Генотипическое разнообразие BLV по GAG и ENV генам у крупного рогатого скота разных пород

Грачева, Наталья Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Генотипическое разнообразие BLV по GAG и ENV генам у крупного рогатого скота разных пород
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Генотипическое разнообразие BLV по GAG и ENV генам у крупного рогатого скота разных пород"

ГРАЧЕВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ГЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЩУ ПО GAG И ENV ГЕНАМ У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА РАЗНЫХ ПОРОД

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03.01.06 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

003493224

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет», Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор ветеринарных наук, профессор Смирнов Павел Николаевич

доктор биологических наук, профессор Белявская Валентина Александровна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Семенихин Владимир Иванович,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Ермолаев Виктор Иванович

ГОУ ВПО Новосибирский государственный университет

Защита состоится «23» марта 2010 г. в 10-00 ч. на заседании диссертационного совета Д.006.045.01. при ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, а/я 8, тел.-факс (8-383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « <Р» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М. Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота остается наиболее распространенной в мире хронической инфекцией, наносящей огромный экономический и социальный ущерб (А.М. Смирнов, 2005).

Болезнь регистрируется практически повсеместно, на всех континентах (М.И. Гулю-кин, 2007; И.М. Донник, 2008; В.В. Храмцов, 2008 и др.).

Вместе с тем BLV, имеющий значительное распространение среди крупного рогатого скота разной породной и территориальной принадлежности, является далеко не однородным по своим генотипическим характеристикам, что представляет как общебиологическое, так и прикладное значение. Так, по данным отдельных авторов (С.Г. Чичинина, 2005; Е.В. Дробот, 2007 и др.), генотипическая принадлежность BLV по env гену в частности, может быть связана с одним из его эндогенных признаков. Например, BLV I генотипа обладает более высокой степенью «агрессивности», проявления своих лейкозо-генных потенций. К сожалению, по данному показателю авторами проведены исследования на крупном рогатом скоте только одной породы.

Следует отметить, что по генотипированию BLV по env гену (gp 51) проведены единичные исследования в России (С.Г. Чичинина, 2005; Е.В. Дробот, 2006) и за рубежом (Н.А. Lewin et al., 1988; R.Z. Mamounet al., 1990; D. Yang, et al., 1993; E. Molteni et al., 1996; D. Beier et al., 2001; E.R. Johnston et al., 2002; M. Licursi etal., 2002). Повышенный риск, как возникновения болезни, так и его профессии и особенности патогенеза являются генетически детерминированным признаком. И доля генетической компоненты, хотя и колеблется под влиянием средовых факторов, но все-таки остается значительной (Н. Ка-beya et al., 2001). Однако так и не установлено, есть ли связь между породной принадлежностью животных и циркуляцией определенных генотипов BLV в этих группах животных.

Ежегодно появляется все больше сообщений о новых особенностях течения лейкоз-ной инфекции, ее этиологическом агенте (BLV) (В.А. Крикун, 2002), но не установлены механизмы изменения структуры вируса, какие факторы оказывают влияние на его эволюцию.

Имеются сведения о том, что в некоторых случаях в оздоровленном стаде, не имевшем контакта с другими, через несколько месяцев или даже лет, вновь выявляются животные, реагирующие в РИД на BLV инфекцию (П.Н. Смирнов, 2000; В.А. Крикун, 2002, И.М. Донник, 2005). Не исключено, что такие животные длительное время остаются скрытыми носителями BLV, сохраняя риск распространения инфекции в стаде.

Подобные факты и не закрытые вопросы лишь подтверждают необходимость проведения дальнейших исследований.

Цель исследований: провести генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота (по генам gag и env) у разных пород животных - носителей BLV.

Для реализации цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести серологическое (в тест-системе РИД с gp 51 антигеном BLV) исследование крупного рогатого скота нескольких популяций для выявления носителей BLV, различающихся по породной принадлежности;

2. Провести молекулярно-генетические исследования:

- выделить ДНК из проб крови животных-носителей BLV;

- выбрать праймеры, фланкирующие наиболее вариабельные участки ДНК по gag ге-

ну BLV;

- адаптировать режимы амплификации по температурно-временным параметрам для получения наиболее достоверного результата;

- подобрать и апробировать эндонуклеазы рестрикции с учетом выбранных нами вариабельных участков gag гена BLV.

3. Установить генотипы провируса BLV по gag гену, циркулирующие у крупного рогатого скота нескольких хозяйств АПК Новосибирской области и Краснодарского края.

4. Сравнить генотипы BLV по gag гену с ранее описанными генотипами по env гену, установить их соответствие.

5. Установить распределение генотипов BLV (gag) у крупного рогатого скота разных пород (черно-пестрой голштинизированной, красной степной, айрширской).

6. Сравнить чувствительность тест-систем ПЦР по gag (р24) и env (gp51) генам.

Научная новизна. Изучено генотипическое разнообразие BLV в стадах Краснодарского края и Новосибирской области. Выявлена ранее не описанная генотнпическая гетерогенность (11 генотипов) популяции вируса по гену gag.

Впервые установлены межпородные различия циркуляции BLV по гену gag у крупного рогатого скота.

Сравнительными исследованиями установлена более высокая чувствительность тест-системы ПЦР по гену gag (р24) в диагностике инфекции BLV.

Предложена гипотеза неравномерной частоты распространения BLV по генам env и gag среди крупного рогатого скота разных пород.

Теоретическая и практическая значимость. Выявленное генотипическое разнообразие BLV и результаты сравнительных исследований открывают новые методические подходы в разработке научно обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.

Установление принадлежности BLV к определенному генотипу может служить основанием для расширения знаний о патогенетических особенностях развития лейкозного процесса, как в экспериментальном, так и спонтанном вариантах.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены: на заседаниях ученого совета Биолого-технологического института ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» (2008-2009); Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Адаптация здоровье и продуктивность животных» (Новосибирск, 2008); Международном сибирско-тайваньском форуме (Томск, 2009); I Сибирской научно-практической конференции «Физиологические основы адаптации сельскохозяйственных животных» (Новосибирск, 2009), II Международном симпозиуме «Экологические проблемы животных и человека» (Новосибирск, 2009).

Публикации результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных работ, в том числе 1 в издании, рекомендованном ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, библиографического списка, приложения. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками. Библиография включает 225 источника, в том числе 117 зарубежных авторов.

Внедрение результатов исследований. Результаты исследований использованы при разработке методических рекомендаций «ПЦР-диагностика: история вопроса, области применения, методика постановки при генотипировании BLV» рассмотренных и утвержденных на научно-методическом совете БиТИ ФГОУ ВПО «Новосибирский государст-

венный аграрный университет» (протокол № 4 от 8 апреля 2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Сравнительная чувствительность ПЦР-диагностики по gag (р24) и env (gp 51) генам BLV.

2. Генотипическое разнообразие BLV в популяциях крупного рогатого скота Новосибирской области и Краснодарского края по gag (р24) и env (gp 51) генам.

3. Концепция возможного распространения BLV разных генотипов у крупного рогатого скота разных пород.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии животных НГАУ и в лаборатории биохимии вирусов ПЩ ВБ «Вектор» в 2006-2009 гг.

Объектом исследования являлся крупный рогатый скот, принадлежащий следующим хозяйствам Краснодарского края: ЗАО «Агроном» (голштино-фризский скот), СПК «Колос» (красная степная порода), Племзавод им. В.И. Чапаева (айрширский скот); Новосибирской области - ОПХ «Кремлевское» (черно-пестрая голштинизированная, разных долей кровности), учхоз НГАУ «Тулинское» (черно-пестрая голштинизированная) (рис. 1).

В работе использовалась ДНК, выделенная из крови животных, принадлежащих вышеперечисленным хозяйствам.

Предметом исследования являлись пробы крови животных, инфицированных BLV, гены вируса лейкоза крупного рогатого скота - gag (р24) и env (gp51).

В процессе работы исследовано в тест-системе ПЦР-диагностики по гену gag 762 пробы, по гену env - 400 проб ДНК. Генотипировано по каждому из генов (gag и env) по 84 пробы крови.

Хранение образцов крови животных. Кровь, полученную от животных (30-50 мл), хранили в замороженном виде при температуре -20° С.

Нами установлено, что срок хранения ДНК при температуре -20°С может составлять не менее 3 лет.

По мнению L. Bicka (2001), P.J. Klasse (2002), повторное замораживание и оттаивание разрушает вирус лейкоза. После проведения несложного опыта мы сделали вывод, что повторное замораживание и оттаивание не разрушает вирус.

Выбор оптимального режима амплификации (env gp51 BLV). ПЦР проводили в 40 мкл реакционной смеси, которую помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Тден94°С - 3 мин; (Тден94°С - 30 с, T^65°C - 30 с, Тэлон 72°С -1 мин) - 35 циклов, Tm0H 72°С - 3 мин.

Для определения вирусоносителя по гену env (gp51) применили следующие прайме-ры: № 1.5 TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3№ 2. 5 'CCCACAAGGGCGGCGCC-GGTTT-3', № 3. 5 'GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3', № 4. 5 'ААСААСААСС-TCTGGGAAGGGT-3 ',(М. Licursi et al, 2002).

Для определения генотипов по гену gag р24 использовали следующие эндонуклеазы рестрикции - Нае III, Fae I.

Выбор оптимального режима амплификации (gag р24 BLV)

ПЦР проводили в 40 мкл реакционной смеси, которую помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Тден94°С - 3 мин; (Тден 94°С - 15 с, Т^в^ -15 с, Tm0H 72°С - 30 с) - 42 цикла, Tm0H 72°С -3 мин.

Рисунок 1 - Схема исследований

Для определения вирусоносителя по гену gag р24 применили следующие праймеры:

№ 1.5'GGAGGWGGRAAGATGCGAACTATT 3',

№ 2. 5'GTCCGYTCTACYAACCCTGAACTT 3', (M.R. Mohatnmadabadi et al, 2004).

Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в лаборатории «МедиГен».

Для определения генотипов BLV по гену env (gp51) использовали следующие эндо-нуклеазы рестрикции: Нае III, Bel I (Ksp22), Pvu II.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Адаптирование режимов амплификации по температурно-временным параметрам

Учитывая тот факт, что режимы амплификации для подобранных нами праймеров и для реакционной смеси МедиГен резко отличались, методика была изменена, адаптирована под длину амплифицируемого фрагмента Т°отж. после проведения температурного градиента и количество реакционной смеси. Стадии начальной денатурации (3 мин. при 94°С) и конечной полимеризации (3 мин. при 72°С) были обязательными в каждом варианте амплификации. Количество циклов подбирали эмпирически для наиболее высокого выхода специфичного ампликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов. ПЦР проводили в 40 мкл реакционной смеси, в отличие от описанных 25 мкл в ранее описанных методиках. В результате составлена следующая программа температур-но-временных циклов для праймеров по гену env gp51: Тден94°С - 3 мин; (Тден 94°С - 30 сек, Тсггж65°С - 30 сек, Тэлон 72°С - 1 мин) - 35 циклов, TMO„ 72°С - 3 мин.

Оптимальный режим амплификации для гена gag (р24) BLV был подобран путем упрощения методики, предложенной М. Reza Mohammadabadi (2004).

Кроме того, изменили количество праймеров по gag и env генам (1,5 мкл на 2 мкл) и ДНК (0,5 мкл на 2 мкл) в реакционной смеси, за счет чего добились более достоверных результатов анализа.

2.2.2. Сравнительные результаты ПЦР-диагностики BLV инфекции по env и gag генам

Степень восприимчивости тест-систем зависит от многих факторов. В наших исследованиях важную роль играл выбор гена и специфического участка ДНК данного гена провируса BLV.

Так, с взаимодействия белков-продуктов гена gag с у-областью геномной вирусной РНК начинается сборка вирусных частиц, так как область, влияющая на эффективность сборки, несколько больше у-области и включает примыкающие к ней 5' концевые последовательности гена gag. Выполнив сборку вирусных частиц, ген gag какое-то время не выявляется в ПЦР, а затем снова участвует в формировании вириона провируса, что позволяет его обнаружить. Соответственно, на ранних стадиях развития вируса эффективнее проводить диагностику тест-системой с праймерами, которые ограничивают участок на gag гене. То есть, если вести оздоровление стада от лейкоза на том этапе, когда больные и инфицированные животные были выбракованы, но при этом есть вероятность, что оставшиеся в хозяйстве животные ранее были инфицированы (до выбраковки), но при этом вирус не был выявлен в ПЦР реакции, будет целесообразнее проводить ПЦР-диагностику BLV по gag гену.

Рассматривая случай, когда к оздоровлению стада только приступили, целесообразно изначально провести диагностику по env гену, а затем по вышеописанной схеме, так как

ген env составляет третью рамку считывания (позиции 4821-6368), то есть обнаруживается на более поздних стадиях, чем gag ген, однако сохраняется на протяжении всего времени существования вируса в организме хозяина.

