Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных

Юрик, София Антоновна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных
ВАК РФ 06.02.02, Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов

Автореферат диссертации по теме "Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных"

На правах рукописи

ЮРИК СОФИЯ АНТОНОВНА

ГЕНОМНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ риЯОВА СТЕМИМ КЕСНОРНСЖ ИМ

И ОПТИМИЗАЦИЯ ГНЕЗДОВОЙ ПЦР С ЦЕЛЬЮ УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ДИАГНОСТИКИ НЕКРОБАКТЕРИОЗА

ЖИВОТНЫХ

06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

(Щ,

003493223

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Сибирского отделения Россельхозакадемии

Научный руководитель доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Семенихин Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Глотова Татьяна Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор

Барышников Петр Иванович

Ведущая организация: Институт ветеринарной медицины ФГОУ ВПО

«Омский государственный аграрный университет»

Защита состоится «_> марта 2010 г. в «__ часов на заседании

диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, тел.-факс (383) 348-44-62.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии

Автореферат разослан «_» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.М.Стеблева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Некробактериоз - инфекционное заболевание животных, проявляющееся гнойно-некротическим поражением различных тканей и органов. Возбудитель заболевания - Fusobacterïum necrophorum (Е.А. Бобылева, 1940; О.И. Соломаха, 1973; A.A. Самоловов, 1986).

Болезнь распространена во многих странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, в Австралии (A.L. Lundstrom, 1981; A.M. Russell et al., 1982). В нашей стране некробактериоз регистрируется почти повсеместно, но чаще среди северных оленей и рогатого скота (Я.Р. Коваленко, 1948; В.М. Львов, 1971). Для профилактики заболевания важное значение имеет достоверный и своевременный диагноз. Для его постановки применяют многочисленные методы: эпизоотологический, клинический, бактериологический, биологический, патологоанатомическое вскрытие. Наиболее информативной структурой, характеризующей вид микроорганизма, остается его геном. В этой связи раработка методов диагностики на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее перспективной. Высокая чувствительность, специфичность и небольшие затраты времени являются достоинствами данного метода (A.B. Масленников, Ю.И.Бравве, 2001).

ПЦР является методом прямого тестирования и результаты ее не зависят от иммунологического состояния организма (М.Ю. Аксенов, A.JI. Гинцбург 1993; Ю.А. Алтухов, Е.А. Салменкова, 2002; И.Ф. Жимулёв, 2006; U. Landegren et al., 1988). В отечественной литературе отсутствуют данные по диагностике некробактериоза методом ПЦР. На сегодняшний день не описано ни одного штамма Fusobacterium. О.И. Соломаха и соавт. (2000) так же отмечали отсутствие эталонных штаммов-референтов Fusobacterium necrophorum.

О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов (2001) сообщали, что в неудачах, которые долгое время сопутствовали работе по созданию специфических средств профилактики некробактериоза, имело немаловажное значение игнорирование авторами неоднородности циркулирующих в природе эпизоотических штаммов Fusobacterium necrophorum.

Для выявления генетического полиморфизма, построения генетических карт в биологии широко применяется один из вариантов ПЦР - RAPD-анализ {random amplified polymorphic DNA), который позволяет получать большое число маркеров, рассеянных по всему геному (J.G.K. Williams et al, 1993; C.A. Булат и соавт., 1992; И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург, 1995). В отечественной литературе отсутствуют данные по генетическому картированию F. necrophorum.

Цель и задачи исследований. Цель работы - изучить геномный полиморфизм Fusobacterium necrophorum и усовершенствовать диагностику некробактериоза животных путем оптимизации условий проведения и

<_л

модификации гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать RAPD-ПЦР и изучить геномный полиморфизм культур Fusobacterium necrophorum.

2. Усовершенствовать методику выделения геномной ДНК F. necrophorum.

3. Оптимизировать условия проведения и модифицировать гнездовую ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

Научная новизна. Разработана RAPD-ПЦР и выявлено генетическое разнообразие культур Fusobacterium necrophorum. Усовершенствована методика выделения геномной ДНК и модифицирована диагностическая тест-система для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum. Оптимизированы условия проведения совмещенной гнездовой ПЦР.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как на основе разработанной RAPD-ПЦР проведено генетическое маркирование Fusobacterium necrophorum, оптимизированы условия проведения гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum и разработана ее модификация путем совмещения двух реакций с наружными и внутренними праймерами в одной пробирке. Получен патент № 2203951 «Способ выявления Fusobacterium necrophorum в гнездовой ПЦР».

На основании результатов генетических исследований подтверждена принадлежность культур № 8 и № 12 к подвиду necrophorum. Культуры депонированы как штаммы Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum под номерами В-1075 и В-1076 от 08.09.2005. На одну из них получен патент № 2347806 «Штамм бактерий Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных».

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики» (г.Алмааты, 2005), научно-практической конференции, посвященной 45-летию ГНЦ НИИ ветеринарии Восточной Сибири СО Россельхозакадемии (Чита, 15-16 сент. 2008г), 8-й межрегиональной научно-практической конференции (г. Омск, 2009).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Доклады Россельхозакадемии», «Ветеринарная патология»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных

исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами. Список литературы включает 208 источников, в том числе 110 зарубежных.

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований использованы при разработке рекомендаций «Выявление патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции (two in one nested PCR) и «Применение RAPD-ПЦР анализа для молекулярно-генетического картирования культур Fusobacterium necrophorum» (протокол №. 3 от 14 сентября 2006 г.), рассмотренных и утвержденных подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии, а также отражены в «Инструкции по применению тест-системы для выявления Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью гнездовых праймеров» и ТУ 9388-001-05095732-2006 (Гос. per. № ПВР-1-2.6/01846 от 20 февраля 2007 г.) и «Инструкции по применению формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и ТУ 9384-001-00492374-2008 (Гос. per. № ПВР-1-2.7/02055 от 06 июля 2008 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Усовершенствованная методика выделения геномной ДНК Fusobacterium necrophorum.

2. Результаты исследований по разработке RAPD-ПЦР и изучению геномного полиморфизма Fusobacterium necrophorum.

3. Результаты исследований по оптимизации условий проведения и модификации гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока в 2003 - 2009 гг.. В своей работе мы исследовали 8 культур F. necrophorum, выделенных от больных животных на территории Кемеровской, Томской и Новосибирской областей и Алтайского края сотрудниками лаборатории по изучению некробактериоза животных д-ром ветеринар, наук, проф. A.A. Самолововым и ст. науч. сотр., д-ром ветеринар, наук C.B. Лопатиным и переданных в лабораторию генной инженерии. В качестве референтной использовали культуру ВИЭВ № 2, любезно предоставленную профессором Ю.Д. Караваевым.

Также исследовали 40 культур F. necrophorum, выделенных сотрудниками (д-ром ветеринар, наук, проф. Х.Н. Макаевым и ст. науч. сотр., канд. ветеринар, наук Д.А. Хузиным) сектора контроля и стандартизации

биопрепаратов Федерального Государственного учреждения «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных» и переданных в лабораторию генной инженерии ИЭВСиДВ. Изоляты бактерий выделены от животных на территории Татарстана, Башкортостана, Марий Эл, Удмуртии, Ульяновской и Самарской областей. В качестве референтной использовали культуру № 3430, выделенную во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) от коровы на территории Московской области в 1963 г.

Биологическую пробу на белых мышах ставили согласно «Методическим указаниям по лабораторной диагностике некробактсриоза» (1987).

Все культуры F.necropharum исследовали при помощи диагностической тест-системы для выявления F. necrophorum subsp. necrophorum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью гнездовых праймеров.

Для анализа нуклеотидных последовательностей Fusobacterium necrophorum использовали данные EMBL/GenBank. Определение последовательностей олигонуклеотидных праймеров проводили по алгоритму выравнивания последовательностей в программах Alignment Service V.4.0 и GENCNER (S.M. Resenchuk, V.M. Blinov, 1995), а для анализа праймеров по уровню свободной энергии использовали программу OLIGO 4.0. Химический синтез праймеров был осуществлен амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск) ст. науч. сотр. Ю.А. Горбуновым ГНЦ ВБ "Вектор".

Для проведения RAPD-анализа использовали произвольные праймеры со «случайной» нуклеотидной последовательностью длиной в 10 н.п., которые выбирали, взяв за основу нуклеотидную последовательность лейкотоксина F. necrophorum штамма А25 (AF312861).

Постановку полимеразной цепной реакции осуществляли на амплификаторах "Бис" М-105 и "Терцик" по общепринятым методикам (Р. Саики и соавт., 1990; А.Б. Вартапетян, 1991). RAPD-ПЦР проводили в следующем режиме: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,3 мин, отжиг при 36-40°С 0,5 мин, элонгация при 72°С 0,7 мин - 30 циклов и досинтез при 72°С в течение 1,5 мин.

Продукты реакции визуализировали путем электрофореза в 1%-ном геле агарозы с бромистым этидием при силе тока 25-40 мА в течение 30-50 мин. В качестве маркера использовали ДНК pUC18, гидролизованную Alul (на фрагменты 667, 521, 251, 226 и 131 н.п.) или ДНК pQPR, гидролизованную НаеШ (фрагменты 1326, 919, 762, 587, 540,434, 307, 267, 164 н.п.).

Для статистической обработки результатов составляли бинарные матрицы RAPD-спектров, где присутствие и отсутствие фрагмента обозначалось соответственно «1» и «0». Количественную оценку различий между изолятами

проводили путем попарного сравнения фингерпринтов. Расчет индексов подобия S осуществляли, по формуле:

S = 2Fab/(Fa + Г-ь),

где Fa и Fb - число фрагментов ДНК в дорожках а и b, Fab- число совпадающих по электро-форетической подвижности фрагментов (V. Miteva, A. Abadijeva, R. Grigorova, 1991). Бинарные матрицы RAPD-спектров были использованы и для построения дендрограмм методом кластерного анализа (STATIST1CA 6).

2. 2. Результаты исследований 2.2.1. Изучение геномного полиморфизма культур F. necrophorum subsp. necrophorum с помощью RAPD-ПЦР-аналша

2.2.1.1. Усовершенствование методики выделения ДНК из культур F.necrophorum subsp. necrophorum и биообразцов с помощью цетриламмония бромид (СТАВ)

Полученная при выделении с использованием 2% СТАВ ДНК в 1%-ном геле агарозы была видна в виде полосы, но не подвергалась гидролизу эндонуклеазами. Тогда мы увеличили концентрацию СТАВ до 5%, затем до 10%, а экспозицию увеличили до 2,5 часов при +65°С. В этом варианте ДНК выделяли в большом количестве, но она так же не подвергалась гидролизу эндонуклеазами. В процессе экспериментов повысили температуру с +65°С до +80°С, а экспозицию довели до 1 часа. Выделенная ДНК в 1%-ной агарозе была в виде четкой полосы. Пробные постановки ПЦР прошли успешно и этот вариант выделения ДНК F.necrophorum с применением 10% СТАВ применяли в последующей работе. Выделенная ДНК хранилась при -18°С в течение восьми месяцев (срок наблюдения) и оставалась пригодной для анализа.

