетекции форм гормона.

»см

На электрофоре граммах для^возрастных групп свиней выявлялась основная и форма 2 соыатотропина. Для 4-х и 9-ти месячных свиней в положении, где мигрирует "кислая" минорная форма 3 наблюдалась соответствующая хорошо окрашенная зона. Для плодов и ново рожденных поросят в этом положении обнаруживается лишь очень слабо выраженная'зона. Форма 4 двигалась вместе с неиден-твфицированным. белком экстракта, её присутствие не определялось.

Для количественной оценки содержания основной и формы 2 белки экстракта разделяли электрофорезом в ШаГе в денатурирующих условиях с использованием трис-ацетатной буферной системы. Такой подход позволил чётко выделить зону соматотропина с ыопекулнр-нзй.ыаесой 22 кДа. Результаты лредставлевы в табл. 2.

13 и .112 £

Относительное содержание осязано а-и формы 2 сзматзг-рзпина л экстрактах гипофизов' свиней.

группы : айвот- : ных : число аи-: вотных в : группах : относительное сод5ркан:!е: соматэтрзпина : ■ 2 Чь : С

г 2. : 3. :

1ЧБ99 6 15,71 + 0,у7 2.57

КБЭсГ 6 25,83 Т 1.21 ¿,195

КЕ49 6 13,35 + 0,89 2,15

КБ4сГ 6 18,09 + 2,05 3,57

ПБНО 6 25,У + 1,73 3,86

КБНсГ 6 23,88 + 1,03 2,30

ИБП? 8 5,68 0,68 1,56

КБП 8 12,56 N + 0,54 1,33

Примечание; КБ9 и КБ4 - соответственно 9-ти и 4-х месячные сзаяьа крупной белой породы; НБН - нзворокденные поросяна; КБП - плод.

Количественная оценка относительного содержания фора 3 и 4 сомамтропина в экстрактах гипофизов мокет быть дана только очень приблизительно и исходя из их доли в препаратах мономера соматотропина свиньи, которая составляет суммарно третью часть от содержания форм I и 2, то есть 4-8%. При этом следует учитывать, что отношение форм в экстрактах и препаратах моает быть неодинаковым.

В нашзм исследовании таете определялось присутствие агрегированных форм соматотропина в экстрактах гипофизов свиней четырёх возрастных групп. Гель-филырация экстрактов с последующей'иымуно-детэкциеа-гормона в материале фракций показала, что как в гипафи-

зах полоеозрелых и 4-х месячных свиней xas и новорождённых поросят и плодов обнаруживается агрегированные формы соматотропина с молекулярной массой йО-ЗЗО вДа и 45-60 нДа.

Таким образом, приведенные' результаты позволили сделать вывод, что спектр идентифицированных форы соматотропина свиньи амеет зозрастЕув зависимость. 3 препаратах и экстрактах гипофизов плодов и новорождённых поросят "кислые" ыономерные формы гормона либо отсутствуют, либо содержатся в очень низких концентратах, тогда как для 4-х и 9-ти месячных свиней их доля доходит до 2% всего мономерного гормона в препаратах и, возможно, до 8$ экстрагируемых из желез белков.

3.4. Содержание матричной РНК для соматотропина в гипофизах свиней разного возраста.

Наряду с изучением спектра форм соматотропина и их ттноси-те льна га содвргэния в гипофизах свиней разных этапов онтогенеза представляла интерес одновременно определить содержание матричных РБК для соматотропина в эти периоды как один из показателей интенсивности синтеза гормона. Эта работа выполнялась с использованием метода dol-гибридизации тотальной РНК с зондом гена гормона роста.

3.4.1. Проверка специфичности зонда гена

» •* н,

гормона роста.