Проведенный нами опыт свидетельствует о более высокой чувствительности диагностики BLV по gag гену. Так, из 400 исследованных в двух тест-системах животных разной породной и территориальной принадлежности 88 % животных среагировали в ПЦР-реакции на специфический участок, находящийся на env гене провируса BLV, в то время как на участок gag-гена среагировали 95% животных, данный факт можно объяснить разным принципом действия праймеров, однако после повторной амплификации амплико-нов с праймерами env, данные пробы среагировали положительно.

Кроме того, специфические «полоски» на электрофореграмме, ограничивающие длину участка, фланкируемую праймерами по gag гену, были более четкими и яркими, что полностью исключало ложноотрицательный результат.

2.23. Генотипическое разнообразие BLV

Результаты генотипирования BLV по env гену. На наличие провирусной ДНК исследовано 400 проб крови, взятых от крупного рогатого скота разных хозяйств Новосибирской области и Краснодарского края, с использованием ПЦР-диагностики, с праймерами на специфический участок env гена. В результате данного исследования выявлено Ъ Si носителя вируса лейкоза крупного рогатого скота и 48 отрицательно среагировавших (табл. 1).

Таблица 1 - Количество проб крови, использованных в диагностических тестах (ет^51)

Порода крупного рогатого скота ПЦР+ ПЦР- Итого исследованных проб

Черно-пестрый голштинизиро-ванный скот 139 8 147

Красная степная порода 117 16 133

Айрширский скот 96 24 120

Методом случайной выборки была сформирована панель из 84 проб с наличием провирусной ДНК, в дальнейшем данные образцы были подвержены гидролизу следующими эндонуклеазами рестрикции - Нае III, Bel I (Ksp22), Pvu II.

При визуальной оценке результатов рестрикции ампликонов вышеуказанными эндонуклеазами были получены следующие данные: на территории Новосибирской области мы обнаружили только I и VI генотипы, ранее описанные Е.В. Дробот (2006); при этом на территории Краснодарского края, кроме ранее известных I и VI генотипов, был обнаружен II (рис. 2). Данный генотип вируса лейкоза крупного рогатого скота циркулировал на поголовье скота всех пород.

Гс ......... Пае II!

1, 4. 5 31 85 200 27 100

3, 5 285 27 95 Щ*

2 315 27

Вс I

1 3.4 120 100 220

1. 5.6 225 220

Pvu 2

6 280 265

1. 4. 2, 3. 5 444

Рисунок 2 - Ожидаемые фрагменты области gp 51 гена env

Результаты генотипированш BLVпо gag гену. На наличие провирусной ДНК исследовано 762 пробы крови, взятых от крупного рогатого скота разных хозяйств Новосибирской области и Краснодарского края, с использованием ПЦР-диагностики, с праймерами на специфический участок gag гена. В результате данного исследования выявлено 724 носителя вируса лейкоза крупного рогатого скота и 38 отрицательно среагировавших (табл. 2).

Далее нами было проведено исследование по изучению полиморфизма вируса по гену gag. Обоснованием данного научного поиска являлась биологическая особенность самого вируса. Так, известно, что ген gag кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса для внутриклеточной сборки вируса и его высвобождения из клетки.

Таблица 2 - Количество исследованных проб крови (gag р24)

Порода крупного рогатогоскота ПЦР+ ПЦР- Итого исследованных проб

Черно-пестрый голштинизиро-ванный скот 263 21 284

Красная степная порода 244 11 255

Айрширский скот 217 6 223

Для выбора праймеров, фланкирующих ген gag, мы провели анализ разных прайме-ров на чувствительность. При этом оптимальным оказался праймер фирмы IsoGene (GenePak). Источником последовательности служила полноразмерная копия гена из последовательности гена gag. Область гена, фланкируемая праймерами, составила 347 нп. Для генотипирования вируса лейкоза крупного рогатого скота по гену gag мы отобрали пробы крови животных, заведомо реагирующих в тест-системах РИД и ПЦР.

На рисунке 3 приведена типичная картина электрофореза продуктов амплификации (фрагмент гена gag 347 bp), свидетельствующая о наличии провирусной ДНК в геноме животного.

Рисунок 3 - Электрофореграмма в 2% агарозном геле продуктов амплификации гена gag BLV .1-17 опытные образцы ДНК, К(-) отрицательный контроль, К(+) положительный контроль.

В дальнейшем был произведен биоинформационный анализ области р24 гена gag изолятов BLV (рис.4) (GenBank: ААТ02652.1, AY277948.1, U97654.1, EF190192.2, GQ491119.1, GQ491118.1, GQ491117.1, GQ491116.1, GQ49U15.1), в результате чего выявлены наиболее вариабельные участки данной области.

NC_001414.1

[413>-

■ - coding region

- mature peptide

[1600 ►

H 3<

NP_C56897.1

Pr44

NP 777379.1 pi 0 ПЙ

NP 7773S0.1 P4

HP 777381.1 p?4 СЙ

NP.. 777332.1 pi 2 NC

Рисунок 4 - Схема расположения областей gag гена

Методом случайной выборки была сформирована панель из 84 проб с наличием про-вирусной ДНК, в дальнейшем данные образцы были подвержены гидролизу следующими эндонуклеазами рестрикции - Нае III, Fae I (рис. 5).

Генотип Нае III

1 100 30 197

2 50 30 40130 177

3 130 20 130 47

4 150 30 20 80 47

5.6 327

7 85 м 202

Х 150 197

9 100 50 ; 177

10 50 70 30 30 100 47

11 50 70 В 50 20 80 47

Fae 1

4.5. 8.10 150 м 177

2. 3. 6, 9 130 70 147

7 347

Рисунок 5 - Ожидаемые фрагменты области р 24 гена gag

В дальнейшем провели оптимизацию по температурно-временным режимам гидролиза и концентрации ДНК. Ампликон подвергли рестрикции в условиях избытка фермента. Продукты реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Известно, что в организме хозяина хронически персистирующий BLV может претерпевать мутационные изменения, направленные на увеличение патогенности, на преодоление более эффективных защитных механизмов хозяина. Поэтому, наряду с генетическим статусом макроорганизма, во внимание необходимо принимать генетическую изменчивость самого патогена, который возможно в процессе длительной персистенции способен изменять свою патогенность, как в сторону комменсализма, так и усиления патогенных свойств.

При визуальной оценке результатов рестрикции ампликонов вышеуказанными эндо-нуклеазами были получены фрагменты. При сопоставлении были условно обозначены генотипы (табл. 3, рис. 6-11).

Сопоставив сайты рестрикции, образовавшиеся в результате поочередного действия двух эндонуклеаз мы получили следующие данные: на территории Новосибирской области были обнаружены только V и VI генотипы, а на территории Краснодарского края генотипическое разнообразие BLV было представлено большим количеством генотипов области р24 gag гена.

Таблица 3 - Схема образования условных генотипов по результатам гидролиза эндо-нуклеазами рестрикции Ilae III, Fae I

Генотип Сайты рестрикции

Нае III Fael

I 20,120,150 150,170,147

II 20,70,100,140,170 130,200,347

III 20,150,170,300,347 130,200,347

IV 20,170,200,220,300,347 150,170,347

V 20,347 150,170,347

VI 20,347 130,200,347

VII 20,40,105,125 347

VIII 150 150,170,347

IX 20,120,170 130,200,347

X 20,70,140,170,200,300,347 150,170,347

XI 20,70,140,150,200,220,300,347 150,170,347

Фрагменты получены при помощи ферментов Нае III, Fae I. Результаты генотипиро-вания BLV, представлены на рис. 6-11.

Нас 11Iftas)

Рисунок 6 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Нае Ш, на участке 347 bp ген gag, р24.

line 111 (цац)

Рисунок 7 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Нае III, на участке 347 bp ген gag, р24.

. Нас III (gag)

500 -Я

•ш 3 «п J

Рисунок 8 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Нае III, на участке 347 bp ген gag, р24.

МЮ ч Jim 300 * >00

100

Рисунок 9 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Fae I, на участке 347 bp ген gag, р24.

Fac I (gag)

Рисунок 10 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Fae I, на участке 347 bp ген gag, р24.

Рисунок 11 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% агарозном геле с применением эндонуклеазы рестрикции Fae I, на участке 347 bp ген gag, р24.

При использовании рестриктазы Fae I в распределении фрагментов было обнаружено три группы. В образцах, «порезанных» эндонукпеазой рестрикции Нае III, насчитывалось 8 групп в распределении фрагментов.

Для реализации одной из задач мы провели исследование по изучению полиморфизма вируса BLV по гену gag. Обоснованием для этого поиска являлась биологическая особенность самого вируса. Так, известно, что ген gag кодирует белки, формирующие «сердцевину» вируса - для внутриклеточной сборки вируса и его высвобождения из клетки. I Область гена, фланкируемая праймерами, составила 347 нп. Для генотипирования ви-j руса лейкоза крупного рогатого скота по гену gag мы использовали пробы крови животных, заведомо реагирующих в тест-системах РИД и ПЦР.

Ампликон подвергли рестрикции в условиях избытка фермента. Продукты реакций анализировали с помощью электрофореза в 2% агарозном геле.

Генотипическое разнообразие по гену gag популяции вируса лейкоза крупного рогатого скота на территории Краснодарского края до этого периода не изучалось. В этой связи, проведенные нами исследования генотипического разнообразия вируса, циркулирующего в стадах сельхозпредприятий Динского района Кубани, носят приоритетный характер. Фрагменты получены при помощи ферментов Нае III, Fae I. Результаты генотипирования BLV, циркулирующего на территории хозяйств Динского района, представлены в таб. 3.

По породной принадлежности генотипы распределились следующим образом: среди крупного рогатого скота красной степной породы циркулируют 3 генотипа BLV (gag) -1, II, III, с преобладанием III генотипа (рис.12, табл. 4).

Рисунок 12 - Распределение генотипов BLV по гену gag у крупного рогатого скота красной степной породы (ЗАО «Агроном»).

Первый генотип (из 8 установленных -1, II, III, VII, VIII, IX, X, XI в «ПЗ им. В.И. Чапаева») также преобладает и у айрширов среди 8 генотипов. При этом следует обратить внимание на то, что 3 генотипа являются общими для инфицированных BLV коров всех пород, представителей данных хозяйств, следовательно, можно предположить, что остальные генотипы (IV-XI) BLV проникли в хозяйства с импортным скотом (рис. 13).

Рисунок 13 - Распределение генотипов BLV по гену gag у голштинизированного крупного рогатого скота (СПК «Колос»).

Таблица 4 - Распределение генотипов BLV в хозяйствах Краснодарского края

Хозяйство, порода крупного рогатого скота Генотип BLV (по gag), %

I II III rv V VI VII VIII IX X XI

ЗАО «Агроном», красная степная 17 8 75

СПК «Колос», голшти-но-фризский скот 44 12 6 6 13 19 - - - -

ПЗ «им. В.И. Чапаева», айрширская 40 6 6 - - - 7 20 7 7 7

Итого, % 36 10 27 2 5 7 2 7 2 2 2

У животных голштино-фризской породы мы выявили 6 генотипов BLV (по gag гену) -с I по VI, с преобладанием генотипа I (рис. 14, табл. 4).

Генотипы BLY по гену eng 6°о-Н б»» III

о -1 ..... i ч^ян^го®»-

Рисунок 14 - Распределение генотипов BLV по гену gag у крупного рогатого скота айрширской породы (ПЗ «им. В.И. Чапаева»)

Таким образом, можно отметить, что существует определенная взаимосвязь между породной принадлежностью крупного рогатого скота и носительством BLV того или иного генотипа по гену gag.

2.2.4. Изучение частоты распространения BLV разных генотипов среди крупного рогатого скота айрширской породы Краснодарского края

Принимая во внимание данные литературы о межпородных различиях в степени вое-1 приимчивости к лейкозу, мы провели оценку влияния породы на характер распределения

полиморфных вариантов гена gag вируса лейкоза. Установлено, что у айрширского скота преобладает I генотип BLV, чаще других генотипов выявляется VIII генотип, остальные 6 генотипов встречаются реже, возможно, это обусловлено генетической предрасположенностью животных данной породы именно к I и VIII генотипам вируса (табл. 5).

Вместе с тем не зарегистрировали ни одного случая носительства BLV IV, V, VT генотипов вируса среди коров ПЗ «им. В.И.Чапаева», хотя на территории Динского района Краснодарского края эти генотипы циркулируют (рис. 6). Можно предположить, что животные айрширской породы устойчивы к BLV IV, V и VI генотипов.