2.2.1.2. Проверка чистоты выделенной ДНК

Проверку чистоты выделения ДНК осуществляли по Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук (1984). С этой целью были использованы культуры № 8 и № 12 Fusobacterium necrophorum. Делали два замера плотности раствора ДНК каждой пробы на спектрофотометре марки СФ-26 при длине волн D260 нм и D280 нм в кювете на 300 мкл. Полученный нами результат по культуре № 8 равен 1,70, а по культуре № 12 - 1,79. В случае, если препарат содержит примесь белка, то D260/D280 значительно меньше указанных выше значений.

2.2.1.3. Выбор произвольных праймеров и проведение RABD-ПЦР

Произвольные праймеры длиной в 10 н.п. со «случайной» нуклеотидной последовательностью выбирали, взяв за основу нуклеотидную последовательность лейкотоксина F.necrophorum штамма А25 (AF312861).

Из проанализированных 50 олигонуклеотидов были выбраны и синтезированы следующие: № 13 - саа acg teg g, № 16 - gac ege ttg t, № 18 - agg tga ccg t, № 20 - age cag ega a, № 21 - ttc ega acc c, № 023 - tea ega tgc a, № 002 - agt get

acg t, № 27 - cag gcc ctt c, № 28 - cag cac cca c, № 36 - ccg caa gcc t, № 38 - gcg gcg ggc c, № 44 - ggt ctc gtg g, № 48 - tea age cgc c, № 50 - cct caa gcc g.

Для постановки реакции в пробирку объемом 0,5 мл вносили следующие компоненты: 2,5 мкл Юхбуфера рН 8,8, по 3,0 мкл 2,5 мМ dNTPs и праймера, 14,5 мкл воды дистиллированной, 0,5 мкл Taq-pol и 1,5-2,0 мкл исследуемой ДНК.

ПЦР проводили в следующем режиме: прогревание реакционной смеси при 95°С в течение 3 мин - 1 цикл, затем денатурация при 94°С 0,3 мин, отжиг при 36°С 0,5 мин и синтез при 72°С 0,7 мин - 30 циклов и один цикл (досинтез) при 72°С в течение 1,5 мин.

После сравнения полученных паттернов выявили, что не все сконструированные праймеры были пригодны для внутривидовой дифференциации F.necrophorum. Малоинформативными олигонуклеотидами оказались № 13, 16, 20, 21, 023, 002, 27, 44, 48, 50. Анализ величин индексов подобия при попарном сравнении выделенных на территории Западной Сибири изолятов, относящихся к патогенному виду Fusobacterium necrophorum, показал, что наиболее информативными были праймеры № 18,28,36 и 38 (табл. 1).

Таблица 1 - Результаты попарного сравнения в RAPD-ПЦР культур F.necrophorum, выделенных на территории Западной Сибири

Наименование культуры Кем ВИЭВ-1 М2 Кремл Р5 Р6 Алт Чик-2003 Кремл, п.З

№ культуры 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Праймер№ 18

ВИЭВ-1 0,46 1,00 0,18 0,20 0,46 0,60 0,18 0 0,20

М2 0,50 0,18 1,00 0,44 0,17 0,22 0,20 0,60 0,22

Р6 0,36 0,22 0,22 0 0,55 1,00 0,22 0,22 0

Праймер № 28

ВИЭВ-1 0,55 1,00 0,17 0,67 0,33 0,55 0,40 0,50 0,31

М2 одз 0,17 1,00 0,38 0,38 0,40 0,14 0,38 0,35

Р6 0.43 0,55 0,40 0,53 0,53 1,00 0,46 0,67 0.25

Праймер № 36

ВИЭВ-1 0,53 1,00 0,46 0,56 0,35 0,53 0,27 0,67 0,47

М2 0,38 0,46 1,00 0,42 0,56 0,63 0,63 0,62 0,33

Р6 0,44 0,53 0,63 0,67 0,60 1,00 0,33 0,67 0,60

Праймер № 38

ВИЭВ-1 0,67 1,00 0,53 0,50 0,12 0,22 0,36 0,31 0,28

М2 0,33 0,53 1,00 0,46 0,14 0,53 0,11 0,40 0,18

Р6 0,27 0,22 0,53 0,50 0,59 1,00 0,27 0,17 0,14

Проведенное исследование с помощью «произвольных» праймеров выявило низкую степень гомологии всех изолятов со штаммом ВИЭВ-1, кроме изолятов № 1, 6, 4 и 8, где индекс подобия был выше, чем у остальных культур и составил

0,60-0,67. При попарном сравнении ДНК культуры № 3 М2 с ДНК культур № 6, I 7, 8 индекс подобия составлял 0,63. Самая высокая степень гомологии с культурой № 6 (Раздольное 6) была у изолятов № 3,4, 5, 8 и равна 0,60-0,67.

Проведенный анализ для распределения изучаемых изолятов /*'. песгорЬогит по группам с применением праймера № 18 (рис. 1, 2) разделил изучаемые культуры на несколько кластеров. Наиболее генетически схожими (0,88) были культуры № 2 и № 4. Рядом с ними (схожесть 0,73) культуры № 1 и 7, № 6 и 8. Отдельной ветвью стоит культура №3 (М2) при генетической близости в 0,10.

М1 2 34567 89

Рисунок 1 - RAPD-спектры ДНК F.necrophorum, полученные в ПЦР с праймером № 18: М - маркер pUC18/AluI, 1- Кем, 2 - 2В (ВИЭВ-1), 3 - М2, 4 -Кремл, 5 - Р5, 6 - Р6, 7 - Алт, 8 - Чик 2003, 9 - Кремл, п.З

1,6 2.0 2.2 2.4 2.6 2,8 3.0 3,2 3.4

Рисунок 2 - Дендрограмма распределения культур F.necrophorum, выделенных от животных на территории Западной Сибири по результатам RAPD-ПЦР с праймером № 18. По горизонтали - генетические дистанции, по вертикали — номера культур: 1- Кем, 2 - 2В (ВИЭВ-J), 3 - М2, 4 - Кремл, 5 - Р5, 6 - Р6, 7 -Алт, 8- Чик 2003, 9- Кремл, п.З

Анализ с использованием праймера № 28 (рис. 3, 4) разделил изучаемые культуры следующим образом. В один кластер вошли три культуры Кпесгор/гогит - № 1, 4, 9. Из них наиболее схожими (0,85) были культуры № 4 и № 9. К ним примыкает культура № 1 (схожесть 0,83). Во второй вошли также три культуры песгорИогит - № 2, 6, 8. Из них наиболее схожими (0,84) были культуры № 2 и № 8. К ним примыкает культура № 6 (схожесть 0,80). В третий - культуры № 5 и № 7. Отдельно стоит культура № 3.

ь h .....1

О 2 4 6 8 10 12

Рисунок 4 - Дендрограмма распределения культур F.песгорИогит, выделенных от животных на территории Западной Сибири по результатам RAPD-ПЦР с праймером № 28. По горизонтали - генетические дистанции, по вертикали - номера культур: I- Кем, 2 - 2В (ВИЭВ-1), 3 - М2, 4 - Кремл, 5 -Р5. 6-Р6, 7- Алт. 8- Чик 2003 , 9- Кремл, п.З

Рисунок 3 - RAPD-спектры ДНК F. песгорИогит, полученные в ПЦР праймером № 28: М - маркер pUC18/AluI, 1- Кем, 2 - 2В (ВИЭВ-1), 3 - М2, 4 Кремл, 5 - Р5,6 - Р6, 7 - Алт, 8 - Чик 2003 , 9 - Кремл, п.З

В результате проведенного анализа с применением праймера № 36 изучаемые культуры были разделены на два кластера. В один из них вошло три культуры Р.песгорИогит - № 1, 4, 9. Из них наиболее генетически схожими (0,83) были культуры № 4 и 9. К ним примыкает культура № 1 (схожесть 0,64).

По результатам ЯАРВ-анализа с праймером № 38 изучаемые культуры распределены на два кластера. В один кластер вошли пять культур Е песгорИогит (№ 3, 5, 6, 8, 9). Из них наиболее генетически схожими (0,88) были культуры № 8 и № 9. К ним примыкает культура № 5 (схожесть 0,50). И один субкластер состоит культур № 3 и № 6 (схожесть 0,35) . В другом кластере объединены четыре культуры Р. песгорИогит (№ 1, 2, 4, 7). Наибольшее генетическое сходство проявили культуры № 1 и № 2 - 0,50.

Выявленные с помощью ЯАРЭ-ПЦР высокие уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций свидетельствуют о генетической неоднородности популяций Р. песгорИогит в Западной Сибири.

Полученные КАРП-спектры (рис. 5) тестировали по уровню схожести к нуклеотидной последовательности культур № 3430 (ВГНКИ), ТС(№8), ВК(№12), ВИЭВ-2 (табл. 2). В результате сравнения установлено, что все исследуемые культуры имеют высокий уровень схожести - от 0,63 до 0,95, кроме № 22, 34, 40,41 и В2 (ВИЭВ-2) с уровнем схожести от 0,10 до 0,61.

Рисунок 5 - НЛРО-спектры ДНК песгорИогит, полученные в ПЦР с праймером № 38/1: М - маркер р1)С18/А1и1, 1- № 2В, 2 - № 41. 3 - № 40, 4 -I № 34, 5 - № 22,6 - № 20,7 - № 19, 8 - № 16,9-12,10-№9.11-№8,12-№2

Таблица 2 - Результаты попарного сравнения в ЯАРО-ПЦР с праймером № 38/1 выделенных на территории Поволжья культур К песгоркогит

№ культуры Наименование культур 3430 ТС ВК ВИЭВ-2

2 3430 1,00 0,67 0,86 0,10

8 ТС 0,67 1,00 0,73 0,23

9 Нфт 0,72 0,72 0,86 0,19

12 ВК 0,81 0,73 1,00 0,11

16 Ал-2 0,78 0,70 0,95 0,10

19 КОН 0,66 0,78 0,84 0,23

20 МШО 0,82 0,63 0,87 0,19

22 Искра 0,61 0,43 0,58 0,18

34 Мож 0,27 0,21 0,30 0,22

40 Шах 0,36 0,31 0,30 0,44

41 СТ(свиноком-плекс,Томск) 0,33 0,29 0,36 0,30

В2 ВИЭВ-2 0,10 0,23 0,11 1,00

4,0

Э.О 2,5

1,5 1.0

41 2В 40 34 22 19 в 20 16 12 9 2

Рисунок 6 - Дендрограмма распределения культур Р.песгорИогит, выделенных от животных на территории Поволжья по результатам ЯАРВ-ПЦР с праймером № 38/1. По горизонтали - номера культур, по вертикали -генетические дистанции.

Кластерный анализ изучаемых изолятов Р.песгоркогит по результатам ИАРО-анализа с праймером № 38/1 изображен на дендрограмме (рисунок 6). Культуры № 19, 8, 20, 16, 12, 9 и 2 вошли в один субкластер (уровень схожести - от 0,63 до 0,95). Высокий уровень схожести у изолятов № 12 и 16 (0,95), 19 и 8 (0,78).

Выявленные с помощью ЯАРО-ПЦР анализа высокие уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций свидетельствуют о генетической неоднородности Р.песгоркогит в Западной Сибири. Произвольные праймеры, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности лейкотоксина Р.песгоркогит штамма А25 в 12699 н.п., можно использовать в исследованиях по идентификации и паспортизации культур.

Исследования геномного полиморфизма Р.песгорИогит помогут в определении закономерностей появления и циркуляции эпизоотических штаммов в стадах. С их помощью так же можно выявлять изменчивость микроорганизмов под воздействием различных факторов.

2.2.2. Исследование патогенности культур РиьоЬаШпит песгорИогит на лабораторных животных

Все исследуемые культуры Р.песгорИогит являлись неподвижными грамотрицательными бактериями. Они располагались в поле зрения в виде палочек или нитей разной длины со слабой или сильной зернистостью. Спор и капсул не образовывали. Продуцировали индол и сероводород, ферментировали с образованием масляной кислоты и незначительного количества газа глюкозу, сахарозу и мальтозу.

Для изучения патогенности культур Р.песгоркогит были проведены биологические пробы на белых мышах. В первой серии опытов в 2004 году изучали культуры № 2, 8, 12, 22, 34, 40, 41. Во второй (в 2006 году) - № 1, 2, 3, 5, 8, 9, 12, 13, 15, 27. Для заражения использовали 18-ти часовые бульонные культуры, выращенные в среде Китта-Тароцци. Для изучения каждого изолята и проведения контрольных испытаний формировали группы по три животных в каждой. В первой серии опытов животным первой опытной группы вводили подкожно в область корня хвоста по 0,6 мл взвеси бактерий в культуральной среде, животным второй опытной группы - культуральную среду после удаления бактерий (супернатант), животным третьей опытной группы - взвесь бактерий, отмытых в физиологическом растворе. Во второй серии опытов (в 2006 году) животным первой опытной группы вводили подкожно в область корня хвоста по 0,6 мл взвеси бактерий в культуральной среде, животным второй опытной группы - взвесь бактерий, отмытых в физиологическом растворе. У животных первой и третьей групп первой серии опытов и первой и второй групп второй серии опытов отмечали судороги, параличи, абсцессы, некрозы.

2.2.3. Генетическая характеристика штаммов Р. песгоркогит эиЬэр. песгорЬогит

На основании результатов биологических и генетических исследований культур ЕпесгорИогит совместно с сотрудниками ФГУ ФЦТРБ (г. Казань) были выбраны две культуры (№ 8 и № 12) для дальнейшей характеристики по генам белка оболочки, гемагглютинина, ДНК-гиразы, спейсера и транспозона. С помощью ПЦР наработали фрагменты вышеназванных генов. Затем провели очистку от белков и секвенирование ампликонов совместно с сотрудниками лаборатории фармакогеномики ИХБиФМ СО РАН на автоматическом секвенаторе по двум цепочкам ДНК.

Принадлежность культур № 8 и № 12 к подвиду песгорИотт подтверждена установлением нуклеотидной последовательности фрагментов генов транспозона (АУ241175), белка оболочки (ОС>336567), топоизомеразы II (ДНК-гиразы) (0(3417656), гемагглютинина (00341278) и межгенной вставки лейкотоксина (168-18-238) (ВС?417657). Культуры № 8 и № 12 депонированы по заявке ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН и ФГУ ФЦТРБ (г. Казань) в ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор» НИИ «Коллекции культур микроорганизмов» под номерами В-1075 и В-1076 от 08.09.2005.

2.2.4. Оптимизация гнездовой ПЦР

Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР нами были модифицированы наружные (№ 11- № 22) и внутренние (№ 011 - № 022) праймеры, в результате чего тестируемый наружный фрагмент увеличился с 546 до 558 н.п., а внутренний - со 187 до 289 н.п. Одновременно с этим увеличили число циклов с 29-30 до 40 и температуру отжига с гнездовыми праймерами с 48°С до 60°С.

Для исследования одного образца ДНК в пробирку объемом 0,5 мл вносим 2,5 мкл 10х буфера, 3,0 мкл сЮТРв, 3,0 мкл праймеров № 11- № 22, 14,5 мкл воды бидистиллированой, 0,5 мкл Тая-полимеразы и по 1,5-2,0 мкл ДНК. ПЦР проводим в режиме: прогревание смеси при 95°С 3 мин - 1 цикл, денатурация при 94°С 0,3 мин, отжиг при 56°С 0,4 мин и элонгация при 72°С 0,6 мин. Всего 40 циклов и один цикл (досинтез) при 72°С в течение 1,5 мин. С помощью наружных праймеров № 11 и № 22 синтезировали фрагмент в 558 н.п.

В случае отсутствия фрагмента после первой ПЦР проводили реамплификацию со второй парой праймеров № 011 и № 022. В качестве матрицы брали 2-4 мкл продуктов амплификации с первой парой праймеров. Состав реакционной смеси тот же, как и в первой ПЦР. Реакцию проводили в режиме: денатурация при 94°С 0,4 мин, отжиг при 60°С 0,4 мин и элонгация при 72°С 0,4 мин. Всего 40 циклов и один цикл (досинтез) при 72°С в течение 1,2 мин. С помощью внутренних праймеров № 011 и № 022 синтезировали

фрагмент в 289 н.п. Чувствительность данной Г1ЦР составляет 12,0 пг/мкл суммарной ДНК.

Проведенные исиытания диагностической тест-системы показали, что положительные анализы в ПЦР получали только тогда, когда в качестве матрицы использовали ДНК возбудителя F.necrophorum subsp. necrophorum. Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий (стафилококк, стрептококк, кишечная, сенная палочки, протей). Тестирование изолятов F.necrophorum проводили согласно «Инструкции по применению тест-системы для выявления Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью гнездовых прай-меров». Из 40 культур 5 были отрицательны, хотя по результатам микробиологического и биологического исследований отнесены к возбудителю некробактериоза. Это культуры № 6,14,16, 22 и 34.

2.2.5. Разработка совмещенной гнездовой ПЦР

Совмещенную гнездовую полимеразную цепную реакцию проводили в два этапа в одной пробирке. Первый этап - полимеразная цепная реакция с наружными праймерами. Для исследования одного образца ДНК в пробирку объемом 0,5 мл вносим 2,5 мкл 10х буфера, 3,0 мкл dNTPs, 3,0 мкл праймеров № 11- № 22, 14,5 мкл воды бидистиллированой, 0,5 мкл Taq-полимеразы и под масло вносим по 1,5-2,0 мкл ДНК. ПЦР проводим в режиме: прогревание смеси при 95°С 3 мин 1 цикл, денатурация при 94°С 0,3 мин, отжиг при 56°С 0,4 мин и элонгация при 72°С 0,6 мин. Всего 30 циклов и еще один цикл (пара) при 72°С в течение 5,0 мин. Второй этап - во время паузы в каждую пробирку вносим по 3,0 мкл смеси второй пары праймеров № 011 - № 022. Амплификацию продолжили в следующем режиме: денатурация 94°С 0,4 мин, отжиг 60°С 0,4 мин и элонгация при 72°С 0,4 мин - 30 циклов и досинтез (один цикл) при 72° 1,2 мин. С помощью праймеров № 11 и № 22 синтезируем фрагмент в 558 н.п., а с помощью праймеров № 011 и № 022 фрагмент внутри первого в 289 н.п.

Таким образом, проведение гнездовой ПЦР в совмещенном варианте сокращает время проведения реакции на 2,5 часа и экономит реактивы.

3. ВЫВОДЫ

1. На основе RAPD-ПЦР разработано генетическое маркирование Fusobacterium necrophorum. Произвольные праймеры длиной в 10 н.п. со «случайной» нуклеотидной последовательностью, выбранные на основе нуклеотидной последовательности лейкотоксина Fusobacterium necrophorum штамма А25 в 12699 н.п., можно использовать в исследованиях по паспортизации культур.

2. С помощью праймеров № 18, 28, 36, 38 выявлены уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций, свидетельствующие о неоднородности

популяции Fusobacterium necrophorum циркулирующих у крупного рогатого скота на территории Западной Сибири. Уровень схожести культур находится в пределах от 0,11 до 0,67.

3. Выявленные в RAPD-ПЦР с помощью праймера № 38/1 высокие уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций свидетельствуют о неоднородности популяции Fusobacterium necrophorum в Поволжье. Уровень схожести находится в пределах 0,30-0,95.

4. Выделение геномной ДНК Fusobacterium necrophorum, где основная депротеинизация осуществляется обработкой 10% СТАВ при +80°С в течение часа, позволило сократить время выделения с 24 ч до 5 ч и получать чистые от примеси белков препараты суммарной ДНК с соотношением D260/D280 равным 1,70-1,79.

5. В результате оптимизации условий проведения гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для повышения чувствительности и специфичности реакции изменены наружные и внутренние праймеры, в результате чего тестируемый наружный фрагмент увеличился с 546 до 558 н.п., а внутренний - со 187 до 289 н.п.

6. Модификация диагностической тест-системы для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum путем совмещения двух реакций с наружными и внутренними праймерами в одной пробирке позволила уменьшить время проведения реакции в 2 раза и снизить стоимость расходуемых реактивов в 1,8 раза.

7. Определена принадлежность культур № 8 и № 12 к подвиду necrophorum и подтверждена секвенированием генов транспозона, белка оболочки, топоизомеразы II (ДНК-гиразы), гемагглютинина и межгенной вставки (16S-23S лейкотоксина).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по применению тест-системы для выявления Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью гнездовых праймеров и ТУ 9388-001-05095732-2006 (Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2.6/01846 от 20 февраля 2007 г.).

2. Инструкция по применению формол-эмульсионной вакцины против некро-бактериоза крупного рогатого скота и ТУ 9384-001-00492374-2008 (Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2.7/02055 от 06 июля 2008 г.).

3. Временная инструкция по применению тест-системы для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции (two in one nested PCR), утвержденная директором ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН 07.06.2006.

4. Временная инструкция по применению тест-системы для генотипи-рования культур Fusobacterium necrophorum методом RAPD-ПЦР анализа, утвержденная директором ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН 23.06.06.

5. Методические рекомендации «Выявление патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции (two in one nested PCR)», рассмотренные и утвержденные подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (прот. № 3 от 14 сентября 2006 г.).

6. Методические рекомендации «Применение RAPD-ПЦР анализа для молекулярно-генетического картирования культур Fusobacterium necrophorum», рассмотренные и утвержденные подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (прот. № 3 от 14 сентября 2006 г.).

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семенихин, В.И. Полиморфизм ДНК изолятов возбудителя некро-бактериоза крупного рогатого скота в Западной Сибири / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Ю.Д. Горбунов, A.A. Самоловов, C.B. Лопатин, Е.В. Дударева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2005. -№ 2.- С. 98-102.

2. Семенихин, В.И. Исследование геномного полиморфизма изолятов Fusobacterium necrophorum в Приволжском округе / В.И. Семенихин, Д.А. Хузин, X. Н. Макаев, С.А. Юрик, Е.В. Дударева // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. - 2005. - № 4. - С. 131-135.

3. Семенихин, В.И. Использование RAPD-PCR анализа в исследовании молекулярно-генетического полиморфизма культур Fusobacterium necrophorum и Mycopîasm / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Д.А. Хузин // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. -2007. - № 1. - С. 76-82.

4. Семенихин, В.И. Генетический полиморфизм ДНК культур Fusobacterium necrophorum по данным RAPD-PCR анализа / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Д.А. Хузин // Доклады Россельхозакадемии. М. - 2007. - № 2. - 52-56.

5. Семенихин, В.И. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев // Ветеринарная патология. - 2008.-№ 1.-С. 181-184.

6. Семенихин, В.И. Выявление возбудителя некробактериоза сельскохозяйственных животных с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции / В.И. Семенихин, A.C. Донченко, С.А. Юрик // Ветеринарная патология. - 2009. -№ 1.-С. 86-90.

7. Патент 2203951 Российская Федерация, МПК7 С 12 Р 19/30, С 12 Q 1/68, С 12 H 21/04. Способ выявления Fusobacterium necrophorum в гнездовой ПЦР / Соавт.: В.И. Семенихин, A.A. Самоловов, С.А. Юрик, H.H. Блинова,

Н.В. Некрасова; заявители и патентообладатели Гос. науч. учреждение Ин-т эксперимент, ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Рос. акад. с.-х. наук Сиб. отд-ние, Гос. науч. центр вирусол. и биотехнол. «Вектор». - 2001133577; заявл. 10.12.2001; опубл. 10.05.03, Бюл. № 13. - 9 с.

8. Патент 2347806 Российская Федерация, МПК С 12 N 1/00. Штамм бактерий Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза животных / Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев, В.И. Семенихин, С.А. Юрик; заявители и патентообладатели Гос. науч. учреждение Ин-т эксперимент, ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Рос. акад. с.-х. наук Сиб. отд-ние, Федер. гос. учреждение «Федер. центр токсикол. и радиац. безопасности жив-х». -2007101929/13; заявл. 18.01.2007; опубл. 27.02.09, Бюл. №6.-9 с.

9. Семенихин, В.И. Исследование полиморфизма ДНК изолятов Fusobacterium necrophorum / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Ю.А. Горбунов // Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики: материалы междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию института. -Алмааты, КазНИВИ, Т.1 - Инфекционные болезни. - Алмааты, 2005 - С. 249252.

10. Семенихин, В.И. Структура спейсерных последовательностей лейкотоксина культур Fusobacterium necrophorum / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Е.А. Храпов // Диагностика, профилактика и лечение болезней животных: сб. науч. тр. / Россельхозакадемия. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ. - Новосибирск, 2008. - С. 95-98.

11. Семенихин, В.И. Биологическая и генетическая характеристика депонированных штаммов Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев // Состояние и перспективы ветеринарного благополучия Восточной Сибири: материалы науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ГНЦ НИИ вет. Вост. Сиб. СО Россельхозакадемии, 15-16 сент. 2008г. - Чита, 2008. - С. 148-152.

12. Юрик, С.А. Диагностика некробактериоза сельскохозяйственных животных с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции / С.А. Юрик, А.С. Донченко, В.И. Семенихин // Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц: материалы 8-й межрегион, науч.-практ. конф., ВНИИБТЖ. - Омск, 2009. - С. 178-180.

Подписано в печать 11.02.2010 г. Формат 60><84 'Лб. Объем 1 п. л. Заказ № 10. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ИИЦ ЦНСХБ СО Россельхозакадемии 630501, Новосибирская обл., пос. Краснообск

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юрик, София Антоновна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика возбудителя некробактериоза

1.1.1. Морфология Fusobacterium necrophorum

1.1.2. Культуральные и биохимические свойства

1.2. Диагностика некробактериоза

1.3. Полимеразная цепная реакция.

1.3.1. Выделение ДНК

1.3.2. Подбор праймеров

1.3.3. Постановка полимеразной цепной реакции

1.4. Гнездовая ПЦР (nested PCR)

1.5. Исследование геномного полиморфизма bRAPD-ПЦР

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных"

Актуальность проблемы. Некробактериоз - инфекционное заболевание домашних животных, проявляющееся гнойно-некротическим поражением различных тканей и органов. Болезнь встречается у многих видов диких животных, болеет им также человек. Возбудитель заболевания - Fusobacterium necrophorum (Е.А. Бобылева, 1940; О.И. Соломаха, 1973; А.А. Самоловов, 1986; L.H. Hagelskjaer et al., 1998).

Болезнь распространена во многих странах Европы, Северной Америки, Южной Африки, в Австралии (A.L. Lundstrom, 1981; A.M. Russell et al., 1982). В нашей стране некробактериоз регистрируется почти повсеместно, наблюдается у разных видов животных, но чаще среди северных оленей и рогатого скота (В.М. Львов, 1971; О.И. Соломаха, 1972). Болезнь причиняет экономический ущерб за счет снижения многих показателей, в т.ч. молочной продуктивности на 5-25%, интенсивности роста на 25-40% (Ю.Г. Анакина, 1988).

Для профилактики заболевания особое значение имеет достоверный и своевременный диагноз. Для его постановки применяют многочисленные методы: эпизоотологический, клинический, бактериологический, биологический, патологоанатомическое вскрытие. В настоящее время наиболее чувствительным и специфичным признан метод, основанный на выявлении фрагментов генома возбудителя в биологическом материале с помощью полимеразной цепной реакции. Необходимо отметить, что этот метод позволяет обнаружить концентрацию возбудителя в несколько раз меньшую, чем при традиционном бактериологическом исследовании. Это часто приобретает определяющее значение при постановке диагноза, так как в гнойно-некротическом очаге присутствует ассоциация микроорганизмов, а непосредственно возбудитель заболевания Fusobacterium necrophorum находится в небольшом количестве.

ПЦР является методом прямого тестирования, позволяет избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, и интепритация его результатов не зависит от иммунологического состояния организма (U. Landegren et al., 1988; М.Ю. Аксенов, A.JI. Гинцбург, 1993; К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун, 2000; Ю.А. Алтухов, Е.А. Салменкова, 2002; И.Ф. Жимулёв, 2006).

Приступая к разработке диагностической тест-системы мы столкнулись с тем, что в отечественной литературе не описано ни одного штамма Fusobacterium. О.И. Соломаха и соавт. (2000) в своих работах так же отмечали отсутствие эталонных штаммов-референтов подвидов Fusobacterium necrophorum.

Развитие молекулярной биологии и генной инженерии дало возможность создать методы, позволяющие оценивать генетическое разнообразие, устанавливать степень родства и выявлять индивидуальные особенности организма при анализе ДНК.

В настоящее время во всем мире широкое распространение получила технология полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для выявления генетического полиморфизма у разных групп организмов она широко используется с короткими в 10-15 нп праймерами со «случайной», произвольно выбранной последовательностью - RAPD-анализ (random amplified polymorphic DNA) (С.А. Булат и соавт. 1992; И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург, 1995; J.G.K. Williams et al., 1993).

Метод RAPD-маркеров позволяет получать большое число маркеров, рассеянных по всему геному, поэтому такие маркеры удобны для построения генетических карт (Ю.П. Алтухов, Е.А. Салменкова, 2002) или карт сцепления с локусами количественных признаков, т.е. локусами хозяйственно важных свойств.

В нашей стране и за рубежом длительный поиск специфических препаратов в виде вакцин и гипериммунных сывороток не принес должного результата. В настоящее время имеются экспериментальные и принятые к применению вакцины против некробактериоза, которые в производственных условиях не всегда дают желаемый результат (А.А. Самоловов, С.В. Лопатин 2001; С.В. Лопатин, Т.М.Магерова, 2004).

А.С. Донченко, А.А. Самоловов (1998) высказали мнение, что создание при некробактериозе высокоэффективных вакцин традиционными методами маловероятно. В то время под традиционными методами понималось следующее. Выделение изолята в данном регионе, изучение его свойств, приготовление вакцины из монокультуры и применение ее в этом регионе. При использовании ее в других регионах она не оказывала должного профилактического эффекта.

Ряд отечественных исследователей (О.И. Соломаха и соавт., 2000; О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов, 2001) сообщали, что в неудачах, которые долгое время сопутствовали работе по созданию специфических средств профилактики некробактериоза, имело немаловажное значение игнорирование авторами неоднородности эпизоотических штаммов Fusobacterium necrophomm.

Цель и задачи исследований. Цель работы — изучить геномный полиморфизм Fusobacterium necrophorum и усовершенствовать диагностику некробактериоза животных путем оптимизации условий проведения и модификации гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать RAPD-ПЦР и изучить геномный полиморфизм культур Fusobacterium necrophorum.

2. Усовершенствовать методику выделения геномной ДНК Fusobacterium necrophorum.

3. Оптимизировать условия проведения и модифицировать гнездовую ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum.

Теоретическая и практическая значимость. Результаты исследований представляют теоретическую и практическую ценность, так как на основе разработанной RAPD-ПЦР проведено генетическое маркирование Fusobacterium necrophorum, оптимизированы условия проведения гнездовой ПЦР по выявлению Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum и разработана ее модификация путем совмещения двух реакций с наружными и внутренними праймерами в одной пробирке. Получен патент № 2203951 «Способ выявления jFusobacterium necrophorum в гнездовой ПЦР».

Апробация полученных результатов. Материалы диссертационной работы доложены на заседаниях Ученого совета ГНУ Института экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (г. Новосибирск, 2003-2009), международной научно-практической конференции

Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики» (г. Алмааты, 2005), научно-практической конференции, посвященной 45-ю ГНЦ НИИ ветеринарии Восточной Сибири СО РАСХН «Состояние и перспективы ветеринарного благополучия Восточной Сибири» (Чита, 15-16 сент. 2008г), 8-й межрегиональной научно-практической конференции «Патология продуктивных и непродуктивных животных, рыб и птиц» (г. Омск, 2009).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, приложения. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 10 таблицами. Список литературы включает 208 источников, в том числе 110 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Кормление сельскохозяйственных животных и технология кормов", Юрик, София Антоновна

4. ВЫВОДЫ

2. С помощью праймеров № 18, 28, 36, 38 выявлены уровни полиморфизма внутривидовых генетических дистанций, свидетельствующие о неоднородности популяции Fusobacterium necrophorum циркулирующих у крупного рогатого скота на территории Западной Сибири. Уровень схожести культур находится в пределах от 0,11 до 0,67.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по применению тест-системы для выявления

Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью гнездовых праймеров и ТУ 9388-001-05095732-2006 (Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2.6/01846 от 20 февраля 2007 г.).

2. Инструкция по применению формол-эмульсионной вакцины против некробактериоза крупного рогатого скота и ТУ 9384-001-00492374-2008 (Свидетельство о государственной регистрации № ПВР-1-2.7/02055 от 06 июля 2008 г.).

3. Временная инструкция по применению тест-системы для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции {two in one nested PCR), утвержденная директором ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН 07.06.2006.

5. Методические рекомендации «Выявление патогенных Fusobacterium necrophorum методом совмещенной гнездовой полимеразной цепной реакции (two in one nested PCR)». Рассмотрены и утверждены подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол № 3 от 14 сентября 2006 г.).

6. Методические рекомендации «Применение RAPD-ПЦР анализа для молекулярно-генетического картирования культур Fusobacterium necrophorum». Рассмотрены и утверждены подсекцией «Проблемы инфекционной патологии животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии (протокол №. 3 от 14 сентября 2006 г.)

Библиография Диссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Юрик, София Антоновна, Новосибирск

1. Алтухов, Ю.А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике / Ю.А. Алтухов, Е.А. Салменкова // Генетика. 2002. - Т.38. - № 9. - С. 1173-1195.

2. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяциях, 1-е изд. М.: Наука. -1983.-279 с.

3. Алтухов, Ю.П. Мономорфная видоспецифическая ДНК, выявляемая в полимеразной цепной реакции со случайными праймерами / Ю.П. Алтухов, А.Б. Абрамов//Генетика. -2000. Т. 36.-№ 12,- С. 1674-1681.

4. Алтухов, Ю.П. Внутривидовое генетическое разнообразие: мониторинг и принципы сохранения /Ю.П. Алтухов// Генетика. 1995. - Т. 31. - № 10. -С.1331-1357.

5. Алтухов, Ю.П. Наследственное биохимическое разнообразие в процессах эволюции и индивидуального развития /Ю.П. Алтухов, Л.И. Корочкин, Ю.Г. Рычков // Генетика. 1996. - Т. 32. - № 11. - С. 1450-1473.

6. Анакина, Ю.Г. Болезни конечностей рогатого скота в условиях интенсивной технологии/ Ю.Г. Анакина. М., 1988. - 50 с.

7. Андо, Т. Применение ферментов в исследовании работы генов / Перевод ГПНТБ СО АН/ Т. Андо// Новосибирск. 1982. - 37 с.

8. Балабанов, В.А. Некробактериоз животных/ В.А. Балабанов М.: Колос, 1971.- 136 с.

9. Балашова, И.А. Использование RAPD-метода для создания ДНК-маркеров к генам Vrn / И.А. Балашова, Ю.М. Сиволап, В.И. Файт, А.Ф.Стельмах// Цитология и генетика. 2001. - Т. 35. - № 2. - С. 49-53.

10. Бобылева, Е.А. Ускоренный метод биологической диагностики некробациллеза и выделения чистых культур Вас. necrophorus/ Е.А. Бобылева// Сборник работ молодых ученых в области ветеринарии. М. - 1940. - С. 148151.

11. Бреслер, С.Е. Молекулярная биология/ С.Е. Бреслер// JL: Наука. 1973. - С. 208-209.

12. Булат, С.А.Полимеразная цепная реакция с универсальными праймерами для изучения геномов / С.А. Булат, O.K. Кобаев, Н.В. Мироненко, Ф.М. Ибатулин, Л.А. Лучкина, А.В. Суслов // Генетика. 1992. - Т. 28. - № 5. - С. 19-27.

13. Вартапетян, А.Б. Полимеразная цепная реакция / А.Б. Вартапетян// Молекулярная биология. 1991. - Т. 25. - Вып. 4. - С. 926-936.

14. Вейнберг, М. Анаэробные микроорганизмы и их роль в патологии / М.Вейнберг, Б. Гинзбург. -М.: Гос. мед. изд-во, 1927. С. 316-325.

15. Голосов, И.М. Некробациллез северных оленей/ И.М. Голосов, Б.В.Маслухин. Норильск, 1969. - С. 7-78.

16. Гришаев, Н.Е. Биологическая диагностика некробациллеза /Н.Е. Гришаев, Д.П.Бахтин // Ветеринария. 1969. - № 7. - С. 37-38.

17. Гришаев, Н.Е. О выживаемости Bact. necrophorum на полужидком МППБ /Н.Е.Гришаев, Д.П. Бахтин // Инфекционные и незаразные болезнисельскохозяйственных животных/ Тр. Казахского НИВИ. Алма-Ата: Кайнар, 1971.-Т.14.-С. 411-413.

18. Девис, Р. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий / Р. Девис, Д.Бодстайн, Дж. Рот// М.: Мир. 1984. - 176 с.

19. Донченко, А.С. Некробактериоз или копытная гниль /А.С. Донченко, А.А.Самоловов //Ветеринарная газета. 1998. - № 8. - С. 9.

20. Дубинин, Н.П. Экологическая генетика и эволюция / Н.П. Дубинин // Кишинёв: Штиинца. 1987. - С. 7- 49.

21. Жимулёв, И.Ф. Общая и молекулярная генетика /И.Ф. Жимулёв // Новосибирск.: Сибирское университетское издательство. 2006. - 395 с.

22. Забаровский, Е.Р. Альтернативные подходы к картированию и секвенированию генома / Е.Р. Забаровский // Молекулярная биология. 2001. -Т. 35.- №2.-С. 224-234.

23. Захаров, И.В. Диагностика некробактериоза лошадей методом РСК / И.В. Захаров // Ветеринария. 1949. - № 7. - С. 54-58.

24. Иванова, М.М. Современные методы ДНК-диагностики: Лекция / М.М. Иванова, В.Н. Лазарев, Р.В. Белоусова, Б.С. Народницкий // М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 1997. 20 с.

25. Ильина, Т.С. Структурная организация и механизмы перемещения генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам, и факторы вирулентности бактерий /Т.С. Ильина //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2001. -№ 1. - С. 3-12.

26. Каган, Ф.И. К биологии возбудителя некробациллеза северных оленей / Ф.И. Каган, Я.Р. Коваленко //Советская ветеринария. 1934. - № 7. - С.64-71.

27. Кайзер, К. Выделение высокомолекулярной хромосомной ДНК из клеток эукариот / К. Кайзер, Н. Мюррей // Клонирование ДНК. Методы/ Под ред. Д. Гловера. -М.: Мир, 1988. С. 59-61.

28. Караваев, Ю.Д. Терапия и специфическая профилактика при некробактериозе /Ю.Д. Караваев, И.Н. Семенова, А.К. Мироненко, JI.H. Зинина,

29. B.И. Тетеричев, И.Г. Мачахтыров//Ветеринария. — 1999. -№8.-С.11-12

30. Караваев, Ю.Д. Опыт борьбы с некробактериозом животных / Ю.Д. Караваев, И.Н. Семенова, Н.Б.Мельник, И.Г. Мачахтыров, М.А. Аникеев, А.К. Мироненко //Ветеринария. 2003. - № 7. - С.7-9.

31. Коваленко, Я.Р. Типовое отождествление возбудителя некробациллеза (Вас. necrophorus) / Я.Р. Коваленко// Тр. Гос. контрольного института вет. препаратов.- 1952. Т. 3.-С. 173-180.

32. Коваленко, Я.Р. Анаэробные инфекции сельскохозяйственных животных / Я.Р. Коваленко//М.: Сельхозгиз, 1954. С. 66-73, 167-222.

33. Козловский, Е.В. Иммунофлуоресцентный метод идентификации Bact. Necrophorum / Е.В. Козловский, О.И. Соломаха // Ветеринария. 1972 - № 4.1. C.102-104.

34. Корнберг, А. Синтез ДНК / А. Корнберг// М.: Мир, 1977. 359 с.

35. Краев, А.С. Методы изучения первичных структур нуклеиновых кислот / А.С. Краев, К.Г. Скрябин // Итоги науки и техники. Сер. Молекулярная биология/ ВИНИТИ.- М., 1980. Т. 12: Генетическая инженерия (методы).- Ч. 2.- С.141-197.

36. Краснобаев, А.К. К вопросу о сохраняемости лабораторных штаммов палочки некроза / А.К. Краснобаев, А.А. Тимофеева // Советская ветеринария, 1939.-№7.-С. 50.

37. Ландер, Э.С. Анализ с рестрикционными фрагментами/ Э.С. Ланд ер// Математические методы для анализа последовательностей ДНК/ Под ред. М.С. Уотермена. М.: Мир, 1999. - С. 63-84.

38. Лайшев, А.Х. Клинико-рентгенологическая картина некробациллезных поражений в области пальцев у северного оленя / А.Х. Лайшев // Матер. Всесоюз. межвуз. конф. по вопр. вет. хирургии. Л. - 1967. - С. 293-295.

39. Лайшев, А.Х. Некробактериоз северных оленей (этиология, патогенез, профилактика и лечение) / А.Х. Лайшев, Н.С. Семенов И Якутск: Якутское кн. изд-во. 1971. - С. 147.

40. Льюин, Б. Гены /Под ред. Г.П. Георгева. 1987. - С. 458-481.

41. Львов, В.М. Анаэробные инфекции и борьба с ними / В.М. Львов// Л.: Колос. 1971.-С. 48-60.

42. Мазин, А.В. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / А.В. Мазин, К.Д. Кузнеделов, А.С. Краев и др,//Новосибирск: Наука. 1990. - С. 248.

43. Малышев, С.В. Молекулярные маркеры в генетическом картировании растений /С.В. Малышев, Н.А. Картель //Молекулярная биология. 1997. - Т. 31.-№ 2. - С. 197-208.

44. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Т. Маниатис, Э. Фрич, Д. Сэмбрук // М.: Мир. 1984. - С. 480.

45. Маслухин, Б.В. Морфологические и физиологические особенности возбудителя некробактериоза северных оленей / Б.В. Маслухин, А. А. Пилипенко, Л.М. Борисова, А.Г. Маслухина // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 1972. - № 2. - С. 66-69.

46. Маслухина, А.Г. Биологический метод получения чистой культуры Bact. necrophorum из органов и тканей экспериментально зараженных кроликов / А.Г.

47. Маслухина // Бюллетень науч.-технич. информации НИИСХ Крайнего Севера.-Норильск. 1974. -№ 7.- С. 15-16.

48. Межиева, З.Х. Влияние условий хранения и времени между пересевами на жизнеспособность культур F. necrophorum / З.Х. Межиева, О.И. Соломаха, Н.Н. Кружнов // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии. 2000. - Вып.1. -С.10-16.

49. Межиева, З.Х. Испытание некоторых сред высушивания для стабилизации свойств F. necrophorum / З.Х. Межиева, О.И. Соломаха, Н.Н. Кружнов// Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии. -2000. -Вып.1. -С. 16-22.

50. Меныпенин, В.В. Питательные среды для промышленного культивирования F. necrophorum / В.В. Меныпенин, Е.Г. Лавченко, О.И. Соломаха, Е.И. Бондаренко // Ветеринария. 1997. - № 3. - С. 27-28.

51. Методические указания по лабораторной диагностике некробактериоза. (Утв. ГУВ Госагропрома СССР 1 июня 1987). М. - 1987.

52. Момыналиев, К.Т. Перспективы применения методов ДНК-диагностики в лабораторной службе / К.Т. Момыналиев, В.М. Говорун // Клиническая лабораторная диагностика. 2000. - № 4. - С. 25-32.

53. Муромцев, С.Н. В. necrophorum и его роль в патологии сельскохозяйственных животных / С.Н. Муромцев, Л.С. Новикова // Советская ветеринария. 1935. - №8. - С. 14-17.

54. Муромцев, С.Н. Копытная болезнь северных оленей / С.Н. Муромцев// Л.: Изд-во Главсевморпути. 1935. - 48 с.

55. Никоноров, П.Н. Зоогигиеническая и ветеринарная оценка технологических систем на скотоводческих комплексах / П.Н. Никоноров// Науч. техн. Бюллетень / ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. - 1980. - Вып. 17. - С. 18-22.

56. Новак, Д.Д. О сущности эпизоотического процесса / Д.Д. Новак // Современные проблемы эпизоотологии». Материалы Междунар. науч. конфер., Краснообск 30 июня 2004 г. - Новосибирск . - 2004. - С.ЗЗ 1-335.

57. Определитель бактерий Берджи / Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П.Снита и др. М.: Мир. - 1997. - Т.1. - С. 295-300, 328-330.

58. Патрушев, Л.И. Экспрессия генов / Л.И. Патрушев // М.: Наука. 2000. -527с.

59. Пилипенко, А.А. Об использовании серологических реакций при изучении некробактериоза / А.А. Пилипенко // Сибирский вестник сельскохозяйственной науки. 1974. - № 1. - С. 79-83.

60. Писаренко, Н.И. Подбор и изучение изменений питательных сред в процессе роста бактерии некроза / Н.И. Писаренко, А.А. Корзенкова, В.П. Шишова // Доклады ВАСХНИЛ. 1973. - № 10. - С. 35-37.

61. Приходько, Г.Г. Общий метод определения участков расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции / Г.Г. Приходько, С.Х. Дегтярев, Н.И. Речкунова // Биотехнология. 1990. - № 1. - С. 12-16.

62. Пушменков, Е.П. Реакция агглютинации в диагностике так называемой копытной болезни северных оленей / Е.П. Пушменков // Ветеринария. 1941. — № 1.-С. 19.

63. Ревнивых, А.Г. Копытная болезнь северных оленей и ее возбудитель //Сборник по оленеводству, тундровой ветеринарии и зоотехнике / А.Г. Ревнивых// М.: Изд-во "Власть Советов" при Президиуме ВЦИК. 1932. - С. 209-233.

64. Ревнивых, А.Г. Этиология так называемой "копытной болезни" северных оленей /А.Г. Ревнивых //Советская ветеринария. 1935. - № 8. - С. 18-24.

65. Ревнивых, А.Г. К вопросу этиологии, клиники и патогенеза летне-осенних заболеваний северных оленей / А.Г. Ревнивых // Советская ветеринария. 1940. -№2-3.-С. 59-65.

66. Ревнивых, А.Г. Аллергическая диагностика некробациллеза у северных оленей / А.Г. Ревнивых, З.А. Балабырдина // Вестник сельскохозяйственной науки. Ветеринария. М.: ОГИЗ: Сельхозгиз. - 1940. - Вып. 3. - С. 10-14.

67. Романова, Ю.М. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий / Ю.М. Романова, A.JI. Гинцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1999. - № 2. - С. 22-29.

68. Саики, Р. Полимеразная цепная реакция / Р. Саики, У. Гиленстен, Г. Эрлих// Анализ генома. Методы/ Под ред. К. Дейвиса. М.: Мир. - 1990. - С. 176-190.

69. Самоловов, А.А. Диагностическая ценность культурально-биохимических свойств F. necrophorum / А.А. Самоловов // Диагностика болезней животных и профилактика их на фермах и комплексах/ Сб. науч. тр. ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. Новосибирск. - 1984. - С. 53-58.

70. Самоловов, А.А. Совершенствование лабораторной диагностики некробакте-риоза / А.А. Самоловов // Ветеринария. 1986. - № 6. - С. 69-70.

71. Самоловов А.А. Некробактериоз крупного рогатого скота /А.А. Самоловов //-Новосибирск, 1998. 140 с.

72. Самоловов, А.А. Роль F. necrophorum в патологии человека / А.А. Самоловов // Научное обеспечение ветеринарных проблем в животноводстве: Сб. науч. тр. РАСХН. Сиб. отд-ние.ИЭВСиДВ Новосибирск. -2000. - С. 154-159.

73. Самоловов, А.А. Изучение и состояние проблемы некробактериоза северных оленей /А.А.Самоловов, В.П.Кечин, К.А.Лайшев // Новосибирск: Ревик-К. -2001.-178 с.

74. Самоловов, А.А. Некробактериоз крупного рогатого скота и пути решения проблемы /А.А. Самоловов, С.В. Лопатин // Аграрная Россия. 2001. - № 3. -С. 34-37.

75. Селедцов, И.А. Множественное выравнивание биополимеров основанное на поиске статистически значимых общих участков / И.А. Селедцов, Ю.И. Вульф, К.С. Макарова // Молекулярная биология. 1995. - Т. 29. - С. 1023-1039.

76. Созинов, А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / Созинов А.А // М.: Наука. 1985. - 272 с.

77. Соломаха, О.И. Обнаружение бактерий некроза в патологическом материале / О.И. Соломаха // Научно-технический бюллетень НИИСХ Крайнего Севера. -Норильск. 1972. - вып. 2 (5). - С. 22-23.

78. Соломаха, О.И. Серогруппы возбудителя некробактериоза / О.И. Соломаха // Научно-технический бюллетень НИИСХ Крайнего Севера. Норильск. - 1972. - вып. 2 (5). - С. 20-21.

79. Соломаха, О.И. Серологическая идентификация Bacterium necrophorum и обнаружение антител к ним в сыворотках крови северных оленей иммунофлуоресцирующим методом / Соломаха О.И.// Автореферат канд. вет. наук. -М. 1973.-16 с.

80. Соломаха, О.И. Получение люминисцентных сывороток против Bacterium necrophorum / О.И. Соломаха // Тр. НИИСХ Крайнего Севера. Норильск. -1974.-Т. 20.-С. 88-90.

81. Соломаха, О.И. Некоторые морфологические особенности Fusobacterium necrophorum / О.И. Соломаха, JI.B. Кириллов, И.Б. Павлова// Аграрная Россия. -2000. — № 3. — С.59-61.

82. Соломаха, О.И. Биотипы возбудителя некробактериоза и подбор штаммов для изготовления вакцины против некробактериоза животных / О.И. Соломаха, JI.B. Кириллов, Н.Н. Кружнов, Е.Г. Лавченко, З.М. Межнева // Аграрная Россия. -2000. -№ 3. С. 62-66.

83. Соломаха, О.И. Некробактериоз комплексное решение проблемы / О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов //Аграрная Россия. - 2001. - № 3. - С. 38-41.

84. Тютиков, Ф.М. Некоторые вопросы микробиологии возбудителя некробактериоза северных оленей / Ф.М. Тютиков// Труды Магаданского Зонального НИИСХ Северо-Востока. 1973. - Вып. 2. - С. 51-58.

85. Хесин, Р,Б. Непостоянство генома / Р.Б. Хесин//М.: Наука. 1985. -С. 37-115.

86. Хузин, Д.А. Меры борьбы с некробактериозом крупного рогатого скота / Д.А. Хузин, Д.И. Александров // Ветеринарный врач. 2002. - № 1(9). - С.46-49.

87. Цыпанов, Д.М, Реакция оседания эритроцитов и формоловая реакция при некробациллезе северных оленей / Д.М. Цыпанов // Советская ветеринария. -1940.-№6.-С. 27-29.

88. Чан, В. Т.-В. Выделение нуклеиновых кислот из клинических образцов и клеточных культур / В. Т.-В. Чан// Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир. - 1999. - С. 302-328.

89. Черкасский, Б.Л. Некробациллез / Б.Л. Черкасский // Руководство по зоонозам/ Под ред. В.И. Покровского. Л.: Медицина. - 1983. - С. 189-191.

90. Шагинян, И. А. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов / И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург //Генетика. 1995. - Т. 31. -№5.-С. 600-610.

91. Шагинян, И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций /И.А. Шагинян, А.Л. Гинцбург // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1991. - № 12. - С. 3-9.

92. Шибата Д.К. Полимеразная цепная реакция и молекулярно-генетический анализ биоптатов / Д.К. Шибата// Молекулярная клиническая диагностика. Методы / Под ред. С. Херрингтона, Дж. Макги. М.: Мир. - 1999. - С. 395-427.

93. Шумилов М.Ф. Некробактериоз северных оленей. Состояние, рекомендации / М.Ф. Шумилов// Магадан: Кн. изд-во. 1973. - 55 с.

94. Amoako, К.К. Comparison of extracellular enzymes of Fusobacterium necrophorum subps. necrophorum and Fusobacterium necrophorum subsp. Funduliforme / K.K. Amoako, Y. Goto, T. Shinjo //J. Clin. Microbiol. 1993. -V.31. - № 8. - P. 2244-2247.

95. Amoako, K.K. Study on the factors affecting the hemolytic activity of Fusobacterium necrophorum / K.K. Amoako, Y. Goto, T. Shinjo // Vet. Microbiol. -1994. -V. 41. -№ 1-2. P. 11-18.

96. Arber, W. Promotion and Limitation of Genetic Exchange /W. Arber //Science. -1979.-V. 205.-P. 361-368.

97. Attwood G.T. Ammonia hyperproducing bacteria from New Zealand ruminants / G.T. Attwood, A.V. Klieve, D. Ouwerkerk // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. -V.64. - №5.-P. 1796-1804.

98. Berg, J.N. Fusobacterium necrophorum and Bacteroides melaninogenicus as etiological agents of foot rot in cattle / J.N. Berg, R.W. Loan // Am. J. Veter. Res. -1975. V. 36. - № 8. - P. 1115-1122.

99. Berg, J.N. Identification of common antigens in ribosome-rich extracts from Fusobacterium necrophorum / J.N. Berg, J.W. Evans // Am. J. Veter. Res. 1985. -V. 46. - № l.-P. 127-131.

100. Berg, J. N. Studies of Fusobacterium necrophorum from bovine hepatic abscesses: biotypes, quantitation, virulence, and antibiotic susceptibility / Berg J. N. and Scanlan С. M. //Am. J. Vet. Res. 1982. - V. 43. - P. 1580-1586.

101. Bloch, W. A biochemical perspective of the polymerase chain reaction / Bloch W. //Biochemistry. 1991. -V. 30. -P. 2735-2747.

102. Brook, I. The relationship between Fusobacterium species and other flora in mixed infection /1. Brook, I J. Walker // Med. Microbiol. 1986. - V.21. - № 2. - P. 93-100.

103. Brosi, J. Compleye nucleotide sequence of a 23 S ribosomal RNA gene from E. coli / J. Brosi, T.J. Dull and M.F. Noller // PNAS USA. 1980. - V. 77. - № 1. - P. 201-204.

104. Brown, R. Phenotypic characteristics and lipopolysaccharides of human and animal isolates of Fusobacterium necrophorum / R. Brown, H.G. Lough, I.R. Poxton // J. Med. Microbial. 1997. - V.46. - № 10. - P. 873-878.

105. Cheetham, B.F. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants / B.F. Cheetham, M.E. Katz //Mol. Microbiol. -1995.-Vol. 162.-P. 201-208.

106. Chen, J. Directed termination PCR: a one-step approach to mutation detection /J. Chen, P.D. Hebert //Nucl. Acid Res. 1998. - V.26. - № 6. - P. 1546-1554.

107. Clark, B.L. Studies into immunization of cattle against interdigital necrobacillosis/ B.L. Clark, D.L. Emery, D.J. Stewart et al.// Aust. Vet. J. 1986. V.63. -№ 4. - P. 107-110.

108. Coyle-Dennis, J.E. Biological and biochemical characteristics of Fusobacterium necrophorum leukocidin / J.E. Coyle-Dennis, L.H. Lauerman // Am. J. Vet. Res. -1978.-V. 39. -№ 11.-P. 1790-1793.

109. Fadl A.A., Analysis of Salmonella enteritidis isolates by arbitrarily primed PCR / Fadl A.A., Nguyen A.V., Khan M.I.// J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 987-989.

110. Fifis, T. Evidence for phospholipase В activity in Fusobacterium necrophorum cultures and its association with hemolysin leucocidin activities / T. Fifis, Costopoulos C., Vaughan J.A. // Vet. Microbiol. 1996. - V. 49. - P. 219-233.

111. Fisher, S.G. DNA fragments differing by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels: Correspondence with melting theory / S.G. Fisher, L.S. Lerman //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. - V. 80. - P. 1579-1589.

112. Foglesong, M.A. Morphology of bacteriophage-like particles from Fusobacterium symbiosum / Foglesong M.A., Markovetz A J //J. Bacterid. 1974. - V. 119. - P. 325-329.

113. Foglesong, M.A. Pleomorphism of Fusobacteriua Isolated from the Cockroach Hindgut / M.A. Foglesong, D.L. Cruden and A.J. Markovetz //J. of Bacteriology. -1984. V. 158. - № 2. - P. 474-480.

114. Emery, D.L. Biochemical and functional properties of a leukocidin produced by several strains of Fusobacterium necrophorum / D.L. Emery, J.H. Dufty, B.L. Clark // Austral. Vet. J. 1984. - V.61. -№ 12. - P. 382-386.

115. Emery, D.L. Cultural characteristics and virulence of strains of Fusobacterium necrophorum isolated from the feet of cattle and sheep / Emery D.L., Vaughan J.A., Clark B.L., Dufty J. H., Stewart D.J.//Aust. Vet. J. 1985. - V. 62. - № 2. - P. 4346.

116. Emery, D.L. Generation of immunity against Fusobacterium necrophorum in mice inoculated with extracts containing leukotoxin / D.L. Emery, J.A. Vaughan // Vet. Microbiol. 1986. - V.12. - № 3. - P. 255-268.

117. Erlich, H.A. PCR-Technology / H.A. Erlich // Perkin-Elmer Cetus. 1993. - P. 234- 237.

118. Fales, W.H. Fluorescent antibody technique for identifying isolates of Sphaerophorus necrophorus of bovin hepatic absc ess origin / W.H. Fales, G.W., Teresa // Am. J. Vet. Res. 1972. - V. 33. - № 11. - P. 2323-2329.

119. Ferris, S. A megabase DNA electrophoresis system / S. Ferris, S. Freeby, P. Zoller // Amer. Biotechnol. Lab. 1989. - V. 7. - P. 36-42.

120. Forrester, LJ. Aggregation of platelets by Fusobacterium necrophorum / L.J. Forrester, B.J. Campbell, J.N. Berg, J.T. Barrett // J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 22. -№2.-P. 245-249.

121. Garcia, M.M. Characterization of endotoxin from Fusobacterium necrophorum / Garcia M.M., Charlton K.M., McKay )K.A. //Infect. Immun. 1975. - V. 11. - P. 371-379.

122. Hagelskjaer, L.H. Humen necrobacillosis, with emphasis on Lemierre's syndrome / L.H. Hagelskjaer, J. Prag // Clin. Infec. Diseases. 2000. - V. 31. - № 9. - P. 524532.

123. Innis, M.A. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications / M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky// San Diego: Academic Press. 1990. - P. 177-183.

124. Jeffreys, A.J. Hypervariable minisatellite regions in human DNA / A.J. Jeffreys, V. Wilson, S.L. Thein //Nature. 1985. - V. 314. - № 6006. - P. 67-73.

125. Jensen, R. Unexpected cross-reaction with Fusobacterium necrophorum in a PCR for detection of micoplasmas / R. Jensen, B. Bruun, B. Gabra-Hansen // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. - № 3. - P. 828-829.

126. Jin, J. Characterization of the 16S-23S rRNA intergenic spacer regions among strains of the Fusobacterium necrophorum cluster / J. Jin, D. Xu, W. Narongwanichgarn // J. Vet. Med. Sci. 2002. - V. 64. - № 3. - P. 273-276.

127. Jin, J. Phylogenetic Analysis of Fusobacterium necrophorum, Fusobacterium varium and Fusobacterium nucleatum Based on gyrB Gene Sequences / Jin J., Haga Т., Shinjo T. and Y. Goto // J. Vet. Med. Sci. 2004. - Vol. 66. - № 10. - P. 12431245.

128. Johnson, C.C. Cell-Wall-Defective Variants of Fusobacterium/ C.C. Johnson, H.M. Wexler, S.Becker, M. Garcia and S.M.Finegold// Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1989. - V. 15 - P. 369-372.

129. Joshi, С. P. RAPD (random amplified polimorphic DNA) analysis in based on interparietal genetic relationships among hexaploid wheats / C. P. Joshi, H.T. Nguyen // Plant. Sci. 1993. - Vol. 93. - P. 95-103.

130. Kanoe, M. Isolation of Fusobacterium necrophorum from bovine ruminal lesions / M. Kanoe, Y. Izuchi, M. Toda // Jpn. J. Vet. Sci. 1978. - V. 40. - № 3. - P. 275281.

131. Kanoe, M. Attempt to detect bovine antibody against Fusobacterium necrophorum by the agar gel double diffusion test / M. Kanoe, M. Toda // Japan. J. Veter. Sci. 1979. - V. 41. - № 2. - P. 97-102.

132. Kanoe, M. Adherence of Fusobacterium necrophorum to bovine ruminal cells /М. Kanoe, K. Iwaki //J. Med. Microbiol. 1987. - V. 23. - № 1. - P. 69-73.

133. Keohavong, P. Enzymatic amplification and characterization of large DNA fragments from genomic DNA / P. Keohavong C.C. Wang R.S. Cha W.G. Thilly // Gene. 1988. - V. 71. - P. 211-216.

134. Khorana, H.G. Total synthesis of the structural gene for the precursor of a tyrosine suppressor transfer RNA from E. coli /H.G. Khorana K.L. Agarval P. Besmer // J. Biol. Chem. 1976. - V.251. - P. 565-670.

135. Kim, H.S. Recombinant fragment assay for gene targetting based on the polymerase chain reaction / H.S. Kim, O. Smithies // Nucl. Acids Res. 1988. - V. 16.-P. 8887-8903.

136. Landegren, U. DNA diagnostics molecular techniques and automation / Landegren U., Kaiser R., Caskey C., Hood L. //Science. - 1988. - Vol. 242. - P. 229-237.

137. Langworth, B.I. Fusobacterium necrophorum: Its characteristics and role as an animal pathogen / Langworth B.I. //Bacteriology Rev. 1977. - V. 41. - P. 373-390.

138. Lechtenberg, K.F. Antimicrobial susceptibility of Fusobacterium necrophorum isolated from bovine hepatic abscess / K.F. Lechtenberg, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa // Am. J. Veter. Res. 1998. - V. 59. - № 1. - P. 44-47.

139. Lundstrom, A. The influence of bread, age, body weight and season on digital diseases and hoof size in dairy cows / A. Lundstrom // Zentralblatt fur Vetrinerkundizen.-1981.-V.28.- № 2.-P.141-152.

140. Manuel, M. G. Ultrastructure and Molecular Characterization Fusobacterium necrophorum Biovars / Manuel M. G., Becker S. A.W., Brian W.B., Berg J.N., Finegold S. //Can. J. Vet. Res. 1992. - V. 56. - P. 318-325.

141. Mazurier, S.I. RAPD analysis of Campylobacter isolates: DNA fingerprinting without the need to purify DNA / Mazurier S.I., Giessen A.V., Heuvelmen K. P. 162-164.

142. Mullis, К. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polimerase chain reaction / K. Mullis, F. Faloona, S. Scharf // Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 1986.-V. 51.-P. 263-273.

143. Narayanan, S.K. Cloning, sequencing, and expression of the leukotoxin gene from Fusobacterium necrophorum strain A25 / S.K. Narayanan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa, G.C. Stewart // Infect. Immun. 2001. - V. 69. - № 9. - P. 5447-5455.

144. Narayanan, S.K. Leukotoxins of gram-negative bacteria /S.K. Narayanan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa, G.C. Stewart // Vet. Microbiol. 2002. - V. 84. - № 4. -P. 337-356.

145. Narongwanichgarn, W. Differentiation of Fusobacterium necrophorum subspecies from bovin pathological lesions by RAPD-PCR / W. Narongwanichgarn, E. Kawaguchi, N. Misawa // Vet. Microb. 2001. - V. 82. - № 6. - P. 383-388.

146. Narongwanichgarn, W. Characterization of the 16S-23S rRNA Intergenic Spacer Regions amons Strains of the Fusobacterium necrophorum Claster / Narongwanichgarn W., Goto Y., Haga T. and Shinjo Т. //J. Vet. Mol.Sci. 2002. -Vol. 64.- №3.-P. 273-276.

147. Ochman, H. Amplification of flanking sequences by inverse PCR / H. Ochman, M.M. Medhora, D. Garza, D.L. Hartl // PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. San Diego: Academic Press. - 1990. - P. 219-227.

148. Paabo, S. Polymerase chain reaction reveals cloning artefacts / S. Paabo, A.C. Wilson//Nature. 1988. -V. 334. - P. 387-388.

149. Paglia, G. PCR-based multiplex DNA fingerprinting for the analisis of conifer genomes /G. Paglia, M. Morgante // Mol.Breed. 1998. - V. 4. - P. 173-177.

150. Price, S.B. Studies on bacterial synergism in mice infected with Bacteroides intermedius and Fusobacterium necrophorum / S.B. Price, R.E. McCallum // J. Basic. Microbial. 1987. -V. 27. - № 7. - P. 377-386.

151. Resenchuk, S.M. Alignment service: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length / S.M. Resenchuk, V.M. Blinov // Comput. Appl.Biosci. 1995. - № 11. - P. 7-11.

152. Rolfs, A. PCR topics: Use of polymerase chain reaction in genetic and infections diseases / A. Rolfs, H.C. Schumacher, P. Marx // Springer Verlag, 1993- P. 873880.

153. Rychlin, W. Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro / W. Rychlin, W.Y. Spencer, R.E. Rhoads // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. -P. 6400-6414.

154. Saiki, R.K. Primer directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase / R.K. Saiki, D.H. Galfand, S. Stoffel // Science. -1988.-V. 239.-P. 487-491.

155. Saiki, R.K. Enzymatic Amplification of P-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia / R.K. Saiki, S.Scharf, F. Fallona, K. Mullis, G. Horn //Science. 1985. - V. 230. - № 6. - P. 1350-1354.

156. Saginala, S. Effect of Fusobacterium necrophorum leukotoxoid vaccine on susceptibility to experimentally induced liver abscesses in cattle / S. Saginala, T.G. Nagaraja, K.F. Lechtenberg //J. Anim. Sci. 1997. - V. 75. - № 4. - P. 1160-1166.

157. Scanlan, C.M. Comparative in vitro leukotoxin production of three bovine strains of Fusobacterium necrophorum / C.M. Scanlan, J.N. Berg, W.H. Fales// Am. J, Vet. Res. 1982.-V. 43.- № 8.-P. 1329-1333.

158. Scanlan, C.M. Biochemical characterizationof leukotoxins of three bovine strains of Fusobacterium necrophorum / C.M. Scanlan, J.N. Berg, F.F. Campbell // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47. - № 7. - P. 1422-1425.

159. Scanlan C.M. A semiquantitative enzyme method for identifying Fusobacterium necrophorum biovars A and В / C.M. Scanlan, A.H. Hoyumpa, P.C. Ainsworth // J. Vet. Diagn. Invest. 1992. - V. 4. - № 1. - P. 86-87.

160. Simon, P.C. Cultivation and maintenance anaerobic medium for aerobic incubation / P.C. Simon // Canad. J. Сотр. Med. 1974. - V. 38. - № 1. - P. 94-96.

161. Simon, P.C. A simple method for rapid identification of Sphaerophorus necrophorus isolates / P.C. Simon // Canad. J. Сотр. Med. 1975. - V. 39. - № 3. -P. 349-353.

162. Shinjo, T. Physiological and biochemical characteristics of Fusobacterium necrophorum biovar A and biovar В strains their deoxyribonucleic acid homology / Shinjo Т., Miyazato S. // Jpn. J. Vet. Sci. 1981. - V. 43. - P. 233-241.

163. Shinjo, T. Hydrophobicity of Fusobacterium necrophorum biovars A and В / T. Shinjo, Hazu H., Kiyoyama H. // FEMS Microbiol. Lett. 1987. - V. 48. - P. 243247.

164. Shinjo, T. Adherence of Fusobacterium necrophorum biovar A and В strains to erythrocytes and tissue culture cells / T. Shinjo, S. Miyazato, H. Kiyoyama // Ann. Inst. Pasteur. Microbiol. 1988. - V. 139. - № 4. - P. 453-460.

165. Shinjo, T. Recognition of biovar С of Fusobacterium necrophorum Moore and Holdeman as Fusobacterium pseudonecrophorum sp. nov., nom., rev / T. Shinjo, K. Hiraiwa, S. Miyazato // Int. Syst. Bacteriol. 1990. - V. 40. - № 1. - P. 71-73.

166. Shinjo, T. Comparison of haemolytic activity between Fusobacterium necrophorum, subps. necrophorum and Fusobacterium necrophorum, subsp.funduliforme in vitro and in vivo / T. Shinjo, N. Misawa, Y. Goto // AMPIS. 1996. -V. 104.-№ l.-P. 75-78.

167. Smith, G.R. Pathogenicity of Fusobacterium necrophorum biovar В / Smith, G.R. //Res. Vet. Sci. 1992. -V. 52. - P. 260-261.

168. Smith, G.R. Pathogenicity of Fusobacterium necrophorum strains from man and animals / G.R. Smith, E.A. Thornton // Epidemiol. Infect. 1993. - V. 110. - № 3. -P. 499-506.

169. Tan, Z.L. Factors affecting the leukotoxin activity of Fusobacterium necrophorum / Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa // Vet. Microbiol. 1992. - V. 32.- № i.p. 15-28.

170. Tan, Z.L. Biochemical and biological characterization of ruminal Fusobacterium necrophorum / Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa // FEMS Microbial. Lett. 1994. -V. 120. -№ 1-2. - P. 81-86.

171. Tan, Z.L. Biological and biochmical characterization of Fusobacterium necrophorum leukotoxin / Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa, J.S. Smith // Am. J. Vet. Res. 1994. - V. 55. - № 4. - P. 515-521.

172. Tan, Z.L. Selective enumeration of Fusobacterium necrophorum from the bovine rumen / Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa // Appl. Environ. Microbiol. -1994. V. 60. - № 4. - P. 1387-1389.

173. Tan, Z.L. Fusobacterium necrophorum infections: virulence factors, pathogenic mechanism, and control measures / Z.L. Tan, T.G. Nagaraja, M.M. Chengappa // Vet. Res. Commun. 1996. -V. 20. -№ 2. - P. 113-140.

174. Vos, P. AFLP: anew tehnique for DNA fingerprinting / P. Vos, R. Hogers, M. Bleeker, M. Rejans, T. van de Lee, M Homes, A. Fritjers, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M Zabeau //Nucl. Acids Res. 1995. - V. 23. - № 21. - P. 4407-4411.

175. Warner, J.F. Endotoxin from Fusobacterium necrophorum of bovine hepatic abscess origin / J.F. Warner, W.H. Fales, R.C. Sutherland, G.W. Teresa // Am. J. Vet. Res. 1975. - V. 36. - № 7. - P. 1015-1019.

176. Welch, J. Fingerprinting genomes using PCR with arbitary primers / J. Welch, M. Mc Clelland //Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18. № 24. - P. 7213 -7218.

177. Werner, H. A serological study of strains belonging to Sphaerophorus necrophorus, Sphaerophorus varius, and Sphaerophorus freundii / H. Werner // Med. Microbiol. Immunol.-1972.-V. 157.-№4.-P. 315-324.

178. Williams, J.G.K. DNA polimorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers / J.G.K. Williams, A.R. Kubelik, K.J. Livan, K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. // Nucleic Acids Res. 1990. - V. 18. - № 22. - P. 6531-6535.

179. Williams, J.G.K. Genetic analysis using random amplified polymorphic DNA markers / J.G.K. Williams, M.K. Hanafey, J.A. Rafalski, S.V. Tongey // Nucl. Acids Res. 1990. - Vol. 18. - № 22. - P. 6531-6536.

180. Wong, C. Cloning a selected fragment from a human DNA «fingerprint»: isolstion of an extremely polymorphic minisatelite /С. Wong, W. Wilson, A.J. Jfereys, S.L. Thein //Nucl. Acid Res. 1986. - V. 14. - № 11. - P. 4605-4614.

181. Zhang, F. The two major subspecies of Fusobacterium necrophorum have distinct leukotoxin operon promoter regions / Nagaraja T.G., George D. and Stewart G.C// Vet. Microbiol.-2006.-Vol. 112.-№ 1.-P. 73-78.

Информация о работе

Юрик, София Антоновна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 06.02.02

Диссертация

Геномный полиморфизм Fusobacterium Necrophorum и оптимизация гнездовой ПЦР с целью усовершенствования диагностики некробактериоза животных - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы