Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота

Шаева, Айгуль Юсуповна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота"

005001929

На правах рукописи

ШАЕВА АЙГУЛЬ ЮСУПОВНА

ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.01.04-биохимия

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 4 НОЯ 2011

Казань-2011

005001929

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждение высшего профессионального образования Казанской государственной академии ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Хазипов Нариман Залилович

Научный консультант: доктор биологических наук,

Вафин Рамиль Ришадович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Шарипова Маргарита Рашидовна

Защита диссертации состоится « 22 » декабря 2011 г. в «_» часов

V/? на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при^ Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. Н.И.Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета.

доктор ветеринарных наук, профессор Равилов Рустам Хаметович

Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики

Казанского научного центра РАН

Автореферат разослан «У£ »

1011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота - инфекционная болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которой является одноименный вирус (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirus семейства Retroviridae (S.M. Rodriguez et al., 2009).

В структуре инфекционных болезней животных лейкоз крупного рогатого скота в Российской Федерации занимает ведущее место. Он представляет угрозу для генофонда племенного молочного скота, наносит значительный экономический ущерб вследствие падежа животных и недополучения продуктов животноводства (Н.З. Хазипов с соавт., 2008).

Лабораторно-диагностические исследования в системе мониторинга инфицированности стад ВЛКРС являются неразрывным звеном противолейкозных мероприятий.

Вопросы диагностики лейкоза крупного рогатого скота в контексте изучения генетического многообразия его этиологического агента весьма актуальны, учитывая факт невозможности типизации данного вирусного патогена серологическими методами исследования (G. Moratorio et al., 2010).

Ряд разработанных на основе интерпретации еиу-ПЦР-ПДРФ-профилей стратегий типизации BLV (Н. Fechner et al., 1997; D. Beier et al., 2001; M. Licursi et al., 2002; H. Fechner et al., 1997) имеют определенную идентификационную ценность, однако не способны охарактеризовать весь спектр генетического многообразия ВЛКРС, нежели современный подход к оценке его генотипического разнообразия на основе филогенетического анализа еот-гена данного возбудителя (S.M. Rodriguez et al., 2009; G. Moratorio et al., 2010).

Цель и задачи исследования. Цель исследования - молекулярно-генетический анализ представителей ВЛКРС на предмет их таксономической классификации в контексте существующих подходов к типизации возбудителя и совершенствование способов генотипической идентификации BLV по локусу еот-гена.

Для реализации цели решались следующие задачи:

- изучить эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан;

- установить таксономическую принадлежность изолятов ВЛКРС, циркулирующих в хозяйствах Республики Татарстан, в контексте существующих молекулярно-генетических подходов к типизации возбудителя, как на основе ПЦР-ПДРФ, так и филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена провируса BLV;

- классифицировать всех заявленных в GenBank NCBI представителей ВЛКРС в зависимости от выбранной стратегии типизации с дальнейшим определением степени согласованности существующих способов генотипической идентификации BLV;

- разработать схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС по локусу ««v-гена возбудителя, согласующуюся с филогенетической классификацией BLV.

Научная новизна.

- Впервые на основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиг-гена провируса ВЬУ охарактеризован новый, ранее не обоснованный генотип ВЛКРС, обозначенный нами «8-й генотип»,

- Впервые разработана схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЬУ в соответствии с филогенетической классификацией данного возбудителя.

Научная новизна отражена в публикациях ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК и глобальной электронной базе данных вепВапк ЫСВЬ

Научно-практическая значимость.

- Результаты молекулярно-генетического анализа представителей ВЛКРС на предмет их таксономической принадлежности существенно повышают уровень знаний о генетическом многообразии ВЬУ и позволяют эффективно использовать полученную информацию в научно-практической деятельности ветеринарной медицины.

- С учетом новых знаний о генетическом многообразии ВЬУ разработана согласующаяся с филогенетической классификацией схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования, позволяющая проводить идентификацию 8-ми генотипов ВЛКРС.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета (Казань, 2009 г.);

- Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию кафедры биологической и органической химии Санкт-Петербургской ГАВМ (Санкт-Петербург, 2009 г.);

- VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, 2010 г.);

- научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО «Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана» (Казань, 2010);

- научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань, 2010 гг.);

- Международной научно-практической конференции «Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии» (Троицк, 2011 г.);

- Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение инновационного развития животноводства» (Казань, 2011 г.);

- Научно-технической конференции «Модернизация АПК на основе инновационных достижений науки и техники» (Казань, 2011 г.).

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, включая 4 депонированные в глобальную базу данных ОепВапк ЫСВ1 публикации нуклеотидных последовательностей локуса еот-гена выявленных изолятов провируса ВЬУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- На основании результатов серологических и гематологических исследований поголовья крупного рогатого скота на лейкоз в Республике Татарстан установлен эндемический характер распространения данной вирусной инфекции.

- На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса елу-гена провируса BLV охарактеризован новый, ранее не обоснованный 8-й генотип ВЛКРС, ввиду формирования на выстраиваемых дендрограммах нового автономного генотипического кластера.

- Схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС, разработанная в рамках совершенствования способов генотипической идентификации возбудителя, согласуется с современным подходом к оценке его генотипического разнообразия, основанным на филогенетическом анализе env-гена BLV.

Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 150 страницах компьютерного текста (текстовый редактор «Microsoft Office 2003», стиль «Times New Roman», размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список использованной литературы (всего 132 источника, в том числе 93 иностранных) и приложения. Диссертация иллюстрирована 29 таблицами, 15 рисунками и 6 схемами. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую значимость работы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились в 2008-2011 годы на кафедре биологической и неорганической химии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана», в ГУ «Республиканская ветеринарная лаборатория РТ» (г. Казань), в лабораториях НПО «СибЭнзим» (г. Новосибирск), а также в сельхозпредприятиях районов Республики Татарстан Российской Федерации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для эпизоотологического анализа использованы статистические данные ветеринарной отчетности, результаты диагностических исследований на лейкоз крупного рогатого скота (РИД и гематология) ветеринарных лабораторий Республики Татарстан.

Молекулярно-генетическим исследованиям была подвергнута 71 проба крови BLV-позитивных коров сельхозпредприятий 9 районов Республики Татарстан на предмет генотипической идентификации выявленных представителей ВЛКРС на основе ПЦР-ПДРФ- и филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еот-гена возбудителя (табл. 1).

Табл. 1. Происследованные образцы провирусной ДНК BLV

РАЙОН РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН ПРОИССЛЕДОВАНО

№ п.п. ПЦР-ПДРФ-анализ Секвенирование и филогенетический анализ

1 Арский 7

2 Дрожжановский 12 2

3 Кайбицкий 7

4 Лениногорский 10

5 Мензелинский 6 1

6 Муслюмовский 3

7 Рыбнослободский 8

8 Спасский 8 1

9 Чистопольский 10

ВСЕГО ОБРАЗЦОВ 71 4

Экстракцию тотальной ДНК из цельной крови крупного рогатого скота осуществляли с помощью коммерческого набора «ДНК-сорб Б» согласно инструкции производителя (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).

При постановке ПЦР с выделенными образцами провирусной ДНК BLV использовалась модификация «nested» ПЦР с применением «внешних» («env5032»: S'-TCTGTGCCAAGTCTCCCAGATA-y и «env5608»: 5;-AACAACA ACCTCTGGGAAGGGT-3') и «внутренних» («env5099»: 5'-CCCACAAGGGCG GCGCCGGTTT-S' и «env5521»: S'-GCGAGGCCGGGTCCAGAGCTGG-S') праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции амплификацию фрагмента ewv-гена ВЛКРС длиной 444 п.н. (D. Beier et al., 2001; М. Licursi et al., 2002; H. Fechner et al. 1997).

Амплификацию локусов ДНК провируса BLV проводили в термоциклере «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

ПЦР-продукты, амплифицированные с «внутренними» праймерами «env5099» и «env5521», обрабатывались соответствующими эндонуклеазами рестрикции в зависимости от выбранной стратегии типизации ВЛКРС, основанных на интерпретации ПЦР-ПДРФ-профилей..

ПЦР-ПДРФ-моделирование: NEBcutter v.2.0.

Детекция результатов ПЦР-ПДРФ проведена методом горизонтального электрофореза в 2,5% агарозном геле в буфере ТВЕ (рН 8,0) содержащем этидий бромид с последующей визуализацией результатов в ультрафиолетовом трансиллюминаторе (Х=310 нм). Размеры фрагментов ДНК оценивали по подвижности в сравнении со стандартными ДНК маркерами.

В работе были использованы продукты для молекулярно-биологических исследований производства ООО «СибЭнзим» (Россия).

Секвенирование продуктов амплификации локуса сиг-гена выявленных изолятов провируса ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим» с использованием праймеров «env5099» и «env5521» в качестве сиквенсных олигонуклеотидов.

GenBank A/N нуклеотидных последовательностей локуса ет>- гена изолятов провируса BLV, выявленных у крупного рогатого скота в животноводческих хозяйствах Республики Татарстан:

GenBank A/N: НМ102355 - локус еиу-гена изолята провируса BLV «N10», выявленного у крупного рогатого скота в Спасском районе РТ.

GenBank A/N: НМ102356 - локус еот-гена изолята провируса BLV «N28», выявленного у крупного рогатого скота в Мензелинском районе РТ.

GenBank A/N: JF683619 - локус еот-гена изолята провируса BLV «N72», выявленного у крупного рогатого скота в Дрожжановском районе РТ.

GenBank A/N: JF713455 - локус еиу-гена изолята провируса BLV «N174», выявленного у крупного рогатого скота в Дрожжановском районе РТ.

Изоляты провируса ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» были выравнены по длине 444 и 400 нуклеотидов локуса ewv-гена с соответствующими опубликованными в GenBank последовательностями известных представителей BLV, используя программы BLAST и CLUSTAL W (v. 1.83) в 2-х форматах филогенетического анализа: CLUSTAL и PHYLIP. При построении филогенетических дендрограмм использован алгоритм NJ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота

в Республике Татарстан 3.1.1. Результаты серологических и гематологических исследований

крупного рогатого скота за 2006-2010 гг В 2006-2010 годах диагностические исследования проводились в рамках реализации целевой программы по борьбе с лейкозом крупного рогатого скота. Обобщенные результаты серологических и гематологических исследований представлены в табл. 2.

Табл. 2. Результаты серологических и гематологических исследований

Исследовано по РИД Исследовано по гематологии

Выявлено Выявлено гематологически больных

Годы Голов инфицированных Голов

(тыс.) Голов (тыс.) В% (тыс.) Голов (тыс.) В%

2006 510 83,8 16,4 296 7,8 2,6

2007 616 94,5 15,3 279 7,9 2,8

2008 688 117 17,0 279 7,8 2,8

2009 747 132,1 17,7 265 6,5 2,5

2010 750 119,9 16,0 277 6,5 2,3

Так, в 2006 году методом РИД было происследовано 510 тыс. голов крупного рогатого скота, 83,8 тыс. (16,4%) из которых оказались инфицированными; гематологически исследовано 296 тыс. голов, 7,8 тыс. (2,6%) из которых оказались больными (табл. 2).

В 2007 году РИД-исследованиям подверглось 616 тыс. голов крупного рогатого скота, положительные результаты дали 94,5 тыс. (15,3%) животных; гематологическим методом исследовано 279 тыс. голов, гемположительными оказались 7,9 тыс. голов (2,8%) (табл. 2).

К 2010 году количество исследованных голов методом РИД возросло до 750 тыс., 119 тыс. голов (16%) было инфицировано вирусом лейкоза крупного рогатого скота; из 277 тыс. гематологически исследованных животных 6,5 тыс. (2,3%) оказались больными (табл. 2).

3.1.2. Степень инфицированности крупного рогатого скота в разрезе районов Республики Татарстан по состоянию на 2010 год

Серологические исследования на лейкоз крупного рогатого скота проводились во всех районах Республики Татарстан. Получены следующие результаты в разрезе районов по степени инфицированности (табл. 3).

Табл. 3. Процент инфицированности крупного рогатого скота _ по лейкозу за 2010 год__

% положительных

животных Количество Наименование %

к общему числу районов РТ районов РТ инфицированных

исследованных

Балтасинский 0,1

Атнинский 0,2

Тюлячинский 1,5

Сабинский 2,8

Сармановский 2,9

От 0,1 до 10% 11 Арский 3,7

Нижнекамский 4,0

Ютазинский 5,8

Высокогорский 7,5

Зеленодольский 7,8

Актанышский 9,9

Тукаевский 10,1

Нурлатский 10,3

Агрызский 12,4

Верхне-Услонский 13,6

Алькеевский 14,3

От 10,1 до 20% 12 Черемшанский 14,9

Елабужским 15,1

Кукморский 16,2

Менделеевский 16,5

Новошешминский 17,8

Алексеевский 19,1

Мензелинский 19,5

Чистопольский 20,8

Бавлинский 21,6

Муслюмовский 21,6

Кайбицкий 22,0

Азнакаевский 22,2

Тетюшский 23,4

Аксубаевский 23,5

От 20,1 до 30% 15 Буинский 23,5

Дрожжановский 24,1

Лаишевский 25,5

Рыбно-Слободский 26,1

Камско-Усгьинский 26,6

Спасский 27,1

Заинский 29,0

Апасговский 29,6

Пестречинский 30,3

Бугульминский 33,2

от 30,1% и выше 5 Лениногорский 37,2

Мамадышский 39,5

Альметьевский 53,7

Так, наименьшая степень инфицированности поголовья вирусом лейкоза крупного рогатого скота (от 0,1 до 10%) отмечалась в 11 районах Республики Татарстан. В 12 районах процент инфицированное™ составлял от 10,1 до 20%. 15 районов РТ характеризовались степенью зараженности крупного рогатого скота от 20,1 до 30%. Наиболее тяжелая ситуация наблюдалась в 5 районах РТ (Пестречинский, Бугульминский, Лениногорский, Мамадышский и Альметьевский): здесь вирусом лейкоза крупного рогатого скота инфицировано более 30% животных (табл. 3).

Следует констатировать, что эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан характеризуется как эндемичная, как и в целом по Российской Федерации.

3.2. Стратегии типизации ВЛКРС, основанные на интерпретации глу-ПЦР-ПДРФ-профилей

Задачей данного раздела исследования являлось определение таксономической принадлежности представителей ВЛКРС, выявленных в хозяйствах РТ, в контексте молекулярно-генетических аспектов идентификации на основе интерпретации еот-ПЦР-ПДРФ-профилей по 3 стратегиям типизации BLV: по D. Beier et al. (2001), М. Licursi et al. (2002) и H. Fechner et al. (1997).

Процедуре ПДРФ-анализа предшествовал этап амплификации локуса env-гена выделенных образцов провирусной ДНК ВЛКРС, для чего использовалась модификация «nested» ПЦР с применением «внешиих» («env5032»+«env5608») и «внутренних» («env5099»+«env5521») праймеров, инициирующих на заключительном этапе реакции наработку ПЦР-продукта размером 444 bp.

Результатом эксплуатации подобранных вариантов постановки «nested» ПЦР явилась детекция стабильного ПЦР-сигнала от BLV-позитивных проб, амплифицированные ДНК которых были пригодны для дальнейших молекулярно-генетических исследований (рис. 1).

200 Ьр

444

1000 bp 800 bp 600 bp 500 bp 400 bp 300 bp

100 bp

Рис. 1. Электрофореграмма результата «nested» ПЦР с образцами провирусной ДИК изолятов BLV «N10» и «N28» (1-й вариант протокола амплификации локуса еиу-гена ВЛКРС) Обозначения:

1.1-1.5) Образец провирусной ДНК изолята «N10» BL V (ПЦР-проду кт: 444 bp). М) ДНК-маркеры 100-1000 bp (СибЭизим).

2.1-2.5) Образец провирусной ДНК изолята «N28» BLV (ПЦР-продукт: 444 bp).

3.2.1. Интерпретация еиу-ИЦР-ПД РФ-профилей В1.\ по О. Ве»ег е! а1. (2001)

В результате реализации стратегии типизации представителей ВЛКРС на основе интерпретации еиг-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по Б. Ве!ег й а1. (2001), установлено, что первоначально изученный нами изолят провируса ВЬУ«1Ч10», выявленный у кр.рог.ск. в Мензелинском районе РТ, относится к Бельгийской подгруппе, а другой изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит Австралийской подгруппе ВЛКРС.

Детальная информация, отражающая характеристику заявленных подгрупп ВЬ\' по протоколу Ве1ег е! а1. (2001), представлена в табл. 4, а результаты ПЦР-ПДРФ-анализа исследованных нами изолятов провируса ВЛКРС «N10» и «N28» отражены на рис. 2.

Два следующих изолята провируса ВЛКРС «N72» и «N174», выявленных у крупного рогатого скота в Дрожжановском районе Республики Татарстан, согласно интерпретации ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по П. Ве1ег е1 а1, (2001), также характеризуются признаком Бельгийской («N72») или Австралийской («N174») подгруппы ВЛКРС, соответственно, формируя на электрофореграмме

КЯТТПТН\/ ИЛРНТИЦ1ЛЛЛ прчиш.тат!/ гутпач;(»иилт; ио пнл О г-----; ■> .........; — I---J------J ^ " ук**,. д..

Табл. 4. Стратегия типизации BLV по Beier et al. (2001)

ПЦР-ПДРФ-типирование ВЛКРС ПЦР-продукт (п.н.) (1Д РФ-фрагменты (п.н.)

Pvuli ВатШ ВсЧ 0Ksp22I)

ПОДГРУППА Бельгийская 444 280/164 444 225/219

...... Австралийская 444 444 316/128 225/219

Японская 444 444 316/128 219/121/104

Рис. 2. Электрофореграмма еиу-ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса ВЬУ «N10» и «N28» (типизация по Ве1ег е! а1., 2001)

Обозначения: 1.0-1.3) ПЦР-ПДРФ-ирофиль изошла провируса В1_У «N10»: 1.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) Ли/7-ПДРФ (280/164 Ьр); 1.2) ВатШ-ПДРФ (444 Ьр); 1.3) Кхр221-ПДРФ (225/219 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭшим). 2.0-2.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N28»: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 2.1) РуШМЩРФ (444 Ьр); 2.2) ВатНШЦРФ (316/128 Ьр); 2.3) Клр221-ПДРФ (225/219 Ьр).

Следует отметить, что точные размеры полученных ПЦР-ПДРФ-фрагментов локуса еиу-гена изолятов провируса ВЛКРС «N10», «N28», «N72» и «N174» были установлены в результате секвенирования продуктов ПЦР-амплификации.

3.2.2. Интерпретация еиу-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по М. Ысиш е! а1. (2002) В результате реализации стратегии типизации представителей ВЛКРС на основе интерпретации еиг-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по М. 1лсига е( а1. (2002), установлено, что изолят провируса ВЬУ «N10» относится к 6-му генотипу, а изолят провируса ВЬУ «N28» - к 1-му генотипу ВЛКРС.

Детальная информация, отражающая характеристику заявленных генотипов ВЬУ по протоколу М. Ысига й а1. (2002), представлена в табл. 5, а результаты ПЦР-ПДРФ-анализа исследованных нами изолятов провируса ВЛКРС «N10» и «N28» отражены на рис. 3.

444 Ьр 316 Ьр 225/219 Ьр

128 Ьр

444 Ьр

280 Ьр -*-225/219 1>р — 164 Ьр —»-

Табл. 5. Стратегия типизации ВЬУ по М. Ькито с? я1. (2002)

ПЦР-ПДРФ- ПЦР-продукт ПДРФ-фрагменты (п.н.)

типи рование ВЛКРС (л.н.) ВсП (Кьр22Г) НаеШ Р\и11

1-й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 444

С 2-й 444 219/121/104 312/94/32/6 444

3-й 444 219/121/104 285/94/32/27/6 444

О 4-й 444 219/121/104 198/94/87/32/27/6 444

к а 5-й 444 225/219 285/94/32/27/6 444

и 6-й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 280/164

ч 444 225/219 225/94/87/32/6 444

1.0 1.1 1.2 1.3 М 2.0 2.1 2.2 2.3

Рис. 3. Электрофореграмма еиу-ПЦР-ПДРФ-профилсй изолятов провируса ВЬУ «N10» и «N28» (типизация по М. Ысига еЛ а!., 2002)

Обозначения: 1.0-1.3) ПЦР-ПДРФ-ирофш1ь изолята провируса ВЬУ «N10»: 1.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) К.чр221-\\}\РФ (225/219 Ьр); 1.2) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 1.3) РтаЯ-ПДРФ (280/164 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭюим). 2.0-2.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N28»: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 2.1) Кхр221-ПДРФ (225/219 Ьр): 2.2) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 2.3) Л'иЯ-ПДРФ (444 Ьр).

Изолят провируса ВЬУ «N72» согласно интерпретации еот-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по М. Ьгсига е! а1. (2002), также как и ранее изученный изолят «N10», принадлежит 6-му генотипу ВЛКРС, а другой выявленный нами представитель ВЬУ - изолят «N174» характеризуется признаком нового, ранее не классифицированного генотипа («?») ввиду генерации уникальной комбинации ПДРФ-профилей [Ал/?22/-Л Д РФ (225/219 Ьр); НаеШ-ПДРФ (225/94/8732/6 Ьр); Л>г(//-ПДРФ (444 Ьр)], не свойственной для классифицированных 6-ти генотипов (табл. 5, рис. 4).

1.0 1.1 1-2 1.3 М

2.0

2.1 2.2 2.3

444 Ьр - »

280 Ьр~»

225/219 Ьр 198 Ьр-» 164 Ьр--»

94/87 Ьр -9 32/27 Ьр

• • . \ • * , . ... , ... .. . Щ " Я 'л^Ш?*-'^ ■'" ■"•' Нш.ч». ■ ,

ШШЬ \ >

ш С: ■ ■".■ шкш

* * я

'г- 444 Ьр

г-225/219 Ьр

¡- 94/87 Ьр Е—32/27 Ьр

Рис. 4. Электрофоре!рамма е/п-ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов

провируса ВI V «N72» и «N174» (типизация по М. Ькига е! а1., 2002) Обозначения: 1.0-1.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N72«: 1.0) 11ЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) К$р221-ПДРФ (225/219 Ьр); 1.2) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр): 1.3) ЯуиЛ-ПДРФ (280/164 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭгоим). 2.0-2.3) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N174»: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 2.1) Кир221-ПДРФ (225/219 Ьр); 2.2) НаеШ-ПДРФ (225/94/87/32/6 Ьр); 2.3) Рш11-ПДРФ (444 Ьр).

3.2.3. Интерпретация ейV-Г1ЦР-Г1ДРФ-профилей ВЬУ по Н. Рес1тег е! а1. (1997)

В ходе проведения процедуры типизации представителей ВЛКРС на основе интерпретации еиг-ПЦР-ГТДРФ-профилей ВЬУ по Н. РесЪпег ег а1. (1997) установлено, что изоляты «N10» и «N72» относятся к вариантной группе «А», а изоляты «N28» и «N174» - к вариантным группам «С» и «Е», соответственно. Детальная информация, отражающая характеристику заявленных вариантных групп ВЬУ по протоколу Н. РесЬпег е1 а]. (1997), представлена в табл. 6, а результаты моделирования еот-ПЦР-ПДРФ-профилей изученных изолятов провируса ВЬУ «N10», «N28», «N72» и «N174» отражены на рис. 5.

ПЦР-ПДРФ- ПЦР- ПДРФ-фрагменты (п.н.)

тнпирование ВЛКРС продукт (п.н.) ВатН1 Вс11 (К$р22Г) в8и НаеШ Р\щЦ

444 444 . 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164

< а А 444

В 444 316/128 219/121/104 328/116 285/94/32/27/6 444

а >, 444

в. и. К! 198/94/87/32/27/6

¡ЙрярЯЯ! 328/116 285/94/32/21/6/6

< в н с 444 316/128 225/219 285/94/32/27/6 444

а ■ : : . ' 444

а а. < о 444 444 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 444

Е 444 316/128 225/219 .328/116 225/94/8732/6: 444

ее К 444 316/128 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164

в 444 316/128 225/219 444 312/94/32/6 444

нагкаг 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 2.1 2.2 2-=1 2.4 2.5 3.1 3.2 3.5 3.4 3.5 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 лагквг

Рис. 5. Моделирование е/я -ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса ВЬУ «N10», «N28», «N72» и «N174» (типизация по Н. ГссЬпсг et а!., 1997) Обозначения: 1.1-1.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята ировируса ВЬУ «N10»: 1.1) ВатН1-Г1ДРФ (444 Ьр); 1.2) Кар221-ПДРФ (225/219 Ьр); 1.3) %//-!! ДРФ (328/116 Ьр); 1.4) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 1.5) />уа//-ПДРФ (280/164 Ьр). 2.1-2.5) ПЦР-ПДРФ-профидь изолята провируса В1Л' «N28»: 2.1) ВатН1-ПДРФ (316/128 Ьр); 2.2) Кзр221-ПДРФ (225/219 Ьр); 2.3) Й#//-ПДРФ (328/116 Ьр); 2.4) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 2.5) РтоЯ-ПДРФ (444 Ьр). 3.1-3.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса В1.У «N72»: 3.1) ВатШ-ПДРФ (444 Ьр); 3.2) Кзр221-ПДРФ (225/219 Ьр); 3.3) %//-ПДРФ (328/116 Ьр); 3.4) НаеШ-ПДРФ (198/94/87/32/27/6 Ьр); 3.5) РтоЯ-ПДРФ (280/164 Ьр). 4.1-4.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса ВЬУ «N174»: 4.1) ВатШ-ПДРФ (316/128 Ьр); 4.2) К$р221-ПДРФ (225/219 Ьр); 4.3) Й^//-ПДРФ (328/116 Ьр); 4.4) НаеШ-ПДРФ (225/94/87/32/6 Ьр); 4.5) РмиН-ПДРФ (444 Ьр).

3.3. Стратегия типизации ВЬУ на основе интерпретации результатов филогенетического анализа локуса еиу-гена возбудителя

Задачей данного раздела исследования являлось определение таксономической принадлежности представителей ВЛКРС, выявленных в хозяйствах РТ, в контексте молекулярно-генетических аспектов идентификации на основе интерпретации результатов филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еот-гена провируса ВЬУ.

В результате филогенетического анализа выравненных нуклеотидных последовательностей локуса еот-гена типовых представителей известных генотипов ВЛРКС установлено, что изолят «N28», выявленный в Спасском районе РТ, принадлежит кластеру 7-го генотипа, а изоляты «N10» и «N72», выявленные соответственно в Мензелинском и Дрожжановском районах РТ, относятся к 4-му генотипу ВЬУ (рис. 6).

Еще один изолят, «N174», выявленный в Дрожжановском районе РТ, характеризуется признаком нового, ранее не обоснованного генотипа ВЛКРС, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемых дендрограммах нового автономного генотипического кластера, в который также входят изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (ОепВапк АЛЧ: НМ563766); «3-41» (ОепВапк А/Ы: НМ563767]) и Хорватии [«М1/ЕЬО Сго/08» (ОепВапк А/№ 011724606)] (рис. 6).

Ё2106/FJ808578/genotype 1 -UTuC06II/FM955S58/genotype 1

- Uru38/ FM209471/genotype 1 -AL 63/FJ808571/genotype 1

-Cow ■527/AF007764/genotype I

-23/lla7873/genotype 1

- VdM/M35239/genotype 1

- Kurdistu.n/EU266062, genotype 1 Jf

AL-164/FJ808S74/genotype 2 -A RGSF8/A F485773/genotype 2

-AL—1453/FJ808577/genotype 2

-PL-4960/FJ80B59G/genotype 2

■-JPFU/EF065650/genotype 3 ■

1-USCA-1 /EF065647/genotype 3

BG/EF065638/genotype 4

\№10/HM102355/genotype 4

- 3/V8 7372/genot.ype

^[72/JF68361Sl/genotype^4\

14-2/тГ5в3781/genotype 4

- CRAS-2/EF065636/genotype 6 - CBGC/EF065639/genotype S -CRLC~1/EF065655/genotype о

- PL-1238/FJa08S82/genol.ype 6

• 151/AY185360/genotype 6

-\*2B/HM1023SK/genatype 7|

1 /AYSt6280/genotype 7 -14/AYStS274/genatype 7

--- 30/DQ059417/genotype 7

- 12/S83530/genotype 7

-\N174/JF7i 345s7^enotyp71\

-3-43/HMS63767/genotype в

-4- 1/НМ563766/genotype в

-Ml/GU724S0B/genotype 8

Рис. 6. Дендрограмма типовых представителей известных генотипов BLV (гот-ген) ICLUSTAL W (v. 1.83): PHYLIP, 444 nt, 33 seq.J

Следует отметить, что предложенная в 2009 году S.M. Rodriguez et al. система классификации BLV на основе филогенетическою анализа env-гена предусматривает наличие 7 генотипов ВЛКРС. Однако, как в данной (S.M. Rodriguez et al., 2009), так и поздней работе G. Moratorio et al (2010), фактически регламентирующей наличие 7 генотипов, не были проанализированы изоляты охарактеризованного нами нового 8-го генотипа, ввиду депонирования их нуклеотидных последовательностей в базу данных GenBank NCBI позже опубликования указанных статей.

3.4. Классификация заявленных в СепВапк N061 представителей ВЬУ в зависимости от выбранной стратегии типизации

Задачей данного раздела исследования являлась классификация заявленных в СепВапк ЫСВ1 210 представителей ВЛКРС в зависимости от выбранной стратегии типизации, как на основе ПЦР-ПДРФ-, так и филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ет-гена возбудителя, с дальнейшим определением степени согласованности существующих способов генотипической идентификации ВЬУ.

При сравнительной оценке 210 заявленных в СепВапк N081 нуклеотидных последовательностей локуса еот-гена представителей ВЛКРС на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено, что известные ранее способы типизации ВЬУ, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа (В. Ве1ег & а1., 2001; М. Усига е1 а1„ 2002; Н. РесЪпег е! а1., 1997), не согласуются с новым подходом к оценке генотипического разнообразия ВЛКРС на основе филогенетического анализа еиу-гена возбудителя. Обобщенные результаты обоснования данной установленной несогласованности отображены в табл. 7.

Табл. 7. Классификация заявленных в СепВапк КСВ1210 представителей ВЬУ

в зависимости от выбранной стратегии типизации (количественное отношение)

ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

ТИПИЗАЦИЯ ВЛКРС ГЕНОТИПЫ

1-й 2-й 3-й 4-й 5-й 6-й 7-й »■и

- Бельгийская

5- Австралийская 8 ий

1 Японская 8 ■ 1

ё 1

1-й 87 1 7 18

1-й

§ 3-й 2 1

•< в о 4-й

Е 5-й 1 4 1

£ ё 6-й 36 25 8

ч 3 1 2 1 4

=г с "■'25 :,

.■/НЯ'-Й

в < &4?"-1.- .;/.."4 .-и 18

РЙ 39 '■Г"': 1

К 4

1 1 "■■

Также в ходе сравнительной оценки для каждой из трех заявленных стратегий типизации ВЬУ на основе интерпретации еиу-ПЦР-ПДРФ-профилей выявлены уникальные комбинации искомых ПДРФ-профилей, не характерные для классифицированных подгрупп (табл. 8), генотипов (табл. 9) и вариантных групп (табл. 10) ВЛКРС, и отождествляемые как принадлежащие неклассифицированным таксонам данного возбудителя («?»).

Табл. 8. Еп г-П ЦР-ПД 1'Ф- п

)офи.||| ВЬУ (типизация по Р. Векг е( а!., 2001)

ПЦР-ПДРФ-типирование ВЛКРС ПЦР-продукт (П.Н.) ПДРФ-фрагменты (п.н.) N

РуиН ВатШ ВсИ \Ksp22I)

ПОДГРУППА Бельгийская 444 280/164 444 225/219 25

Австралийская 444 444 316/128 225/219 83

Японская 444 444 316/128 219/121/104 11

- ' -.' .. *> 444 444 444 ; 225/219 . »41..

' 7 : 444 V 444 316/128 ■ 444 .. . 2

444 444 316/128 225/191/28 ■:■>.,-.

.. .-. ? 444 280/164 316/128 225/219 45-

..... 7 . 444 280/164 316/128 444 ■■ 1

444 . 2X0/164 316/128 219/189/36 • 1

Табл. 9. ¿Уи'-ПЦР-ДДРФ-профили ВЬУ (типизация по М. Ькигм И а!., 2002)

ПЦР-ПДРФ- ПЦР-продукт ПДРФ-фрагменты (п.н.) N

гнппрование ВЛКРС (п.н.) ВсИ (Кзр22Г) ИаеШ Руи11

1-й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 444 113

2-й 444 219/121/104 312/94/32/6 444

3-й 444 219/121/104 285/94/32/27/6 444 11

4-й 444 219/121/104 198/94/87/32/27/6 444

$-й 444 225/219 285/94/32/27/6 444 6

Е 6-й 444 225/219 198/94/87/32/27/6 280/164 69

н . ч 444 444 198/94/87/32/27/6 444 'Л.'?

о я 444 : • 225/191/28 198/119/94/27/6 • 444 ■"Г-;'

« ■ ■:■■■■) •• 444 • 225/219 312/94/32/6 444 1 '

7 : ' ' . 444 V .444 ... 198/94/87/32/27/6 280.164: 1

"-■'■! ?■'■'■■■ 444 219/189/36 198/94/87/32/27/ 6 280/164 1

..- ? ' 444 ■: ■ '225/219 285/94/32/27/6 280/164 I

■."..444"'" : 444 198/87/49/45/32/27/6 444 1

444 . 225/219 225/94/87/32/6 +14 4

Табл. 10. £"яг-ПЦР-ПДРФ-проф».т ВЬУ (типизация по Н. УесЬпсг а а!., 1997)

ПЦР-ПДРФ- ПЦР- ПДРФ-фрагменты (п.н.)