Таблица 5 - Распределение генотипов BLV по гену gag среди крупного рогатого скота айрширской породы

Хозяйство, порода животных Генотип BLV (по gag), %

I И III IV V VI VII VIII IX X XI

ПЗ «Чапаева», айр-ширская 40 6 6 - - - 7 20 7 7 7

У крупного рогатого скота айрширской породы циркулирует наибольшее количество генотипов вируса лейкоза. При этом 5 генотипов кардинально отличаются от всех остальных циркулирующих на территории Краснодарского края. Их появление можно объяснить только тем, что завезенные из Московской области животные были инфицированы BLV и, таким образом, вирус лейкоза разных генотипов проник на территорию края.

2.2.5. Изучение частоты встречаемости BLV разных генотипов среди крупного рогатого скота красной степной породы

На территории ЗАО «Агроном» среди скота красной степной породы нами было выявлено 3 генотипа BLV с явным преобладанием III генотипа (табл. 6).

Учитывая тот факт, что BLV III генотипа в других исследованных нами хозяйствах оказался мало распространенным, напрашивается вывод о том, что животные красной степной породы являются наиболее благоприятным хозяином для локализации вируса именно III генотипа.

Генотипы BLV, циркулирующие на поголовье данного скота, не отличаются особым генетическим разнообразием. Возможной причиной этого явилось длительное пребывание животных замкнутой группой, в которой сформировался определенный генофонд.

Таблица 6 - Распределение генотипов BLV по гену gag среди крупного рогатого скота красной степной породы

Хозяйство, порода животных Генотип BLV (по gag), %

I II III IV V VI vn VIII IX X XI

ЗАО «Агроном», красная степная 17 8 75 - - - - - - - -

2.2.6. Изучение частоты регистрации BLV разных генотипов среди черно-пестрого голштинизированного крупного рогатого скота

Крупный рогатый скот черно-пестрой породы на Кубани совершенствовался путем поглотительного скрещивания с голштино-фризским скотом.

Исследованные нами животные отличались высокой гетерогенностью генотипов BLV, хотя и уступали животным айрширской породы. У гояштинов преобладал I генотип BLV по гену gag, так же как у айрширов. Можно предположить, что это обусловлено высокой степенью восприимчивости животных данных пород к вирусу именно этого генотипа, или возможно преобладание на Кубани I генотипа BLV в целом (табл. 7).

BLV первых трех генотипов является общим для животных всех трех пород. Этот факт можно объяснить наличием у всех групп местных предков, которые, вероятно, и стали источником BLV данных генотипов.

Селекция сибирского скота с использованием поглотительного скрещивания (быками шлштино-фризской породы), значительно расширила распространение BLV.

Таблица 7 - Распределение генотипов BLV по гену gag среди голштинизированного крупного рогатого скота

Хозяйство, порода животных Генотип BLV (по gag),%

I II III IV V VI VII VIII IX X XI

СПК «Колос», голштино-фризская 44 12 6 6 13 19 - - - - -

Так же как и айрширская порода, голштинская создана на базе местной красной степной, но при этом имеет три генотипа BLV, которые циркулировали только на поголовье гояштинов. Наиболее восприимчивы животные данного хозяйства к I генотипу BLV.

2.2.7. Интерпретация результатов изучения генотипического разнообразия BLV в контексте выяснения природы их распространения

Анализируя материалы из истории импортирования трех вышеперечисленных пород крупного рогатого скота, можно сделать вывод о том, что в их выведении в обязательном порядке принимали участие животные красной степной породы.

Нами выявлены генотипы BLV по гену gag у крупного рогатого скота трех пород -айрширской, красной степной и черно-пестрого голштинизированного скота. При этом установили, что общими для всех трех пород являются I, II, III генотипы BLV. Только эти генотипы циркулируют на поголовье красного степного скота, с которым мы связываем распространение BLV (этих же генотипов, как обязательных) при выведении как голшти-нофризов, так и айрширов.

Вместе с тем, BLV, выделенный от животных каждой из двух других пород - айрширской и голшганской, характеризуется своими генотипами.

Поскольку до сегодняшнего дня факт передачи BLV со спермопродукцией не подтвержден, остается только одна схема, по которой BLV IV-VI генотипов проникли в популяцию животных СПК «Колос», а именно - с голштино-фризским скотом, завезенным из Голландии, Германии и Венгрии.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод о том, что лейкоз крупного рогатого скота генетически детерминирован, то есть, каждой породе присущи свои генотипы вируса лейкоза крупного рогатого скота. Генотипическое разнообразие зависит от пород, участвовавших в скрещивании при выведении новой породы.

2.2.8. Сравнительный анализ материалов по генотипической характеристике BLV, выделенных от крупного рогатого скота разных территорий

Рассматривая генотипы BLV субъектов РФ, можно сделать вывод, что Сибирь отличается меньшим генотипическим разнообразием вируса лейкоза крупного рогатого скота, по сравнению с Краснодарским краем. В Сибири при низких температурах и сравнительно невысокой влажности воздуха создаются менее комфортные условия для развития инфекций, в то время как в Краснодарском крае ситуация обстоит с точностью до наоборот.

В качестве объективного примера рассмотрим животных, в выведении которых участвовали голштино-фризы, поскольку их представители были исследованы нами как в Новосибирской области, так и в Краснодарском крае. На территории Новосибирской области обнаружено всего лишь 2 генотипа BLV как по env, так и по gag генам, в то время как на территории Краснодарского края у представителей данного скота генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота по гену gag более обширное. Зарегистрировано 6 генотипов BLV по гену gag. Что касается генотипического разнообразия BLV по гену env, то на территории Новосибирской области, как было установлено, циркулируют два генотипа - I и VI, тогда как на территории Кубани - II и VI.

Рассматривая распределение генотипов BLV (gag) у крупного рогатого скота разных пород, мы видим ярко выраженные различия. У животных красной степной породы наименьшее разнообразие генотипов I, II, III, что можно объяснить скудным разнообразием генофонда данной породы. Оставшиеся две породы созданы с использованием местного красного степного скота, что подтверждается наличием I, II, III генотипов BLV по гену gag, присущих только этой породе. Однако кроме общих генотипов у животных каждой породы присутствуют свои, характерные только конкретной породе генотипы: у черно-пестрого голштинизированного скота - IV, V, VI, а у айрширов - VIII, IX, X, XI (табл. 4).

Генотипы по gag гену BLV несут большую информационную нагрузку, чем по гену env. Установлено, что генотипы по gag-гену разделяются по породам и циркулируют строго на определенном для каждого генотипа генофонде крупного рогатого скота.

2.2.9. Концепция эволюции BLV в процессе селекции крупного рогатого скота

Как упоминалось выше, чем большее разнообразие генофонда животных, тем больше разнообразие генотипов вируса лейкоза крупного рогатого скота. Данный факт, возможно, объясняется следующей системой распространения и изменения вируса.

На разных территориальных участках Земли организовывались, с течением времени, обособленные группы крупного рогатого скота, которые размножались внутри популяции, без «прилития» крови извне. Вирус, приспосабливаясь к условиям организма-хозяина, претерпевал определенные структурные изменения. Таким образом, на разных территориях циркулировали различные генотипы BLV. В 60-х годах XX в. в хозяйства Российской Федерации начали интенсивно завозить племенных телок, без предварительной проверки на BLV инфекцию (этиологическая роль вируса в то время была не откры-

та), что привело к «смешиванию» генотипов разной территориальной принадлежности в хозяйствах. Результат такого процесса мы видим на примере племзавода «им. В.И. Чапаева». Животные айрширской породы, инфицированные BLV, отличаются многообразием генотипов провируса. Кроме того, мы наблюдали множество сайтов рестрикции в структуре провируса BLV каждого из этих животных, что указывает на множественные изменения самого вируса в процессе его эволюционного приспособления к организму «хозяина».

3. ВЫВОДЫ

1. Выявлены I, II, III генотипы BLV по гену gag, циркулирующие у крупного рогатого скота трех исследованных пород - айрширской, красной степной и черно-пестрой гол-штинизированной. Причем, если для животных (носителей BLV) красной степной породы характерны только данные три генотипа BLV провируса, регистрируемые и у скота других двух изучавшихся пород, то кроме этих трех у них регистрировали еще 8 генотипов BLV.

2. Наибольшее разнообразие генотипов BLV провируса по гену gag выявлено у крупного рогатого скота айрширской породы, инфицированного BLV. Данный факт, по-видимому, явился результатом интенсивного использования генофонда импортного скота, что и наложило свой отпечаток на изменчивость BLV в процессе его адаптации в организме хозяина.

3. В АПК Краснодарского края генофонд крупного рогатого скота наиболее широко представлен красным степным скотом, с использованием которого создавалось поголовье трех исследованных нами хозяйств. Этим и объясняется, что генотипы BLV, циркулирующие в популяциях этих стад, отличаются генотипическим разнообразием.

4. Молекулярно-биологические исследования BLV, циркулирующего в популяциях крупного рогатого скота Западной Сибири позволили выявить 2 генотипа (V и VI) по gag гену.

5. Тест-система с праймерами по gag гену BLV является более чувствительной, а продукты амплификации по gag гену электрофоретически регистрируются более четко, чем продукты амплификации по env гену BLV.

6. Наиболее широкое разнообразие генотипов BLV провируса, регистрируемого у крупного рогатого скота в Краснодарском крае, в сравнении с генотипическим разнообразием BLV провируса у животных Новосибирской области, может быть связано с кли-матогеографическими и селекционными особенностями изучаемых территорий.

7. Экспериментально установлено, что повторные замораживания и оттаивания ДНК и продуктов амплификации по gag и env генам BLV не приводят к разрушению структуры провируса.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕД ЛОЖЕНИЯ

Методические рекомендации «ПЦР-диагносгика: история вопроса, области применения, методика постановки при генотипировании BLV» рассмотрены и утверждены научно-методическим советом Биолого-технологического института ФГОУ ВПО НГАУ (протокол № 4 от 8 апреля 2009 г.) могут быть использованы в исследовательских и лабо-раторно-диагностических целях при решении проблемы лейкоза крупного рогатого скота.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Смирнов, П.Н. Генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупною рогатого скота разной породной принадлежности/ П.Н. Смирнов, Н.В. Грачева В.А. Белявская, В.А. Ря-бинина //Аграрный вестник Урала. - 2009. - № 7 (61), - Екатеринбург, 2009 - С.89-91.

Дробот, Е.В. Генотипическое разнообразие вируса лейкоза крупного рогатого скота /Е.В. Дробот, Н.В. Грачева, // Сб. материалов XI междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых и специалистов «Вклад молодых ученых в реализацию приоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса» (21-23 ноября 2007). - Троицк, 2007 - С. 21-24.

Грачева, Н.В. Заболеваемость лейкозом и молочная продуктивность коров айршир-ской породы разных генеалогических линий/ Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов // Сб. докл. Сиб. межрегион, науч.-практ. конф. (Новосибирск, 22-23 мая 2008 г.), «Адаптация, здоровье и продуктивность животных». - Новосибирск, 2008,- С.76-78.

Грачева Н.В. Изучение частоты распространения BLV разных генотипов среди крупного рогатого скота / Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов, В.А Рябинина, Т.А. Каширских // Физиологические механизмы адаптации животных в меняющихся условиях существования: сб. докл. Сиб. межрегион, науч.-практ. конф. (Новосибирск, I июня 2009 г.). - Новосибирск, 2009. - С. 23-25.

Грачева Н.В. Взаимосвязь между породной принадлежностью крупного рогатого скота и носительством генотипов BLV по гену gag / Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов, В.А. Рябинина, Т.А. Каширских // Физиологические механизмы адаптации животных в меняющихся условиях существования: сб. докл. Сиб. межрегион, науч.-практ. конф. (Новосибирск, 1 июня 2009 г.). - Новосибирск, 2009. - С. 25-28.

Грачева Н.В. Рабочая гипотеза распространения BLV среди крупного рогатого скота разных пород / Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов, В.А. Рябинина, Т.А. Каширских // Экологические проблемы животных и человека: сб. докл. II Междунар. симпозиума. - Новосибирск, 2009.-С. 23-26.

Грачева Н.В. Генотипическое разнообразие BLV на территории Краснодарского края / Н.В. Грачева, П.Н. Смирнов, В.А. Рябинина, Т.А. Каширских // Экологические проблемы животных и человека: сб. докл. II Междунар. симпозиума. - Новосибирск, 2009. - С. 26-29.

Belyavskaya V.A. Interaction of bovine cytokines and bovine leukemia virus genes polymorphism in the process of leukemia development as potential model for human lymphoid malignancie/V.A. Belyavskaya, P.N. Smirnov, N.V. Gracheva, L.A. Vasil'eva, M.I. Voevoda //Siberian-Taiwan Forum (16-17 September, 2009).- Tomsk, 2009,- P. 68-72.

Формат 60x90 1. усл. печ. л.. Тираж 100 экз. Отпечатано в ООО «2Д» малотиражная типо-графия 630073, г.Новосибирск, ул. Карла Маркса Проспект 57 -108

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Грачева, Наталья Владимировна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Распространение BLV в Российской Федерации и за рубежом.

1.2. Строение вируса BLV.

1.3. Структура и цикл жизни ретровирусов.

1.4. Принципы конструирования ретровирусных векторов.

1.5. Генотипическое разнообразие BLV.

1.6. История создания пород крупного рогатого скота, подвергнутых исследованиям при реализации поставленных перед нами задач.

1.7. Гипотезы эволюции вирусов.

1.8. Методы диагностики BLV.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Генотипическое разнообразие BLV по GAG и ENV генам у крупного рогатого скота разных пород"

Актуальность проблемы. Лейкоз крупного рогатого скота (BLV) остается наиболее распространенной хронической инфекцией крупного рогатого скота в мире, наносящей огромный экономический и социальный ущерб (A.M. Смирнов, 2005).

Болезнь регистрируется практически повсеместно, на всех континентах (М.И. Гулюкин, 2007; И.М. Донник , 2008; В.В. Храмцов, 2008; и др.).

Вместе с тем BLV, имеющий значительное распространение среди крупного рогатого скота разной породной и территориальной принадлежности, является далеко не однородным по своим генотипическим характеристикам, что представляет как общебиологическое, так и прикладное значение. Так, по данным отдельных авторов (С.Г. Чичинина, 2005; Е.В. Дробот, 2007; и др.), гено-типическая принадлежность BLV, по env гену в частности, может быть связана с одним из его эндогенных признаков. Например, BLV I генотипа обладает более высокой степенью «агрессивности», проявления своих лейкозогенных потенций. К сожалению, по данному показателю авторами проведены исследования крупного рогатого скота только одной породы.

Следует отметить что, по генотипированию BLV по env гену (gp 51), проведены единичные исследования в России (С.Г. Чичинина, 2005; Е.В. Дробот, 2006) и за рубежом (Н.А. Lewin, et al., 1988; R.Z. Mamoun et al., 1990; D. Yang, et al., 1993; E. Molteni et al., 1996; D. Beier et al., 2001; E.R. Johnston et al., 2002; M. Licursi et al., 2002). Повышенный риск, как возникновения болезни, так и его прогрессии и особенности патогенеза являются генетически детерминированным признаком. И доля генетической компоненты, хотя и колеблется под влиянием средовых факторов, но все-таки остается значительной (Н. Kabeya, et al., 2001) . Однако так и не установлено, есть ли связь между породной принадлежностью животных и циркуляцией определенных генотипов BLV в этих группах животных.

Ежегодно появляется все больше сообщений о новых особенностях течения лейкозной инфекции, ее этиологическом агенте (BLV) (В.А. Крикун, 2002), но не установлены механизмы изменения структуры вируса, какие факторы оказывают влияние на его эволюцию.

Подобные факты и не закрытые вопросы лишь подтверждают необходимость проведения дальнейших исследований.

Цель исследований: провести генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота (по генам gag и env) у разных пород животных— носителей BLV. Для реализации цели были сформулированы следующие задачи:

2. Провести молекулярно-генетические исследования:

- выделить ДНК из проб крови животных-носителей BLV;

- выбрать праймеры, фланкирующие наиболее вариабельные участки ДНК по gag гену BLV;

- адаптировать режимы амплификции по температурно-временным параметрам для получения наиболее достоверного результата;

- подобрать и апробировать эндонуклеазы рестрикции с учетом выбранных нами вариабельных участков gag гена BLV.

4. Сравнить генотипы BLV по gag гену с ранее описанными генотипами по env гену, установить их соответствие.

5. Установить распределение генотипов BLV (gag) у крупного рогатого скота разных пород (черно-пестрая голштинизированная, красная степная, айрширская).

6. Сравнить чувствительность тест-ситем ПЦР по gag (р24) и env (gp51) генам.

Научная новизна. Изучено генотипическое разнообразие BLV в стадах Краснодарского края и Новосибирской области. Выявлена ранее не описанная генотипическая гетерогенность (11 генотипов) популяции вируса по гену gag.

Впервые установлены межпородные различия циркуляции BLV по гену gag у крупного рогатого скота.

Теоретическая и практическая значимость. Генотипическое разнообразие BLV и результаты сравнительных исследований открывают новые методические подходы в разработке научно обоснованных схем оздоровления неблагополучных по лейкозу стад.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 104 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений, библиографического списка, приложения. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 28 рисунками. Библиография включает 224 источника, в том числе 117 зарубежных авторов.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Грачева, Наталья Владимировна

4. ВЫВОДЫ

1. Выявлены I, II, III генотипы BLV по гену gag, циркулирующие у крупного рогатого скота трех исследованных пород - айрширской, красной степной и и черно-пестрой голштинизированной. Причем, если для животных (носителей BLV) красной степной породы характерны только эти три генотипа BLV провируса, регистрируемые и у скота других двух изучавшихся пород, то кроме этих трех генотипов регистрировали еще 8 других.

3. В АПК Краснодарского края генофонд крупного рогатого скота наиболее широко представлен красным степным скотом, с использованием которого создавалось поголовье трех исследованных нами хозяйств края. Этим и объясняется, что генотипы BLV, циркулирующие в популяциях этих стад, отличаются генотипическим разнообразием.

6. Наиболее широкое разнообразие генотипов BLV провируса, регистрируемого у крупного рогатого скота в Краснодарском крае, в сравнении с генотипическим разнообразием BLV провируса у животных Новосибирской области, может быть связано с климатогеографическими и селекционными особенностями изучаемых территорий.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Методические рекомендации «ПЦР-диагностика: история вопроса, области применения, методика постановки при генотипировании BLV» рассмотрены и утверждены научно-методическим советом Биолого-технологического института ФГОУ ВПО НГАУ (протокол № 4 от 8 апреля 2009 г.), могут быть использованы в исследовательских и лабораторно-диагностических целях при решении проблемы лейкоза крупного рогатого скота.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ

Итак, относительно краткий анализ публикаций по рассмотренным нами вопросам показал, что BLV, имеющий значительное распространение среди крупного рогатого скота разной породной и территориальной принадлежности, является далеко неоднородным по своим генотипическим характеристикам. Последнее представляет как общебиологическое, так и прикладное значение.

Так, по данным отдельных авторов (С.В. Чичинина, 2006; Е.В. Дробот, 2007; и др.), генотипическая принадлежность BLV, по env гену в частности, может быть связана с одним из его эндогенных признаков. В частности, установлено, что BLV первого генотипа обладает более высокой степенью агрессивности в проявлении своих лейкозогенных потенций. К сожалению, этот показатель установлен пока на крупном рогатом скоте только одной породы. Кроме того, представляет общебиологический интерес широта распространения инфекции BLV среди крупного рогатого скота разных пород, причем в разных административно-хозяйственных территориях.

В проанализированных нами публикациях красной линией проходит мысль о том, что BLV не является однородной вирусной структурой. Его (вируса) генотипическая принадлежность (по env, gag и другим генам) сформировалась в процессе породообразования или под влиянием других каких-то факторов. Именно данный принцип и был положен в основу наших исследований.

Анализ мировой селекционной работы, проведенной при выведении крупного рогатого скота разных пород, позволил установить, что красная степная порода скота использовалась при выведении всех других пород, приведенных нами в обзоре литературы. Именно данный факт позволяет сделать предположение о том, что животные данной породы могли нести с собой тот «рецессивный фактор» - носительство BLV определенной генотипической принадлежности, который мог закрепиться в помесях на всех этапах селекции. Именно эти вопросы и составили отчасти предмет наших исследований -научного поиска.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии животных НГАУ и в лаборатории биохимии вирусов ГНЦ ВБ «Вектор» в 2006-2009 годах.

Объектом исследования являлся крупный рогатый скот, принадлежащий следующим хозяйствам Краснодарского края: ЗАО «Агроном» (черно-пестрый голштинизированный скот), СПК «Колос» (красной степной породы), «Племза-вод имени В.И. Чапаева» (айрширский скот) и Новосибирской области - ОПХ «Кремлевское» (черно-пестрая голштинизированная), учхоз НГАУ «Тулинское» (голштинизированный черно-пестрый скот).

В работе использовалась ДНК, выделенная из крови животных, принадлежащих вышеперечисленным хозяйствам Краснодарского края и Новосибирской области.

В процессе работы исследованию в тест-системе ПЦР-диагностики по гену gag подвергнуто 762 пробы, по гену env - 400 проб ДНК. Всего геноти-пировано по гену gag и по гену env 84 пробы крови.

Отбор и хранение образцов крови животных. Отбор проб крови для ПЦР осуществляли из подхвостовой вены животных в стерильные одноразовые шприцы с соблюдением правил асептики.

Полученный материал (30-50 мл крови каждой пробы) хранили в замороженном виде при температуре -20° С.

Лабораторное оборудование: амплификатор; УФ-трансиллюминатор; мик-роцентрифуга/встряхиватель (до 12000 об/мин); микротермостат; аппараты для горизонтального и вертикального электрофорезов; источники питания постоянного тока; автоматические пипетки от 0,5 до 1000 мкл; наконечники от 0,5 до 200 мкл; пробирки на 0,5/1,5 мкл; штативы для пробирок;

Материалы: олигонуклеотиды; набор для выделения ДНК «МедиГен»; набор для постановки ПЦР «МедиГен»; ферменты (Нае III, Bel I, Pvu II, Fae I); агароза; акриламид, ЭДТА; маркер молекулярного веса 100 bp; Трис- 10 х ТВЕ буфер; краситель бромфеноловый синий водорастворимый; этидиум бромид 1% раствор; вода стерильная; бидистиллированная вода.

Выделение ДНК. Мониторинг вирусной инфекции предполагает массовые исследования животных. Предпочтение отдается ресурсосберегающим методам на каждой из стадий анализа. Первая стадия анализа методом ПЦР предполагает получение образцов ДНК. В зависимости от того, что является источником про-вирусной ДНК, методы ее выделения разделают на инвазивные (из цельной периферической крови) и неипвазивные (из секретов: молока, спермы), предусматривая высокий выход, чистоту препаратов ДНК, сохранность, возможность повторного анализа и использования для расширенного анализа генотипов хозяина. Неинвазивные методы более быстрые и простые, Отсутствие клеточного дебриса позволяет получить более чистые препараты ДНК, тем самым увеличив чувствительность анализа. Кроме того, мы полагали, что выделенная ДНК из внеклеточного содержимого (включая сыворотку крови) будет являться не только ранним диагностически значимым маркером инфекции, но и прогностическим маркером онкокомпрометации. Хотя биологическая роль внеклеточной ДНК при онкопа-тологиях остается неизвестной, однако, показано, что определенная часть ее является опухолеспецифической и способна к длительной циркуляции в кровотоке и трансформации нормальных клеток (D. Carcia-Olmo et al., 2004).

Во избеэюание контаминации выделение ДНК проводится в ламинаре. Перед работой включаем УФ-обработку ламинара на 1 час, после этого все инструменты и приборы тщательно обрабатываются спиртом. Заранее подбираем нужные для работы наконечники (носики). Рекомендуется использовать носики с фильтром. При откапывании реактивов не рекомендуется касаться стенок пробирки. Каждый носик используется только один раз. При центрифугировании и инкубировании наконечники закрывают крышкой.

Выделение ДНК проводиться при помощи набора для выделения ДНК «Ме-диГен» (инструкция «МедиГен»)

В инструкции к набору по выделению ДНК фирмы «МедиГен» указано, что ДНК хранится в течение двух месяцев при -20° С. Нами установлено, срок хранения ДНК при температуре -20°С может составлять не менее 3 лет.

Для проведения данного исследования использовали кровь и ДНК инфицированных животных (30 проб, ПЦР gag). Перед выделением ДНК из крови в пробирках трехкратно размораживали и замораживали (одна разморозка и заморозка в день), ДНК размораживали и замораживали по той же схеме. Все исследованные образцы оставались положительными в ПЦР. Данный опыт позволяет судить о том, что после повторного замораживания и оттаивания вирус не разрушается.

Полкмеразная цепная реакция — это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях {in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (Л.И. Патрушев, 2005). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях, длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равнозначительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд. пар оснований (L. Ryan, R.J. North, 2002).

Диагностические исследования крупного рогатого скота на лейкоз и инфекцию BLV проводили в иммунологической лаборатории физиологии и биохимии животных НГАУ, в соответствии с Методическими указаниями по диагностике лейкоза крупного рогатого скота, утвержденными ДВ МСХ РФ (М., 1999), а также в лаборатории биоинженерии ГНЦ ВБ «Вектор» (п. Кольцово, г. Новосибирск).

Выбор оптимального рео/сгша амплификации (env gp51 BLV). При выборе режима амплификации мы основывались на данных Е.В. Дробот (2007), при этом методика нами была несколько изменена, адаптирована под длину ампли-фицируемого фрагмента Т°отж. после проведения температурного градиента. Стадии начальной денатурации (3 мин. при 94°С) и конечной полимеризации (3 мин. при 72°С) были обязательными в каждом варианте амплификации. Количество циклов подбирали эмпирически для наиболее высокого выхода специфичного ампликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов. Смесь помещали в амплификатор Eppendorf "Mastercycler Gradient". ПЦР проводили в 40 мкл реакционной смеси, которую помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Тден94°С - 3 мин; (Тден 94°С -30 сек, Тотж65°С - 30 сек, Тэло„ 72°С - 1 мин) - 35 циклов, Тэлон 72°С - 3 мин.

Для определения вирусоносителя по гену env gp51 применили следующие праймеры: 1. 5 'TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-3' № 2. 5 'CCCACAAGGGCGGCGCCGGTTT-3' № 3. 5 'GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-3' № 4. 5'AACAACAACCTCTGGGAAGGGT-3' (М. Licursi et al., 2002) Выбор оптимального режима амплификации (gag р24 BLV) проводили, исходя из длины амплифицируемого фрагмента Т°отж. после проведения температурного градиента. Был изменен режим ПЦР на более простой вариант, в отличие от варианта, предложенного М. Reza Mohammadabadi (2004).

Кроме того, изменили количество праймеров по gag и env генам (1,5 mkl на 2 mkl) и ДНК (0,5 mkl на 2 mid) в реакционной смеси, за счет чего добились более четких результатов анализа.

Стадии начальной денатурации (3 мин. при 94°С) и конечной полимеризации (3 мин. при 74°С) были обязательными в каждом варианте амплификации. Количество циклов подбирали эмпирически для наиболее высокого выхода специфичного ампликона при минимальном содержании неспецифических фрагментов. Смесь помещали в амплификатор Eppendorf "Mastercycler Gradient". ПЦР проводили в 40 мкл реакционной смеси, которую помещали в амплификатор с заданной программой температурно-временных циклов: Тден94°С - 3 мин; (Тден 94°С - 15 сек, Тотж 58°С - 15 сек, Тэлоп 72°С - 30 сек) - 42 цикла, Тэлон 72°С -3 мин.

Для определения вирусоносителя по гену gag р24 применили следующие праймеры (347 bp): 1. 5'GGAGGWGGRAAGATGCGAACTATT 3' 2. 5'GTCCGYTCTACYAACCCTGААСТТ 3'

M. Reza Mohammadabadi et al, 2004).

Олигонуклеотидные праймеры синтезировали в лаборатории «МедиГен» (Новосибирск).

Постановка реакции полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ). При проведении ПДРФ анализа нами были оптимизированы настройки источника тока: 1= 50 мА, U=250B, Р= 10 Вт, за счет чего добились более четких электрофореграмм и лучшего распределения отрезков.

Для определения генотипов BLV по гену env gp51 использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: Нае III, Bel I (Ksp22), Pvu II.

Для определения генотипов по гену gag р24 использовали следующие эндонуклеазы рестрикции: Нае III, Fae I (рис. 6, 7). BSA-стабилизатор фермента перед применением необходимо развести в 10 раз и использовать из расчета 1 мкл разведенного раствора на 1 реакцию. f

M 7к 17к 1в* 1«К 20» 21» 22* 23к 25к К- К+

Рисунок 6 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% геле агарозы с применением эндонуклеазы рестрикции Fae I на участке 347 bp ген gag, р24 до оптимизации настроек источника тока.

500 400 .ТОО

200

100

Пае III (gag)

Fae I (gag) t

Рисунок 7 - Электрофореграмма продуктов рестрикции в 2% геле агарозы с применением эндонуклеазы рестрикции Fae I на участке 347 bp ген gag, р24, после оптимизации настроек источника тока.

Приготовление реакционной смеси: буфер эндонуклеазы в объеме 2 мкл; эндо-нуклеаза рестрикции 0,1 мкл; BSA-стабилизатор - 1 мкл; Н20 - 11,9 мкл; ампли-кон - 5 мкл.

Сайты рестрикции области р24 гена gag определяли самостоятельно, так как генотипирование по гену gag в литературных данных ранее не описано (табл. 1).

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Грачева, Наталья Владимировна, Новосибирск

1. Авилов, В.М. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота в РСФСР / В.М. Авилов// Проблема оздоровления хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота: тез. докл. Всесоюз. науч. произв. конф. Новосибирск, 1990. -С.13-14.

2. Агол, В.И. Генетически запрограммированная смерть клеток / В.И. Агол // Онкология. 1996. - № 6. - С. 20-24.

3. Альберте, Б. Молекулярная биология клетки. / Б. Альберте, Б. Брей, Дж. Льюис// М.: Мир, 1994. Т. 3. - С. 21-26.

4. Арутюнян, В.Г. Сравнительная характеристика серологических методов диагностики РИД и ИФА в системе оздоровительных мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота: автореф. дис. . канд. ветерин. наук / В.Г. Арутюнян.-М., 1992.- 24 с.

5. Ачайте, Ю.Ю. Фагоцитарная активность воспалительно экссудата при хроническом лимфолейкозе / Ю.Ю. Ачайте, Л.П. Лукшис, В.Б. Добкавичюс и др.// тез. Всесоюз. конф. Самарканд, 9-11 октября, 1984/Ташкент, 1984.-С. 37.

6. Бергольц, В.М. Сравнительная патология и этиология лейкозов человека и животных / В.М. Бергольц, Н.В. Румянцев// Медицина.-1966. 366 с.

7. Бурба, Л.Г. Основные результаты научных исследований по проблеме лейкозов селькохозяйственных животных и птиц, проводимых странами-членами СЭВ / Л.Г. Бурба / Бюл.ВИЭВ.- М., 1977. Вып.30.- С.14-12.

8. Бурба, Л.Г Диагностика лейкозов сельскохозяйствен-ных животных / Л.Г. Бурба, А.А. Кунаков. М.: Колос, 1983.- 190 с.

9. Бурба, Л.Г. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / Л.Г. Бурба, А.Ф Валихов, В.А. Горбатов; под ред. В.П. Шишкова, Л.Г. Бурбы. 2-е изд., пере-раб.и доп. - М.: Агропромиздат, 1988. - 400 с.

10. Бусол, В. А. Тест-система для выявления BLV полимеразной цепной реакцией/ В. А. Бусол, О. Ю. Лиманская, А. П. Лиманский, В. И. Цымбал// Ветеринария.-1999.-№6.- С.27-30.

11. Буткявичене, А.А. Кормление высокопродуктивных коров/ А. А. Буткявичене -Л.: Колос. Ленинградское отделение, 1973.- 56 с.

12. Валихов, А.Ф. Лейкоз крупного рогатого скота (вирусологические аспекты) / А.Ф. Валихов, В.П. Шишков, Л.Г. Бурба-М., 1980.

13. Васильев, Н.Т. Лейкоз крупного рогатого скота/ Н.Т. Васильев. Волгоград, 1962.- 149с.

14. Вейсман, И.Л. Ввение в иммунологию: учеб. пособие / И.Л. Вейсман, Л.Е. Худ, У.Б. Вуд; предисл. и общ. ред. А.Я. Кульберга; пер. с англ. Е.В. Тархановой. -М.: Высш. шк., 1983.- 160 с.

15. Верховский, О. А. Иммуноферментный анализ в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / О.А. Верховский, В.В. Цибезов, М.В. Баландина, И.В. Непоклонова //Ветеринария,- 2002. № 12. - С. 21-23

16. Ветеринарная генетика и селекция сельскохозяйственных животных / В. Л. Петухов, А. Г. Незавитин, С. Г. Куликова, С. П. Князев; под ред. В. Л. Петухова, А. Г. Незавитина,- Новосибирск, 1994. -116 с.

17. Вирусные болезни животных/ В.Н. Сюрин, АЛ. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина М., 1998. - 928 с.

18. Виттман, П. Исследование морфологии и ревертазной активности онкорнави-русов, выделеных от крупного рогатого скота, больного энзоотическим лейкозом/ П. Виттман, П. Венкер Бюлл. ВИЭВ // - М., 1977.- № 30.- С. 13-14.

19. Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота с помощью полимеразной цепной реакции. Метод, рекомендации Новосибирск, 2004.-16с.

20. Гаврилова, Г. А. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота/Г. А. Гаврилова, Ю.А. Макаров, С. В. Бахметьева//Ветеринария, 2004.- № 1.- С. 20-23.

21. Галеев, Р.Ф. Трансплацентная передача ретровируса лейкоза (BLV) от инфицированных коров потомству / Р.Ф. Галеев, А.Ф. Валихов, С.А. Мурватуллоев

22. Распознование и меры борьбы с лейкозами человека и животных. М, 1982. -С.196-197.

23. Глазко, Г. В. ДНК-технологии и биоинформатика в решении проблем биотехнологий млекопитающих / В. И. Глазко, Е. В. Шульга, Т. Н. Дымань, Г. В. Глазко. Белая Церковь, 2001.

24. Двоеглазов, Н.Г. Оценка эффективности различных методов диагностики инфекции вируса лейкоза крупного рогатого скота: автореф. дис. . канд. биол. наук. /Н.Г. Двоеглазов. Новосибирск, 2009. - 18 с.

25. Джупина, С.И. Итоги научных исследований по лейкозу крупного рогатого скота / С.И. Джупина, П.Н. Смирнов // Проблема оздоровления хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота: тез. докл. Всесоюз. науч. произв. конф. - Новосибирск, 1990.-С.7-11.

26. Диагностика лейкоза КРС методом полимеразной цепной реакции./JI. Б. Прохватилова, А. И. Ломакин, С. Н. Колосов, В. В. Дрыгин, С. С. Рыбаков, А. А. Гусев //Вест. РАСХН.-1998.- №5.- С.65-68.

27. Дробот, Е.В. Результаты изучения генотипического разнообразия вируса лейкоза крупного рогатого скота и особенности эпизоотологического и гематологического проявления: автореф. дис. канд. биол. наук./ Е.В. Дробот. Новосибирск, 2007.-18 с.

28. Жданов, В.М. Исследование возможности культивирования вируса, выделенного из первичных культур органов больных лейкозом коров в перевиваемыхклеточных линиях коровьего происхождения/ В.М. Жданов, М.И. Парфанович

29. Вирусы рака и лейкоза.- М., 1974.- С 41-45.

30. Жданов, В.М. Эволюция вирусов/В.М. Жданов М.: Медицина, 1990. - 376 с.32.3ильбер, JI.A. Эволюция вирусно-генетической теории возникновения опухолей /Л.А. Зильбер, И.С. Ирлин, Ф.Л. Киселев М.: Наука, 1975. - С.7-33

31. Иванов, А.Г. Особенности взаимосвязи проявления туберкулеза, бруцеллеза, лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Курганской области: автореф. дис. канд. вет. наук./ А.Г. Иванов .- Новосибирск, 2000. 21с.

32. Итоги изучения эпизоотологии лейкоза крупного рогатого скота в хозяйствах Новосибирской области / П.Д. Шатько, А.Л. Корнилова, Л.Н. Гейль, В.Г. Рудя-нова // науч. Сб. работ Алт. НИВС.-Барнаул, 1972.-Вып.З.- С. 134-136.

33. Колина, С.В. Трансплацентарная передача вируса лейкоза крупного рогатого скота // Проблема оздоровления хозяйств от лейкоза крупного рогатого скота: тез. докл. Всесоюз. науч.- произв. конф. Новосибирск, 1990. - С. 61-62.

34. Колина, С.В. Трансплацентарная передача вируса лейкоза крупного рогатого скота: автореф. дис. канд. биол. наук. / С.В. Колина М., 1993. - 18 с.

35. Крикун, В. А. Лейкоз крупного рогатого скота и иммунологическая толерантность // Ветеринария.-2002.- №6.- С.7-9.

36. Крикун, В.А. Слизистая носа наиболее вероятный путь заражения животных вирусом лейкоза крупного рогатого скота // Лейкозы крупного рогатого скота: сб. науч. тр. - М., 1985. - С.5.

37. Критский, Г.А. Аномалия первичной структуры ДНК при лейкозах и лучевом поражении животных / Г.А. Критский, Г.Ф. Коромыслов и др. // Тез. докл. Ш Всесоюз. конф. по эпизоотологии. Новосибирск, 1991. - С. 74-77.

38. Кукаин, Р.А. Вирусы группы HTLV // Ретровирусы и их роль в патологии человека и животных/ Р.А. Кукаин. Рига: Зинатне, 1989. - С. 6-11.

39. Кукайн, Д.В. Вирус лейкоза крупного рогатого скота/ Д.В. Кукайн, Л.И. Нагаева, В.П. Ложа.- Рига, 1982.

40. Лейкоз крупного рогатого скота: учеб. пособие / С.Н. Магер, В.В. Храмцов, П.Н. Смирнов, В.В. Смирнова, В.В. Разумовская, О.Н. Паршина; НГАУ, ИЭВ-СиДВ Новосибирск, 2005.-160с.

41. Лемеш, В.М. О мерах борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Белоруссии / В.М. Лемеш // Прионные и ретровирусные инфекции животных: Тр. ВНИИЭВ. 1996. - Т. 77. - С. 96-97.

42. Лемеш, В.М. Эпизоотические особенности лейкоза крупного рогатого скота в Калининградской области / В.М. Лемеш, В.Г. Минасян // Тез. докл. Всесоюз. конф. Новосибирск, 1990. - С.44-45.

43. Лиман екая, О. Ю. Выявление вируса лейкоза крупного рогатого скота посредством полимеразной цепной реакции / О.Ю. Лиманская, А.П. Лиманский, В.И. Цымбал // Вет. Медецина. 1998. - Вып.74. - С. 35-44.

44. Лиманский, А.П. Типирование вируса лейкоза крупного рогатого скота циркулирующего на территории Украины / А.П. Лиманский// Вопросы вирусологии. -2004.- №49(1): -С. 39-44.

45. Лиманский, А. П. Молекулярно-генетические методы основа программ по искоренению лейкоза крупного рогатого скота / А. П. Лиманский, О. Ю. Лиманская //Биотехнология.- 2001.- №3. - С. 40-50.

46. Макаров, В.В. ПЦР в диагностике вируса лейкоза крупного рогатого скота /

47. B.В. Макаров, Д.П. Гришанин // Ветеринария.- 2005.- №4. С. 9-11.

48. Маниатис, Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование : пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук.- М.: Мир, 1984.1. C.157-186.

49. Мате, Дж. Гистологическая и цитологическая классификация опухолевых болезней кроветворной и лимфоидной тканей/ Дж. Мате.- Женева.- 1981.- 47 с.

50. Москалик, Р.С. Ускоренный метод ликвидации лейкоза крупного рогатого скота на племпредприятиях / Прионные и ретровирусные инфекции животных бюлл. ВНИИЭВ,- М, 1996. Вып. 77.

51. Нахмансон, В.М. Лейкоз крупного рогатого скота. — М, 1986.-175 с.

52. Нахмансон, В.М. Генетический аспект лейкоза крупного рогатого скота. / В.М. Нахмансон, Л.Г. Бурба, Е.А. Дун // Всесоюз. НИИ информатики и технико-эконом. Исслед. по сел. хоз. -М. 1975. С.47-58.

53. Незавитин, А.Г. Селекционно-генетические и организационные основы борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Новосибирской области // Тез. докл. Всесоюз. науч.-произв. конф. СО ВАСХНИЛ.- Новосибирск, 1990.- С. 37-38.

54. Новые методы диагностики и современные принципы профилактики и борьбы с лейкозами крупного рогатого скота / В.П. Шишков, Г. Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба, В.М. Нахмансон, П.П. Рахманин // Тр. ВИЭВ. 1983. Т.59. - С.3-6.

55. Опанасюк, А. С. Функциональная активность лимфоидной системы плодов крупного рогатого скота, больного лейкозом: автореф. дис. . канд. вет. наук./ А.С. Опанасюк. Новосибирск, 1991,- 24с.

56. Особенности распространения антигенов BOLA-A и аллелей гена BOLA- DRB3 у черно-пестрого скота в связи с ассоциацией с лейкозом/ Л.К. Эрнст, Г.Е. Су-лимова, А.Р. Орлова, И.Г. Удина, С.П. Павленко// Генетика .-1997. Т .33, - №1. - С.87-95.

57. Островская, В.Ф. Сравнительная оценка продуктивности и состава молока у здоровых и больных лимфолейкозом коров / В.Ф. Островская, Т.Н. Бабкина //

58. Изучение лейкоза крупного рогатого скота: сб. науч. тр. Персиановка, 1980. - Т 25. - вып. №4. - 83с.

59. Паракин В.К. Экспериментальный лейкоз овец/ В.К. Паракин, Л.Ф. Силкин, Н.Н. Котлярова // тр. ВИЭВ.- М., 1981.-Т. 54.-С. 19

60. Парфанович, М.И Обнаружение онкорнавируса в культурах клеток тканей больных лейкозом коров// Ве теринария.- 1974.- №4.- С.47-49.

61. Паршина, О.Н. Результаты сравнительного изучения интерьерных показателей крупного рогатого скота при лейкозе и экономическая оценка оздоровительных мероприятий: автореф. дис. . канд вет. наук/ О.Н. Паршина Новосибирск, 2002.

62. Петров, Н.И. Лейкоз крупного рогатого скота. Насколько он опасен?// Зооинду-стрия,- 2001.-№3.

63. Проблемы лейкоза животных/ П.Н. Смирнов, А.Г. Незавитин, В.В. Смирнова, В.В. Храмцов; под ред. П.Н. Смирнова.- Новосибирск, 1992.-468с.

64. Прохватилова, Л. Б. Применение ПЦР для раннего обнаружения провируса лейкоза крупного рогатого скота у экспериментально инфицированных животных / Л. Б. Прохватилова, С. Н. Колосов, А. И. Ломакин // Ветеринария.- 1999.-№ 10,- С. 17-20.

65. Разведение и селекция сельскохозяйственных животных/Учебное пособие для практических занятий / А.И. Желтиков, Н.С. Уфимцева, Т.В. Макеева, В.И. Устинова, В.В. Гарт. Новосибирск 2002. - С.25-27.

66. Румянцев, Н.В. Производственный вывод на основании обследования хозяйств на лейкоз крупного рогатого скота / Н.В. Румянцев // Тр. MB А. М. 1961. - Т. 37.-С.21-24.

67. Русинович, А.А Особенности эпизоотического процесса лейкоза крупного рогатого скота в разные сезоны года. / А.А. Русинович. // Вести Академии аграрных наук Беларуси. Минск, 1995. - №4. -С. 99-101.

68. Самуйленко, А.Я. Иммуноферментный анализ в ветеринарной медецине / АЛ. Самуйленко, Д.П. Кузнецов, С.В. Кузнецова // Ветеринария. 2001.-№12.- С 20-23.

69. Смирнов, Ю. П. Зависимость частоты лейкоза от некоторых факторов среды обитания крупного рогатого скота // Профилактика и лечение заболеваний крупного рогатого скота в условиях Нечерноземья.- Горький, 1990. С. 12-18.

70. Смирнов, Ю.П. Развитие лейкозного процесса у инфицированных BLV коров в зависимости от их возраста/Ю.П. Смирнов // Ветеринария.-1999.-№12.-С.15-17.

71. Смирнов, П.Н. Болезнь века лейкоз крупного рогатого скота. - 2007. - 301 с.

72. Смирнов, П.Н. Диагностика лейкоза крупного рогатого скота/ П.Н. Смирнов, В.В. Смирнова, А.Т. Левашев.- метод, рекомендации. Новосибирск, 1989.-46с.

73. Смирнов, П.Н. Лейкоз крупного рогатого скота: научно обоснованные подходы к эффективному оздоровлению //Ветеринария Сибири.- 2002.- №7-8.-С 21-24.

74. Смирнов, П.Н. Научное образование и реализация в условиях производства комплексной системы противолейкозных мероприятий в Сиби-ри./П.Н. Смирнов, В.В. Храмцов, В.В. Смирнова// Ветеринария Сибири.-2001.-№5.-С.47-50.

75. Смирнова, В.В. Патоморфология, эпизоотология и вопросы иммунологии ге-мобластозов крупного рогатого скота в Западной Сибири: автореф. дис. . .канд. вет.наук./ В.В. Смирнова. М., 1984.- 24с.

76. Смит, К. Анализ генома/ К.Смит, Ф.Коллинз, Ч.Кантор.- М., 1990.-58с.

77. Снарските, А.В. Эпизоотические особенности, диагностика и иммунопрофилактика лейкоза крупного рогатого скота в Литве: дис. . канд. вет. наук./ А.В. Снарските. Рига, 1992. - 168 с.

78. Сторожилова, Т.П. Стратегия борьбы с лейкозом крупного рогатого скота в Ленинградской области / Т.П. Сторожилова, Н.И. Петров, Б.Е.Свиридов // Зоо-индустрия. 2001. - № 12.

79. Сусова, О. Ю. Область рХ HTLV-1 в жизненном цикле вируса и карценогенезе / O.IO. Сусова, В. Э. Гурцевич // Молекулярная биология. 2003.-Т.37, №3. - С. 392-403.

80. Таубеков, Г.К. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота в Казахстане. / Г.К. Таубеков, А.И. Испуллаев. // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири. Новосибирск, 1995. - С. 52-56.

81. Файзулин, Р.З. Реагенты из моноклональных антител для идентификации инфицированных вирусом лейкоза животных// Автореф. канд. ветерен. наук/ Р.З. Файзулин. — Новосибирск, 1996.

82. Федоров, В.В. Лейкоз крупного рогатого скота. / В.В. Федоров, И.Г. Беспалько -Псков, 1972.-31с.

83. Хисамутдинов, Ф.Ф. Эпизоотическая ситуация и перспективы осуществления противолейкозных мероприятий в Республике Татарстан / Ф.Ф. Хисамутдинов // Прионные и ретровирусные инфекции животных: тр. ВНИИЭВ. 1996. - Т. 77. - С. 82.

84. Храмцов, В.В. Распространение, патогенетическая характеристика лейкоза крупного рогатого скота и система противолейкозных мероприятий в Сибири: дис. д-ра ветерен. наук/В.В. Храмцов. Новосибирск, 1995. - С.284.

85. Храмцов, В.В. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в некоторых областях Сибири / В.В. Храмцов, Т.А. Агаркова // Проблемы адаптации сельскохозяйственных животных в Сибири.- Новосибирск, 1995.- С.57-62.

86. Цонев, П.И. Взаимосвязь между заболеваемостью лейкозом и молочной продуктивностью коров основных пород, разводимых в Болгарии / П. Цонев, Д. Кирчев, К. Анатасов. // Живота, науки. -1987. Т. 24, №3. С. 23-27.

87. Чичинина, С.В. Роль аллельной вариабельности генов цитокинов в формировании резистентности крупного рогатого скота к лейкозу: /автореф. дис. . канд. биол. наук/ С.В. Чичинина-Новосибирск, 2005. 24с.

88. Шапот, B.C. Еще раз об онкогене/ B.C. Шапот, М.А. Шлянкевич, Р.В. Лоба-ненков //Вопросы онкологии.- 1983.- Т. 29, №5.- С. 76-86.

89. Шишков, В.П. Основные итоги научных исследований по проблеме лейкоза с.-х. животных за 10-ю пятилетку и задачи на 1981-1985гг. / В.П. Шишков, Г.Ф. Коромыслов, Л.Г. Бурба// Тр. ВИЭВ. М., 1981. - С. 3-10.

90. Шишков, В.П. Иммунологические аспекты ветеринарной лейкозологии// Иммунология и иммунотерапия лейкозов человека и животных: тез. Всесоюз. конф.- Ташкент, 1984. -С.3-5.

91. Шишков, В.П. Лейкозы и злокачественные опухоли животных / В.П. Шишков, Л.Г. Бурба. М.: Агропромиздат, 1988.- 301с.

92. Шишков, В.П. Опухоли и лейкозы животных (биологические, экономические и ветеринарно-медицинские аспекты)// Проблемы экспериментальной онкологии и лейкозов человека и животных.- М.: Колос, 1973.- С. 11-22.

93. Шишков, В.П. Туберкулез животных, методы диагностики и профилактики/ В.П. Шишков, А.В. Ткачев-Кузьмин, С.П. Кочанова/ ВНИИИТЭИ по сельскому хозяйству. М., 1986.-43 с.

94. Шукель, А.А. Сравнительная характеристика иммунологических методов диагностики инфекции BLV в системе противолейкозных мероприятий: автореф. дис. канд. ветерен. наук/ А.А. Шукель.- Барнаул, 1998.-18с.

95. Шукель, А.А. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Мирнинском улусе Республики Саха (Якутия) // Сб. науч. тр. / РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. Новосибирск, 1996. - С. 42-45.

96. Шульга, П.Г. Роль абютичных i бютичных фактор1в у виникненш i ноширенш лейкозу велико! poraToi худоби: автореф. дис. канд. ветерен. наук/ П.Г. Шульга. Харыов, 1996. - 15 с.

97. Яунслейнис, Э.Я. Связь между заболеваемостью лейкозом и продуктивностью коров бурой латвийской породы в стадах Валмиерского района Латвийской ССР / Э.Я. Яунслейнис, P.O. Гринберг. // Лейкоз крупного рогатого скота. Рига, 2004. - № 45(3). - С. 68 -74.

98. Abt, D.A. Studies on the development of persistent lymphocytosis and infection with the bovine C-type leukemia vims (BLV) in cattle /R.R. Marshak, J.F. Ferrer, G.E. Piper, D.M. Bhatt // Vet. Microbiol., 1976. vol. 1. - P.287-300.

99. Adam, E. Willems Involvement of the cyclic AMP- responsive element binding protein in bovine leukaemia virus expression in vivo J / P. Kerkhofs, M. Mammerickx., R. Kettmann, A. Bumy, L. Droogmans // Virol., Sep., 1994. vol 68,№.9.-P. 5845-5853.

100. Agresti, A. Use of polymerase chain reaction to diagnose bovine leukaemia virus infection in calves at birth Am.J. /W. Ponti, M. Rocchi, A. Marozzi, D. Cavalteri et al.// Vet. Res., 1993. № 54. - P. 373-378.

101. Amills, M. Cytokine mRNA expression in В cells from bovine leukemia virus-infected cattle with persistent lymphocytosis/ J. Noriminel, A. Colleen, et al.// Scien-ceDirect., 2004.- P. 25-28

102. Amills, M. Reduced IL-2 and IL-4 mRNA expression in CD4+ T cells from bovine leukemia virus-infected cows with persistent lymphocytosis / V. Ramiya, J. No-rimine, C. Olmstead, H. Lewin// Virology, 2002. № 304. - pp. 1-9.

103. Angelino, D. Productive and reproductive performance in cattle infected with bovine leucosis virus / L. Garcia, E. Birgel// J. Dairy Res., 1998.-№65- P. 693-695.

104. Argyle, D. Gene therapy in veterinary medicine Технологии генной терапии и перспективы ее применения в ветеринарии. (Великобритания). Veter. Rec., 1999. vol.144, № 14.-P. 369-376

105. Asfaw , Y. Distribution and superinfection of bovine leukaemia virus genotypes in Japan / S. Tsuduku, M. Konishi, K. Murakami, T. Tsuboi, et al. / Arch Virol., 2004.-P. 24-27.

106. Azuba, R.B. A prevalence study of bovine leukemia virus infection in slaugtered cattle in selected areas in Uganda / U. Zieger, F. Schmidt // Bull. Anim. Prod. Afr., 1994.-vol. 42.-№1,-P. 13-17.

107. Ballingall, K.T. The DY genes of the cattle MHC: expression and comparative analysis of an unusual class П gene pair/ K.T. Ballingall, S.A. Ellis, N.D. Mac Hugh, S.D. Archibald // Immunogenetics., 2004. № 55. - pp. 748-755

108. Baltimore, D. RNA-dependent DNA-polymerans in viricus of RNA-tumor viruses. Nature., 1970. vol. 226. - P. 476-478.

109. Bederke, G. Zup Placentaren Ubertragbarkeit der Rinderleukose / G. Bederke, A. Tolle, F. Schmidt. //Zbl. Vet. Med, 1968. -Bd.15. № 7. -P. 782-793.

110. Beier, D. R. Blankenstein, Fechner H. Possibitilies and limitations for use of the polymerase chain reaction (PCR) in the diagnosis of bovine leukemia vims (BLV) infection in cattle // Dtsch.Tierarztl Wochenschr, 1998.- № 105(11).- P. 408-12.'

111. Beier, D. Comparison of Serological Tests for the Diagnosis of Enzootic Bovine Leukosis and Eradication of Infection from a Large Herd / H. A. Siakkou / Tie-rarztliche umschau, 1994.- vol. 49.- № 6.- P. 356-360.

112. Beier, D. Establishment of a new bovine leucosis virus producing cell line / R. Riebe, P. Blankenstein, E. Starick, A. Bondzio// J. of Virological Metods, 2004.-vol. 121.- № 2.- P.-239-246.

113. Belak, S. Application of the polymerase chain reaction (PCR) in veterinary diagnostic virology/ A. Pollagy-Pordany//Vet. Res Comm., 1993. № 17. -P.55-72.

114. Beyer, J.R. M. 2002 Cattle infected with bovine leukaemia virus may not only develop persistent B-cell lymphocytosis but also persistent B-cell lymphopenia. / R.B. Kollner, J.P . Teifke, D. Beier//Joumal of Veterinary, 2002.- № 49(6). P. 270.

115. Bicka, L. Expression of bovine leukemia virus protein p24 in Escherichia coli and its use in the immunoblotting assay / J. Kuzmak, B. Kozaczynska// J.Acta Biochimica Polonica, 2001.- vol.48. № 1.- P.227-232.

116. Bishop, J.M. Retroviruses and cancer genes.// Adv. Cancer Res, 1982. vol. 37.-p. 1-32.

117. Boros, I.M. Interaction of bovine leukemia virus transactivator Tax with bZip pro-teins./F. Tie, C. Giam //Virology vol, 1995.- 214. P. 207-214.

118. Brenner, J. The fat content of milk from dairy cattle infected with bovine leucosis vims./1. Rosenthal, S. Bernstein, Z. Trainin.// Vet.Res: Commun, 1990.- № 14. P. 167-171.

119. Brenner, J. The implication of BLV-infection in productivity, reproductive capacity and survival rate or a daily cow./ M. Van-Haam, D. Savir, Z. Trainin // Vet. Immun. Immunopath., 1989,- № 22. P. 299-305

120. Burny, A. Bovine leukemia virus: molecular biology and epidemiology/ C. Bruck,

121. A. Chantrenne, J. Clenter, D. Dekagel, et al.// In: Viral Oncology., 1980.- Raven Press, New York.- P. 236-289.

122. Bumy, A. Bovine leukemia: fact and hypoteses derived from the study of an infections cancer / Y.Clenter, R.Kettman, M. Mammerick, D. Portetelle, et al.|/ Vet.Microbiol., 1988. -№17.- P. 197-218.

123. Burridge, M. Fall in antibody titer to bovine leukemia virus in the periparyturient period// Can. J. Сотр. Med, 1982. vol. 46. - P. 270-271.

124. Burridge, M. Prevalence of leukomia Virus Infection in Florida / M. Puhr,

125. B. Hennemann // Javma, 1981. vol. 179 - № 7. - P. 704-707.

126. Buzala, E Comparison of PLA with AGID and ELISA results in serology diagnosis of bovine leukosis / W. Deren //Pol J Vet Sci, 2003. № 6. - P. 9-11.

127. Callahan, R. Bovine leukemia virus genes in the DNA of leukemie cattle/ M.M. Lieber, G.J. Todaro et al.// Science, 1976. vol. 1922. - № 243. - P. 10051007.

128. Carli, K.T. Comparison of Serum, Milk and Urine as Samples in an Enzyme-Immunoassay for Bovine Leukemia Virus Infection / K.T. Carli, H. Batmaz, A. Sen, A. Minbay // Res.Vet.Sci, 1993. vol.55, № 3.- P.394-395.

129. Carpenter, S. Molecular and functional characterization of genes encoding horse MHC class I antigens/ S. Carpenter, S. Carpenter, J. Baker, S. Bacon, et al.// Immuno-genetics, 2001. № 53. - P. 802-809.

130. Da, Y. Milk and fat yields decline in bovine leukemia virus-infected Holstein cattle with persistent lymphocytosis / Y. Da, D. Shanks, J. Stewart and H. Lewin // Proc. Natl. Acad. Sci US A., 1993,- № 90, P. 6538-6541.

131. Deren, W. The eradication of enzootic leovine leucosis in lage farm population / W.A. Deren, Szewczyk-Sadowska, S. Rulka //Pol J. Vet. Sci., 2003. №6(3). -P. 124.

132. Derse, D. Bovine leukemia virus transcription is controlled by a virus-encoded trans-acting factor and by cis-acting response elements J.// Virol., 1987.- № 61.- P. 2464-2471.

133. Derse, D. Trans-Acting regulation of bovine leukemia vims mRNA processing. J. Virol., 1988.-№62.-P. 1115-1119.

134. Devare, S. Bovine lymphosarcoma //Development of aettiologic agent . Sciens., 1978.-vol. 194.-P. 1428-1430.

135. Devare, S. Gold spring harbor couf//Cell Prolif., 1988. vol.7. - P. 943-952.

136. Dohun, P. Interleukin 12 p40 mRNA Expression in bovine Leukemia Virus-Infected Animals: Increase in Alymphocytosis but Decrease in Persistent Lymphocytosis/ P. Dohun, G. Splitter . //J. Virol.August., 1998.- vol.72, № 8.- P. 69176921.

137. Doolittle, R. Simian sarcoma viruscuc-gene, v-sis, is derived from the gene (or genes) encoding on plateled-derived growth factor/ R. Doolittle, M. Hunkapilier, L. Heod, S. Devare, et al.// Science, 1983, vol. 221.- N 4607,- P. 275-277.

138. Eaves, F.W. A Field evaluation of the polymerrase chain reaction procedure for the detection of bovine leukaemia virus proviral DNA in cattle/ F.W. Eaves, J.B. Molloy, C.K. Dimmock, L.E. Eaves // Vet.Microbiol., 1994.- № 39.- p. 313-321.

139. Everman, J. Prevalence of bovine leukemia virus antibody in seven herds of Hols-tein-Friesian cattle / J. Everman, R. DiGiacomo, N. Huber //J.Am. Vet. Med. Assoc., 1980.-V. 177.-P. 549-550.

140. Fecher, H. Evaluation of polymerase chain reaction (PCR) application in diagnosis of bovine leukaemia virus (BLV) infection in naturally infected cattle./ H. Fecher, A. Kurg, L. Geue et al.// J. Am. Vet. Med. Assoc., 2003.-V.222(7).-P.983-5

141. Felber, B.K. The pX protein of PITLV-I is transcriptional activator of its long terminal repeats/ B.K. Felber, H. Paskalis, C. Kleinman-Ewing, F. Wong-Staal, G.N. Pavlakis // Science., 1985,- V. 229.- p. 675-679.

142. Felmer, R. Molecular analysis of a 444 bp fragment of the BLV gp51 env gene reveals a high frequency of non-silent point mutations and suggest the presence of two subgroups of BLV in Chile //Vet.Microbiology., 2005.- V. 108.- p. 39-47

143. Franchini, G. Molecular mechanism of human T-cell leukemia// lymphotropic virus type I infection. Blood., 1995.-V. 86.- p. 3619-3639.

144. Galligan, C.L. Effects of human IL-8 isoform on bovine neutrofil function in vitro / C.L. Galligan, B. L. Coomber //Vet. Immynology and Immynopathology., 2000.-V. 74.- P. 71-85.

145. Gangur, V. Chemokine in healf and disease / V. Gangur, N. Birmingham, S. Thanesvorakul // Vet. Immynology and Immynopathology., 2002.- vol. 86.- P. 127136.

146. Ghysdael, J. Bovine leukemia virus. / J. Ghysdael, C. Bruck, R. Kettmann, A. Burny. // Curr. Top. Microbiol. Immunol., 1984. vol. 112. -P. 1-19.

147. Gonzalez, E.T. Leucosis enzootica bovina: evaluation de tecnicas diagnosticas (ID, ELISA-I, WB, PCR) en bovinos inoculados experimentalmente/ E.T. Gonzalez, G. Oliva, A. Valera, E. Bonzo, M. Licursi, et al. // Analecta Vet., 2001.- № 21. P. 12-20.

148. Grosse, W.M. Single nucleotide polimorphism(SNP) discoveri and linkage mapping of bovine cytokine genes./ W. M. Grosse, S. M. Kappes, W. W. Laegreid, et al.//Mammalian Genome., 1999.- vol. 10.-P. 1062-1069.

149. Heeney, J. Evidence for bovine leukemia virus infection of peripheral blood monocytes and limited antigen expression in bovine lymphoid tissue/ J. Heeney, P. Valli, R. Jacobs, V. Valli // Lab.Invest., 1992,- № 66. P. 608-617.

150. Homey, B. Chemokines: agent for the immynotherapy of cancer? // Nature Reviews Immynology., 2002.- № 2. P. 175-184.

151. Jacobs, R.M. Production and Related Variables in Bovine Leukemia Virus-Infected Cows/ R.M. Jacobs, J.L. Heeney, M.A. Godkin, K.E. Leslie, J.A. Taylor, et al7Vet.Res.com., 1991.- vol.15, № 6.- P.463-474.

152. Kabeya, H. Host immune responses in the course of bovine leukemia vims infection. / H. Kabeya, K. Ohashi, M. Onuma//J. Vet. Med. Sci., 2001.- № 53(7). -P.703-708.

153. Katoh, I. The bovine leukaemia virus X region encodes a trans-activator of its long terminal repeat Jpn J&nbsp/ N. Sagata, Y. Yoshinaka, Y. Ikawa / Cancer Res., 1987.-№78.-P. 93-98.

154. Kelly, E. J. Early detection of bovine leukaemia vims in cattle by use of the polymerase chane reaction./ E. J. Kelly, M. K. Jackson, G. Marsolais et al.// Dtsch. Tierarztl. Wochenschr, 1998.- vol.105. -№ П.- P.408.

155. Klintevall, К. Evaluation of an Indirect ELISA for the Detection of Antibodies to Bovine Leukemia-Virus in Milk and Serum / K. Naslund, G. Svedlund, L. Hajdu, et al. / J. Vir.Meth, 1991.- vol. 33, №3,- P. 319-333.

156. Kucleburg, G.J. Detection of bovine leukemia virus in blood and milk by nested and real-time polymerase chain reaction / C.C. Chase, E. A. Nelson, S.A. Marras, et al. //J. Vet. Diagn Invest, 2003. №15(1).- P. 72-6.

157. Kurdi, A. Serologic and virologic investigations on the presence of BLV infections in a dairy herd in Syria / A. Kurdi, P . Blankenstein, O. Marquardt, D. Ebner // Berl Munch. Tierarztl Wochenschr, 1999. vol. 112. - № 1. - P. 18-23.

158. Langston, A.G. Comparison of production variables of bovine leukemia virus antibody-negative and antibody-positive cows in two California dairy herds./ A. Ferdinand, R. Ruppanner, G.Theilen, et al. //Am. J.Vet.Res, 1978 .- № 39. -P.1093-1098.

159. Licursi, M. Genetic heterogeneity bovine leukemia virus genotypes and its relation to humoral responses in hosts/ Y. Inoshima, T. Yokoyama, E. Gonzales, H. Sentsui // Virus Research, 2002.- № 86. P. 101-110.

160. Mammerickx, M. Rapid Detection of Bovine Leukemia Virus Infection in large Cattle Population with an ELISA performed on Pooled Sera Grouped by Herd / D. Portetelle, I. Nys, A. Bumi / J. Vet. Med, 1985.- vol. 32. P. 601-608.

161. Marsolais, G. Importance of primer selection in the application of PCR technology to the diagnosis of bovine leukemia virus / R. Dubuc, J. Bergeron, J. Morsey, et al.//J. Vet. Diagn. Invest, 1994. № 6. - P.297-301.

162. Martin, D. Comparative study PCR as direct assay and ELISA and AGID as indirect assay for the detection of bovine leukaemia virus / A. Arjona, I. Soto,

163. N. Barquero, M. Viana, et al. // J. Vet Med. В Infect.Dis/ Vet Public Health., 2001.-№48.-P. 97-106.

164. Meas, S. Evidens for BLV unfection in cattle in Zambia// S .Meas, M. Nakayama, T. Usui, Y. Nakazato, et al.//Jpn J Vet Res., 2004. № 52. - P. 3-8.

165. Miller, J.M. Virus-like particles in phytohemagglutinin-stimulated lymphocyte culteres with referenct to bovint lymphosarcoma. / J.M. Miller, L.D. Miller, C. Olson, K.G. Gillette. J. Natl. Cancer Inst., 1969.- № 43,- P. 1297-1305.

166. Ming-Che, W. Milk and fat prodaction in dairy cattle influeced by advanced subclinical bovine leukemia virus infection / D. Roger, S. Harris, H. Lewin // PNAS., 1989,- vol. 86.- № 3.- P. 993-996

167. Mirsky, M.L. The prevalence of pro viral bovine leukaemia virus in peripheral blood mononuclear cell at two subclinical stages of infection / C.A. Olmstead, Y. Da, H. Lewin/ J. Virol, 1996.-№ 70.- P. 2178-2183.

168. Monke, D.R. Estimation of the sensitivity and specificity of the agar-gel immunodiffusion test for bovine leukemia-vims 1,296 cases (1982-1989) / R.F. Rohde, W.D. Hueston, R.J. Milburn // J.Amer.Vet.Med.Ass., 1992.- vol.200, № 12.- P. 2001-2004.

169. Monti, G. Genetic diversity and spread of Bovine leukaemia virus isolates in Argentine dairy cattle / R . Schrijver, D. Bier //Arch Virol., 2005.- vol. 150,- № 3.- P. 443-458.

170. Motton, D.D. Bovine leukemia virus alters growth properties and casein syntesis in mammary epithelial cells / G.C. Buehring // J. Dairy Sci., 2003.- vol. 86.- P. 28262838.

171. Nagy, D.W. Use of a polymerase chain reaction assay to detect bovine leucosis vims in daiiy cattle/ D.W. Nagy, J.W. Tyler, S.B. Kleiboeker, A. Stoker.// J.Am Vet Med Assoc., 2003.- vol 222(7).- № 1. P. 983.

172. Naif H. Bovine leukemia proviral DNA detection in cattle using the polymerase chane reaction / R. Brandon, R. Daniel, M. Lavin// Vet. Microbiol., 1990. № 25.-P. 117-129.

173. Nuotio L. Eradication of enzootic bovine leucosis from Finland// L. Nuotio H. Rusanen, L. Sihvonen, E. Neuvonen //Prev.Vet.Med., 2003.- vol. 30.-№ 59(1-2).-P. 43.

174. Ohsima, K. A pathologoc study on fetuses and placentas from cows affected with enzootic bovine leucosis with referens to transplacental infection of bovine leukemia virus / K. Takahashi, K. Okada//Japan J. Vet. Sci, 1982,- vol. 44. №3. - P. 479-488.

175. Olson C. Development of bovine leukosis virus infection in cattle / R. Kaja, R. Stauffacher, E. Zehner//A perliminari study. Ann. Rech. Vet, 1978,- № 9.- P. 8845-8849.

176. Ott, S. Association between bovine-leukosis virus seroprevalence and herd-level productivity on US dairy farms/ R. Johonson, S. Wells //Prev. Vet. Med, 2003.- vol. 61.-№4.-P. 249-262

177. Palma, F. D. А ВАС contig of approximately 400 kb contains the classical class I MHC genes of cattle\ F. Palma, S. Archibald, J. Young and S. Ellis //Eur. J. Immu-nogenet, 2002. № 29. - P. 65-68.

178. Perea, G. Clinical utility of bone marrow flow cytometry in B-cell non-Hodgkin lymphomas (B-NHL) / A. Altes, M. Bellido et. al. // Histopathology, 2004.- vol. 51. -№3.-P. 159-163.

179. Pichowski, J.S. Sequence of 2 cattle MHC class I cDNAs associated with BoLA A10 specificity/ J.S. Pichowski, S.A. Ellis, W.I. Morrison, //Immunogentics, 1996.-№43.-P. 253-254.

180. Piper, C.E. Postnatal and prenatal transmission of the bovine leukemia virus under natural conditions/ J.F. Ferrer, D.D. Abt, R.R. Marshak // J. Natl. Cancer Inst, 1979.-vol. 62.-P. 165-168.

181. Pringl, C.R. Virus taxonomy // ICTV. Arch. Virol, 1999.- vol. 144.- P.421-429.

182. Radostitis, O. Enzootic bovine leucosis (bovine lymphosarcoma) / D. Blood, C. Gay //Vet. Med. Eight ed Bailliere Tindall, London, 1995. P.954-965.

183. Regenmort, V. In: Virus Taxonomy/ V. Regenmort, V. Regenmortel, C.M. Fauquet, D.H. Bshop et al.// Classificfnion and Nomenclature of viruses, Academic Press, San Diego., 2000. P.369-387.

184. Reichert, M. Simultaneous use of two primer pairs increasestheefficiency of polymerase chaine reaction assay in the diagnosis of bovine leukaemia virus infection / J. Stec // J. Vet. Diag. Invest., 2001 .-№11.- P.543-547.

185. Richmond, A. NF-kB, chemokine gene transcription and tumour // Nature Reviews Immynology., 2002. № 2. - P.664-674.

186. Rulka, J. Evaluation of the nested-PCR method for the diagnosis of bovine leukaemia virus infection /Р. Kubis, W. Deren, E. Buszala//Bull.Vet.Inst.Pulawy., 2001. -vol. 45.-P. 11-19.

187. Rulka, J The improvement of monitoring methods of cattle infection with bovine leukemia virus (BLV) / P. Kubis, E . Buzala, S. Kaminski, W. Deren // Pol J Vet Sci.,2003.- №6.- P. 40.

188. Sagata, N Complete nucleotide sequence of the genome of bovine leukemia virus: its evolutionary relationship to oher retroviruses / T. Yasunaga, J. Tsuzuku- J. Kawamura, K. Ohishi et al. // PNAS., 1985,- № 82.- P.677-681.

189. Schwartz, I. Pathobiology of bovine leukemia virus/1. Schwartz, D. Levy IN et Res., 1994. № 25.- P. 521-536.

190. Sommerfelt, M.A. Retrovirus receptors. / M.A. Sommerfelt. // J. Gen. Virol., 1999. -vol. 80. -P. 3049-3064.

191. Sothy, M. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in daiiy cattle herds/ T. Usui, K. Ohashi, C. Sugimoto, M. Onuma /J. Vet. Microbiology., 2002.- vol.84.- № 3.- P. 275-282.

192. Straub O.C. Versuche uber die verticale Ubertragung der Rindeleukose / O.C. Straub. // Dtsch. Tierarzt. Wacher., 1969. vol. 76. - P. 365-392.

193. Suh, G.H. Establishment of BLV-free dairy herd in Korea // G.H. Suh,J.C. Lee, C.Y. Lee, T.Y. Hur et al. //J. Vet.Set., 2005,- №6(3).- P. 227-230.

194. Tajima, S. Ikawa Y, Aida Y. Complete bovine leukemia virus (BLV) provirus is conserved in BLV-infected cattle throughout the course of B-cell lymphosarcoma development / S. Tajima, Y. Ikawa, Y. Aida//J. Virology, 1998.- vol. 72.- № 9.-P.7569-7576.

195. Tajima, S. Mutant Tax protein from bovine leukemia virus with enchanced ability to activate the expression of c-fos. / S. Tajima, Y. Aida //J. Virology, 2002.- vol. 76.- № 5,- P. 2557-2562.

196. Temin, A.M. RNA-directed DNA synthesis and RNA tumor viruses/ A.M. Temin, D. Baltimore //Advances on virus Research, 1972.- vol. 17.- P. 129186.

197. Thurmond, M. Economics of enzootic bovine Leukosis // Enzootic bovine leukosis and Bovine Leukemia vims, 1987.- vol. 4. P. 192.

198. Trono, K. G. Seroprevalens of BLV in dairy cattle in Argentina comparison of sensitivity and specificity of different detection methods// K.G. Trono, D.M. Perez-Filgueira, S . Duffy, M.V. Borca, C. Carrillo // Vet.Microbiol, 2001.- № 26.- P. 23548.

199. Van der Maaten, M. J. In utero transmission of bovine leukemia vims / J.M. Miller, M.J. Schme. // Am. J.Vet. Res, 1981. vol. 42. - P. 1052-1054.

200. Van der Maaten, M.J. Isolation of a virus from cattle with persistent lymphocytosis/ M.J. Van der Maaten, A.Boothe, S.Seger // J. Nat. Cancer Inst., 1972.- vol.49.-P. 1649-1657.

201. Van, E. Extensive polimorphism of the BoLA- DRB3 gene distinguished by PCR-RFLP. / E.Van, J. Stewart-Haynes, H. Lewin //Animal Genetics., 1992.- vol. 23.- P. 483-496.

202. Willems, L. Phosphorylation of bovine leukemia virus Tax protein is required for in vitrj transformation but not for transactivation/ L. Willems, C. Grimonpont P. Kerkhofs, C. Capiau et al./ Oncogene, 1998.- № 30.- P. 2165-2176.

203. Xie, B. Detection a proviral DNA of bovine leukemia virus in cattle by a combination of in situ hybridization and the polymerase chane reaction/ T. Oyamada, H. Yoshikawa, T. Oyamada, H. Yoshikawa//J.comp Path.,1997.- vol. 116.- P. 87-96.

204. Yang, D. Milk and Fat Yields decline in bovine leukemia virus-infected Holsten cattle with persistant lymphocytosis / D. Yang, R. D. Snanks, J. A. Stewart, H.A. Lewin //PNAS, 1993.- vol.90.- P. 6538-6541.

205. Zabeau, M. Selective restriction fragment amplificanion: a general method for DNA fingerprinting /М. Zabeau, P. Vos//European Patent Application 924026297, Pub. № 053458.

206. Zaghawa, A. An outbreak of bovine leucosis in upper Egypt: clinical, laboratory and molecular-epidemiological studies. / A. Zaghawa, D. Beier, I.H. Abd El-Rahim et al. //J. Vet.Med. B.Infected Dis. Vet. Public Healf, 2002 .- vol. 49.- № 3.-P. 123.

207. Zlotnic, A. A new classification system and their role in immunity/ A. Zlotnic, O. Yoshie // Immynity,2000.-vol. 12.-P. 121-127

Информация о работе

Грачева, Наталья Владимировна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Генотипическое разнообразие BLV по GAG и ENV генам у крупного рогатого скота разных пород - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы