Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гетерогенность полиморфизмов в гене NPHS2 у детей с нефротическим синдромом

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Гетерогенность полиморфизмов в гене NPHS2 у детей с нефротическим синдромом"

На правах рукописи

Корнненко Владимир Юрьевич

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНЕ У ДЕТЕЙ С

НЕФРОТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ.

03.02.07 генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Москва 2012

005055108

Работа выполнена в лаборатории мембранологии с трунной гена нчеекпх исследований <1)1 ЬУ "Научный Центр Здоровья Да ей" РАМП.

Научны» руководители:

Пинелис Всеволод Григорьевич

дотпор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией клеточных и молекулярных технологий (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный цент]) здоровья детей» Российской академии медицинских паук)

Цмгин Алексей доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделением

Николаевич нефрологии (Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Научный пет р здоровья детей» Российской академии медицинских наук)

Официальные оппоненты:

/Курков Вячеслав доктор медицинских ггаук, профессор заведующий лабораторией

Серафимович генетического мониторинга (Федеральное государственное

бюджетное учреждение «Научно - исследовательский институт экологии человека и гагиснм окружающей среды» имени А.Н. Сыснна Российской академии медицинских наук)

Сергеева Тамара доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник

Васильевна (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный

центр здоровья детей» Российской академии медицинских паук)

Ведущая организации: Государственное бюджетное образовательное учреждешк высшего профессионального образования «Московский государственный меднко стоматологический университет» Министерства здравоохранения и социальною развит»: Российской Федерации (МГМСУ).

Защита состоится «28» ноября 2012 г. в 1500 часов на заседании Диссертационноп совета Д 212.203.05 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ул Миклухо-Маклая, д. 8.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федеральной государственного образовательного учреждения высшего профессионального образовали; «Российского университета дружбы народов» но адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо Маклая, дом 6.

Автореферат разослан <¿6 С^т-^см 2012.г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

Гиганн О.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Нефритический синдром (НС) объединяет гетерогенную группу гломерулярных заболеваний и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. Заболеваемость первичным НС составляет 2-13 случаев на 100 ООО детей в возрасте до 10 лет (Tryggvason К. et al, 2006). Постоянное увеличение числа больных с НС, прогрессирующих до стадии терминальной почечной недостаточности и нуждающихся в заместительной терапии (хронический или перитониальный диализ, трансплантация почки), показывает необходимость включения этого заболевания в список приоритетных исследований в нефрологии (Цыгин А.Н., и др., 2010, Becker-Cohen et al., 2007, Caridi et al.,2010).

Для понимания этнологии и патогенеза нефротического синдрома научные исследования последних лег были сосредоточены на оценке вклада генетических факторов в механизмы повреждения и фиброгенеза почек.

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущей к хронической почечной недостаточности (ХПН). В то же время, около 20% от общего числа детей с диагнозом нефротичсскнй синдром составляет группа пациентов со стероидрезнстентным нефротическим синдромом в этиологии и патогенезе которых, генетические факторы играют важную роль (Цыгин А.Н., и др. 2010, Ulinski Т. et al., 2010).

В настоящее время для изучения роли генетических факторов в этиологии и патогенезе мультифакториальных заболеваний, к которым относится и НС, часто используется подход, основанный на исследовании полиморфных маркеров генов-кандидатов. Таким геном-кандидатом, нарушения в последовательности которого могут приводить к возникновению резистентности к тлюкокоргикоидам при терапии НС, является ген подоцина (NPIJS2) (Pereira A.C. et al., 2004, Tsukaguchi et al., 2000, BeckerCohen et al., 2007, Caridi et al., 2003). Подоцин - это трансмембранный белок, играющий важную роль в процессах клубочковой фильтрации, эксиресируется в специализированных клетках почек - подоцитах (Рис. 1).

Этот ген расположен на 1 хромосоме в положении Iq25-q31. Ранее было показано, что причиной резистентности к стероидной терапии, у больных стероидрезнстентным нефротическим синдромом, могут быть нарушения различного рода в гене подоцина. Он состоит из 8 экзонов, интропиых и промоторной области, их расположение представлено на рис 2.

В настоящее время известно множество различных мутаций в гене NPHS2: мисенс-мутации, ноисепс-мутацин, делении. Так, Di Duca М. et al. (2005), после обследования итальянских пациентов обнаружили три мутации в промоторном регионе NPHS2, которые сильно снижали экспрессию гена. Ilinkes В. et al. (2008), показали, что при НС 69% мутаций в гене NPHS2- это нонсенс-мутации, сдвиг рамки считывания или мутация R138Q. Furue Т. et al. (2008), после определения нуклеотидной последовательности NPHS2 у 11 японских больных выявили наличие полиморфизма в 318 положении у 7 из 11 детей. Berdeli А. et al. (2007), при исследовании 295 детей в турецкой популяции больных нефротическим синдромом обнаружили 37 новых мутаций в гене NPHS2. В ряде случаев

275-2 A»G

ДбТУ

P20L

0~.....— О G32C

-«-«о j Е87Х A29T

Q-— —о I 1

А-- I 1 1

Внутриклеточное пространство

L156isX166 G35fsX69 L156fsX180 G140fsX180 F18SfsX186

N term

W256X

L236 R238<iei

Q285fsX302

m

1 R168C I viaoM R2290 i A284V

R168H E23/Q! A288T

K168S R238S

T326fsX345 ■it

C-ternn

R322X

Р1181. т®И31.172У А208Т А242У У260Е И!29Ш

Рис. 1 Структура и распределение аминокислотных замен в белке подоцина.

подоцин всё же может выявляться в подоцитах, но при этом подоцин теряет способность удерживать нефрин в липидных мостиках. В российской выборке больных со стероидрезистентным нефротическим синдромом (СРНС), исследований нуклеотидной последовательности гена ИРН82 и оценки влияния тех или иных нуклеотидных замен на развитие стероидрезистентного нефротического синдрома, практически не проводилось, за исключением единичных работ (Приходина Л.С. и др., 2005, Полтавец, Н.М и др., 2007, 'ПкЬоггпгоу Е, 2007).

PolyA Signal j PolyA Site

NPHS2 11893 n.H.)

Exon 1

Exon 4 _____

ЕхопЗ Exon 2

Рис. 2 Расположение гена ЫРН$2 на I хромосоме

Таким образом, актуальным является определение вклада полиморфных маркеров и мутаций гена /УЛ№>2 в развитие резистентности к терапии глюкортикоидними препаратами у российских детей с СРНС, т.к. от его молекулярно-генетической диагностики может зависеть терапия НС и её эффективность.

Цель исследован и я

Изучить роль полиморфных маркеров гена ЫРН82 в развитии резистентности к пиококортикоидной терапии у детей с нефротическим синдромом в российской выборке.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

Задачи исследования

1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками стероидрезистентного и стероидчувствителыюго нефротического синдрома для проведения молекулярно-генетического анализа гена ЫРНК2.

2. Провести полное секвеннрование гена ЫРИЯ2 у детей с признаками стероидрезистентного и стероидчувствителыюго нефротического синдрома.

3. Изучить распределение полиморфных маркеров гена ЫРИЯ2 у детей с нефротическим синдромом (стероидчувствителышя и стероидрезнстентиая формы) в зависимости от клинической формы заболевания.

4. Определить нуклеотидную последовательность гена N¡'N32 у детей с нефротическим синдромом в зависимости от морфологических изменении в почках.

5. Разработать мультиплексную панель на наиболее значимые нуклеотидные замены гена ЫРШ2 у больных нефротическим синдромом, основанную на реакции удлинения олигонуклеотидов (ЗЫаРяЬоЦ.

Научная новизна работы

Впервые у детей с нефротическим синдромом проведен комплексный молекулярно-генетический анализ полиморфизмов гена ЫРШ2, основанный на изучении нуклеотидных последовательностей гена ЫРН52 в группах стероидрезистентных, стероидчуствительных больных. Показано, что наиболее перспективным для целей диагностики СРНС в российской выборке детей является полиморфный маркер 112290. Представленный в европейской популяции полиморфный маркер К1380, описанный в работе Пткея В., (2008), среди больных в российской выборки со стероидрезистентным нефротическим синдромом выявлен не был.

Впервые выявлена и описана новая мутация \V256X, которая может приводить к образованию терминирующего кодона, прерывавающего синтез белка.

Впервые разработана мультиплексная панель, включающая в себя основные полиморфизмы гена ЫРН82. Разработанная панель основана на реакции удлинения олигонуклеотнда (З^РвЬо!). Предложенная панель позволила в 5 раз ускорить диагностику основных мутаций, описанных в гене А'РНБ2.

В случае семейного стреондрезистентного нефротического синдрома была обнаружена ранее описанная мутация в гене А'РН82, приводящая к формированию терминирующего кодона 01и87Тегш, обрывающая синтез белка ("ПкЬопжоу, (2007)).

Практическая значимость работы

Выявление значимых аллельных вариантов полиморфных маркеров гена МРПЯ2 свидетельствует о повышенном генетическом риске возникновения повреждения щелевой диафрагмы и как следствие развитие стероидрезистентной формы нефротического синдрома, что создает практическую и теоретическую базу для разработки диагностических методов прогнозирования терапии этого заболевания.

Разработанная мультиплексная панель (вЫзРвНо^ позволяет проводить диагностику 7 наиболее частых полиморфных маркеров, расположенных в гене NPHS2 в 5 раз быстрее, чем с помощью секвснирования методом Сэнгсра.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработаны последовательности олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования всех экзонных областей гена NPHS2 с захватом промоторной и частичным захватом интронных областей.

2. Основные полиморфные маркеры, для которых показана ассоциация с стероидрезистентным нефротическим синдромом не выявлялись у здоровых детей и у больных со стероидчувствительным нефротическим синдром.

3. Наиболее распространённым, ассоциированным с резистентностью к стероидной терапии нефротического синдрома, в российской выборке больных детей является нуклеотидная замена G755A (R229Q). Полиморфный маркер R138Q, характерный для европейской популяции больных со СРНС в российской выборке не обнаружен.

4. В гене NPHS2 обнаружена новая, ранее не описанная нуклеотидная замена c.768G>A (W256X), приводящая к образованию терминирующего кодона, обрывающего синтез белка.

5. При семейной форме СРНС выявлена значимая нуклеотидная замена c.259G>T (Glu87Term).

6. Разработана мультиплексная SNaPShot панель, значительно ускоряющая проведения исследования 7 основных нуклеотидных замен в гене NPHS2, в том числе, в положениях соответствующим R138Q и R229Q.

Внедрение результатов работы в клиническую практику

Результаты работы внедрены в клиническую практику нефрологического отделения НЦЗД РАМН, используются при медико-генетическом консультировании пациентов НЦЗД РАМН, в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева и в учебном процессе кафедры медицинской генетики первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация и публикации

Материалы диссертации были представлены на XV Конгрессе педиатров России (Москва, 2010); Европейском конгрессе по генетике человека (Амстердам, 2010), V Европейском конгрессе педиатров (Вена, 2011), JV международной школе по молекулярной генетике (Звенигород, 2010); научных конференциях лаборатории мембранолопш с группой генетических исследований НЦЗД РАМН.

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи в журналах входящих в список ВАК, а также тезисы докладов и сообщений на конференциях.

Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста и иллюстрированы 11 таблицами и 15 рисунками. Библиографический список включает в себя 131 источник из них 122 в зарубежных изданиях.

Материал исследования.

В исследование было включено 87 детей: 72 ребенка находились на стационарном лечении в нефрологическом отделении ФГБУ НЦЗД РАМН в период с 2008 по 2012 г., из них 57 с диагнозом СРНС, 15 со стероидчувствительным НС и 15 здоровых детей. Среди пациентов со стероидрезистеитным иефротическим синдромом было 34 девочки, 23 мальчика, в возрасте от 1 года до 17 лет, с длительностью болезни - от 5 мес. до 15 лет. У 8 детей выявлен инфантильный иефротическим синдром, 49 детей - с первичным стероидрезистеитным иефротическим синдромом. В активной стадии находились 44 ребенка, в стадии частичной ремиссии - 9 детей, в стадии полной ремиссии - 4 детей. Из 13 детей со стероидрезистеитным иефротическим синдромом, достигшими полной (п = 4) и частичной ремиссии (п = 9), 10 детей оказались чувствительны к терапии сапдиммуном, 3 - к комбинированной терапии (сандиммун + селлсепт). Среди 15 детей со стероидчувствительным иефротическим синдромом (5 девочек, 10 мальчиков), в возрасте от 3 лет до 17 лет и с длительностью болезни от 2 лег до 9 лет, в активной стадии болезни находился I ребенок, остальные - в стадии полной ремиссии.

Методы исследования

Морфологические методы исследования. Нами было исследовано 57 детей со стероидрезистеитным иефротическим синдром, из них, биопсия почки проведена 55 детям, а также 8 детям со стероидчувствительным иефротическим синдромом. Чрескожная пункционная нефробиопсия проводилась в нефрологическом отделении НЦЗД РАМН заведующим клиникой, д.м.н., профессором Цыгиным А.Н. с использованием ультразвуковой визуализации и биопсийного пистолета с иглами типа Quick-Core диаметром 16-18 гейджей. Морфологическое исследование биоптата почки методом световой иммунофлуоресцептной микроскопии (окраски гематоксилин-эозин, трихром по Масону, ШИК-рсакция) выполнялось в лаборатории патоморфологии на базе Детской городской клинической больницы №1 г. Москвы, д.м.н., профессором Леоновой JI.B. (руководитель - профессор Талалаев А.Г.). Морфологическое исследование биоптата почки методом электронной микроскопии проводилось на базе ЭМ - ГУЗ Патологоанатомического бюро Ростовской области, к.м.н. Повилайтите П.Э. По данным световой и электронной микроскопии, у пациентов со стероидрезистеитным иефротическим синдромом, фокально-сегментарный гломерулосклероз (ФСГС) был выявлен в 25 биоисийных образцах (45% случаев), болезнь минимальных изменений (БМИ) - в 22 (40%), мезангиопролиферативный гломерулонефрит (МезПГН) - 4 (7,2%), IgA-нефропатия - в 1 (2%), мембранопролиферативный гломерулонефрит - в 2 (4%), мембранозная нефронатия - в 1 (2%). У пациентов со стероидчувствительным иефротическим синдромом БМИ выявлялась в 6 биопсийных образцах, ФСГС - в 1, МезПГН - в I, что значительно меньше, чем у больных с СРНС. Функционально-компенсированная стадия болезни определена у 51 ребенка со стероидрезистеитным иефротическим синдромом и у всех детей со стероидчувствительным иефротическим синдромом. Хроническая болезнь почек III-V стадии выявлена у 6 детей со стероидрезистеитным иефротическим синдромом: III стадия - у 4 детей, IV стадия - у 1, V стадия - у 1 ребенка.

Молекуляппо-генетические методы. Молекулярно-гепетические исследования

проводились в лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ФГБУ

Таблица 1.

Последовательности олигонуклеотидов и особенности амплификации экзонных областей гена NPHS2

Название Последовательность праймеров Экзон Длинна фрагмента

NPHS2-ex l_vne-F (внешние) tgcgatgagcttctgtatctccgtcag 1 952

NPHS2-ex l_vne-R (внешние) cttcgtccccaacctgtaccacactc

NPHS2- ex 1 vnu-F (внутренние) agacacagctgtcggggttcc 1 613

NPHS2- ex 1 vnu-F (внутренние) cttacgcccltccgttcctg

NPHS2-ex2-F ggaccaacagatgctagtcagtg 2 258

NPHS2-ex2-R agaaaacagaagtgagaatgggcatg

NPHS2-ex3-F ggccttttgaagactttttctttctgggag 3 191

NPHS2-ex3-R ggttgaagaaattggcaagtcaggag

NPHS2-ex4-F cagaaaggtgaaacccaaacagcc 4 231

NPHS2-ex4-R gagtataaataatcattttgtccacggtagg

NPHS2-ex5-F ccacataggaaaggagcccaaga 5 335

NPHS2-ex5-R ttaataaatgtccaatgaacaaatgaataaaag

NPHS2-ex6-F gggtttaggcatgctctcctc 6 175

NPHS2-ex6-R aaaccagaatattttcctttatcatacag

NPHS2-ex7-Fnew agaggcttgcaagtctgtgtgaa 7 260

NPHS2-ex7-R cccagtgcctaatgaatggacag

NPHS2-ex8-F aacgcattccaccttaaattgtgatta 8 610

NPHS2-ex8-R ctgtcattacatcatttcaccgtcttc

"НЦЗД" РАМН (заведующий - проф. Пинелис В. Г.). Использовались следующие молекулярно-генетические методы: выделение ДНК, полимеразная цепная реакция (ПЦР), прямое автоматическое секвенирование, SNApShot. Для выделения геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови использовали набор реактивов «Wizard Genomic DNA Purification Kit» фирмы «Promega» (США) в соответствии с протоколом производителя.

Хранение выделенной ДНК осуществляли при - 20°С. Амплификацию всех исследуемых фрагментов ДНК проводили методом ПЦР на программируемом термоциклере "DNA Engine thermal cyclers" (Bio-Rad). Дизайн праймеров для амплификации и секвенирования осуществлялся на основании данных GeneBank с использованием программ «Vector NTI Suite 8» и «Oligo 6.31» (Табл. 1). Состав реакционной смеси для амплификации фрагментов был стандартным: Taq Буфера х 10 (рН=8.6) - 2,5 мкл; Taq полимеразы 5ед/мкл - 1 мкл; магния хлорида 25 шМ р-ра - 1,5 мкл; смеси дНТФ (5шМ) - 0,5 мкл; геномной ДНК - 100 иг; стерильная денонсированная вода до конечного объема 25 мкл. Разделение и детекцию продуктов амплификации и ферментативного гидролиза проводили с помощью горизонтального электрофореза в 2,0% и 3,0% агарозном геле в зависимости от величины получаемых фрагментов. В качестве интерколирующего красителя использовали раствор бромистого этидия. Визуализацию результатов электрофореза проводили в УФ-свете на приборе гель-документации Gel Doc XR (Bio-Rad). Определение нуклеотидной последовательности гена нодоцина (NPHS2) проводили на генетическом анализаторе

2 ре E« я-— equence £on(lg Grojecl SfJP Netsearch itfndjw н* : 214 <- 78 ■ 137 25.313»

с OCCCAGTGCC-TAATGAATGGACAGTAAGGAAGCAAAG--G-G-GAAATG-TT

г

йыктмкяшгж:

Рис.3 Результат выравнивания сиквенсов гена NPHS2 между собой.

Applied Biosystems 3130. Секвенирование проводили в двух направлениях, как с прямого, так и с обратного праймеров. Для проведения сиквенсовой реакции использовали те же праймеры, что и для постановки ПЦР. Сиквенсовую реакцию проводили с использованием наборов BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), длина капилляров, в которых происходило разделение продуктов сиквенсовой реакции, составляла 36 см. Для разделения продуктов сиквенсовой реакции использовали полимер РОР7 (Applied Biosystems). Полученные нуклеотидные последовательности гена NPHS2 выравнивали с известной нуклеотидной последовательностью с помощью утилиты SeqMan из пакета программ Lasergene (Рис. 3). Для анализа результатов сиквенировапия использовали программу Chromas. Олигонуклеотиды для мультиплексной панели SNaPshot

были разработаны нами. Панель 5№Р$1юГ использовалась в 2 вариантах, в I варианте все семь олигонуклеотидов участвовали непосредственно в одной реакции (Рис. 4),во втором варианте производили 2 реакции. В первой реакции участвовали олигонуклеотиды под номерами 1, 2, 3, 6. Во второй реакции участвовали олигонуклеотиды под номерами 4, 5, 7.

Рис. 4. Результат разгонки мультиплексной SNaPshot реакции на генетическом анализаторе ABI 3130 у здорового ребёнка при исследовании гена подоцина.

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием параметрической и непараметрической статистики. Расчеты осуществляли с использованием пакета «Statistica 6.0». Анализ признаков проводили с использованием критериев Стыодента, отношения шансов, %двустороннего теста Фишера, непараметрического критерия Манн-Уитни. Использовали мультипликативную, общую и аддитивную модель наследования. Выводы о результатах использования моделей зависят от равновесия выборки по тесту Харди-Вайнберга. Уровень значимости р < 0,05 был принят достаточным для признания различий достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Настоящая работа посвящена анализу роли мутаций и полиморфных маркеров в гене подоцина и их генетической гетерогенности в развитии стероидрезистентного нефротического синдрома, что позволило разработать систему индивидуального прогнозирования течения заболевания и с учетом генетических особенностей использовать более рациональную терапию.

Молекулярно-генетические исследования были проведены у 87 детей. Из них, 69 детей были исследованы методом прямого секвенирования методом Сэнгера. Распределение аллелей соответствовало закону Харди-Вайнберга. При этом у 38 больных со СРНС были обнаружены различного рода нуклеотидные замены в экзонных, интронных областях, а также в промоторной части гена NPHS2, и только у одного больного в

исследуемой нуклеотидной последовательности, не было обнаружено отклонений. У 38 больных было обнаружено 11 различных нуклеотидных замен (Табл. 2), из них 5 (5968

Таблица 2

Нуклеотидные замены обнаруженные методом прямого секвенирования у больных с нефротическим синдромом (мультипликативная модель наследования)

Аминокислотные замены № аь БЫ!' Частота мутанзного аллеля в группах, % Х-* Р

Контрольной (п=15) Больные с СЧНС (п=15) Больные с СРНС (п=39)

Промо горная область

1У81-31С>А ге1079291 6,7 6,7 11.5% 0.56 0.45

с.35 ОТ Ы2406197 3,3 3,3 11,5% — 0.19

Интронная область

1У83+15070Т (новая) 0 0 15% — 0.02

1У87+7А>0 - 0 0 3% — 0.28

1УБ7+54С>А ге! 1808359 0 3% 5% — 0.21

1У87+10780>С Г.42274624 3,3% 3% 7% — 0.41

Экзонная область

Я229д ГБ61747728 0 0 11% — 0.05

\V256X (новая) 0 0 2.6% — 0.53

8968 183738423 3,3% 16% 7% — 0.41

АЗ 18 А гя1410592 63,3% 36% 46% 0.79 0.37

1.3461, гэ3818587 3.3%. 10% 6% — 0.53

* значения у! приведены только для групп (СРНС и контрольной) с минимальной численностью каждого класса больше 4.

(ге3738423), А318А (ГБ1410592), Ь346Ь (ге3818587), \У256Х, Я2290 (геб 1747728)) находились в кодирующей области, 4 в интронной области (1У83+1507С>Т, 1У87+7А>С5, 1У87+54С>А, 1У87+1078ОС), 2 в промоторной (ГУБ 1-3 Ю> А (ге1079291), гв1240619). У 24 больных были выявлены по 2 и более полиморфных маркеров в гене М5Я52. Аминокислотная замена 11229(2 была выявлена в 20,5% случаев. Среди описанных полиморфизмов обнаружены 2 новые нуклеотидные замены: первая из них (1У83+1507С>Т) была выявлена в интронной области и вторая (АУ256Х), - в кодирующей. Аминокислотную замену 11229(3 (геб 1747728) в гомозиготном состоянии имел I больной, 2 нуклеагидные замены К229С) (1561747728) и 1У83+1507С>Т в гетерозиготном состоянии имели 2 больных. У остальных 5 больных аминокислотная замена 112290 (геб 1747728)

была представлена в различных комбинациях с другими полиморфизмами или в единственном числе. Одна аминокислотная замена (W256X) ранее не была описана (базы данных NCBI и HGMD). Анализ данных, полученных с помощью прямого секвенирования гена NPHS2, показал наличие значимых мутаций R229Q и W256X, только у больных со СРНС (Табл 3, Рис. 5). Кроме того, только у этих больных в сочетании с R229Q выявлен полиморфизмы IVS3+15070T и IVS7+7A>G (Рис.6). Нуклеотидные замены S96S, А318А, L346L, обнаруженные в экзонных областях гена NPHS2, встречаются с примерно равной частотой во всех исследованных выборках детей, что позволяет рассматривать их в качестве полиморфизмов, не влияющих на синтез подоцина. Полученные результаты хорошо согласуются с данными других авторов.

На рисунке 6 представлены нуклеотидные замены, выявленные в интронной области. Нуклеотидные замены IVS3+15070T и IVS7+7A>G встречались только в группе стероидрезистентных и не встречались в других группах. Нуклеотидная замена IVS7+54G>A была представлена как в группе стероидрезистентных, так и в группе стероидчувствительных. Нуклеотидная замена 1VS7+1078G>A была представлена во всех группах. Таким образом, анализ результатов проведенных исследований показал, что в российской выборке больных перспективной для целей диагностики является нуклеотидная замена G755A (rs61747728), соответствующая аминокислотной замене R229Q (Рис. 7). Полученные нами данные показывают, что у больных СРНС нуклеотидная замена G755A (R229Q) встречается достоверно чаще (х2=3,78, р=0.05) по сравнению с группами сгероидчуствительных и здоровых детей. Ранее было показано, что эта замена ассоциирована с протеипурией и микроальбуминурией (Pereira A.C. et а], (2004)). Однако Weber S. et al. (2004), исследовали 319 пациентов из Франции и североафриканских стран, и пришли к заключению, что G755A (R229Q) является лишь полиморфизмом, вероятно не приводящим к развитию протеинурии. В тоже время Karle S. М. et al. (2002), провели

исследование 53 пациентов из 27 семей, а также 25 спорадических случаев нефротического %

60 50 40 30 20 10 0

_

j

1

if Г1 - -г=-г- 1=Ц- Л<=ц

□ Стероидрезистентные 0 Стероидчуствительные

□ Группа сравнения (здоровые)

R229Q W256X S96S А318А L346L

Рис. 5. Частота полиморфных маркеров гена ИРН82, расположенных в экзонной области, у стероидрезистентных, стероидчуствительных больных и у детей в группе

сравнения.

синдрома и отметили, что С755А (Я2290) встречался в 3 из 4 семей, имеющих одну мутацию в гене NPHS2. При этом авторы, правда, отмечают, что функция аминокислотной замены 1*229(3 неизвестна и относят данную замену к значимым полиморфизмам. С другой стороны, Вакг А. е1 а1. (2008), исследовав 16 египетских пациентов со стероидрезистентным нефротическим синдромом, не обнаружили замены Г<22УС,), также

□ Группа сравнения (здоровые)

И Стероидчуствительные

□ Стероидрезистентные

Рис.6. Частота полиморфных маркеров гена NPHS2, расположенных в интронной области у стероидрезистептных, етероидчуствительпых больных и у детей в группе сравнения.

Я22т

Рис. 7. Прямое секвепировапие гена подоцина у больного со СРНС, полиморфный маркер 1*229(3

эти авторы не обнаружили и другой известной замены Ш38<3. №аис1е1 Р. е1 а1. (2004), указывают на то, что в 10-30% случаев при спорадическом стероидрезистентном нефротическом синдроме обнаруживается мутация Г<2290 в гене NF'HS2. Ншке.ч В. е1 а1.

(2008), показали, что при семейном нефротическом синдроме замена R229Q присутствует в 27,7% случаев. В нашем исследовании замена R229Q обнаруживалась у 20,5% больных со СРНС (частота мутантного аллеля R229Q составила 11%). Это согласуется с ранее опубликованными данными, полученными на европейских и американских выборках (Niaudet Р. et al, 2004). Нами так же показано, что замена R229Q достоверно чаще выше встречается в группе больных со стероидрезистентным синдромом в сравнении со здоровыми и больными со СРНС. Хотя, многие авторы указывают замену R229Q как гтопуляцнонный полиморфизм (Weber S. et al, 2004), другие показывают его ассоциацию с протеинурией, липидемией, микроальбуминурией (Hinkes В. et al, 2008).

Среди больных с обнаруженной заменой R229Q (rsöl747728) у троих больных после проведённой терапии метилпреднизолоиом и циклоспорином, болезнь перешла в стадию ремиссии, а у 5 больных ремиссия не была достигнута. Тот факт, что у большинства больных, имеющих R229Q в группе со стероидрезистентным нефротическим синдромом, не проявилась стадия ремиссии согласуется с современными представлениями о взаимосвязи R229Q с резистентностью к глюкокортикоидной терапии.

Многие авторы в своих работах отмечают, что наиболее распространённой мутацией характерной для западноевропейской популяции является замена R138Q. Hinkes В. et al. (2008), при исследовании 430 пациентов с семейным стероидрезистентным нефротическим синдромом из европейской популяции отметил, что замена R138Q встречается в 57,5% случаев. В нашем исследовании аминокислотная замена R138Q в исследуемой выборке не была обнаружена. Возможно, это связано с особенностями выборки больных стероидрезистентным нефротическим синдромом. Полтавец и др. (2006), исследовали ген NPHS2 у 21 ребёнка и также не выявили никаких полиморфизмов этого гена.

Особый интерес вызывает, новая, обнаруженная нами, и ранее не описанная пуклеотидная замена, соответствующая W256X, ведущая к образованию терминирующего кодона, в результате может быть нарушение синтеза подоцина. Мы не обнаружили упоминания о ней в литературных источниках, также этой замены нет в интернет базах данных. У 2 больных с семейным СРНС, нами была обнаружена описанная ранее замена в кодоне Glu87Term (Tikhomirov, 2007).

В нашей выборке были обнаружены 2 нуклеотидиых замены, расположенные в 5'-нетранслируемой области гена NPHS2. Одна из них находилась в промоторной области в положении IVS1-31G>A, а другая, в 5' - нетрапслируемой области в положении c.35G>T. Ранее были предприняты попытки исследования промотора гена NPHS2. Duca М. Di. et al, (2006) с соавторами исследовал промоторную область гена NPHS2 на наличие eis- и Irans -регуляторных элементов. В его работе приняли участие 542 пациента с различными нефропатиями. В результате было выявлено, что сочетание двух полиморфных маркеров в положениях -116С / -51С среди больных с IgA нефропатией ассоциируется с протеинурией и повышенным уровнем креатинина. В наших исследованиях положения -116С / -51С не были изучены, вследствие их удалённости ог кодирующей области. Однако было показано, что нуклеотндная замена IVS1-31G>A (rsl079291), расположенная в промоторной области, встречается достоверно чаще в группе больных с болезнью минимальных изменений, по сравнению, с контрольной группой. Caridi G et al., (2005), рассматривая нромогорную область гена NPHS2, указывают на то, что наличие нуклеотидиых замен в промоторной области этого гена, вероятно, могут приводить к снижению экспрессии гена, и следовательно, к уменьшению синтеза подоцина.

Во многих работах описываются нуклеотидные замены, не изменяющие аминокислотную последовательность белка. В гене NPHS2 к таким заменам относятся: G34G, S96S, А318А, L346L. В исследованиях, проводимых другими авторами, обнаруживаются данные замены в различных комбинациях, однако, их относят к полиморфным маркерам, не оказывающим влияния на повреждение щелевой диафрагмы. Так, например, McKenzie LM et al. (2007) обнаружили различные синонимичные нуклеотидные замены в гене NPHS2. Авторы считают, что синонимичные замены, также как и нуклеотидные замены в интронной области гена NPHS2, не ассоциированы с фокальносегментарным гломерулосклерозом. Karle S.M. et al. (2002), др. в своей работе указывают на полиморфные маркеры А318А, G34G, S96S, L346L в rene NPHS2, которые не связаны с нарушениями синтеза подоцнна. В настоящей работе также были обнаружены полиморфные маркеры, характерные для гена NPHS2: А318А, G34G, S96S, L346L. Статистический анализ подтвердил отсутствие ассоциации с резистентностью к терапии нефротического синдрома (/»0,05).

Для гена NPHS2 также известны различные нуклеотидные замены в интронной области. Наиболее интересной из часто встречающихся является нуклеотидная замена IVS7+7A>G. Полтавец и др. (2006), обнаружили данную нуклеотидную замену у больных со стероидрезистентным нефротическим синдромом в российской выборке. Caridi G. и др. (2001), также обнаружил вышеуказанную замену. Однако, ассоциация с развитием резистентности к терапии или возникновение патологических состояний, в этих работах выявлена не была. Как показали наши исследования, этот полиморфизм чаще встречался в группе больных СРНС, по сравнению с другими группами (р>0,05). Такая ситуация может быть объяснена его близким расположением к экзонной области 7 экзона, а значит, и возможным участием в формировании сайта сплайсинга между экзонной и интронной областями 7 экзона, однако данные оказались не достоверными из-за небольшой выборки. В настоящее время известно, что клиническая значимость нуклеотидных замен в сайте сплайсинга неравнозначна. Как правило, считают, что сайт сплайсинга состоит из восьми нуклеотндов в интронную и экзонную сторону, наиболее критичными из них являются мутации в первом и втором положениях, далее клиническая значимость нуклеотидных замен может снижаться и к восьмому нуклеотиду она сводится к минимуму. В наших исследованиях показано, что нуклеотидная замена IVS7+7A>G в седьмом положении нитрона, встречалась чаще в группе больных с стероидрезистентным нефротическим синдромом (р>0,05). Отсюда мы предположили возможный механизм патологического воздействия нуклеотидной замены IVS7+7A>G, когда данная замена может приводить к нарушению сплайсинга после чего образуется дефектная молекула белка.

В интронной области гена подоцнна были обнаружены нуклеотидные замены в следующих положениях: IVS3+1507C>T, IVS7+54G>A, IVS7+1078G>C. Нуклеотидная замена IVS7+1078G>C присутствовала только в группе, где ремиссия не была достигнута. Замена IVS3+1507C>T описана нами впервые. Нуклеотидная замена IVS3+1507C>T в группе больных с последующей ремиссией встречалась 3 раза, а в группе больных без ремиссии 6 раз. Однако механизмы влияния нуклеотидных замен, находящихся в интронной области, остаются не ясными и требуют дополнительные исследований, включающие анализ мРНК гена подоцнна. Также у одного пациента из группы больных, где ремиссия не была достигнута, были обнаружены обе нуклеотидные замены rs61747728 (R229Q) и 1VS7+1078G>C.

В настоящей работе были обследованы дети с семейной формой СРНС (2 случая из одной семьи). У обоих больных обнаружена нуклеотидная замена c.259G>T (Glu87Term), о которой ранее в своей работе сообщил Tikliomirov Е. (2007).

Группа из 39 больных со СРНС, исследованная методом прямого секвенирования, была разбита согласно морфологическому анализу биоптата почек на 3 подгруппы: больные с болезнью минимальных изменений (14 человек), больные с фокалыюсегмеитарным гломерулосклерозом (16 человек) и мезангиопролиферативным гломерулонефритом (4 человека). А также по возрасту: первая группа дети до двух лет (16 человек), вторая группа дети старше двух лет (23 человека). Каждую группу больных с одним морфологическим признаком или возрастом больных сравнивали соответственно с так называемой «контрольной» группой огличающиейся другими морфологическими проявлениями или по возрасту.

В группе больных с болезнью минимальных изменений обращают па себя внимание нуклеотидная замена в промоторной области: IVS1-31G>A (rs 1079291). В этой группе больных состоящей из 14 человек эта нуклеотидная замена встречалась у 5 человек, а в контрольной группе (стероидрезнстентные больные без данной морфологической парадш-мы), состоящей из 25 человек, - только у 2 детей (Рис. 8). Частота мугантного аллеля в контрольной группе была 5,6%, а в группе больных - 21%, ассоциация этой нуклеотндной замены с болезнью минимальных изменений оказалась статистически достоверной (х2 =4.75 и />=0.03).

Другая нуклеотидная замена (c.35G>T (rs 12406197)), гак же расположенная в промоторной области встречается с одинаковой частотой, как в «контрольной группе», так и в группе больных с болезнью минимальных изменений. Также в этой группе, для нуклеотндной замены rs61747728 (R229Q) не было существенных различий между группой больных и контрольной группой. Описанная выше замена встречалась в 21,4% и 20% соответственно. Нуклеотидные замены IVS3+1507С>Т, 1VS7+1078G>C (rs2274624), А318А (rs 1410592), L346L (rs3818587) встречались примерно одинаково в обеих группах.

Необходимо отметить, что только у одного больного со СРНС (болезнь минимальных изменений) встретилась, как уже отмечалась выше, впервые описанная в настоящей работе новая мутация W256X.

Группа больных со СРНС, для которых был определён фокальносегментарный гломерулосклероз (Рис 8) состояла из 16 детей, а «контрольная» группа из 23 человек. В этой группе, также обращает на себя внимание нуклеотидная замена IVS1-31G>A (rs 1079291). При этом частота встречаемости мугантного аллеля в контрольной группе была 17,4% (6 больных), а в группе больных 3,1% (1 больной) (/.2=3.76, р=0.05). Остальные нуклеотидные замены представлены в равной степени в группе больных и в соответствующей "контрольной" группе.

В группе с мезангиопролиферативным гломерулонефритом (Рис 8), а также в группах, сформированных но показателю возраста больных (2 группы, первая до 2 лет, вторая старше 2 лет) значимые полиморфизмы в гене NPHS2 встречались с одинаковой частотой по сравнению с контрольной группой.

Вольные с болезнью минимальных изменений (А)

50 л 40 30 20 10 +

Мх

пи т

ТП г, г-11 И пзт

/////М

□ БМИ

□ Контрольной

Больные с фокальносегментарным гломерулосклерозом (Б)

80 60 40 20 0

гГ ; ЕЗФСГС

я □ Контрольной

Л сЛ [11 в, п- т т яи И П—■_|

^ / ^ ^ ^ # ^

Больные с мезангиопролиферативным гломерулонефритом (С)

50 40 30 20 10 0

-

-

-- -Т7*-, -., ТТ-

□ Больных

□ Контрольной

.А*

¿Vх

«йР

Рис.8 Нуклеотидные замены в группе стероидрезистентных больных с больные с болезнью минимальных изменений (А), больные с фокальносегментарным гломерулосклерозом (Б) и мезангиопролиферативным гломерулонефритом (С).

Метод реакции элонгации олигонуклеотида (SNaPshot) в ряде случаев позволяет отказаться от прямого секвенирования всей последовательности того или иного гена, что существенно ускоряет молекулярно-генетическую диагностику по выбранным "точкам" в последовательности ДНК. По этому, для исследования больных стероидрезистентным нефротическнм синдром нами была разработана мультиплексная панель, основанная на реакции элонгации олигонуклеотида (SNaPshot). Ранее, различными авторами, в том числе Berdeli A. et al. (2007), было показано, что в гене NPHS2 существуют несколько позиций, в которых нуклеотидные замены, приводящие к стероидрезистентной форме нефротического синдрома, встречаются особенно часто. Выборочное исследование этих "горячих точек" позволило бы избежать трудоёмкого исследования методом прямого автоматического секвенирования экзонной части гена NPIIS2 и существенно ускорить и удешевить диагностику стероидрезистентного нефротического синдрома оставив значения чувствительности и специфичности метода на уровне равном секвенированшо.

Основной проблемой при разработке мультиплексной панели является сложность предсказания всех взаимодействия между олигонуклеотидами, которые возможно будут происходить во время проведения реакции элонгации.

Основываясь на ранее опубликованных данных Stephen Т. et al. (2008), мы разработали мультиплексную SNaPshot панель для диагностики замен в следующих положениях: R138Q, Q215X, R229Q, T232I, E237Q, A242V, с.396А>Т. Разработанная панель была отлажена на генетическом анализаторе ABI 3130. В процессе проверки панели были исследованы три человека с нуклеотидной заменой R229Q в трёх аллельных вариантах, полученных методом прямого сиквенировапия.

Результаты, полученные с помощью SNaPshot панели, подтвердили аллельные варианты, определённые ранее методом прямого секвенирования. На следующем этапе с помощью представленной мультиплексной панели была исследована группа из 18 человек. Среди исследуемых пациентов у 1 была обнаружена замена G755A (R229Q) в гомозиготном состоянии. Проверка полученных результатов методом прямого секвенирования подтвердила их достоверность. Согласно нашим данным на секвеиирование гена NPHS2 с помощью автоматического секвенатора методом Сэнгера требовалось до 14 дней, на анализ амплнконов с помощью реакции удлинения нуклеотида необходимо только 3 дня. Таким образом, использование SNaPshot позволило в 5 раз ускорить исследование.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в настоящей работе нами были разработаны последовательности олигонуклеотидов для амплификации экзонных, промоторной и интронных областей гена NPNS2. Проведено исследование кодирующей области гена NPHS2 у больных российской выборки в группах со стероидрезистентным нефротическнм синдромом, стероидчувствительным нефротическнм синдромом и группой условно здоровых. Впервые для российской выборки больных проведено генетическое сравнение групп стероидрезистентпых и стероидчувствительных больных. Были обнаружены характерные для российской выборки детей полиморфные маркеры и мутации (IVS1-31G>A, c.35G>T, IVS3+15070T, 1VS7+7A>G, 1VS7+54G>A, IVS7+1078G>C, R229Q, W256X, S96S, A318A, L346L). Показана диагностическая значимость нуклеотидной замены G755A (R229Q) для изученной выборки российских больных СРНС. Выявлена новая ранее не описанная

нуклеотидная замена с.768й>А (W256X) приводящая к образованию терминирующего кодона и, таким образом, обрывающая синтез полипептидной цепи. Нами были исследованы 2 случая семейного стероидрезистентного нефротического синдрома, при которых была подтверждена обнаруженная ранее замена СПи87Тегт в гомозиготном состоянии (ИкЬогшгоу 2007). Разработана мультиплексная панель З^РвИо! для определения частых мутаций в гене подоцина (МРН.Ч2), которая может быть применена для более быстрой диагностики основных мутаций в гене подоцнна. Полученные данные важны для проведения диагностики и обследования больных с нефротическнм синдромом, что позволит использовать адекватные методы терапии.

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны и использованы оригинальные последовательности олигонуклеотидов для амплификации и секвенирования экзонных областей гена МРШ2 с захватом промоторной области и частичным захватом интронных областей.

2. Установлено, что основные полиморфные маркеры, для которых выявлена ассоциация с стероидрезистентным нефротическнм синдромом, слабо представлены в группе больных со стерондчусгвительным нефротическнм синдромом.

3. Нуклеотидная замена 0755А (1*2290) в гене АТРНБ2 является наиболее распространённым полиморфизмом, ассоциированным со стероидрезистентным нефротическнм синдромом в российской выборке больных детей. Этот полиморфизм был выявлен у 20,5% больных со СРНС (частота мутантного аллеля составила 11%). Полиморфный маркер Я1380, который наиболее часто встречается в европейской популяции больных со стероидрезистентным нефротическнм синдромом, не был выявлен в исследованной выборке детей.

4. У детей со стероидрезистентным нефротическнм синдромом была выявлена нуклеотидная замена в сайте сплайсинга 1У57+7А>(3, которая не встречается в группе здоровых и больных со стероидчуствительным нефротнческим синдромом. Установлена значимая ассоциация нуклеотидиой замены в промоторной области гена подоцнна (1У51-3 Ю>А) у больных со СРНС и болезнью минимальных изменений.

5. У одного больного с стероидрезистентным нефротическнм синдромом выявлена новая, ранее не описанная нуклеотидная замена с.768С>А (\V256X) в гене ЛОТЖ?, приводящая к образованию терминирующего кодона, что предполагает нарушение синтеза подоцина.

6. При семенной форме стероидрезистентного нефротического синдрома была выявлена гомозиготная мутация 01и87Тегт.

7. Разработанная мультиплексная 8№Р51ю1 панель отдельных вЫР позволила в 5 раз ускорить выявление 7 основных нуклеотпдных замен в гене ИРШ2, в том числе и 1*2290, может быть использована при скрининге больных с нефротическнм синдромом.

Благодарности:

д.б.н., профессору Носикову В.В. за внимание и поддержку при выполнении работы. длин., профессору Леонову Л.Ю. за консультации при написании работы.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Корниенко В.Ю., Алябьева Н..М., Батурина Т.В, Цыган А.Н., Пинелис В.Г., Асанов АЛО " Изучение гетерогенности гена NPHS2 у детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом " Молодой учёный. 2012 (1) т.2 с.131-135.

2. Корниенко В.Ю., Алябьева Н..М., Вашурина Т.В., Цышн А.Н., Пинелис В.Г., Асанов АЛО. "Результаты секвенироваиия гена NPHS2 у детей со стероидрсзистеншым синдромом" Вопросы диагностики в педиатрии 2011 т.З №5 с.26-30

3. Корниенко В.Ю., Алябьева Н..М., Вашурина Т.В., Цыпш А.Н., Пинелис В.Г., Асанов АЛО. "Результаты секвенироваиия гена NPHS2 у детей со стероццрезистентиым синдромом" Инновационные технологии в генетитике и детской эпилептологии. 2011 с. 163-168

4. Корниенко B.IO. "Результаты секвенироваиия гена NPHS2 у детей со стеровдрезистентным сшцфомом" Инновационные технологии в генетшике и детской эпилептологии. 2011 с.163-168.

5. Kornienko V.U. "Mutation analysis of the NPHS2 gene with the direct DNA sequencing method in Russian children with steroid-resistant nephritic syndrome" European Human Genetics Conference 2011, abstract book, P02.196

6. Корниенко B.IO. "Генетическая гетерогенность гена NPHS2 у детей со стероидрезистентным нефротическим синдром" XV Конгресс педиатров, сборник тезисов, с.53

7. Корниенко B.IO. "Секвенирование гена NPHS2 у больных стероидрезистентным нефротическим синдром" IV международная школа молодых ученых по молекулярной генетике «Геномика и биология клетки», сборник тезисов, с.40

Корниенко Владимир Юрьевич

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ПОЛИМОРФИЗМОВ В ГЕНЕ NPHS2 У ДЕТЕЙ С НЕФРОТИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ

Нефротический синдром объединяет гетерогенную группу гломерулярных болезней и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. Известно, что мутации в гене ИРНЯ!, кодирующем ключевой белок в щелевой диафрагме, могут быть ответственны за развитие стероидрезистентной формы нефротического синдрома. Чтобы изучить роль полиморфизмов гена Ь'РНБ! в этиологии и патогенезе нефротического синдрома мы исследовали 72 подтверждённых биопсией больных со стероидрезистентной и стероичувствительной формами нефротического синдрома и 15 условно здоровых. В 18 случаях для исследования мы применяли метод элонгации олигонуклеотида (8ЫаР51ю1). Было установлено, что основные полиморфные маркеры, для которых выявлена ассоциация с стероидрезистентным нефротическим синдромом (СРНС), слабо представлены в группе больных со стероидчуствителышм нефротическим синдромом. Нуклеотндная замена 0755А (1*229(3) 0 гене 'V/5/¡.42 является наиболее распространённым полиморфизмом, ассоциированным со стероидрезистентным нефротическим синдромом в российской выборке больных детей. Этот полиморфизм был выявлен у 20,5% больных со СРНС (частота мутантного аллеля составила 11%). Полиморфный маркер 1*138(3, который наиболее часто встречается в европейской популяции больных со стероидрезистентным нефротическим синдромом, не был выявлен в исследованной выборке детей. У детей со стероидрезистентным нефротическим синдромом была выявлена нуклеотндная замена в сайте сплайсинга 1У57+7А>(3, которая не встречается в группе здоровых и больных со стероидчуствительным нефротическим синдромом. Установлена значимая ассоциация нуклеотидной замены в промоторной области гена подоцина (1У81-ЗЮ>А) у больных со СРНС и болезнью минимальных изменений. У одного больного с стероидрезистентным нефротическим синдромом выявлена новая, ранее не описанная нуклеотндная замена с.7680>А (\V256X) в гене Д'/)//52, приводящая к образованию терминирующего кодона, что предполагает нарушение синтеза подоцина. При семейной форме стероидрезистентного нефротического синдрома была выявлена гомозиготная мутация 01и87Тепп. Разработанная мультиплексная БШРЗЬо! панель отдельных 8ЫР позволила ускорить примерно в 5 раз выявление 7 основных нуклеотидных замен в гене 1ЧР11Б2, в том числе и 1*229(3 11 поэтому может быть использована при скрининге таких больных.

Kornienko Vladimir Yuryevich

HETEROGENEITY OF POLYMORPHISMS IN THE GENE NPHS2 IN CHILDREN WITH NEPHROTIC SYNDROME.

Nephrotic syndrome combines a heterogeneous group ofglomerular diseases and is one of the urgent problems of Pediatric Nephrology. It is known that mutations in NPHS2, the gene that encoded podocin, a key protein of podocyte slit diaphragm, may be responsible for the development of steroid-resistant forms of nephrotic syndrome. To investigate the role of NPHS2

polymorphisms in etiology and pathogenesis of nephrotic syndrome, we studied 72 biopsy-confirmed cases and 15 controls. The method of direct sequencing by Singer was used in 54 patients with steroid-resistant and steroid-sensitive nephritic syndrome and 15 controls; in 18 cases we employed genotyping by single-base extension of oligonucleotides (SNaPshot). It was established that the main polymorphic markers, which depicted an association with steroid-resistant nephrotic syndrome (SRNS), were poorly exhibited in the group of patients with steroid-sensitive nephrotic syndrome. Nucleotide substitution G755A (R229Q) in the NPHS2gene is the most frequent polymorphism associated with steroid-resistant form of nephrotic syndrome in Russian children. R229Q polymorphism was detected in 20.5% of patients with SRNS (mutant allele frequency was 11%). Polymorphic marker R138Q, which is most common in the European population of patients with steroid-resistant nephrotic syndrome, was not found in our patients. Nucleotide substitution in the splice site IVS7+7A>G was detected only in children with steroid-resistant nephrotic syndrome, this substitution was not found in steroid-sensitive and healthy children. At first we identified new nucleotide substitution 768G>A (W256X) in the gene NPHS2 that was detected in one patient. This substitution probably leads to the formation of a stop codon, which decreases synthesis of podocin. In family form of steroid-resistat nephrotic syndrome was found homozygous mutation Glu87Term. The significant association of nucleotide substitution in the promoter region of the gene podocin (IVS1-31G>A) was established in patients with SRNS and with minimal change disease. We have developed a multiplicative SNaPShot panel to diagnose the main nucleotide polymorphisms associated with steroid-resistant nephrotic syndrome. This method was at 5 times faster than direct sequencing.

Подписано в печать. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,5 Тираж 105 Экз. Заказ № 2318 Типография ООО "Ан-клуб" (Печатный салон МДМ) 119146, г. Москва, Комсомольский пр-кт, д.28 Тел. 8-495-782-88-39

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корниенко, Владимир Юрьевич

Список сокращений

Введение

ГЛАВА 1 Обзор литературы

1.1 Общие сведения о физиологии почек, основных белках базальной мембраны

1.1.1 Строение нефрона, клубочковая фильтрация, базальная мембрана

1.1.2 Канальцевые реабсорбция и секреция.

1.1.3 Белки базальной мембраны клубочка

1.2 Современные представления об этиологии и патогенезе нефротического синдрома

1.2.1 Стероидрезистентпый иефротический синдром

1.2.2 Врожденный иефротический синдром финского типа

1.2.3 Другие синдромы

1.2.4 Полиморфизмы гена подоцина при пефротическом синдроме

ГЛАВА II. Материалы и методы

11.1 Характеристика обследованных больных

11.2. Морфологические ме тоды исследования

II.3 Молекулярно-гепетические методы исследования

11.4. Реактивы, буферные рас творы и ферменты

11.5. Статистические методы

ГЛАВА III. Результаты и обсуждение собственных исследований.

III Л. Результаты секвепирования гена NPHS2 у детей группы сравнения

111.2. Результаты секвенироиания гена NPHS2 у детей со стероидчувствительным нефротическим 53 синдромом.

111.3. Результаты секвепировапия гена NPIIS2 у детей со стероидрезистентным пефротнческим синдромом.

III. 4. Разработка панели для определения пуклеотидпых замен в гене NPIIS2 методом мультиплексной реакции элонгации праймера (SNaPshol)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гетерогенность полиморфизмов в гене NPHS2 у детей с нефротическим синдромом"

Нефротический синдром (НС) объединяет гетерогенную группу гдомерулярных заболеваний и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. Заболеваемость первичным НС составляет 2-13 случаев на 100 ООО детей в возрасте до 10 лет [1]. Постоянное увеличение числа больных с нефротическим синдромом, прогрессирующих до стадии терминальной почечной недостаточности и нуждающихся в замести тельной почечной терапии (перитопиальпым диализом, - или в трансплантации почки) [2], показывает необходимость включения проблемы НС в список приоритетных исследований в нефрологии.

Для понимания этиологии и патогенеза пефротического синдрома научные исследования последних лет были сосредоточены на оценке вклада генетических факторов в механизмы повреждения и фиброгенеза почек.

В общей сложности, по данным крупных европейских медицинских центров, наследственные гломерулопатии занимают от 6,5 до 15% среди патологий, ведущей к хронической почечной недостаточности (ХПН). В то же время, около 20% от общего числа детей с диагнозом нефротический синдром составляет группа пациентов со стероидрезистентным нефротическим синдромом в этиологии и патогенезе которых, генетические факторы играют важную роль

В настоящее время для изучения роли генетических факторов в этиологии и патогенезе мультифакториальпых заболеваний, к которым относится и НС, часто используется подход, основанный па исследовании полиморфных маркеров генов-кандидатов. Таким геном-кандидатом, нарушения в последовательности которого могут приводить к возникновению резистентности к ппококортикоидам при терапии НС, является ген подоципа (ИРН82). Подоцин - это трансмембранный белок, играющий важную роль в процессах клубочковой фильтрации, окспресируетея в специализированных клетках почек - иодоцшах. За синтез белка подоцина ответственен ген NPHS2. Различные мутации в гене подоцина являются не только частой причиной возникновения и прогрессировапия нефротического синдрома, по и устойчивости кчерапии ипококортикоидами при лечении последнего.

Этот ген расположен па 1 хромосоме в положении Iq25-q31. Он состоит из 8 экзопов, интронных и промоторпой облас1ей

В настоящее время известно множество различных полиморфизмов и му таций в гене NPHS2, мисенс-мутации, нонсенс-мутации, а также делеции.

Так, например Duca Di.M. с соавторами, после обследования итальянских пациентов обнаружили три мутации в промоторном регионе NPIIS2, которые сильно снижали экспрессию гена |П1]. Hinkes В. с соавторами показали, что при НС 69% мутаций в rene NPHS2 - это нонсенс-мутации, сдвиг рамки считывания или мутация R138Q [113]. Furue Т. с соавторами после определения пуклеотпдной последова1елыюети NPHS2 у 11 японских больных выявили наличие полиморфизма в 318 положении у 7 из 11 детей |114]. Berdeli А. с соавторами при исследовании 295 детей в турецкой популяции больных псфротическим синдромом обнаружили 37 новых мутаций в iene NPHS2 [2¡. В ряде случаев спорадически возникший фокальносегментарный гломерулосклероз (ФСГС) во взрослом состоянии был ассоциирован с носительством гетерозиготного генотипа Arg/Gly. Иногда подоцип прису[ствуе1 в нодоцшах, по [еряет способность удерживать пефрип в липидпых мостиках, на это влияют такие мутации как R138Q, D160G, R168C, R168H, R168S, V180М, P20L, V260B [1111.

В России исследований lena NPIIS2 практически не проводилось, существуют еденичные работы 127, 117, 128).

Определение вклада полиморфных маркеров и мутаций гена NPHS2, в развитие резистентности к'терапии пнокортикоидними препаратами является одной из важных и актуальных проблем нефрологии. В этом случае от молекулярио-генетической диагностики может зависеть тип терапии нефротического синдрома. Эффективная молскулярно-генетическая диагностика позволит избежать дорогой и неэффективной терапии.

Цель исследования.

Изучить роль полиморфных маркеров гена ЫРН32 в развитии резистентности к ппококортикоидной терапии у детей с нефротическим синдромом в российской выборке детей.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

Задачи исследования:

1. Сформировать репрезентативную выборку пациентов с признаками стероидрезистентного и стероидчувствительпого нефротического синдрома для проведения молекулярно-гепстического анализа гена МРН82.

2. Провести полное ссквспировапие гена N¡4-132 у детей с наиболее выраженными признаками стероидрезистентного и стероидчувствительпого нефротического синдрома.

3. Изучить распределение полиморфных маркеров гена ЫРН82 у детей с нефротическим синдромом (стероидчувствительная и стероидрезистептпая формы) в зависимости от клинической формы заболевания.

4. Определить пуклеотидную последовательность гена АРН82 у детей с нефротическим синдромом в зависимости от морфологических изменений в почках.

5. Разработать мультиплексную панель па наиболее значимые пуклеотидные замены гена МРН82 у больных нефротическим синдромом, основанную па реакции удлинения олигопуклеотидов (8№Рз1ю1).

Научная новизна работы.

Впервые у российских дечей с нефротическим синдромом проведен комплексный молекулярпо-гснетический анализ полиморфизмов гена АГРНБ2, основанный на изучении пуклеотидных последовательностей гена А1РН82 в группах стероидрезистеп'шых, стероидчуствтельпых и здоровых детей. Показано, чю наиболее перспеюивным для диагноежки стероидрезистептиого пефротического синдрома (СРЫС) в российской выборке детей является полиморфный маркер 11229(2. Представленный в европейской популяции полиморфный маркер 111380 (Нткеэ В., 2008), среди больных в российской выборке со стероидрезистепчным нефрожческим синдромом выявлен не был.

Впервые выявлена и описана новая мутация с.768в>А (\V256X), которая может приводить к образованию терминирующего кодона, прерывавающего синтез белка.

В случаях семейного стреоидрезистептного пефротического синдрома была обнаружена ранее описанная мутация в гене ЫРИ82, приводящая к формированию терминирующего кодона С1и87Тепп, обрывающая синтез белка.

Впервые разработана мультиплексная панель, включающая в себя основные пуклогидпые замены гена А¡РН82, встречающиеся при СРНС. Разработанная панель основана на реакции удлинения олигонуклеотида (8ЫаРзЬо1). Предложенная панель позволила в 5 раз ускорить диагностику основных мутаций, описанных в гене ¡\iPNS2.

Практическая значимое п> работы

Выявление значимых аллельпых вариантов полиморфных маркеров гена ЫРН82 свидетельствует о повышенном генетическом риске возникновения повреждения щелевой диафрагмы и как следствие развитие стероидрезистентпой формы пефротического синдрома, что создает практическую и теоретическую базу для разработки диагностических методов прогнозирования терапии этого заболевания.

Разработанная мулы индексная панель (ЗЫаРзЬоО позволяет проводить диагностику 7 наиболее частых полиморфных маркеров, расположенных в гене МРН82 в 5 раз быстрее, чем с помощью секвенирования методом Сэпгера.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработаны последовательное ¡и олигопуклеотидов для амплификации и секвенирования всех экзонных областей гена N№82 с захватом промоторпой и частичным захватом иптроппых областей.

2. Основные полиморфные маркеры, для которых показана ассоциация с стероидрезистентным пефротическим синдромом не выявлялись у здоровых детей и у больных со стероидчувствительпым пефротическим синдром.

3. Наиболее распространённым, ассоциированным с резистентностью к стероидной терапии нефротического синдрома, в российской выборке больных детей является иуклеошдпая замена 0755А (11229С)). Полиморфный маркер III38^), характерный для европейской популяции больных со СРНС, в российской выборке не обнаружен.

4. В гене ЫРН82 обнаружена новая, ранее не описанная пуклеотидпая замена с.7680>А (\V256X), приводящая к образованию терминирующего кодона, обрывающего синтез белка.

5. При семейной форме СРНС выявлена значимая пуклеотидная замена с.2590>Т (01и87Тегт).

6. Разработана мультиплексная 8№Р81ю1. панель, значительно ускоряющая проведения исследования 7 основных пуклеотидных замен в гепе ИРН82, в том числе, в положениях соответствующим КЛ 38(2 и К-229С).

Апробация и публикации

Материалы диссертации были представлены на XV Конгрессе педиатров России (Москва, 2010); Европейском конгрессе по генетике человека (Амстердам, 2010), V Европейском конгрессе педиатров (Вена, 2011), IV международной школе по молекулярной генетике (Звенигород, 2010); научных конференциях лаборатории мембранологии с группой генетических исследований НЦЗД РАМН.

По материалам диссер:ации опубликовано 7 печатных работ, включая 3 статьи в журналах входящих в список ВАК, а также тезисы докладов и сообщений па конференциях.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Корниенко, Владимир Юрьевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нефротический синдром объединяет группу гломерулярных заболеваний и является одной из актуальных проблем детской нефрологии. По данным литературы, из общего числа детей с диагнозом нефротический синдром 80% составляют дети со стероидрезистентпым нефротическим синдромом |110|. 13 международных регистрах стероидрезистептный нефротический синдром рассматривают как наиболее частое заболевание почек. Исследования последних лет свидетельствуют о важном вкладе генетических факторов в механизмы развития стероидрезистептного нефротического синдрома |2, 8, 13, 14]. Для изучения роли генетических факторов часто используется подход, основанный на поиске полиморфных маркеров генов-кандидатов. Среди многочисленных работ, посвященных исследованию клинической значимости мутаций и полиморфизмов, ассоциируемых с стероидрезистентпым нефротическим синдромом, большое значение придаётся гену подоцина (NPHS2) [2, 8].

Подоцип является белком, который участвует в формировании единой структуры щелевой диафрагмы, он подобно шпильке, замыкает нефрин в подоцитах [13, 111] и так же как нефрин и белок CD2AP связан липидными мостиками [12].

Различные мутации в гене подоцина (NPITS2) являются не только частой причиной возникновения и прогрессировапия гломерулонефрита, но и устойчивости к терапии ппококортикоидами при его лечении; именно при дефиците белка может развиться стероидрезистептный нефротический синдром [2, 8, 13, 14|.

Настоящая работа посвящена анализу роли мутаций и полиморфных маркеров в гене подоцина и их генетической гетерогенности в развитии стероидрезистептного нефротического синдрома, что позволит разработать систему индивидуального прогнозирования течения заболевания и с учетом генетических особенностей использовать более эффективную терапию.

В работе представлен анализ молекулярно-генегических исследований 37 детей с первичным несемейным сгероидрезистентпым нефротическим синдромом (14 мальчиков и 23 девочки) в возрасте от 2 мес. до 15 лет и 2 детей из одной семьи в возраст 10 и 7 лет. Наряду с этим были обследованы 15 детей со стероидчувспепельным нефротическим синдромом. Больные наблюдались в отделении нефрологии ФГБУ «НЦЗД» РАМН. Кроме того, были обследованы 15 относительно здоровых детей.

В данной работе использовались клинические, молекулярпо-генетческие, морфологические методы.

У всех детей, как со стероидрезистентным, так и стероидчувствительным нефротическим синдромом проводилась биопсия почечной ткани. Данные диагнозы были установлены па основании общепринятых диагностических критериев и данных морфологического исследования биоптатов ночек. При морфологическом исследовании, проведённом у всех 39 нацистов со сюроидрезисгентпым нефротическим синдромом, были выявлены следующие морфологические варианты: болезнь минимальных изменений - в 39% случаев, фокальносегментарный гломерулосклероз - в 51%, мезаш иопролиферагивный гломерулонефрит - в 10%. В то же время, у детей со стероидчуствительпым нефротическим синдромом при морфологическом исследовании были обнаружены следующие морфологические варианты: болезнь минимальных изменений -40% случаев, фокальносегментарный гломерулосклероз - 13%, мезангиопролиферативпый гломерулонефрит - 13%, для остальных 34% биопсия не проводилась. Клиническое проявление стероидрезистентного нефротического синдрома отмечалось у детей в возрасте от 11 мес. до 16 лет, при этом детей с дебютом заболевания до года было 14%, от года до шести лет - 36%, старше шести лет - 49%, медиана составила 2. Для стероидчувствительного пефротического синдрома дебют заболевания приходился па возраст от 3 мсс. до 11 лет. При этом количество детей с дебютом заболевания до года составило 13%, от года до шести лет - 47%, старше 7 лет - 39%, медиана составила 2,5.

Молекулярно-гепетическое исследование 87 детей было проведено в лаборатории мембранологии с группой генетических исследований ФГБУ «НЦЗД» РАМН.

Ранее было показано, что причиной резистентности к терапии могут быть нарушения различного рода iсна подоципа [2, 8, 13, 14]. В настоящей работе нами впервые с использованием секвепировапия по методу Сэигера, была изучена кодирующая область гена подоципа у достаточно широкой группы больных из разных регионов России, с диагнозом стероидрезистентпый пефротический синдром и стероидчувствительпый нефротичеекий синдром. Анализ проведенных исследований показал, что для российской выборки детей наиболее перспективной для целей диагностики является нуклеождная замена (1755 А (rs61747728), соответствующая аминокислотной замене R229Q. Полученные нами данные показывают, что у больных СРНС нуклеотидпая замена G755A встречается достоверно чаще (р=0,007, "/2=7,41) по сравнению с группами стероидчувствительных и здоровых. Ранее было показано, что э i а замена ассоциирована с протеипурией и микроальбумипурией [14J. Однако Weber S. с соавторами исследовали 319 пациентов из Франции и североафриканских стран и пришли к заключению, чю G755A (R229Q) является полиморфизмом, не приводящим к нарушению клубочковой фильтрации [124]. Karle S.M. и др. провели исследование 53 пациентов из 27 семей, а также 25 спорадических случаев пефротчсскою синдрома и отмстили, что G755A (R229Q) встречался в 3 из 4 семей, имеющих одну мутацию в гене NPHS2. При этом авторы отмечают, что функция аминокислотной замены R229Q неизвестна и относят данную замену к полиморфизмам [125]. Группа авторов Bakr А. и др., исследовав 16 египетских пациентов со стероидрезистентпым нефротичсским синдромом, не обнаружила замены R229Q, также авторы не обнаружили и другой известной замены R138Q [126]. Patrick Niaudet отмечает, что замена R229Q представлена приблизительно в 4% случаев в западной популяции, при этом клиническое значение замены R229Q остаётся неизвестным [127|. Однако этот автор указывает на то, что в 10-30% случаев при спорадическом стероидрезистентпом пефротическом синдроме обнаруживается эта мутация в гене NPHS2. Hinkes В. с соавторами показали, что при семейном пефротическом синдроме замена R229Q присутствует в 27,7% случаев [113]. Stephen Tonna и др., исследуя 56 немецких пациентов с болезнью тонких базальпых мембран, показал, что аминокислотная замена R229Q гена NPIIS2 встречается у 9% больных [123]. В нашем исследовании R229Q встретилась в 20,5% случаев, что согласуется с ранее опубликованными данными [123, 127]. Нами также показано, что замена R229Q достоверно чаще встречается в группе больных со стероидрезистсптным синдромом в сравнении со здоровыми. Хотя многие авторы указывают замену R229Q как популяционный полиморфизм [124, 125, 127], другие показывают его ассоциацию с протеипурией, липидемией, микроальбумипурией [113, 123|.

Среди больных с обнаруженной пуклеотидной заменой G755A (R229Q) у троих больных после проведённой терапии метилпреднизолоном и цитостатическими препаратами, болезнь перешла в стадию ремиссии, и у 5 ремиссия не была достигнута. Факт, что у большинства больных, имеющих R229Q в группе со стероидрезистсптным нефротичсским синдромом, не проявилась стадия рсмиссии, согласуется с современными представлениями о взаимосвязи G755A (R229Q) с резистентностью к терапии.

Многие авторы в своих работах отмечают, что наиболее распространённой мутацией, характерной для западноевропейской популяции, является замена R138Q | 127, 113]. Niaudet Р. также указывает, что R1380 является наиболее часюй мутацией в северной Европе [127]. Hinkes В. с соавторами при исследовании 430 пациентов с семейным стероидрезисчешным псфрошчсским синдромом из европейской популяции ошешл, что замена R138Q встречается в 57,5% случаев [113]. В нашем исследовании аминокислотная замена R138Q в исследуемой выборке не была обнаружена. Возможно, это связано с малой выборкой. При исследовании российских детей, рядом авторов чакже не было выявлено R138Q. Полтавец и др. исследовали ген NPHS2 у 21 ребёнка и не выявили никаких нуклеотидпых замен [ 128].

Особый интерес вызывас! новая, обнаруженная нами и ранее не описанная иуклеотидная замена c.768G>A, соответствующая аминокислотной замене W256X. Мы не обнаружили упоминания о ней в лшературпых источниках, доступных нам. Также этой замены нет в интернет базах данных. У 2 больных нами была обнаружена описанная ранее замена в кодоне Glu87Term 115].

В нашей выборке были обнаружены 2 нуклеогидные замены, расположенные в 5'- нетранслирусмой области гена NPITS2. Одна из них находилась в промоторпой области в положении IVS1-31G>A, а другая в 5'-петранслируемой области в положении c.35G>T.

Ранее были предприняты попытки исследования промотора гена NPHS2. М. Di Duca и др., исследовали промоторную область гена NPHS2 на наличие eis- и trans- регуляторпых элементов. В их работе приняли участие

542 пациента с различными пефропатиями [129]. В результате было выявлено, что сочетание двух полиморфных маркеров в положениях -116С / -51С среди больных с IgA нефропатией ассоциируется с протеинурией и повышенным уровнем креатипина. В наших исследованиях положения -116С / -51С не были изучены вследствие их удалённости от кодирующей области, которая была исследована нами в данной работе. Однако нами было показано, что нуклеошдная замена 1VS1-31G>A (rs 1079291), расположенная в промоторпой области, встречается достоверно выше в группе больных с болезнью минимальных изменений, по сравнению с контрольной группой. Caridi G. с др., рассматривая промоторную область гена NPHS2, указывают на то, что наличие пуклеотидпых замен в промоторпой области этого гена, вероятно, могут приводить к снижению экспрессии мРНК [130].

Во многих работах описываклся нуклеотидные замены, не изменяющие аминокислотную последовательность белка. В гене NPTIS2 к таким заменам относятся: G34G, S96S, А318А, L346L. В исследованиях, проводимых другими авторами, обнаруживаются данные замены различных комбинации, однако их относят к полиморфным маркерам, не оказывающим влияния па развитие резистентности или же нарушение клубочковой фильтрации в подоцитах. Так, например, McKenzie L.M. и др. в своей работе |120] обнаружили различные синонимичные нуклеотидные замены в гене NPHS2. Автор считает, что синонимичные замены, также как и нуклеотидные замены в интропной области гена NPHS2, пе ассоциированы с фокальпоссгмептарпым гломсрулосклерозом. Karle S.M. и др. в своей работе [125] указывают па полиморфные маркеры A3 18A, G34G, S96S, L346L в гене NPHS2. В нашей работе также были обнаружены полиморфные маркеры, характерные для гена NPITS2: А318А, G34G, S96S, L346L. Статистический анализ подтвердил 01сутствис ассоциации с резистентностью к терапии нефротического синдрома.

Для гена N14182 также известны различные пуклеотидные замены в интронной области. Наиболее интересной из часто встречающихся является нуклеотидпая замена 1У87+7А>0. Полтавец и др. обнаружили данную нуклеотидпую замену у больных со стероидрсзистсптным нефротическим синдромом в российской выборке больных [128]. СапсИ С и др. также обнаружили вышеуказанную замену. Однако ассоциация с развитием резистентности к терапии или возникновение патологических состояний выявлена не была [131]. В нашем исследовании этот полиморфизм чаще встречался в группе больных СРНС, по сравнению с другими группами. Такая ситуация может быть объяснена его близким расположением к 7 экзопу экзониой области, а значш, и возможным участием в формировании сайта сплайсинга между экзоппой и интронной областями 7 экзона. В настоящее время известно, что клиническая значимость пуклеотидпых замен в сайте сплайсинга неравнозначна. Как правило, считают, что сайт сплайсинга состоит из восьми пуклеотидов в интроппую и экзонпую сторону, наиболее критичными из них являются мутации в первом и втором положениях, далее клиническая значимость пуклеотидпых замен снижается, и к восьмому пуклеотиду она сводится к минимуму. В нашей работе было отмечено, что нуклеотидпая замена 1У87+7А>0 в седьмом положении интропа встречалась чаще в группе больных с стероидрезистентным нефротическим синдромом. Таким образом, мы предположили возможный механизм патологического воздействия нуклеотидной замены 1У87+7А>С приводящий к образованию изменённой мРНК и как следствие, пурушению синтеза подоципа.

Нами также были обнаружены пуклеотидные замены в интронной области в других положениях: IУ83+15070Т, 1У87+540>А, 1У87+1078С>С. Нуклеотидпая замена 1У87-И078С>С присутствовала только в группе, где ремиссия не была достигнута. Замена 1У83+15070Т описана нами впервые. Как отмечалось выше (см. стр. 53), выявлена ассоциация между нуклеотидной заменой 1У83+1507С>Т и прогрессировавшем стероидрезистентпого нефротического синдрома. Однако механизмы влияния нуклеотидных замен, находящихся в интронной области остаются неясными, т.к. в интроппых областях гена ИРНБ! не извест но регуляторных областей.

Также у одного пациент а из группы, где ремиссия не была достигнута, были обнаружены обе нуклеотидные замены: гй6 1747728 (11229^)) и 1У87+Ю780>С. Нуклеотидная замена 1У83+15070Т в группе больных с последующей ремиссией встречалась 3 раза, а в группе больных без ремиссии 6 раз.

Появление метода реакции элонгации олигопуклеотида (8НаРзЬо1) в некоторых случаях позволяет отказаться от секвепировапия всей последовательности того или иного гена, существенно ускорив диагностику по выбранным "точкам" в последовательности ДНК. Для упрощения диагностики стероидрезисгентпого нефротического синдрома нами была разработана мультиплексная панель, основанная на реакции элонгации олигопуклеотида (8ЫаРзЬо1). Ранее различными авторами было показано, что в гене ИРНБ! существуют несколько позиций, в которых нуклеотидные замены, приводящие к стероидрезистептпой форме нефротического синдрома, встречаются особенно часто [2, 8, 13, 14]. Выборочное исследование этих "точек" позволило бы избежать трудоёмкого исследования методом прямого автоматического секвепировапия экзонной части гена ЫРН82 и существенно ускорить и удешевить диагностику стероидрезисгентпого нефротического синдрома. Основной проблемой при разработке мультиплексной панели является сложность предсказания всех взаимодействия между олигонуклеотидами, которые возможно будут происходить во время проведения реакции элонгации. В настоящее время программное обеспечение может лишь приблизительно предсказать последствия ДНК-ДНК взаимодействия и определить температуры плавления подобранных олигонуклеотидов. Как правило, после обширного компьютерного исследования олигонуклеотидов для мультиплексной ПЦР системы, впоследствии фебуется тонкая практическая работа по определению условий проведения мультиплексной ПЦР реакции.

Первоначально нами были разработанные несколько вариантов последовательностей олигонуклео1идов для проведения мультиплексной реакции, в процессе практической работы отчасти из них пришлось отказаться вследствие их неработоспособности.

Основываясь па ранее опубликованных данных, мы разработали мультиплексную 8ЫаРйНо1 панель для диагностики замен в следующих положениях: 111380 (^74315343), 0215Х, 112290 (геб 1747728), Т2321, Е2370 (гб 146906190), А242У (ге61747727), с.396А>Т. Разработанная панель была отлажена на генетическом анализаторе АВ1 3130. В процессе проверки панели были исследованы три человека с пуклеотидпой заменой 112290 (гэб 1747728) в трёх аллельпых вариантах.

Результаты, полученные с помощью 8ЫаРз11о1 панели, подтвердили аллельпые варианты, определённые ранее методом прямого секвепирования. На следующем этапе с иомощыо представленной мультиплексной панели была исследована группа из 18 человек. Среди исследуемых пациентов у 1 была обнаружена нуклеошдная замена К2290 (гб6 1747728) в гомозиготном состоянии. Проверка полученных результатов секвеиироваиием методом Сэигера подтвердила их достоверность.

Таким образом, пасюящсй работе памп были разработаны последовательности олигонуклеотидов для амплификации экзопных, промоюрной и иптропных областей гена ЫРН82. Проведено исследование кодирующей области гена А'РП82 у больных российской выборки в группах со стеропдрезистеншым нефротическим синдромом, стероидчувствительпым нефротическим синдромом и группой сравнения.

Впервые для российской выборки больных проведено генетическое сравнение групп стероидрезистептных и стероидчувствительных больных. Были обнаружены характерные для российской выборки детей полиморфные маркеры и мутации (IVS1-31G>A, c.35G>T, IVS3+15070T, IVS7+7A>G, IVS7+54G>A, IVS7+1078G>C, R229Q, W256X, S96S, A318A, L346L). Показана диагностическая значимость нуклеотидной замены G755A (R229Q) для изученной выборки российских больных СРНС. Выявлена новая ранее не описанная пуклеотидная замена c.768G>A (W256X) приводящая к образованию терминирующего кодона и, таким образом, обрывающая синтез полипептидпой цепи. Нами были исследованы 2 случая семейного стероидрезистентного пефротического синдрома, при которых была подтверждена обнаруженная ранее замена Glu87Term в гомозиготном состоянии (Tikhomirov 2007). Разработана мультиплексная панель SNaPshot для определения частых мутаций в гене подоцина (NPHS2), которая может быть применена для более быстрой диагностики основных мутаций в гене подоцина. Полученные данные важны для проведения диагностики и обследования больных с псфротическим синдромом, что позволит использовать адекватные методы терапии.