а качестве зонда предполагалось использовать фрагмент кДНК гена гормона роста свиньи клонированный в плазыиде лаз-

мзда рзси! ), Однако, при анализе клонов из библиотеки вдНК выяс аззось, что зонд гибриди зов алея с плазиидно й ДНК даве при жестки условиях отиывки. Это обстоятельство поставило под сомнение спе-

цифичязсть выбранного зонда, возникла необходимость его проверки. Для этого фосфотриэфирным методом были синтезированы два олнго-нуклеотидных фрагмента размером в 47 а 51 нунлеотид с перекрывающимся участком з 8 нуклеотидов, последовательность которых соответствовала гену гормона роста свиньи. После отжига однонитезых

я?

фрагментов и их достраивания а присутствии меченных Р дезокси-рибонуклеотидтрифосфатов синтезированный зонд был использован- для анализа фрагмента нДНл из плазмиды . оказалось, что на-

ряду с отчётливым сигналом на последовательность нуклеотидов для соматотропина в экснерементах и с/с4- гибридизации син-

тетический зонд дает такой.же сигнал и с плазмидоа рё£12г. Последующий компьютерный анализ последовательностей нуклеотидов плазмиды ^,££522 и зонда позволил обнаружить в составе плазмиды 9 областей гомологии С4)-50#)'к зонду.

В целом, выполненная работа позволила сделать заключение о специфичности зонда из плазмиды уьЛглЧ к гену гормона роста и его пригодности для определения концентрации ыРКК для соматотропина.

3.4.2. Содержание.матричной РНа. для соматотропина в гипофизах.

Используя с!о{~ -гибридизации РНН с зондом гена гормона.

а,

роста свиньи с последующим денситоыетрированиеи радио авто градр в сравнивали содержание аРНК для соматотропина в препаратах тотальной РНК из гипофизов плодов, новорождённых, 4-х и 9-ти месячных животных. Установлено, что степень гибридизации зонда с тотальной РНК из гипофизов плодов и новорождённых поросят приблизительно в три раза выше, чем степень гибридизации с тотальной РНК из гипофизов 4-х месячных животных и а четыре раза выше, чем с тотальной РНй. из гиюфизоз 2-ти месячных свиней, что свидетельствует о сэ-

ответствущем более высоком содержании мРНК для соматотропина в гипофизах плода а в новорождённых поросах. Не различалась между собой со относительному содержанию мРНК для соматотропина в гипофизах плоды г новорождённые, не обнаружено половых различай.

Пакли образом, в поздний лренатальный период онхогенеаа и период новорождённо с ти в гипофизах свиней содержится значительна больше мРНК для соматотропина, чем у жиаохных 4-х в 9-ти месячного возраста, что, очевидно, свидетельствует о более активном синтезе соматохролянв у плодов и новорождённых, результатом которого является высокие уровни гормона а их крова (Панд У.Д.Даупт К.А., 1983). С другой стороны, s эти периоды развития а гипофизах обнаруживается только две формы гормона: основная я минорная 2, причём их относительное содержание в гипофизах различается, так у плодов оно значительно ниже, чем у новорождённых поросят. Можно предположить, что активный синтез соматотропина у плодов не приводах к существенному накоплению гормона s гипофизах. В гипофизах новорожденных при активном синтезе основной в формы 2 соматотропина, очевидно, имеет место депонирование гормона* Депонирование гормона при более умеренной его синтезе, вероятно, происходи у 4-х я 9-ти месячных саинев, у которых наблюдается высокое относительное содержание основной и формы 2 соматотропина в гипофизах. При атом у животных этих групп а железах обнаруживаются ещё две "квелые" формы гормона: гликозидирааанный соматотропия s форма 4.

ВЫВДЫ

1. Выделено и охарактеризовано четыре моюмерные (основная в три минорна) формы соматотропина свиньи. Показано, чхо основная и минорная форма 2 соматотропина отличаются от "кислых" форм 3 и 4

по аминокислотному составу в M-концевым аминокислотным остаткам.

2. Обнаружена, что форма 3 исследуемого гормона с молекулярной массой 26 i£a представляет собой гликозидироаанныЯ сомагл-

- а

ропин, углеводным компонентом которого является Ь-глвкзза алз О -аанноза.

3. По результатам анализа выделенных мономерных фора соматотропина выдвинуто предположение, что "кислые" формы 3 и 4 контролируется геном гормона роста отличным от уде известного.

4. В экстрактах а препаратах гипофизов свиней идентифицированы две агрегированные формы соматотропина с молекулярная массой 45-60 кДа и 80-Ш0 ¡¡Да.

5. Изучена возрастная зависимость спектра моязмэрных и агрегированных форм соматотропина. В препаратах из гипофизов плодов г но во рождённых поросят "кислые" мономеряые форма 3 и 4 не обнаруживается, тогда как в препаратах 4-х и 9-ти месячных свиней их доля доходят до 25$ Есегэ монзыернзго гэрмэна.Агрегирозанньв формы гормона присутствуют в экстрактах гипофизов ывотнкх всех групп.

6. Выявлено разное содераание ьатричной РНК для соматотропина в гипофизах свиней разных стадий развития. £ гипофизах плодов и новорождённых поросят её уровень бып значительно выше, зэм в гипзфиаах 4-х и 9-ти месячных свиней, что предполагает соответствующий более активный синтез гормона.

Список работ, опубликованных по тема диссертации

1. Балацкий В.Н. Выделение и формы соматотропина свиньи // У съезд генетиков и селекционеров Украины: тез. докл.- Наев: 1986. - С 9-Ю.

2. Балацкий В.Н. Гетерогенность соматотропина свиньи // Всесоншая научно-техническая конференция " Применение биотехнологий а аивотновздетве, растеневодстзе и Еетеринарнзй медицине", Ленинград, П-13 октября 1988.: Т.докл.-М.: ВНИЭСХ, 1988. - С. 53-54.

3. Бзлацы'й В.Н. Синтез и формы соматотропина свиньи в онтогенезе // ¿-я всесоюзная конференция по цитогенетикё сельскохозяйственных животных, Ленинград-Пушкин, 1988 г.: Материалы конференции. Т Ленинград, 1989.- С. 157-158.

4. Балацкий u.ä. Содержание соматотропина в гипофизах .свиней разного возраста // Свиноводство. - К : Урожай, 1989.- Вып. 45.

- С. 66-68. .

5. ¡¿алюта C.G., Балацкий Б.Н.,Окунзв O.S., Телегеев Г.Д., Фомин В.В Почерняев К.ш., Близнюченко А.Г. Соматотропин свиньи: генетическая организация в структура гормона // 3-я школа-семинар

по генетике и селекции животных. 2-е научные чтения памяти академика Д.й..Беляева, г.Бийск, сентябрь 1989 г.: Тез.докл.- Кз' вести я Си би jekd го отделения АН СССР. - Î989. - Вып. 2. - С D-II.

ь. БалацквЁ В.Н., Малюта С.С. Получение и характеристика препарата соматотропина свиньи. // Свиноводство - К : Урокай, 1990 г Быв. 46.-е. 38-42.

7. Шчерняев К.Ф., Балацкий-В.Н., Кияница К..И., Фомин В.В., Телегеев l'.JU Гомология гена гормона роста свиньи с вектором рВК 322. // Всесоюзная конференция молодых ученых я Современные методы исследования в свиноводстве"- посвященная 60-летию института, г.Полтава, сентябрь 1990 г.,: Тез.докл. - Полтава, 1991. - С. 93.

6. Балацкий Б.Н* Содержание матричных РНК для гормона роста в гипофизах свиней разного возраста // Всесоюзная конференция молодых учёных "Современные методы исследования в свиноводстве" посвященная 60-летию.института, г.Полтава, сентябрь 1990 г.: Тез.докл.- Полтава, 1991. - С. 92.

Академия наук Украины Институт молекулярной биологии и генетики

На правах рукописи

БАЛАЦКИЙ Виктор Николаевич

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ССМАТСТРОШНА СВИНЬИ: ВДЕНТИ-ЙКАДЙЯ И ХАРАКТЕРИСТИКА ФОРМ ГОРШНА, ИХ . " СПЕКТР И СОДЕРЖАНИЕ 3 ШТОГЕНЕЭЕ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степею: какдклатв еиояогичзских иву!-:

Киев - 1992