тяпироваиие ВЛКРС продукт (п.н.) ВатНI ВЫЦКзрШ) в«и НаеШ РтП N

А 444 444 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 25

444

В 444 316/128 219/121/104 328/116 285/94/32/27/6 444 и

444

198/94/87/32/27/6

£ 328/116 285/94/32/21/6/6

В 5 а. С 444 316/128 225/219 285/94/32/27/6 444 78

444

О 444 444 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 444 40

Е 444 316/128 225/219 328/116 225/94/8732/6 444 4

К 444 316/128 225/219 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 44

- С 444 316/128 225/219 444 312/94/32/6 444 1

а. ? . 444 316/128 444 328/116 198/94/87/32/27/6 ' : 444 1

2 ■' 444 316/128 225/191/28 328/116 198/119/94/27/6 /,:.444;к 1 ■

» ■ 444 ■ V: 444 225/219 :, 444 285/94/32/27/6 444 1

444 316/128 . "444 ... 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164 1

. ? 444 316/128 219/189/36 328/116 198/94/87/32/27/6 280/164- 1

444 316/128 225/219 444 285/94/32/27/6 280/164 •--г..

. 444 316/128 444 328/116 198/87/49/45/32/27/6 414 1

N - количество проанализированных представителей ВЬУ с соответствующим ПЦР-ПДРФ-профилем, чьи нуклеотндные последовательности локуса ¿т'-гена депонированы в базу данных СепВалк (по состоянию на апрель 2011 г). «?» - неклассифицированный таксон ВЬУ.

3.5. Совершенствование способов генотппической идентификации BLV но локусу env-гена возбудителя

Задачей данного раздела исследования являлась разработка схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования BJIKPC, согласующейся с филогенетической классификацией, предложенной S.M. Rodriguez (2009), для чего на первом временном этапе был проведен скрининг известных эндонуклеаз рестрикций для формирования оптимального протокола идентификации путем моделирования ПЦР-ПДРФ-профилей нуклеотидных последовательностей локуса еиу-гена представителей известных генотипов BLV, депонированных в базу данных GenBank по состоянию на июнь 2010 г.

Следует отметить, что количество проанализированных представителей BLV, чьи нуклеотидные последовательности локуса гот-гена были депонированы в базу данных GenBank, по состоянию на июнь 2010 г составляло 184, в число которых входили и 2 выявленных нами изолята провируса ВЛКРС - «N10» (GenBank A/N: НМ102355) и «N28» (GenBank A/N: НМ102356).

По результатам тотальной оценки рестрикционных картирований локуса еот-гена известных представителей BLV, в рамках разработки схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования, согласующейся с филогенетической классификацией, нами были подобраны условия идентификации генотипов ВЛКРС по 5 эндонуклеазам рестрикции: BamHl, PvuII, Ddel, Sspl и HphI (AsuHPI).

Информация с интерпретацией полученных ет'-ПЦР-ПДРФ-профилей 184 заявленных в GenBank (по состоянию на июнь 2010 г) представителей BLV, представлена в обобщенной табл. 11, фактически отражающей схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС в соответствии с филогененетической классификацией возбудителя.

Г Типовой изолят GenBank A/N ПЦР-продукт НД РФ-фрагменты (п.н.) К N

BamHl PvuII Ddel Sspl HphHlmHPl)

1-й AL-63 FJ808571 444 316/128 444 444 399/45 224/220 1 57

1-й AL-2106 FJ808578 444 444 444 444 399/45 224/220 2 17

1-й Uru38 FM209471 444 444 444 330/114 399/45 224/220 1 1

1-й VdM M35239 444 316/128 444 444 399/45 224/181/39 4 l

1-й Kurdistan EU266062 444 316/128 444 444 399/45 220/196/28 5 I

2-й AL-164 FI808574 444 316/128 28Ш164 276/168 399/45 224/220 6 11

2-й ARGSF8 AF485773 444 316/128 280/164 276/168 399/45 444 7 I

2-й AL-1453 FJ808577 444 316/128 280/164 276/168 444 224/220 R l

3-й JPFU EF065650 444 316/128 444 276/168 399/45 444 9 4

4-й BG EF065638 444 444 280/164 276/168 399/45 224/220 10 16

4-й _N10 _ HM10235S iV.444.-js' 444 280/164 168/162/114 .399/45 i s.;-: 224/22o-«r It 1

4-й 3 U87872 444 444 444 168/162/114 399/45 224/220 1? 1

5-й CRAS-2 EF065636 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/181/39 11 %

5-й CRLC-1 EF065655 444 316/128 280/164 276/168 444 224/181/39 14 2

6-Я PL-1238 FJ808582 444 316/128 444 276/168 399/45 224/220 15 in

7-я V» '"■■¡MJJU ........ •»«*•♦ ■■. Уюив 444 i 276/168 ,444 224/137/83 16 1

7-й 12 S83530 444 316/128 444 276/168 444 224/220 17 1

7-й 14 AY515274 444 316/128 444 276/168 444 145/137/83/79 18 1

7-й 30 DQ059417 444 316/128 444 276/168 444 444 19 1

соответствующей комбинацией ПЦР-ПДРФ-профилей, чьи нуклеотидные последовательности локуса еда-гена депонированы в базу данных СепВалк (по состоянию на июнь 2010 г).

Необходимо подчеркнуть, что рассчитанная нами в результате секвенирования продуктов ПЦР-амплификации точная картина ожидаемых ПДРФ-фрагментов локуса ет>-гена провирусной ДНК изолятов ВЛКРС «N10» и «N28» в дальнейшем была воспроизведена экспериментально.

Так, на рис. 7 видно, что при обработке ПЦР-продукта от изолята провируса BLV «N10» ферментом BamHl, ПДРФ-фрагментов не образуется ввиду отсутствия соответствующего сайта рестрикции в анализируемом локусе еиу-гена; Рvull расщепляет ампликон на 2 фрагмента - 280 и 164 п.н., Dclel на фрагменты 168, 162 и 114 п.н., Sspl - 399 и 45 п.н., AsuHPI - 224 и 220 п.н. Полученный ампликон длиной 444 п.н. от изолята провируса BLV «N28» расщепляется эндонуклеазой рестрикции BamHI на фрагменты длиной 316 и 128 п.н., Dclel ~ 276 и 168 п.н., а рестриктазой AsuHPI на 224, 137 и 83 п.н.. Ферменты PvuII и Sspl в данном локусе еиу-гена изолята «N28» ПДРФ-фрагментов не образуют из-за отсутствия соответствующих сайтов рестрикции.

Таким образом, отображенные на рис. 7 комбинации ПЦР-ПДРФ-профилей характерны для 4-го (треки 1.0-1.5) и 7-го (треки 2.0-2.5) генотипов ВЛКРС.

1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 М 2.0 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5

444 Ьр — т Ь|] 280 Ьр 224 Ьр —-164 Ьр — 114 Ьр —

45 Ьр -»-

Рис. 7. Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса В1Л' «N10» и «N28» (предложенная схема генотипирования ВЛКРС) Обозначения: 1.0-1.5) ПЦР-ПДРФ-профиль изолята провируса В1Л' «N10»: 1.0) Г1ЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) ВатН1-ПДРФ (444 Ьр); 1.2) Руы11-ПДРФ (280/164 Ьр); 1.3) /Ш-ПДРФ (168/162/114 Ьр); 1.4) Л^-ПДРФ (399/45 Ьр): 1.5) А,тНР1-ПДРФ (224/220 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1000 Ьр (СибЭнзим). 2.0-2.5) ПЦР-ПДРФ-профнль изолята провируса В1Л' «N28»: 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр): 2.1) ВатШ-ПДРФ (3 (6/128 Ьр); 2.2) Ли//-ПДРФ*(444 Ьр); 2.3) Ш?/-ПДРФ (276/168 Ьр); 2.4) 5Ьдя/-ПДРФ (444 Ьр); 2.5) АзиНР!-ПДРФ (224/137/83 Ьр).

На втором временном этапе работы, в рамках разрабатываемой схемы ГЩР-ПДРФ-генотипирования В1Л', согласующейся с филогенетической классификацией, количество проанализированных по нуклеотидным последовательности локуса еиу-гена представителей ВЛКРС, депонированных в базу данных ОепВапк, по состоянию на апрель 2011 г составляло 210, в число которых входили помимо 2-х ранее выявленных нами изолятов «N10» (СтепВапк А/№ НМ102355) и «N28» (ОепВапк А/№ НМ102356), еще 2 изолята провируса ВЬУ - «N72» (ОепВапк А/Ы: №683619) и «N174» (ОепВапк А/Ы: №713455), оба выявленных в Дрожжановском районе Республики Татарстан.

- 444 bp

-3|6Ьр

- 276 bp -224 bp

- 168 bp -137 bp

- 83 bp

Так, было определено, что изолят провируса ВЬУ «N72», первоначально идентифицированный на уровне разрабатываемой схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования как представитель 4-го генотипа ВЛКРС (рис. 8, треки 1.01.5), по результатам сравнительного филогенетического анализа секвенированной последовательности локуса еот-гена (ОепВапк А/Ы: №683619), продолжал соответствовать ранее установленной генотипической принадлежности.

-444 Ь|> -399Ьр Ьр Ьр Ьр 168 Ьр 128 Ьр

280/276 Ьр 224/220 Ьр-» 168/164 Ьр-»-

Рис. 8. Электрофореграмма ПЦР-ПДРФ-профилей изолятов провируса ВЬУ «N72» и «N174» (предложенная схема генотипнрования ВЛКРС) Обозначения: 1.0-1.5) ПЦР-ПДРФ-профидь изолята провируса ВЬУ «N72»: 1.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 1.1) ВатМ-ПДРФ (444 Ьр); 1.2) Руг/Я-ПДРФ (280/164 Ьр); 1.3) £Ш-ЛДРФ (276/168 Ьр); 1.4) 5'хр/-ПДРФ (399/45 Ьр); 1.5) АыНРШДРФ (224/220 Ьр). М) ДНК-маркеры 100-1500 Ьр (СибЭнзим). 2.0-2.5) ПЦР-ПДРФ-профшть изолята провируса ВЬУ «N174»; 2.0) ПЦР-продукт (444 Ьр); 2.1) ВатН1-ПДРФ (316/128 Ьр); 2.2) РхшП-ПДРФ (444 Ьр); 2.3) /Ш-ПДРФ (276/168 Ьр); 2.4) &/./-ПДРФ (399/45 Ьр); 2.5) А*и11Р1-ЛДРФ (224/220 Ьр).

А изолят провируса ВЬУ «N174», первоначально идентифицированный на уровне разрабатываемой схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования как представитель 6-го генотипа ВЛКРС (рис. 8, треки 2.0-2.5), по результатам сравнительного филогенетического анализа секвенированной последовательности локуса еот-гена (ОепВапк А/И: №713455), характеризовался признаком нового, ранее не обоснованного генотипа ВЬУ, обозначенного нами «8-й генотип», ввиду формирования на выстраиваемых дендрограммах нового автономного генотипического кластера, в который также входили изученные другими исследователями близкородственные изоляты, выявленные в Украине [«4-1» (ОепВапк А/ТМ: НМ563766); «3-41» (ОепВапк А/М: НМ563767]) и Хорватии [«М1/ЕЬО_Сго/08» (ОепВапк А/Ы: ОШ24606)].

Таким образом, достоверно установлено, что предложенная нами на первом временном этапе схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования с подобранными условиями идентификации 7-ми генотипов ВЛКРС по 5 эндонуклеазам рестрикции [ВатН1, Рги11, Ос1е1, Бзр1 и НрМ {МиНРЦ}, не позволяет дискриминировать новый 8-й генотип от 6-го генотипа ВЛКРС.

Необходимо подчеркнуть, что изоляты охарактеризованного нами нового 8-го генотипа BJIKPC не были проанализированы в работах S.M. Rodriguez et al (2009) и G. Moratorio et al. (2010), так как их нуклеотидные последовательности локуса еиг-гена были депонированы в базу данных GenBank после выхода статей (S.M. Rodriguez et al., 2009; G. Moratorio et al., 2010) указанных авторов.

С учетом новых знаний о генетическом многообразии BLV, нами была продолжена работа по совершенствованию схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования BJIKPC, согласующейся с филогенетической классификацией, в результате которой были подобраны условия идентификации 8-ми генотипов ВЛКРС по 6 эндонуклеазам рестрикции: BamHl, PvuII, Ddel, Sspl, HphI (изошизомер AsuHPI) и Haelll.

Дополнительно введенный в протокол ПЦР-ПДРФ-генотипирования шестой фермент Haelll расщепляет ПЦР-продукт, амплифицированный от провирусной ДНК изолятов 8-го генотипа BLV, на характерные только для них ПДРФ-фрагменты (225/94/87/32/6 п.н.) что позволило в дальнейшем проводить корректную процедуру генотипической идентификации ВЛКРС.

Информация с интерпретацией полученных ewv-ПЦР-ПДРФ-профилей 210 заявленных в GenBank (по состоянию на апрель 2011 г) представителей BLV представлена в обобщенной табл. 12, фактически отражающей усовершенствованную схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС в соответствии с филогененетической классификацией изучаемого инфекционного агента.

Так, 1-ый генотип BLV характеризуется наличием восьми комбинаций env-ПЦР-ПДРФ-профилей (К 1-8), 2-ой генотип - четырех комбинаций (К9-12), 3-ий генотип - наличием двух комбинаций (К 12-14); 4-ый генотип - трех комбинаций (К15-17); 5-ый генотип - трех комбинаций (К18-20); 6-ой генотип - двух комбинаций (K2I-22), 7-ой генотип - четырех комбинаций (К23-26) и 8 генотип ВЛКРС - наличием одной комбинации (К27) елv-ПЦР-ПДРФ-профилей BLV (табл. 12).

Примечательно, что для идентификации 1-го генотипа ВЛКРС достаточно даже одной эндонуклеазы рестрикции - Ddel. Охарактеризованный в нашей работе новый, ранее не обоснованный 8-ой генотип ВЛКРС также может быть идентифицирован с использованием одной единственной рестриктазы - НаеШ. С применением двух ферментов могут быть определены представители 4-го [ВатШ и Ddel], 5-го [Pvull и HphI {AsuHPI)] и 7-го генотипов [PvuII и Sspi\ BLV (табл. 12).

В целях же исчерпывающей идентификации генотипов ВЛКРС целесообразно руководствоваться полной картиной аот-ПЦР-ПДРФ-профилей с сопоставлением полученных данных с результатами секвенирования ПЦР-продуктов и последующим филогенетическим анализом представителей BLV по еиу-гену данного возбудителя.

Табл. 12, Новая схема ПЦР-ПДРФ-геногипнровання ШЛ в соошегегвмп с филогенетической классификацией

г Типовой CcflBank иэолят A/N ПЦР-проду»гт (П.И.) ПДРФ-фрагмеиты (п.н.) К

BamHl P\uII Mel Sspl Hphl (4 >«///>/) Haelll N

1-й AL-63 ; FI808571 444 316/128 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 1 48

1-й Cow 527 AF007764 444 316/128 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 2 8

1-1 23 U87873 444 316/128 444 444 399/45 224/220 312/94/32/6 3 1

1-й AL-2106 FJ808578 444 444 444 444 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 4 36

1-й UruC06II FM955558 444 444 444 444 399/45 224/220 285/94/32/27/6 5 1

1-й Uru38 FM209471 444 444 444 330/114 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 6 3

1-й VdM M35239 444 316/128 444 444 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 7 1

1-й Kurdistan EU266062 444 316/128 444 444 399/45 220/196/28 198/119/94/27/6 8 1

2-й AL-164 FJ808574 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 9 34

2-й PL-4960 FJ808590 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/220 198/87/49/45/32/27/6 10 1

2-й ARGSF8 AF485773 444 316/128 280/164 276/168 399/45 444 198/94/87/32/27/6 11 1

2-й AL-1453 FJ808577 444 316/128 280/164 276/168 444 224/220 198/94/87/32/27/6 12 1

3-й JPFU EF065650 444 316/128 444 276/168 399/45 444 285/94/32/27/6 13 3

3-й USCA-1 EF065647 444 316/128 444 276/168 399/45 444 285/94/32/21/6/6 14 1

4-й N72 ■ ■■ №683619 444 444 : 280/164 276/168 399/4$ '■ 224,220 198/94;S7/32.'27/6 15 24

4-в N10 HMI023S5 ■ , 444is: ' Ш.\ : 280/164 168/162/114 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 IS 1

4-й 3 U87872 444 444 444 168/162/114 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 17 1

5-й CRAS-2 EF065636 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/181/39 198/94/87/32/27/6 18 7

5-й CRGC EF065639 444 316/128 280/164 276/168 399/45 224/181/39 285/94/32/27/6 19 1

5-й CRLC-1 EF065655 444 316/128 280/164 276/168 444 224/181/39 198/94/87/32/27/6 20 2

6-й PL-1238 FJ808582 444 316/128 444 276/168 399/45 224/220 285/94/32/27/6 21 3

6-й 151 AY185360 444 316/128 444 276/168 399/45 224/220 198/94/87/32/27/6 22 7

7-й N28 HM102356 •■"■■444., ':. 316/128 444 276/168 •144 224/137/83 198/94/87/32/27/6 - 23 17

7-й ,_ 12 S83530 444 316/128 444 276/168 444 224/220 285/94/32/27/6 24 1

7-й 14 AY515274 444 316/128 444 276/168 444 145/137/83/79 198/94/87/32/27/6 25 1

7-й 30 DQ059417 444 316/128 444 276/168 444 444 198/87/49/45/32/27/6 26 1

8-Л N174 JF713455 / \ 444 316/128 444 276/168 , 399/45 : 224/220 225/94/87,"32« 7,7 4

Обозначавши: 1' - генотип; К - комбинация; N - количество проанали j ирован н ых июлятов BLV с соответствующей комбинацией ГЩР-ПДРФ-профилей, чьи иуклеотпдиые последовательности локуса <w-rena депонированы в баiv данных Gen Bank (по состоянию па апрель 2011 г).

Таким образом, в ходе реализации усовершенствованной нами схемы П1ДР-ПДРФ-генотипирования ВЬУ, согласующейся с филогенетической классификацией, проведена идентификационная оценка образцов провирусной ДНК ВЛКРС, выделенных от крупного рогатого скота сельскохозяйственных предприятий 9 районов Республики Татарстан Российской Федерации.

Обобщенный результат идентификационной оценки в зависимости от выбранной стратегии типизации ВЬУ представлен в табл. 13.

Табл. 13. Идентификационная оценка образцов провирусной ДНК ВЛКРС в зависимости от выбранной стратегии типизации ВЬУ_

Район Республики Татарстан Исследовано ГЕНОТИП

1-Й 2-й 3-Й 4-п 5-й 6-Й 7-Й 8-й

К15 К16 К23 К27

1 Аре кий 7 6 1

? Дрожжановский 12 4 7 1

Кайбицкин 7 7

4 Лениногорский 10 6 4

Мензелинский 6 4 2

в Муслюмовский 3 3

7 Рыбнослободский 8 5 3

8 Спасский 8 2 6

9 Чистопольский 10 3 6 1

71 37 5 27 2

ВСЕГО ОЬРАЗЦиВ 42

ТИПИЗАЦИЯ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ

ГЕНОТИП

1-Й 2-Й 3-Й 4-Й 5-Й 6-Й 7-Й 8-й

К15 К16 К23 К27

ПЦР-ПДРФ-АНАЛИЗ 1 Бельгийская

Австралийская 2

Японская

ГЕНОТИП 1-й 27

2-Й

3-й

4-н

5-Й

6-Й 37 5

9 2

V: х «е- 'г ' Ес -' 'Ж г 37 5

ПV ■

ВЫВОДЫ

1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан характеризуется как эндемичная. Степень инфицированности стада в разрезе районов РТ за 2010 год варьировала в пределах 0,1-53,7%, со средним значением 16% РИД-позитивных животных от обшего числа происследованного поголовья скота Республики Татарстан.

2. В популяциях крупного рогатого скота Республики Татарстан циркулируют изоляты ВЛКРС, идентифицированные в зависимости от выбранной стратегии типизации ВЬУ на основе интерпретации еот-ПЦР-ПДРФ-профилей как представители Бельгийской и Австралийской подгрупп; 6-го, 1-го и не классифицированного генотипов; вариантных групп «А», «С» и «Е» ВЛКРС; а на основе интерпретации результатов филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена как представители 4-го, 7-го и нового, ранее не обоснованного 8-го генотипов ВЛКРС, соответственно.

3. По результатам сравнительной оценки 210 заявленных в СепВапк ЫСВ1 нуклеотидных последовательностей локуса ет-гена представителей ВЛКРС на предмет их классификации в зависимости от выбранной стратегии идентификации установлено, что известные ранее способы типизации, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа, не согласуются с позже предложенной филогенетической классификацией данного инфекционного агента.

4. Разработанная нами схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС с подобранными условиями идентификации 8-ми генотипов ВЬУ по 6 эндонуклеазам рестрикции согласована с современным подходом к оценке его генотипического разнообразия, основанным на филогенетическом анализе ет-гена возбудителя.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Внедрить в систему мониторинга эпизоотической ситуации по лейкозу крупного рогатого скота молекулярно-генетические способы оценки генотипического разнообразия ВЬУ, включая предложенную нами схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС, согласующуюся с современной филогенетической классификацией данного возбудителя.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1) Шаева, А.Ю. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота / А.Ю. Шаева, Н.З. Хазипов, Ф.Ф. Зиннатов, Б.В. Камалов // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - Санкт- Петербург, 2009.-№4.-С. 97-98.

2) Шаева, А.Ю. Молекулярно-генетический анализ вируса лейкоза крупного рогатого скота (BJIKPC) / А.Ю. Шаева // Ученые записки КГАВМ, Казань. -2009.-Т. 196.-С. 319-323.

3) Шаева, А.Ю. Молекулярно-генетические аспекты типизации вируса лейкоза крупного рогатого скота / А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, A.M. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2011.-Т. 205. - С 226-232.

4) Шаева, А.Ю. Разработка схемы ПЦР-ПДРФ-генотипирования BLV в соответствии с филогенетической классификацией / А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, A.M. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки КГАВМ. - Казань, 2011. - Т. 205. - С 232-237.

5) Вафин P.P. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота по env-гену / P.P. Вафин, М.Ш. Тагиров, А.Ю. Шаева, Н.З. Хазипов, A.M. Алимов, Б.В. Камалов // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2011. - №2. - С. 62-63.

6) Шаева, А.Ю. Генотипическая идентификация изолятов ВЛКРС, выявленных в хозяйствах Республики Татарстан / А.Ю. Шаева, P.P. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, A.M. Алимов, М.Ш. Тагиров // Ученые записки КГАВМ. -Казань, 2011. - Т. 208. - С. 330-337.

Публикации в материалах конференций, научных и научно-практических журналах и изданиях

7) Шаева, А.Ю. ПДРФ-анализ вируса лейкоза крупного рогатого скота / А.Ю. Шаева // Материалы научно-практической конференции «Становление и достижения биохимической школы Казанского университета. - Казань, 2009.-С. 173-175.

8) Шаева, А.Ю. Генотипирование Bovine leukemia virus / А.Ю. Шаева, Н.З. Хазипов, P.P. Вафин, Б.В. Камалов, A.M. Алимов // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика -2010». - Москва, 2010. - С. 192-195.

9) Шаева, А.Ю. Идентификация изолятов ВЛКРС, выделенных в Республике Татарстан / А.Ю. Шаева // Сборник статей: Ветеринарная медицина домашних животных. - Казань, 2010. - Вып.7. - С. 294-299.

10) Шаева, А.Ю. Определение таксономической принадлежности изолятов ВЛКРС, выделенных в РТ / А.Ю. Шаева // Актуальные проблемы развития АПК в научных исследованиях молодых ученых. Труды Всероссийского совета молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и

научных учреждений. - Москва: ФГНУ «Росинформагротех», 2011. - Т. 4. -С. 72-78.

11)Шаева, А.Ю. Определение генотипической принадлежности изолятов BJIKPC, выделенных в Республике Татарстан / А.Ю. Шаева, Н.З. Хазипов, P.P. Вафин // Инновационные подходы в ветеринарии, биологии и экологии. Материалы международной научно-практических конференций. - Троицк, 2011.-С. 249-254.

12) Шаева, А.Ю. Типизация вируса лейкоза крупного рогатого скота / А.Ю. Шаева. Р.Р. Вафин, Н.З. Хазипов, Б.В. Камалов, A.M. Алимов, М.Ш. Тагиров //Ж. Нива Татарстана. -2011. -№1-2. -С. 49-51. Публикации в глобальной электронной базе данных GenBank NCBI

13)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: HM102355 - Bovine leukemia virus isolate N10 glycoprotein precursor (env) gene, partial cds / Khazipov.N.Z., Shaeva.A.Y.. Kamalov,B.V., Alimov,A.M., Zaripov.O.G., Akhmetov,T.M. and Vafin.R.R. - Электрон, дан. -GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2010. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM102355, свободный.

14)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: HM102356 - Bovine leukemia virus isolate N28 glycoprotein precursor (env) gene, partial cds / Khazipov.N.Z., Shaeva,A.Y.. Kamalov.B.V., Alimov.A.M., Zaripov.O.G., Akhmetov.T.M. and Vafin.R.R. - Электрон, дан. -GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2010. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/HM102356, свободный.

15)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: JF683619 - Bovine leukemia virus isolate N72 glycoprotein precursor (env) gene, partial cds / Shaeva,A.Y„ Khazipov.N.Z., Kamalov.B.V., Alimov.A.M., Tagirov.M.S. and Vafm,R.R. - Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2011. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF683619, свободный.

16)National Center for Biotechnology Information [Электронный ресурс]: NCBI GenBank (A/N: JF713455 - Bovine leukemia virus isolate N174 glycoprotein precursor (env) gene, partial cds / Shaeva,A.Y„ Khazipov.N.Z,, Kamalov.B.V., Alimov,A.M., Tagirov,M.S. and Vafin.R.R. - Электрон, дан. - GenBank (NCBI), Bethesda, MD, USA, 2011. - Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/JF713455, свободный.

Отзыв на автореферат просим высылать по адресу: 420008 г.Казань, ул.Кремлевская, 18, КГУ, Отдел аспирантуры, Ученому секретарю Диссертационного совета Д 212.081.08 Абрамовой Зинаиде Ивановне

Факс: (843) 238-76-01

Отпечатано в ООО «Печатный двор», г. Казань, ул. Журналистов, 2А, оф.022

Тел: 295-30-36, 541-76-41, 541-76-51. Лицензия ПД№7-0215 от 01.11.2001 г. Выдана Поволжским межрегиональным территориальным управлением МПТР РФ. Подписано в печать 15.11.2011 г. Печ.л. 1,6 Заказ № К-7080. Тираж 100 экз. Формат 60x841/16. Бумага офсетная. Печать -ризография.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шаева, Айгуль Юсуповна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Лейкоз крупного рогатого скота.

1.2. Вирус лейкоза крупного рогатого скота.

1.2Л. Состав и структура вириона.

1.2.2. Геном вируса.

1.3. Патогенез лейкоза крупного рогатого скота.

1.4. Эпизоотология лейкоза крупного рогатого скота.

1.4.1. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота в Российской Федерации.

1.4.2. Эпизоотическое состояние по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан.

1.5. Методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

1.5.1. Реакция иммунодиффузии (РИД).

1.5.2. Иммуноферментный анализ (ИФА).

1.5.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

1.5.4. ПЦР-ПДРФ-анализ.

1.5.5. Секвенирование.

1.5.6. Филогенетический анализ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан.

3.1.1. Результаты серологических и гематологических исследований крупного рогатого скота за 2006-2010 гг.

3.1.2. Степень инфицированности крупного рогатого скота в разрезе районов Республики Татарстан по состоянию на 2010 год.

3.2. Стратегии типизации ВЛКРС, основанные на интерпретации ет>-ПЦР-ПДРФ-профилей.

3.2.1. Интерпретация еяу-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по Б. Ве1ег ег а1. (2001).

3.2.2. Интерпретация елу-ПЦР-ПДРФ-профилей ВЬУ по М. Ысит & а1. (2002).

3.2.3. Интерпретация епу-ТХ\ТР-ГТДРФ-профи.ттей ВЬУ по Н. РесЬпег & а1. (1997).

3.3. Стратегия типизации ВЬУ на основе интерпретации результатов филогенетического анализа локуса еяу-гена возбудителя.

3.4. Классификация заявленных в ОепВапк ЫСВ1 представителей ВЬУ в зависимости от выбранной стратегии типизации.

3.5. Совершенствование способов генотипической идентификации ВЬУ по локусу ет>-гена возбудителя.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Лейкоз крупного рогатого скота — инфекционная болезнь опухолевой природы, этиологическим агентом которой является одноименный вирус (ВЛКРС, англ. Bovine leukemia virus, BLV), относящийся к роду Deltaretrovirns семейства Retroviridae (S.M. Rodriguez et al., 2009).

Ряд разработанных на основе интерпретации e^v-ПЦР-ПДРФ-профилей стратегий типизации BLV (Н. Fechner et al., 1997; D. Beier et al., 2001; M. Licursi et al., 2002; H. Fechner et al., 1997) имеют определенную идентификационную ценность, однако не способны охарактеризовать весь спектр генетического многообразия ВЛКРС, нежели современный подход к оценке его генотипического разнообразия на основе филогенетического анализа env-гена данного возбудителя (S.M. Rodriguez et al., 2009; G. Moratorio et al., 2010).

Цель и задачи исследования. Цель исследования — молекулярно-генетический анализ представителей ВЛКРС на предмет их таксономической классификации в контексте существующих подходов к типизации возбудителя и совершенствование способов генотипической идентификации BLV по локусу еяу-гена.

Для реализации цели решались следующие задачи:

- изучить эпизоотическую ситуацию по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан;

- классифицировать всех заявленных в ОепВапк ІЧГСВІ представителей ВЛКРС в зависимости от выбранной стратегии типизации с дальнейшим определением степени согласованности существующих способов генотипической идентификации ВЬУ;

- разработать схему ПЦР-ПДРФ-генотипирования ВЛКРС по локусу еиу-гена возбудителя, согласующуюся с филогенетической классификацией ВЬУ.

Научная новизна.

- Впервые на основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса ет-гена провируса ВЬУ охарактеризован новый, ранее не обоснованный генотип ВЛКРС, обозначенный нами «8-й генотип».

Научная новизна отражена в публикациях ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК, и глобальной электронной базе данных ОепВапк ЫСВЬ

Научно-практическая значимость.

- С учетом новых знаний о генетическом многообразии ВЬУ, разработана согласующаяся с филогенетической классификацией схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования, позволяющая проводить идентификацию 8-ми генотипов ВЛКРС.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

- научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных» (Казань, 2010 гг.);

- Всероссийской научно-практической конференции. «Научное обеспечение инновационного развития животноводства» (Казань, 2011 г.);

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 16 работ, в том числе 6 публикаций в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК, включая 4 депонированные в глобальную базу данных ОепВапк ЫСВ1 публикации нуклеотидных последовательностей локуса еяу-гена выявленных изолятов провируса ВЬУ.

Основные положения, выносимые на защиту.

- На основании филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса env-гена провируса BLV охарактеризован новый, ранее не обоснованный 8-й генотип BJIKPC, ввиду формирования на выстраиваемых дендрограммах нового автономного генотипического кластера.

- Схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования BJIKPC, разработанная в рамках совершенствования способов генотипической идентификации возбудителя, согласуется с современным подходом к оценке его генотипического разнообразия, основанным на филогенетическом анализе еиу-гена BLV.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шаева, Айгуль Юсуповна

5. ВЫВОДЫ

1. Эпизоотическая ситуация по лейкозу крупного рогатого скота в Республике Татарстан; характеризуется как эндемическая. Степень инфицированности стадам в разрезе: районов РТ за 2010 год варьировала в пределах 0,1-53,7%, со средним значением 16% РИД-позитивных животных от общего числа происследованного поголовья скота Республики Татарстан:

2. В популяциях; крупного рогатого скота Республики Татарстан циркулируют изоляты ВЛКРС, идентифицированные в зависимости от выбранной стратегии типизации на основе интерпретации е«у-ПЦР-ПДРФ-профилей как представители Бельгийской и Австралийской подгрупп; 6-гоу 1-го; и не: классифицированного генотипов; вариантных групп «А», «С» и «Е» ВЛКРС; а на основе интерпретации результатов филогенетического анализа секвенированных последовательностей локуса еиу-гена как представители 4-го; 7-го и нового ранее не обоснованного 8-го генотипов ВЛКРС, соответственно.

3. По результатам сравнительной оценки 210 заявленных в ОепВапк ЫСВГ нуклеотидных последовательностей локуса егсу-гена представителей ВЛКРС на предмет их классификации в зависимости) от выбранной стратегии идентификации установлено; что известные ранее способы типизации ВЕУ, разработанные на основе ПЦР-ПДРФ-анализа, не согласуются с позже предложенной филогенетической; классификацией; данного? инфекционного агента.

4. Разработанная нами схема ПЦР-ПДРФ-генотипирования: ВЛКРС с подобранными условиями идентификации. 8-ми генотипов ВЬУ по 6 эндонуклеазам рестрикции согласована с современным подходом к оценке его генотипического разнообразия, основанным на филогенетическом анализе ет>-гена возбудителя.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шаева, Айгуль Юсуповна, Казань

1. Валихов, А.Ф. Распространение онкорновируса крупного рогатого скота в неблагоприятных по лейкозу хозяйствах / А.Ф. Валихов, Л.Г. Бурба, В.М. Нахмансон // Ветеринария. 1977. - №3. - С. 4043.

2. Галеев, Р.Ф. Характеристика гематологических показателей и серологических реакций у коров, спонтанно инфицированных вирусом лейкоза / Р.Ф. Галеев // II съезд гематологов и патоморфологов. — 1985: — 335 с.

3. Гулюкин, М.И. Исключить крайности' в проведении противоэпизоотических мероприятий при лейкозе крупного рогатого скота / М.И. Гулюкин // Ветеринарный консультант. — 2005а. — № 13-14. — С. 4 ~ 6.

4. Гулюкин, М.И. Обзор эпизоотической ситуации по лейкозу в РФ / М.И. Гулюкин // Доклад на координационном совещании ВИЭВ — Москва, 2005Ы 17 с.

5. Иванов, O.B. Эффективность серологических методов исследования при лейкозе крупного рогатого скота / О.В. Иванов, О.Ю. Иванова, В.П. Федотов, Т.И. Брезгинова, Н.Г. Монова // Ветеринария. — 2008. — №7. — С. 6-8.

6. Итэсь, Ю.В. Результаты комплексных иммунобиохимических исследований крупного рогатого скота разной породной принадлежности и степени компрометации к лейкозу: Автореф. дис. . канд. биол. наук. — Новосибирск, 2002. — 22 с.

7. И. Камалов, Б.В. Лейкоз крупного рогатого скота в Республике Татарстан и меры борьбы с ним: Автореф. дис: . канд. ветер, наук. — Казань, 2006. — 24 с.

8. Камалов, Б.В. Лейкоз крупного рогатого скота. Методическое пособие / Б.В. Камалов, Ф.Ф. Зиннатов, Н.З. Хазипов, А.Х. Волков // Казань, 2005. -37 с.

9. Камалов, Б.В. Организация противолейкозных мероприятий в Республике Татарстан и их экономическая эффективность / Учёные записки КГАВМ. — 2009. -№ 198.-С. 93-99.

10. Ковалюк, Н.В. Современные методы диагностики лейкоза крупного рогатого скота / Н.В. Ковалюк, В.Ф. Сацук, Е.В. Мачульская // Ветеринария Кубани. 2007. - №1. - С. 11-12.

11. Крикун, В.А. Специфическая профилактика лейкоза крупного рогатого скота / В.А. Крикун, Т.В. Щекотурова // Бюлл. ВИЭВ. 1996. - Т. 77. - С. 49-51.

12. Крикун, В.А. Эффективность РИД с двойным антигеном онкорнавируса типа С при оценке эпизоотического состояния хозяйств по лейкозу крупного рогатого скота / В.А. Крикун, В.Г. Куликов, Л.И. Нагаева // Рига: Зинатне, 1979.-С. 130-140.

13. Кукайн, P.A. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / P.A. Кукайн, Л.И. Нагаева//Рига: Зинатне, 1982.- 175 с.

14. Лукашов, В.В. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ / В.В. Лукашов // М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009. — 256 с.

15. Лысов, Ю.П. Определегие нуклеотидной последоватеьности ДНК гибридизацией с олигонуклеотидами: Новый метод / Ю.П. Лысов, В. Л. Флорентьев, А. А. Хорлин, К. Р. Храпко. В.В. Шик, А.Д. Мирзабеков // Докл. АН СССР.-1988.-Т. 303.-С. 1508-1511.

16. Максам, A.M. Метод определения последовательности ДНК (секвенирования) после введения метки, в конец молекулы и расщепления ее по основаниям / A.M. Максам, У. Гилберт // Молекуляр. биология. — 1986.-Т. 20.-С." 581-637.

17. Малоголовкин, С.А. Роль моноклональных антител в диагностике лейкоза крупного рогатого скота / С.А. Малоголовкин // Ветеринария. — 1997. — № 4.-С. 16.

18. Петров, И.Н. Обнаруживающие результаты есть, возвращаясь к теме лейкозов КРС / И. Н. Петров // Ветеринарная газета. 1998. - № 1. — С. 5.

19. Петропавловский, М.В. Эффективность диагностических тестов, в выявлении вируса лейкоза крупного рогатого скота в оздоравливаемых отлейкоза стадах: Автореф. дис. . канд. вет. наук. Екатеринбург, 2010. — 26 с.

20. Рачкус Ю.А. и др. Авт. свид. 4811056/13 опубл. 23.12.91, Бюлл. 47.

21. Сергеев, В.А. Вирусы и вирусные вакцины / В.А. Сергеев, Е.А. Непоклонов, Т.И. Алипер // Москва: Библионика, 2007. — С. 348.

22. Сергеев, В.А. Структура и биология вирусов животных / В.А. Сергеев, Б.Г. Орлянкин // Москва, 1983. — 336 с.

23. Симонян, Г.А. Ветеринарная гематология / Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов // М.: Колос, 1995. С. 99-104.

24. Смирнов, П.Н. Практические аспекты лейкоза крупного рогатого скота / П. Н. Смирнов // Ветеринарная газета. — 1998. — №13. — С. 4.

25. Сюрин, В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина//Москва: МВА, 1986. —29 с.

26. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, Н.В. Фомина// Москва: ВНИТИБП, 1998. 528 с.

27. Хазипов, Н.З. Молекулярная генодиагностика в ветеринарии / Н.З. Хазипов, А.Н. Аскарова // Казань, 2002 100 с.

28. Хазипов, Н.З. Репродукция вируса лейкоза крупного рогатого скота и иммунный ответ на нее / Н.З. Хазипов, Р.П. Тюрикова // Учёные записки КГАВМ. 2008. - № 192 - С. 152-160.

29. Хисамутдинов, Ф.Ф. Система противоэпизоотических мероприятий в скотоводстве / Ф.Ф. Хисамутдинов, И.Н. Никитин // Казань, 1996. С. 304.

30. Чемерис, А.В. Секвенирование ДНК / А.В. Чемерис, Э.Д. Ахунов, В.А. Вахитов // М.: Наука, 1999. 427 с.

31. Шишков, В.П. Серологические методы выявления животных, инфицированных вирусом лейкоза крупного рогатого скота / В.П.tv Шишков, А.Ф. Валихов // Лейкозы и злокачественные опухоли животных.-М.: Агропромиздат, 1998.-С. 173-194.

32. Adam, Е. Involvement of the cyclic AMP-responsive element binding protein in bovine leukemia virus expression in vivo / E. Adam, P. Kerkhofs, M. Mammerickx, R. Kettmann, A. Burny, L. Droogmans, L. Willems// P. Virol. -1994. V. 68. - P. 5845-5853.

33. Avidan, O. The processivity and fidelity of DNA synthesis exhibited by the reverse transcriptase of bovine leukemia virus / O. Avidan, M.E. Meer, I. Oz, A. Hizi // Eur. J. Biochem. 2002. - V. 269. - P. 859-867.

34. Bains, W. A novel method for nucleic sequence determination / W. Bains, G.C. { Smith // J. Theor. Biol'. 1988. - V. 135. - P. 303-307.

35. Baumgartener, L.E. Host range of bovine leucosis virus: preliminary report /

36. E. Baumgartener, C. Olson // Curr. Top. Med. Amin. Sci. 1982. - V. 15. - P.338.347.

37. Camargos, M.F. Partial Sequencing of env Gene of Bovine Leukaemia Virus from Brazilian^ Samples and Phylogenetic Analysis / M.F. Camargos, D. Stancek, M.A. Rocha, L.M. Lessa, JtK.P. Reis, R.C. Leite // J. Vet. Med. -2002.-V. 49;-P. 325-331.

38. Carli, K.T. Detection of IgG antibody, to bovine leukaemia virus in. urine and serum by two enzyme immunoassays / K.T. Carli, A. Sen, H. Batmaz, E. Kennerman // Appl. Microbiol. 1999. - V. 28. - P. 416.

39. Chen, G. Synthesis of functional bovine leukemia virus (BLV) p34tax protein by recombinant baculoviruses / G. Chen, L. Willems, D. Portetelle, K.E. Willard-Gallo, A. Burny, D. Gheysen, R. Kettmann // Virology. 1989. - V. 173.-P. 343-347.

40. Choi, E.A. Mutational analysis of bovine leukemia virus Rex: identification of a dominant-negative inhibitor / E.A. Choi, T.J. Hope // J. Virol. 2005. - V. 79. -P. 7172-7181.

41. Copeland, T.D. Complete amino acid sequence of the nucleic acid-binding ' protein of bovine leukemia virus / T.D. Copeland, M.A. Morgan, S. Oroszlan //

42. FEBS Lett. 1983. -V. 156. - P. 37-40.

43. Derse, D. Nucleotide sequence and structure of integrated bovine leukemia virus long terminal repeats/ D. Derse, A.J. Diniak, J.W .Casey, P.L. Deininger // Virology. 1985.-V. 141.-P: 162-166.,

44. Derse, D. Two elements in the bovine leukemia virus long terminal repeat that regulate gene expression/ D. Derse, J.W. Casey // Science. 1986. - V. 231.1. P. 1437-1440.

45. Deshayes, L. Spontaneous immune response of bovine leukemia-virus-infected cattle against five different viral proteins/ L. Deshayes, D. Levy, A.L. Parodi, J.P. Levy // Int. J. Cancer. 1980. - V. 25. - P. 503-508.

46. Dolz, G. Comparison of agar gel immunodiffusion test, enzyme-linked immunosorbent assay and western blotting for the detection of BLV antibodies / G. Dolz, E. Moreno // J. Vet. Med. B. 1999. - V. 46. - P. 551-558.

47. Dube, S. Degenerate and specific PCR assays for the detection of bovine leukaemia virus and primate T cell leukaemia/lymphoma virus pol DNA and

48. RNA: phylogenetic comparisons of amplified* sequences from cattle andprimates from around the world / S. Dube, S. Bachman, T. Spicer, J. Love, D.

49. Choi, E. Esteban, J.F. Ferrer, B.J. Poiesz // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78 - P. i 1389-1398.

50. Fechner, H. Provirus variants of the bovine leukemia virus and their relation tof the serological status of naturally infected cattle / H. Fechner, P. Blankenstein,i A.C. Looman, J. Elwert, L. Geue, C. Albrecht, A. Kurg, D. Beier, O. Marquardt,r

51. D. Ebner // Virology -1997. V. 237. - № 2. - P. 261 -269.

52. Francki, R.I.B. Classification and Nomenclature of viruses. Fifth report of the International Committee on Taxonomy of viruses / R.I.B. Francki, C.M Fauquet,

53. D.L. Knudson; F. Brown // Arch. Virol. (Suppl.). 1991 - V. 2. - P. 297.

54. Gatei, M. H. T-cell responses to highly conserved CD4 and CD8 epitopes on the outer membrane protein of bovine leukemia virus: relevance to vaccine development / M.H. Gatei, M.F. Good, R.C. Daniel, M.F. Lavin // J: Virol. -1993.-V. 67.-P. 1796-1802.

55. Ghysdael, J. Translation of bovine leukemia virus virion RNAs in heterologous protein-synthesizing systems / J! Ghysdael, R. Kettmann; A. Burny // J. Virol. -1979.-V. 29.-P. 1087-1098

56. E.M. Pituco, J.C.F. Oliveira, V.C.A. Ferreira, A.A. Ikuno // Arg. Inst. Biol. -2004.-V. 71.-P. 303-308.

57. Gupta, P. Detection of a precursor-like protein of bovine leukaemia virus structural polypeptides in purified virions / P. Gupta, J.F. Ferrer // J. Gen. Virol. 1980.-V. 47.-P. 311-322.

58. Hislop, A. D. Vaccine-induced cytotoxic T lymphocytes protect against retroviral challenge/ A.D. Hislop, M: F. Good, L. Mateo, J. Gardner, M.H. Gatei, R.C. Daniel, B.V. Meyers, M.F. Lavin, A. Suhrbier // Nat. Med. 1998. -V. 4.-P. 1193-1196.

59. Hyman, E.D. A new method of sequencing DNA / E.D. Hyman // Anal. Biochem. 1988. - V. 174, №2. - P.423-436.

60. Johnston, E.R. The SU and' TM envelope protein subunits of bovine leukemia virus are linked by disulfide bonds, both in cells and in virions / E.R. Johnston, K.J. Radke // Virol. 2000: - V. 74. - P. 2930-2935.

61. Kerkhofs, P. In vitro* and in vivo oncogenic potential of bovine leukemia virus G4 protein / P. Kerkhofs, H. Heremans, A. Burny, R. Kettmann, L. Willems // J. Virol. 1998. - V. 72. - P. 2554- 559.

62. Kettmann, R. Bovine leukemia virus: an exogenous RNA oncogenic virus / R. Kettmann, D. Portetelle, M. Mammerickx, Y. Cleuter, D. Dekegel, M. Galoux, J. Ghysdael, A. Burny, H Chantrenne // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1976. -V. 73.-P. 1014-1018.

63. Khrapko, K.R. An oligonucleotide hybridization approach to DNA sequencing / K.R. Khrapko, Yu:P. Lysov, A.A. Khorlin, V.V. Shick, V-.L. Florentiev, A.D. Mirzabekov // FEBS Lett. 1989. - V. 256. - P. 118-122.

64. Licursi, M. Genetic heterogeneity among bovine leukemia virus genotypes and' its relation to humoral responses in hosts / M. Licursi, Y. Inoshima, D: Wu, T. Yokoyama, E.T. González, H. Sentsui // Virus. Res. 2002. - V. 86. - №1-2. -P. 101-110. • ! . .

65. Licursi, M. Provirus variants of bovine leukemia virus in naturally infected cattle from Argentina and Japan / Mi Licursi, Y. Inoshima, D. Wu, T. Yokoyama, E. T. González, H. Sentsui // Vet. Microbiol. 2003. - V. 96. - P. 17-23.

66. Mahieux, R. New human retroviruses: HTLV-3 and HTLV-4 / R. Mahieux,. A. Gessain // Med. Trop. 2005. - V. 65. - P. 525-528.

67. Mamoun, R.Z. Bovine lymphosarcoma: expression1 of BLV-related; proteins in cultured cells / R.Z. Mamoun, T. Astier, B. Guillemain, J:F. Duplan // J. Gen. Virol. 1983. - V. 64. - P. 1895-1905.

68. Mamoun, R.Z. The pX region of the bovine: leukemia virus is transcribed as a 2.1-kilobase mRNA/ R.Z. Mamoun, T. Astier-Gin, R. Kettmann, J. Deschamps, N. Rebeyrotte, B:Ji Guillemain // J; Virol. 1985: - V. 54; - P.'.625^6291

69. Mateo, L. Delayed emergence of bovine leukemia virus after vaccination with a protective cytotoxic T cell-based vaccine / L. Mateo, J. Gardner, A. Suhrbier // AIDS Res. Hum: Retroviruses. 2001^ —V. 17. -P: 1447-1453.

70. Matthews, S. The solution structure of the,bovine leukaemia virus.matrix protein and: similarity with lentiviral matrix proteins / S. Matthews, M: Mikhailov, A. Burny, P. Roy //EMBO J. 1996. - V. 15. -P. 3267-3274.

71. Maxam, A.M. A new method for sequencing DNA / A.M. Maxam, W. Gilbert // Proc.Nat. Acad; Sci. USA.- 1977.-V. 74.-P. 560-564.

72. Meas, S. Vertical transmission of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency virus in dairy cattle herds / S. Meas , T. Usui, K. Ohashi, C. Sugimoto, M. Onuma // Vet. Microbiol: 2002. - V. 84. - P: 275-282.

73. Miller, J.M. Virus-like particles in phytohemagglutinin-stimulated lymphocyte cultures with reference to bovine lymphosarcoma / J.M. Miller, L.D. Miller, C. Olson, K.G. Gillette // J. Natl. Cancer Inst. 1969. - V. 43. - P. 1297-1305.

74. Miller, J.M., Serological detection of bovine leukemia virus infection / J.M. Miller, Ml J. van der Maaten // Vet. Microbiol. 1976. - №1. - P.l 95-202.

75. Morcock, D.R. Fluorescence and nucleic acid binding properties of bovine leukemia virus nucleocapsid protein / D.R. Morcock, S. Katakam, B.P. Kane, J.R. Casas-Finet // Biophys. Chem. 2002. - V. 97. - P. 203-212.

76. Nguyen, V.K. Evaluation* of an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for detection of antibodies to Bovine Leukemia Virus in serum and milk / V.K. Nguyen, R.F. Maes // J. Clin. Microbiol. 1993. - V. 31(4). - P. 979-981.

77. Nyren, P. Enzymatic method for continuous monitoring of inorganic pyrophosphate synthesis / P. Nyren, A. Lundin // Anal. Biochem. 1985. - V. 151, №2. - P.504-509.

78. Nyren, P. Enzymatic method for continuous monitoring of DNA polymerase activity / P. Nyren // Anal. Biochem. 1987. - V. 167. - №2: - P.235-238.

79. Ogawa, Y. Structure of a defective provirus of bovine leukemia virus- / Y. Ogawa, N. Sagata, J. Tsuzuku-Kawamura, H. Koyama, M. Onuma, H. Izawa, Y. Ikawa // Microbiol. Immunol. 1987. -V. 31. - P. 1009-1015.

80. Pamba, R. Detection of bovine retrospumavirus by the polymerase chain reaction / R. Pamba, C. Jeronimo, D. Archambault // J. Virol. Meth. 1999. - V. 78.-P. 199-208.

81. Phillips, M. Isolation of a precipitating glycoprotein antigen from cell cultures persistently infected with bovine leukemia virus/ M. Phillips, J.M. Miller, M.J. Van der Maaten// J. Natl. Cancer Inst. 1978. - V. 60: - P. 213-217.

82. Portetelle, D. In animals infected by bovine leukemia virus (BLV) antibodies to envelope glycoprotein gp51 are directed against the carbohydrate moiety/ D. Portetelle, C. Brack, M. Mammerickx, A. Burny// Virology. 1980. -V. 105. -P: 223-233.

83. Powers, M.A. Activation of bovine leukemia virus transcription in lymphocytes from infected sheep: rapid transition through early to late gene expression / M.A. Powers, K. Radke // J Virol. 1992. - V. 66. - P. 4769-4777.

84. Powers, M.A. Episodic occurrence of antibodies against the bovine-leukemia virus Rex protein during the course of infection in sheep / M.A. Powers, D. Grossman, L.C. Kidd, K.Radke // J. Virol. 1991. - V. 65. - P. 4959-4965.

85. Rice, N.R. Sequence analysis of the bovine leukemia virus genome: Enzootic bovine leukosis and bovine leukemia virus / N.R. Rice, R.M. Stephens, R.V. Gilden // Martinus Nijhoff Publishing, The Hague, The Netherlands 1987. - P. 115-144.

86. Rice, N.R. The nucleotide sequence of the env gene and post-env region of bovine leukemia virus / N.R. Rice, R.M. Stephens, D. Couez, J. Deschamps, R. Kettmann, A. Burny, R.V. Gilden // Virology. 1984. - V. 138 - P. 82-93.

87. Rodriguez, S.M. Bovine leukemia virus can be classified into seven genotypes: evidence for the existence of two novel clades / S.M. Rodriguez, M.D. Golemba,

88. R.H. Campos, K. Trono, L.R. Jones // J Gen Virol. 2009. - V. 90. - № 11. - P. 2788-2797.

89. Rola, M. the detection of bovine leukemia virus proviral DNA by PCR-ELISA / M. Rola, J. Kuzmak // J. Virol. Meth. 2002. - V. 99. - P. 33-40.

90. Ronaghi, M. A sequencing method based on real-time pyrophosphate / M. Ronaghi, M. Uhlen, P. Nyren // Science. V. 281. - P. 363-365.

91. Sanger, F. A rapid method for determining sequences in DNA- by primed synthesis with DNA polymerase / F.J. Sanger, A.R. Coulson // Moh Biol. — 1975i-V. 94.-P. 441-448.

92. Sanger, F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / F. Sanger, S. Nicklen, A.R. Coulson // Ibid. 1977. - V. 74. - P. 5463-5467.

93. Schultz, A.M. The envelope proteins of bovine leukemia virus: purification and sequence analysis / A.M. Schultz, T.D. Copeland, S. Oroszlan// Virology. — 1984.-V. 135.-P. 417-427.

94. Simard, C. ELISA for the diagnosis of bovine leukosis: comparision with AGID test approved by the Canadian food Inspection Agency / C. Simard, S. Richardson, P. Dixon, C. Belanger, P. Maxwell // Can. J! Vet. Res. 2000. - V. 64.-P. 101-106.

95. Southern, E.M. Analyzing and comparing nucleic acid sequences by hybridization to arrays of oligonucleotides: Evaluation using experimentalmodels / E.M. Southern, U. Maskos, J.K. Elder // Genomics. 1992. - V. 13. -P. 1008-1017.

96. Tanaka, A.S. Targeted rearrangement of a chromosomal repeat sequence by transfection of a homologous DNA sequence using purified integrase /A.S. Tanaka, K. Komuro // Gene Ther. 2005. - V. 12. - P. 783-794.

97. Tham, K.M. Parvovirus (feline panleucopaenia virus) plaque formation / K.M. Tham, M.J. Studdert // Arch. Virol. 1985. - V. 84. - P. 261.

98. Uckert, W. Translational order of bovine leukemia virus gag and env gene-coded proteins / W. Uckert, M. Grofova, G. Beaudreau // Virology 1984. - V. 135.-P. 288-292.

99. A. Burny, R. Brasseur // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1992. V. 89. - P. 3810-3814.

100. Wang, H. Analysis of bovine leukemia virus gag membrane targeting and late domain function/ H. Wang, K.M. Norris, L.M. Mansky // J. Virol. 2002. - V. 76.-P. 8485-8493.

101. Willems, L. Expression of a cDNA clone corresponding to the long open reading frame (XBL-I) of the bovine leukemia virus / L. Willems, C. Brack, D. Portetelle, A. Burny, R. Kettmann // Virology. 1987. - V. 160. - P. 55-59.

102. Willems, L. The amino acid (157-197) peptide segment of bovine leukemia virus p34tax encompass a leucine-rich globally neutral activation domain / L. Willems, R. Kettmann, A. Burny// Oncogene. 1991. - V. 6. - P. 159-163.

103. Willems, L. The major homology region of bovine leukaemia virus p24gag is required for virus infectivity in vivo / L. Willems, P. Kerkhofs, L. Attenelle, A. Burny, D. Portetelle, R. Kettmann // J. Gen. Virol. 1997. - V. 78. - P. 637640.

104. Wu, D. In vivo transcription of bovine leukemia virus and bovine immunodeficiency-like virus / D: Wu, K. Murakami, A. Morooka, H. Jin, Y. Inoshima, H. Sentsui // Virus Research. 2003. - V. 97 - P. 81-87.

Информация о работе

Шаева, Айгуль Юсуповна
кандидата биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Генотипическая идентификация вируса лейкоза крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы