Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill.

Фесенко, Иван Николаевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill.
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill."

На правах рукописи

Фесенко Иван Николаевич

Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill.

Специальность 03.02.07 — генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

12 СЕН 2013

Санкт-Петербург 2013

005532910

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики и биотехнологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Россельхозакадемии в 1998-2012 гг.

Научный консультант:

Ригин Борис Викторович, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник отдела генетики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии

Официальные оппоненты:

Борисов Алексей Юрьевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакадемии

Макарова Галина Александровна, доктор биологических наук, главный научный сотрудник Малого предприятия ГНУ Агрофизического научно-исследовательского института Россельхозакадемии

Соловьев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева

Ведущее учреждение: ГНУ Московский научно-исследовательский

институт сельского хозяйства «Немчиновка» Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « 6 » ноября 2013 г. в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 006.041.01 при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии по адресу: 190000, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Морская, 44; тел.: (812) 314-78-36, факс: (812) 571-87-28, e-mail: v.gavrilova@vir.nw.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии

Автореферат размещен на сайтах: http://vir.nw.ru и http://www.vak.ed.gov.ru « 28 »июня2013 г.

Автореферат разослан « к » 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук " Гаврилова Вера Алексеевна

Актуальность работы

Гречиха является важной продовольственной культурой: в России ее посевы занимают около 1 млн. га. Все возделываемые в России сорта представлены одним видом - Fagopyrum esculentum Moench.(гречиха обыкновенная). Этот вид обладает классической гетеростилией, обеспечивающей облигатное перекрестное опыление, которое считается одной из причин нестабильности урожая зерна (Campbell С., 2003) и обусловливает сложность селекционной работы с культурой. Попытки использования самофертильных форм в селекции гречихи не имели успеха из-за свойственной виду сильной инбредной депрессии. В Юго-Восточной Азии в качестве зерновой культуры возделывается также автогамный вид F. tataricum Gaertn. (гречиха татарская): в Китае его посевы занимают треть площадей под гречихой (Wang Y., Campbell С., 2004). В России этот вид не возделывается из-за его несоответствия местным условиям и потребительским традициям.

Объединение ценных качеств возделываемых видов в одном генотипе оказалось невозможным (Samimy С. et al., 1996).

Внимание к межвидовой гибридизации гречихи как способу создания самоопыляющихся сортов гречихи обыкновенной резко усилилось после открытия автогамного вида F. homotropicum Ohnishi, близкородственного F. esculentum (Ohnishi О., 1995). F. homotropicum, вместе с F. tataricum, F. cymosum Meisn. и F. esculentum, относится к крупносемянной группе рода Fagopyrum (Ohnishi О., 2009); другие виды, составляющие мелкосемянную группу, не имеют практического значения (Ohnishi О., 2010). В отличие от F. tataricum, вид F. homotropicum способен скрещиваться с F. esculentum с получением фертильных межвидовых гибридов. Тем не менее, для получения гибридов в этой комбинации используют методы культивирования незрелых зародышей (Wang Y, Campbell С., 1998).

Другим перспективным подходом к созданию форм гречихи с высокой инбредной жизнеспособностью является использование искусственного амфидиплоида F. giganteum Krotov, полученного скрещиванием тетраплоидных образцов F. tataricum и F. cymosum (Кротов A.C., Драненко Е.Т., 1973). Амфидиплоид самофертилен, но поддерживает гетерозис за счет межгеномных взаимодействий. F. giganteum перспективен для введения в культуру в России, однако для этого требуется преодоление ряда его недостатков, в первую очередь - сокращение продолжительности вегетационного периода и улучшение технологических качеств зерна. Это может быть сделано только посредством гибридизации F. giganteum с родительскими видами.

в) экспериментальное определение возможности интрогрессии интересующих генов (и признаков) одного вида в другой. Немаловажное значение имеет выяснение закономерностей эволюции системы размножения видов крупносемянной группы рода Ра%оругит.

Цель работы

Изучить генетику репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Ра^орутт в связи с исследованиями процессов видообразования и возможностей обмена генами между видами.

Задачи исследований

1. Изучить генетику барьеров несовместимости между видами крупносемянной группы рода Гадоругит, действующих на стадии роста пыльцевых трубок.

2. Изучить генетику различий (внутривидовых и межвидовых) по ряду признаков (форма семян, устойчивость к опадению семян, размер цветка, размер соцветия, число соцветий, тип цветка).

3. Разработать эффективную методику получения и использования в селекции межвидовых гибридов К езси1епШт с К ИотоН'орюит.

4. Исследовать формообразовательный процесс у гибридов амфидиплоида Р- &%ап1еит с родительскими формами Г. ¡Мапсит и Г. сутожт.

Научная новизна

1. Впервые для таксонов с гетероморфной системой несовместимости у видов крупносемянной группы рода Fagopyrum выявлены функциональные гены несовместимости гаметофитного типа, один из которых ассоциирован с доминантным аллелем супергена гетеростилии. Показано, что гетеростилия в роде Fagopyrum возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости. Получено прямое экспериментальное доказательство формулы Д. Льюиса (1954), объединившей известные компоненты супергена гетеростилии и 5-локусов гомоморфных систем несовместимости.

2. На основе анализа морфологии и генетических механизмов системы несовместимости К еэси1епШт, Р. котоихщсит, Р. сутсшап и Р. ю/апсит предложены вероятные последовательности событий на начальных стадиях их дивергенции.

3. Установлено, что окультуривание К езыйеШит сопровождалось накоплением рецессивных генов, увеличивающих размер соцветия; переход к самоопылению дикого вида Р. Иото1гор1сит сопровождался накоплением рецессивных генов, уменьшающих размер цветка.

4. Установлено, что ген Б4, контролирующий гомостилию цветка морфологически различных образцов Р. 1юто1гор1сит, находится в группе сцепления №4. Выявлен мультиаллелизм по субгену Р.

5. Гомостилия цветка F. tatariciim обусловлена рецессивными аллелями субгенов G и А, в сочетании с минус-аллелями модификаторов, влияющих на длину пестика. Аллель субгена Р в геноме F. tatariciim отличается от аллелей этого субгена, характерных для F. cymosum.

6. Установлено наследование новых мутаций tepal-like bract (tlb), articulation (atl) и мутации, вызывающей замену 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими фрагменты лепестков и генеративных органов; определена локализация гена TLB, контролирующего базальную границу экспрессии генов В-класса.

7. Выявлены гены, контролирующие число соцветий у детерминантной формы гречихи (гомозигота по аллелю det).

Практическое значение работы

1. Амфидиплоид F. giganteum рассматривается как перспективная основа для создания материала с высокой инбредной жизнеспособностью, поддерживаемой за счет межгеномных взаимодействий. Созданы предпосылки для селекционной работы с F. giganteum: путем гибридизации с родительскими формами (F. tatariciim и F. cymosum) получены межвидовые рекомбинанты с почти оптимальной продолжительностью вегетационного периода и улучшенными характеристиками зерна.

2. Разработаны методики массового получения межвидовых гибридов F. esculentum х F. homotropicum и их ускоренной селекционной проработки. Это позволило создать селекционный материал, на основе которого был выведен и передан в производство сорт Темп.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Прогамная несовместимость между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum обусловлена действием механизмов двух типов.

2. Идентифицировано два гена несовместимости гаметофитного типа, проявляющихся в межвидовых скрещиваниях гречихи. Один из них ассоциирован с доминантными генами, контролирующими тип цветка.

3. Гетеростилия в роде Fagopyrum Mill, возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости.

4. Формирование культивируемого вида F. esculentum сопровождалось накоплением рецессивных генов, увеличивающих размер соцветия.

5. Формирование F. homotropicum сопровождалось мутацией доминантного аллеля S-локуса, изменением его локализации, и накоплением рецессивных минус-аллелей генов, влияющих на размер цветка.

Апробация работы

Результаты работы доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 7-м (Канада, 1998), 8-м (Корея, 2001), 9-м (Чехия, 2004), 10-м

(Китай, 2007) (публикации в сборниках трудов) и 11-м (Орел, Россия, 2010)(публикации и доклад) международных симпозиумах по гречихе; 3-м международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва - Пущино, 1999); 2-м (С.-Петербург, 2000), 3-м (Москва, 2004)(доклад), 4-м (Москва, 2009) съездах ВОГиС; международной конференции "Генетические коллекции, изогенные и аллоплазматические линии" (Новосибирск, 2001); 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Москва, 2003); 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (С.-Петербург, 2006); 2n Meeting of the European Society for Evolutionary Developmental Biology, (Belgium, 2008); семинаре "Научные основы создания высокоэффективных технологий производства гречихи и проса" (Орел, 2009); региональной научно-практической конференции "Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области" (Орел, 2010).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 67 печатных работ в международных и отечественных научных журналах, сборниках симпозиумов и конференций, в том числе 22 - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, Методические рекомендации, Авторское свидетельство РФ №46923 на сорт Темп, Патент РФ на селекционное достижение №5456 на сорт Темп.

Личный вклад автора

Все результаты, представленные в диссертационной работе, получены при участии автора с 1998 по 2012 год. Участие автора было определяющим при постановке проблемы диссертационной работы, при выполнении всех экспериментов, при оформлении научных публикаций. Сорт гречихи Темп создан совместно с сотрудниками лаборатории селекции крупяных культур ВНИИЗБК.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 252 страницах, состоит из введения, 7 глав (обзор литературы (глава 1), условия проведения опытов, материал и методы (глава 2), описание экспериментов (главы 3, 4, 5), обсуждение (глава 6) и описание практического использования результатов работы (глава 7)), выводов, рекомендаций для селекционной практики и списка цитированной литературы, насчитывающего 398 источников, в т.ч. 60 на русском языке. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 33 таблицами.

1. ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ БАРЬЕРОВ

МЕЖДУ ВИДАМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ. ФИЛОГЕНИЯ

ВИДОВ РОДА FAGOPYRUM (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Анализируются современные представления о природе репродуктивных постзиготических и прогамных барьеров между видами высших растений, эволюционные взаимосвязи между известными системами несовместимости. Обсуждаются известные генетические механизмы действия различных систем несовместимости, в том числе - на уровне межвидовых скрещиваний. Изложены современные представления о филогении рода Fagopyrum Mill.

2. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОПЫТОВ, МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты проведены в теплице и на опытном поле лаборатории генетики и биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института зернобобовых и крупяных культур. Как правило, колебания погодных условий по годам в летний сезон были в пределах адаптивной нормы гречихи и морфологических повреждений у контрольных растений не вызывали. Единственное исключение - 2010 год: рекордно высокая температура воздуха в июле и августе в сочетании с небольшим количеством осадков крайне негативно повлияли на развитие растений.

В работе использованы следующие образцы гречихи:

F. esculentum subsp. esculentum: диплоидные сорта Богатырь, Скороспелая 86 (индетерминантный тип роста), Деметра, Дождик, Дикуль (детерминантный тип роста); тетраплоидный сорт Минчанка, тетраплоидные селекционные образцы ВНИИЗБК; мутации wl (willow leaf)(группа сцепления №4); lib (tepal-like bract), ген TLB картирован автором; atl (articulation), автором установлено влияние этой мутации на проявление доминантного гена SHT (опадение семян по разделительному слою); форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов (автором выделена мутация и установлено ее наследование); формы с детерминантным типом роста, различающиеся по числу соцветий на побегах; гомостильная форма Гд-1 (Замяткин Ф.Е., 1971).

F. esculentum subsp. ancestrale: С9015 (Китай, пров. Юньнань)(2х=16).

F. homotropicunv. С9139 (Китай, Юньнань), С9606 (Китай, Сычуань) (2х=16); Н#4 (2п=32).

F. tataricum subsp.potanini: С9119 (Китай) (2х=16).

F. tataricum subsp. tataricum: к-17 (Китай), к-62 (Канада), к-66 (Белоруссия), к-103 (Индия), FT9901 (Алтайский край)(2х=16); к-108 и к-113, тетраплоидные (4х=32) аналоги образцов к-17 и к-66.

F. cymostim: С9143 и С2049 (Китай)(2х=16); к-4231 (Индия)(4х=32).

F. giganteum (амфидиплоид, полученный скрещиванием F. tataricum с F. cymosum (к-108 * к-4231) (Кротов A.C., Драненко Е.Т., 1973): к-109 (мономорфный по типу цветка (длинностолбчатый) образец); гетеростильный

аналог F. giganteum, полученный нами скрещиванием к-108 х к-4231 с использование в качестве опылителя короткостолбчатых растений к-4231 F. cymosum (Fesenko I.N., 2005).

Образцы к-17, к-66, к-103, к-108, к-113, к-109, к-4231 получены из коллекции ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Образцы С9015, С9139, С9606, С9119, С9057 и С9143 любезно предоставлены проф. О. Ohnishi (университет Киото). Образец Н#4 любезно предоставлен С. Campbell (Канада). Мутантные формы wl (nr), tlb, atl выделены во ВНИИЗБК в разное время. Форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов, выделена автором. Характеристики образцов, использованные в работе, приведены при описании экспериментов.

Наблюдение роста пыльцевых трубок проведено в ультрафиолетовом свете после окрашивания анилиновым синим. Пестики для микроскопии были извлечены из цветков через 6-7 часов после опыления и зафиксированы в 1мл свежеприготовленной смеси "3 этанол: 1 ледяная уксусная кислота". После фиксации (2-5 дней) материал был промыт в 2 сменах воды, и помещен в 2М NaOH на 18-20 часов, и затем (после промывки в воде) раздавлен покровным стеклом в капле раствора анилинового синего. В каждой комбинации проанализировано не менее 10 цветков, взятых не менее, чем с 4-5 растений; в качестве опылителей использовано не менее 5 растений. Длина пыльцевых трубок измерена с помощью программы AxioVision Reí. 4.7.

Объем пыльцевого зерна определяли по формуле V=(7rd2D)/6 (объём эллипсоида вращения), где d и D - короткий и длинный диаметры эллипса (пыльцевого зерна под микроскопом). Измеряли не менее 30 пыльцевых зерен каждого образца.

Скрещивания проведены в контролируемых условиях в теплице. Цветки гомостильных и короткостолбчатых растений кастрировали перед опылением, длинностолбчатые цветки, как правило, опыляли без кастрации. Отсутствие пыльцы на рыльцах до опыления контролировали с помощью лупы (х20).

Типы генетических взаимодействий, а также приблизительное число генов, участвующих в расщеплении, определяли с помощью алгоритма, описанного H.A. Соболевым (1976), в котором использованы подходы К. Мазера (Mather К., 1949) для анализа генетических взаимодействий, и Кастла-Райта (Castle W.E., 1921; Wright S„ 1968) для оценки числа генов. Параллельно, для оценки числа генов, участвующих в расщеплении, в работе использовали подходы, основанные на анализе распределений величины признака у родительских форм и в гибридных поколениях (Powers L., 1951; Мережко А Ф 1994).

Другие особенности методов исследования представлены в соответствующих разделах.

3. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ГЕНЕТИКА ПРИЗНАКОВ ЦВЕТКА

И СЕМЯН ВИДОВ F. ТА TARICUM И F. CYMOSUM

Несмотря на существенные морфологические различия, F. tataricum и F. cymosum - относительно близкородственные виды, между которыми возможен обмен генами. Гибрид F. tataricum * F. cymosum на тетраплоидном уровне впервые был получен А.С. Кротовым и Е.Т. Драненко (1973). Синтезированный амфидиплоид оказался фертильным, и получил статус искусственной видовой формы F. giganteum Krotov (гречиха гигантская). Мы продолжили эту работу (Фесенко И.Н., Голышкин Л.В., 1997; Fesenko I.N., Fesenko N.N., 1998): были получены фертильные реципрокные гибриды F. giganteum с обоими родительскими видами (F. tataricum и F. cymosum), а также гибриды F. tataricum с F. cymosum на диплоидном и тетраплоидном уровнях (Fesenko I.N. et al., 2001; Fesenko I.N., 2005).

В главе приведены результаты генетического изучения:

1) полиморфизма по типу семян (включая межвидовые различия);

2) альтернативы "наличие/отсутствие функционального разделительного слоя на плодоножке" (ключевой признак для разделения F. tataricum на подвиды);

3) различий между F. tataricum и F. cymosum по типу цветка (гомостилия/гетеростилия).

Генетический контроль полиморфизма по форме семян

Плод татарской гречихи - трехгранный орешек, чаще всего с закругленными ребрами и продольной бороздкой на гранях, что сильно затрудняет его обрушивание. Дикие формы F. tataricum характеризуются наличием скульптуры на оболочке семян (шипов или "зарубок"): тип "notched". Культивируемые образцы формируют семена без шипов: тип «round» (длина примерно равна ширине) или "slender" (длина примерно вдвое превышает ширину) (Hirose T. et al., 1995). "Рисовая" (rice) форма татарской гречихи рассматривается как наиболее перспективная для создания сортов, пригодных для производства крупы. Основное отличие этого типа - отсутствие продольной бороздки на гранях. Вместо неё на оболочке плода формируется выступающая продольная полоса, что существенно упрощает обрушивание (Wang Y., Campbell С., 2007). Дополнительным источником изменчивости для F. tataricum может служить дикий многолетний вид F. cymosum Meisn. (плоды с ровными гранями и четко выраженными ребрами, без шипов). Далее приведены результаты генетического анализа ключевых альтернатив, характеризующих морфологические различия между семенами разных типов F. tataricum: "наличие - отсутствие шипов на семенах" и "продольная бороздка / продольный выступ посередине грани плода", а также различий по форме семян между F. tataricum и F. cymosum.

Ген БМК. Гибриды Р^гоипс^псЯсЬес!) и Р^поиЛеа^епскг) формируют семена со скульптурными образованиями на оболочке (шипами). Расщепления в Р2 показывают, что в обоих случаях отсутствие шипов контролируется одним рецессивным геном (табл. 3.1).

Таблица 3.1 - Анализ реципрокных гибридов F2 roundxnotched и notchedxslender

F. tataricum (2004-2006 г.).

Комбинация Тип семян Проверка гипотезы 3:1

Notched Round Slender Р

roundxnotched к-17 х С9119 159 70 3,79 0,05

к-66 х к-17 132 32 2,63 0,10

notchedxslender к-66 х к-62 70 19 0,63 0,43

к-62 х С9119 245 83 0,02 0,90

Гибриды F, (slender x round) формируют семена без скульптурных образований на оболочке, промежуточные по соотношению длины и ширины (гены, контролирующие отсутствие шипов на семенах этих форм, аллельны); в F2 доля растений с зерном типа round составила 18,2% (x2(3 i) =1,64). Количественные различия между этими формами обусловлены одним геном, который может быть обозначен SMK (smooth kernel).

Ген SPL. В F,(ricexround) доминировал тип round. В F2 наблюдалось расщепление на 2 фенотипических класса в соотношении 3:1 (табл. 3.2). Ген, контролирующий альтернативу "бороздка - продольный выступ на грани или "разлом" (split) (Wang Y., Campbell С., 2007)" может быть обозначен SPL (split).

Таблица 3.2 - Анализ гибридов F2 ricexround и notchedxrice F. tataricum (2008г.).

Комбинация Тип семян Проверка гипотезы

Notched Round Rice Rice+Notched ХЧЗ:1) Р

к-ЮЗхк-17 187 59 0,14 0,71

С9119х к-103 523 100 102 68

В F^notchedxrice) доминировал тип notched, в F2 наблюдалось расщепление, в котором можно было выделить 4 фенотипических класса (табл. 3.2) - два исходных и два рекомбинантных. Доля растений с семенами без шипов (round + rice) составила 25,47% (х2(3:1)=0,09; Р=0,76). Доля растений с семенами «рисового» типа (с шипами и без шипов) составила 21,44% (х2(3.1} = 5,37; Р=0,02). Доля двойных рецессивов spl/smk (тип rice) вдвое превышала ожидаемую при независимом расщеплении по этим генам: расчетная частота рекомбинации составила 28,2%.

Тип семян, характерный для F. cvmosnm. Линия к-108 (тетраплоидный аналог линии к-17) формирует семена с бороздкой без шипов (тип round), но с более грубой оболочкой, чем у диплоидного аналога. Семена F. cymosum (образец к-4231) имеют гладкие ровные грани и четко выраженные ребра. F. giganteum (к-108 х к-4231) формирует семена типа "notched" с четко выраженными шипами, то есть происходит восстановление доминантного типа: рецессивные гены, вызывающие отсутствие скульптурных образований на оболочке плода у F. cymosum и F. tataricam, неаллельны.

Генетический анализ проведен на гибридах BCiF!(k-4231 х F. giganteum) (гибриды F¡ (к-4231 х F. giganteum) опыляли пыльцой к-4231: получено расщепление по генам F. tataricum, аналогичное расщеплению при анализирующем скрещивании. Среди этих гибридов 20 формировали семена, аналогичные семенам образца к-4231, и 21 - аналогичные семенам, характерным для F. giganteum (xVd =0,02; Р=0,88): тип семян, характерный для образца к-4231 F. cymosum, контролируется одним рецессивным геном, что делает F. cymosum перспективным донором этого признака в селекционных программах по татарской гречихе.

Устойчивые к опадению семян образцы F. tataricum гомозиготны по рецессивным аллелям двух локусов, влияющих на развитие функционального разделительного слоя

Детали методики анализа. Анализ расщеплений проведен в конце августа, когда на всех растениях были одновременно зрелые семена и открытые цветки. С помощью лупы (х20) идентифицировалось наличие выраженного разделительного слоя, и затем оценивалась легкость опадения зрелых семян и отмерших цветков. Облигатное опадение всегда ассоциировалось с ясно выраженным функциональным разделительным слоем. Для устойчивых к опадению растений характерно отсутствие разделительного слоя на плодоножке, или наличие слабозаметного нефункционального разделительного слоя. Поскольку развитие нефункционального разделительного слоя широко варьировало, в том числе в пределах растения, точный анализ альтернативы "отсутствие разделительного слоя/нефункциональный разделительный слой" не проводили.

Генетический контроль альтернативы облигатное опадение семян/ устойчивость к опадению. Гибриды F, во всех изученных комбинациях скрещиваний между устойчивыми и неустойчивыми к опадению образцами (к-17 х С9119, к-66 х С9119 и FT9901 х С9119) формировали функциональный разделительный слой на плодоножке. В F, во всех перечисленных комбинациях наблюдалось соотношение 9:7 в пользу растений с опадающими семенами (табл. 3.3). Дигенный контроль признака подтвердился анализом семей F3.

Все гибриды Б] между устойчивыми к опадению семян образцами (к-66 х к-17, к-17 х РТ9901, РТ9901 х к-66) не формировали разделительный слой на плодоножках. Следовательно, в каждой из перечисленных комбинаций как минимум один из двух выявленных рецессивных генов, нарушающих развитие разделительного слоя, идентичен у скрещиваемых линий.

Таблица 3.3 - Расщепления в Р2 (устойчивые к опадению х опадающие)

(2004, 2005 г.).

Потомство № Комбинация Расщепление Тест 9:7, х2 *р

Опадающие Устойчивые

1 FT9901 х С9119 346 240 1,86 0,17

2 351 239 2,52 0,11

3 160 122 0,03 0,87

4 к-17 х С9119 133 118 1,09 0,30

5 131 103 0,01 0,93

6 к-66 х С9119 54 51 0,99 0,32

7 40 26 0,51 0,48

* Вероятность подтверждения гипотезы.

Гены, контролирующие развитие разделительного слоя на плодоножке, проявляют сцепление с локусами, влияющими на число узлов в зоне ветвления стебля и верхних ветвей: опадающие и устойчивые к опадению гибриды F2 во всех случаях достоверно различались по среднему числу вегетативных узлов на главном побеге (t=2,82... 6,85).

Идентифицированные мутации, нарушающие развитие разделительного слоя на плодоножке (обсуждение). Альтернатива "опадение семян по разделительному слою/устойчивость к опадению" является одной из ключевых в числе генетических различий между дикими и культурными формами растений. В роде Fagopyriim два вида имеют формы, устойчивые к опадению семян, то есть не формирующие действующий разделительный слой на плодоножке F. esculentum и F. tataricum.

У F. esculentum выявлено три или четыре гена, влияющих на развитие разделительного слоя (Matsui et al., 2004; Wang Y. et al., 2005), включая ген ATL (Фесенко A.H. и др., 2009), но в большинстве случаев подтверждается моногенный контроль устойчивости к опадению (Campbell С., 1995; Wang Y. Campbell С, 1998; Fesenko N.N. et al., 1998, 2006; Ohnishi О., 2000).

У F. tataricum нами выявлено по крайней мере два таких гена (Fesenko I.N., 2006). Мутация в любом из них вызывает устойчивость к опадению, но, несмотря на анализ образцов, представляющих три географически отдаленных области естественного распространения вида, во всех случаях зафиксирован дигенный контроль альтернативы "опадение — устойчивость". По мнению О. Ohnishi (2000), сорные формы F. tataricum с опадающими семенами могли

возникнуть в результате гибридизации между культурными и дикими формами. В областях, где такие скрещивания имеют место, могут быть найдены формы с моногенным контролем устойчивости к опадению. Однако, вопрос о существовании "эволюционно долговечных" линий, несущих только одну такую мутацию, остается открытым.

Генетический контроль гомостнлии цветка /<". Шапсит

Гибриды р! и Р2 в комбинациях к-17 * к-66 (также как к-108 * к-113), к-17 х С9119 и к-66 х С9П9Я 1аШпсит формировали только гомостильные цветки. Следовательно, гены, контролирующие тип цветка различных образцов (и подвидов) татарской гречихи, аллельны.

Гомостилия Г, 1сПапсит рецессивна по отношению к короткостолбчатости и длинностолбчатости Е. сутотт, но четкость проявления гетеростильных типов цветка у межвидовых гибридов была снижена по сравнению с гетеростильным родителем, пропорционально дозе генов К Штчсшп в генотипе гибрида (табл. 3.4, 3.5).

Таблица 3.4 - Характеристики длинностолбчатости цветка тетраплоидных межвидовых гибидов Р] и родительских образцов (2000 г.).

Вид, гибрид Длина пестика Ы, мм Длина тычинки Ь2, мм L1-L2

Х±ш Х±ш Х+т

ШШг1сит, к-108 1,48±0,02 1,44+0,03 0,04+0,03

к-108 х к-119 2,18±0,02 1,82+0,04 0,38±0,04

К giganteum, к-119 2,65±0,07 1,74±0,17 0,92±0,12

к-119 х к-4231 3,11 ±0,07 1,62±0,09 1,48±0,14

к-4231 х к-119 3,30+0,11 1,83+0,04 1,47+0,11

К сутозит, к-4231 3,42+0,07 1,82±0,06 1,60±0,08

Таблица 3.5 - Характеристики короткостолбчатости цветка тетраплоидных межвидовых гибридов и гетеростильного вида Г. суто.чит (2000 г.).

Гибрид, вид Длина пестика Ъ1, мм Длина тычинки Ь2, мм L2-L1

Х±т Х+т Х±ш

к-108 х F. giganteum" 1,78+0,04 2,07±0,08 0,29±0,09

F. giganteum 1,64+0,02 2,42±0,17 0,78+0,19

F. giganteum' x к-4231 1,60+0,04 2,29±0,05 0,69±0,04

к-4231 x F. giganteum' 1,63 ±0,01 2,90±0,02 1,28±0,02

F. cymosum, к-4231 2,15±0,04 3,64±0,04 1,49±0,05

'ресинтезированный амфидиплоид к-108 х к-4231 с короткостолбчатыми цветками

Сравнение гибридов Ft F. giganteum * F. cymosum и F. cymosum x F. giganteum показало, что на степень выраженности гетеростилии, особенно на длину тычинок короткостолбчатых цветков, достоверно (t=13,2) влияет цитоплазма (табл. 3.5): цитоплазма F. cymosum обеспечивает более четкую экспрессию гетеростилии.

В расщепляющейся популяции F2 {F. tataricum х F. giganteum) идентификация типа цветка была затруднена вследствие непрерывного варьирования признака от гомостилии до длинностолбчатости на уровне F. giganteum: степень проявления длинностолбчатости цветков межвидовых гибридов прямо зависит от дозы генов F. cymosum в их генотипах.

Для идентификации аллеля субгена Р (размер пыльцы) было проведено сравнение по размеру пыльцы Д- и К- форм F. giganteum. В качестве контроля использовались Д- и К- растения F. cymosum. Пыльца Д-формы F. giganteum была достоверно (t=2,69) мельче пыльцы К-формы (40,5*103 и 44,0 ><103 мкм соответственно), но значительно крупнее пыльцы Д-формы F. cymosum (от 16,8х 103 до 33,3х103 мкм3). Таким образом, F. tataricum несет функциональный аллель субгена Р, отличающийся от соответствующих аллелей F. cymosum. Этот аллель может быть обозначен Р,.

Структура генетических различий между F. cymosum и F. tataricum по типу цветка (гетеростилия/гомостилия"). Перекрестное опыление в роде Fagopyrum Mill, ассоциировано с гетеростилией (Yasui Y. et al., 1998). Генетический анализ типа цветка проведен на F. esculentum (гречиха обыкновенная), и классический тип наследования гетеростилии был подтвержден: короткостолбчатый тип цветка определяется доминантным аллелем 5-локуса, длинностолбчатая форма - рецессивная гомозигота ss (Dahlgren К.V.O., 1922).

В межвидовых скрещиваниях между F. tataricum и F. cymosum гомостильный вид ведёт себя как рецессивная гомозигота ss (если принимать во внимание длину пестика и тычинок). В комбинации "гомостилия х длинностолбчатость" получаются только длинностолбчатые гибриды; в комбинации "гомостилия х короткостолбчатость" получены длинностолбчатые и короткостолбчатые гибриды. Количественный анализ длинностолбчатых цветков межвидовых гибридов (включая беккроссы) показал промежуточное и явно полигенное наследование длины пестика. Таким образом, идентифицирован полигенный комплекс, участвующий в контроле гетеростилии F. cymosum и гомостилии F. tataricum.

У обыкновенной гречихи ранее была идентифицирована полигенная система с буферными свойствами, включающая в себя "плюс" и "минус" аллели по меньшей мере шести локусов, влияющих на длину пестика (Fesenko N.N., 1989). Обычное развитие гетеростилии бывает обусловлено плюс-аллелями в четырех из этих локусов и минус-аллелями - в двух. Единичная аллельная замена не оказывает существенного влияния на проявление гетеростилии.

Появление "рецессивных" гомостильных форм с короткими органами цветка было объяснено накоплением дополнительных минус-аллелей на фоне рецессивной гомозиготы по главному стрелочному гену S. В этих случаях уменьшение длины пестика до уровня тычинок у рецессивов по локусу гетер остилии было обусловлено аллельными заменами как минимум в двух локусах полимерной системы (Fesenko N.N., 1989).

Хотя экспрессия гетеростилии в популяции может варьировать, в аутбредных сортах гречихи обыкновенной заметного накопления редких аллелей в этих локусах не происходит вследствие действия стабилизирующего естественного отбора, направленного против форм, склонных к самоопылению, к которым относятся и дшшностолбчатые растения с уменьшенной длиной пестика (Фесенко Н.Н., Фесенко И.Н., 2005). При изменении направления действия отбора, например в результате принудительного самоопыления, такие формы получают преимущество, благодаря чему были изолированы линии с генетически уменьшенной длиной столбика, вплоть до гомостилии (Fesenko N.N., 1989). Анализ межвидовых гибридов F. tataricum с F. cymosum (и F. giganteum) позволяет заключить, что аналогичный генетический механизм определил возникновение гомостилии и самофертильности вида F. tataricum. Однако, сформировавшийся гетеростильный вид (в том числе F. cymosum) не мог быть его прямым предком. F. tataricum несет, по-видимому, рецессивные аллели аналогов субгенов А (длина тычинок) и G (дайна пестика) супергена гетеростилии. Но, с другой стороны, он несет функциональный, хотя и несколько отличающийся от соответствующего доминантного аллеля F. cymosum, аллель субгена Р. Таким образом, фрагмент предполагаемого аналога супергена гетеростилии, контролирующего основные характеристики морфологического диморфизма, у татарской гречихи имеет вид gP<a. Мутация gpa —у gP&, необходимая для прямого происхождения F. tataricum от длинностолбчатой формы гетеростильного вида, выглядит маловероятной.

4. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДЕТЕРМИНАЦИЯ ОСОБЕННОСТЕЙ

СИСТЕМЫ РАЗМНОЖЕНИЯ ВИДОВ F. ESCULENTUM

И F. HOMOTROPICUM

F. esculentum и F. homotropicum - близкородственные виды, формирующие в скрещиваниях между собой на диплоидном уровне полностью фертильные межвидовые гибриды. F. esculentum (гречиха обыкновенная) -перекрестноопыляющийся вид с гетероморфной системой несовместимости, возделываемый как зерновая культура. Поскольку этот вид широко культивируется и является объектом селекционной работы, его полиморфизм достаточно хорошо изучен: известен ряд мутаций (мутации супергена гетеростилии, гомеозисные мутации и т.д.), составлена генетическая карта, включающая в себя семь групп сцепления из восьми возможных (Фесенко Н.В., 1983; Fesenko N.N., 1989; Ohnishi О., 1990; Фесенко Н.В. и др., 2006). Дикий

подвид F. esculentum subsp. ancestrale произрастает в горах южного Китая (Ohnishi О., 1991). Это более ксерофитные растения с "альпийским" типом роста (медленное развитие побега на ранней стадии и, как следствие, сильно укороченные нижние междоузлия) и функциональной гетеростилией.

F. homotropicum - недавно открытый вид, произрастающий на юге Китая (Ohnishi О., 1995). Известно несколько форм, объединенных под этим видовым названием в основном по двум признакам: тип системы размножения (автогамия, ассоциированная с гомостилией) и морфологическое сходство с F. esculentum subsp. ancestrale (Asano N., Ohnishi O., 1999). Эволюционный и таксономический статус этих форм предстоит уточнить. Сейчас известно, что они различаются между собой по плоидности (2п=16 или 32), размеру цветка и степени репродуктивной изолированности от F. esculentum (Wang Y., Campbell С., 1998; Fesenko I.N. et al., 2001; Wang Y. et al., 2002). По-видимому, некоторые из них вполне можно рассматривать как самостоятельные виды, другие - как разновидности или микровиды.

Сравнение двух образцов F. homotropicum (С9139 и С9606) показывает существенные различия между ними по размеру цветка, размеру пыльцы и совместимости с F. esculentum (Fesenko I.N. et al., 2001). Образец C9139 (мелкие цветки, мелкая пыльца) выглядит как самостоятельный вид, репродуктивно изолированный от F. esculentum в естественных условиях: эта изоляция может быть преодолена в экспериментах. Образец С9606 (крупные цветки, крупная пыльца) совместим с F. esculentum в комбинации F. esculentum, Д х С9606. В то же время, комбинация F. esculentum, К х С9606 несовместима абсолютно (Fesenko I.N. et al., 2001).

Отсутствие заметной дивергенции геномов (заметных нарушений фертильности межвидовых гибридов), в сочетании с заметным накоплением достаточно контрастных морфологических изменений, предположительно ассоциированных с разнонаправленной эволюцией системы размножения и с доместикацией одного из видов, делает комплекс F. esculentum - F. homotropicum (особенно эволюционная линия, представленная образцом С9139) подходящей моделью для анализа генетических изменений, сопровождавших эти процессы.

В главе приведены результаты изучения:

1) генетической системы, контролирующей изменчивость числа соцветий на фоне рецессивного аллеля локуса D (DET) (включая межвидовые различия);

2) генетического контроля различий между F. esculentum (сортовая популяция) и F. homotropicum (линия С9139) по размеру цветка и соцветия;

3) различий между F. homotropicum и F. esculentum по типу цветка (гомостилия/гетеростилия);

4) наследования новых мутаций (tepal-like bract, articulation, формы с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов).

Генетический контроль числа соцветий на побегах детерминантной

формы гречихи

Детерминантность, ограничивающая морфогенез репродуктивной сферы побега формированием 3-4 соцветий — один из ключевых признаков в селекции гречихи (Fagopyrum esculenttim), поскольку с его помощью была в значительной мере решена проблема неограниченного роста, характерного для гречихи и, как следствие, значительно повышена дружность зацветания и созревания растений. В настоящее время признак "тип роста побегов" является ведущим в параметрах сортов гречихи (Фесенко Н.В. и др., 2006).

Детерминантность наследуется как рецессивная гомозигота по локусу, обозначенному D (Фесенко Н.В., 1968) или DET (Ohnishi О., 1990). Существует также количественная изменчивость числа генеративных узлов на побегах детерминантных растений: к настоящему времени выделены детерминанты с числом соцветий от одного до пяти и более, что может свидетельствовать о существовании генетической системы, регулирующей проявление рецессивной гомозиготы по локусу D.

Растительный материал и особенности генетического анализа. Детерминантные линии с повышенным (4-5) числом соцветий были скрещены с линиями с "нормальным" (3) и пониженным (2) числом соцветий на побегах. Фенотипы индивидуальных растений, включенных в скрещивания: 5+4+4 (число соцветий на главном побеге и двух ветвях сверху) и 2+2+2 (Комбинация №1), 5+4+5 и 3+3+3 (Комбинация №2). Скрещивание растений и размножение гибридов проводили в теплице, морфологический анализ родительских форм и гибридов — в полевых условиях в 2008 г. В качестве контроля использовались линии, из которых были отобраны растения для скрещиваний.

Для оценки аллельного состава исследуемых локусов в геноме дикого вида F. homotropicum, близкородственного гречихе обыкновенной, анализировали детерминантные растения F2 F. esculentum (3+3+3) х F. homotropicum (линия C9139).

Чтобы минимизировать влияние модификационной изменчивости, для каждого растения определяли средние значения числа соцветий/побег (сумма по главному побегу и двум верхним ветвям деленная на три). Эти средние значения были использованы для генетического анализа.

Характер генетических взаимодействий и приблизительное число генов, участвующих в расщеплении, оценивали по методу H.A. Соболева (1976). Дополнительно для оценки числа генов использовался подход, основанный на разложении популяции на компонентные фенотипы (Мережко А.Ф., 1994). Доля популяции F2, соответствующая родителю Pi (родительская форма с большим значением признака), определялась как доля растений этого типа, в которой среднее значение признака равнялось среднему значению Р].

Анализ гибридов между детерминантными линиями К езси1еМит с разным числом генеративных узлов на побегах. В таблице 4.1 представлены результаты двух экспериментов по анализу наследования различий между детерминантными линиями по числу соцветий на побегах. В обоих экспериментах средние значения признака в р1 и ¥2 различались незначительно и недостоверно (1=0,41 и 0,55 для комбинаций №1 и №2, соответственно), однако наследование не было строго промежуточным (аддитивным).

Таблица 4.1 - Анализ наследования признака «число соцветий на побегах» _ F. esculentum (по H.A. Соболеву, 1976)(2008 г.). _

Родительские формы, гибриды N lim X+m °2g D E Число генов

Комбинация Pi(l) 42 2,7...5,6 3,95±0,07

№1 Р2(1) 21 2,0...2,8 2,49±0,07

F,(l) 24 2,3...4,0 2,89±0,09

F2(l) 230 2,0...5,5 2,85±0,04 0,255 -1,54 1,10 3

Комбинация Р.(2) 57 3,0...7,0 4,5±0,11

№2 Рг(2) 113 1,8...4,4 3,13±0,04

Fi (2) 18 2,0...5,2 3,58±0,17

F2(2) 104 2,6...6,0 3,68±0,06 0,321 -0,45 0,10 1

Генетическим анализом по схеме Н.А. Соболева установлено, что в комбинации №1 отрицательное сверхдоминирование частично уравновешивалось противоположным эффектом эпистатических взаимодействий (табл. 4.1). Расчетное число генов, участвовавших в расщеплении, не превышало 3. В комбинации №2 наблюдалось частичное отрицательное доминирование; эпистатические взаимодействия практически отсутствовали (Е=0,10), что полностью согласуется с расчетным числом генов, участвующих в расщеплении (табл. 4.1). Доля растений ¥2, среднее значение признака в которой была равна средней Р, (родитель с большим значением признака), в опыте 2 была близка к 25% (25 растений из 104) (%2 =0,05), ожидаемым при расщеплении по 1 гену. В комбинации №1 доля таких растений Р2 составила 13,5% (31 растение из 230), что достоверно меньше 25% (х2 =16,28), но явно превышает 6,25% (%2 =20,51), ожидаемых при расщеплении по Двум генам. По-видимому, это можно объяснить частичным сцеплением генов, участвующих в расщеплении.

Анализ детерминантных межвидовых гибридов ^ Р.еясикпШт х Р. кото1готсит. Межвидовые гибриды Р, характеризовались индетерминантным типом роста (признак Р. /юто1гор1сит), среди гибридов Р2 наблюдалось ожидаемое моногенное расщепление.

Среднее значение числа соцветий на побегах детерминантных межвидовых гибридов Р2 составило 1,59, что значительно меньше средней для сортовых детерминантных популяций F. езсикпШт с "типичным" значением признака (2,75). В проанализированной выборке (164 растения) преобладали растения с 1-2 соцветиями на побегах. Степень редукции зоны плодообразования у этих детерминантов отражает аллельное состояние в геноме /•". Ьото^оркит генов, гомологичных генам, контролирующим степень редукции зоны плодообразования у детерминантной формы Г. ехсиктит. Доля выборки растений межвидовых гибридов с максимальными значениями признака, средняя которой составила 2,75, то есть равнялась средней детерминантного родителя, составила 17,1%, что свидетельствует о расщеплении по двум сцепленным генам.

Генетическая система, модифицирующая фенотип (число соцветий) рецессивной гомозиготы по локусу О (обсуждение). Генетическим анализом выявлено небольшое число генов, участвующих в расщеплении, причем различные подходы дали близкие результаты. Дикий вид /\ /юто1го/псит, близкородственный гречихе обыкновенной (межвидовые гибриды полностью фертильны), с индетерминантным типом роста несет аллели модификаторов, снижающие число соцветий на побеге у гомозиготы по аллелю с! до 1. Анализ выборки детерминантных межвидовых гибридов Р2 (/•*. е.чси1епШт х /\ Иотой-оркит) показывает, что эти аллели доминируют над аллелями, обусловливающими большее число соцветий, причем различия между детерминантами с 1 и 3 соцветиями обусловлены, по-видимому, двумя частично сцепленными генами. Увеличение числа соцветий с 2-3 до 4-5 обусловлено дополнительными рецессивными генами.

По-видимому, /\ 1юто1горюит несет полный набор доминантных минус-аллелей локусов, модифицирующих фенотип рецессивной гомозиготы по локусу Б. Рецессивные плюс-аллели этих модификаторов обнаружены в популяциях детерминантных сортов Восточно-Европейского ареала. Поскольку аллель был редкой примесью в восточноевропейских популяциях (Фесенко Н.В., 1968), направленный отбор рецессивных плюс-аллелей модификаторов для увеличения числа соцветий у детерминантов представляется маловероятным. В то же время, детерминанты сразу после обнаружения были включены в селекцию (Фесенко Н.В., 1968), и скорее всего они представляли собой растения не менее чем с 2-3 соцветиями на главном побеге. Кроме того, растения с одним соцветием (генеративным узлом) на главном побеге были обнаружены только среди межвидовых гибридов Р2 с участием дикого вида Г. )юто1гор1сит, и, по-видимому, культивируемые популяции не несут полного набора доминантных минус-аллелей всех выявленных модификаторов.

Таким образом, рецессивные плюс-аллели модификаторов, определяющих степень редукции зоны плодообразования у детерминантов, накопились в популяциях на окраине ареала гречихи обыкновенной случайным

образом, причем их концентрация оказалась достаточно высокой, что, по-видимому, способствовало закреплению в этих популяциях и рецессивного аллеля d. Широкое использование детерминантных форм в селекции привело к увеличению концентрации плюс-аллелей этих модификаторов.

Генетика различий между F. esculentum и F. homotropicum по

признакам, ассоциированным с типом системы размножения

F. esculentum - возделываемый перекрестноопыляющийся вид с крупными цветками, собранными в крупные соцветия. Дикий вид F. homotropicum - полиморфный самоопылитель: встречаются образцы как с достаточно крупными (почти как у F. esculentum), так и мелкими (примерно вдвое мельче, чем у F. escidentum) цветками и мелкими соцветиями. В разделе изложены результаты изучения генетического контроля межвидовых различий по размеру цветка и соцветия. Обсуждается возможная связь этих различий с разнонаправленной эволюцией системы размножения и/или доместикацией.

Материал и особенности генетического анализа. F. esculentum: сорт Скороспелая 86 (Ск. 86), для которого характерно минимальное варьирование числа узлов в зоне ветвления главного побега (Фесенко H.H., Гуринович И.А., 1999) и обычный размер соцветия (сорт создан без специального отбора по этому признаку); F. homotropicum: образец С9139 из коллекции университета Киото, (почти чистая линия с мелкими гомостильными цветками и мелкими соцветиями); Гибриды F, и F2 (Ск. 86 х С9139).

Для измерения брали пять полноценных свеже-сорванных цветков с каждого растения. Размер цветка определяли по величине радиуса венчика. Размер соцветия определяли по числу составляющих его метамеров (повторяющихся единиц структуры растения (Harper J.L., 1977; White J., 1979), в данном случае - элементарных соцветий). Такой подход успешно применяется для описания и сравнительного анализа строения главного побега и ветвей различных генотипов гречихи (Фесенко Н.В. и др., 2006). Анализировали второе снизу соцветие на главном побеге.

Анализ вклада аллельных и неаллельных взаимодействий генов в контроль наследственной изменчивости признака, а также приблизительный подсчет числа генов, обусловливающих межвидовые различия, проведен по схеме, предложенной Н.А.Соболевым (1976).

Генетический контроль изменчивости по размеру соцветия. В среднем, соцветия растений из сортовой популяции перекрестноопыляющегося вида почти в 2 раза крупнее соцветий F. homotropicum. Однако, размах варьирования по этому признаку в популяции F. esculentum был настолько велик, что диапазоны изменчивости двух видов перекрывались (табл. 4.2).

Дополнительная (генотипическая) дисперсия популяции Pi по сравнению с линией Р2 равнялась а2„Р1 = X2P1(CV2P, - CV2P2) = 15,32(0,2092 - 0,1342) = 6,02.

Популяция Р](Ск.86 X С9139) была относительно однородной, со средним выражением признака близким к промежуточному (по отношению к родительским формам). Популяция Р2(Ск.86 х С9139) существенно отличалась от популяции Р,(Ск.86 х С9139) по среднему значению признака, что заставляет отказаться от предположения об аддитивном характере взаимодействия генов, обусловливающем промежуточное наследование признака в первом поколении.

Таблица 4.2 - Наследование числа элементарных соцветий в соцветии(1999 г.).

Родительская форма, гибрид n Число элементарных соцветий, шт. Cv,% o2ph D Е Число генов

Х±ш lim

Рь Ск.86 23 15,3±0,7 9...22 20,9 10,23 6,02

Р2, С9139 22 8,1 ±0,2 7...10 13,4 1,18 -

F,(PixP2) 5 12,6±0,7 11...15 12,0 2,29 -

F2(PixP2) 93 9,9±0,2 5...16 15,9 2,48 0,72 -2,25 2,5 25

Размах изменчивости гибридов второго поколения (lim = 5... 16) был значительно меньше, чем между родительскими формами (lim = 7...22) из-за отсутствия в гибридной популяции растений с наиболее крупными соцветиями, что свидетельствует об участии в расщеплении большого числа генов. Генотипическая дисперсия F2(Ck.86 х С9139) также была относительно небольшой величины: a2gF2 = X2F2(Cv2f2 - Cv2pi) = 9,92(0,159 - 0,134 ) = 0,72. Дальнейший генетический анализ проведен по схеме H.A. Соболева (табл. 4.2). Таким образом, промежуточное наследование размера соцветия гибридами первого поколения обусловлено разнонаправленностью аллельного и неаллельного взаимодействий генов. Предположение о полигенном контроле межвидовых различий по этому признаку подтвердилось, но в данной ситуации точное определение числа генов невозможно.

Особенностью рассматриваемой генетической ситуации является многократное превышение генотипической дисперсии популяции Pi(Ck.86) над генотипической дисперсией популяции F2(Ck.86 х С9139) (табл. 4.2). Кроме того, в популяции F2(Ck.86 х С9139) наблюдалась трансгрессия в сторону наименьшего значения признака, но отсутствовали растения с крупными соцветиями. Это можно объяснить тем, что по случайным причинам гибридные семена были получены на основе только одного генотипа, гомозиготного по минус-аллелям наиболее сильных локусов, определяющих генотипическую изменчивость сортовой популяции F. esculentum. Поэтому имеет смысл скорректировать результаты генетического анализа, построив модель этой ситуации. Неизвестная величина этой модели - Р]М, то есть фенотипическое значение уменьшенной средней Скороспелой 86. Вероятно, это значение должно быть ближе к Fb чем реальная популяционная средняя Рь Иначе,

модельную величину Р1М следует приравнять к полученному в эксперименте значению F,. Тогда исходные данные и ход анализа будут иметь следующий вид: P1M=F,=12,6; P2=8,l; F,=12,6; F2=9,9; Ха=0,5(12,6+8,1)=10,35; а7=0,5(12,6-8,1)—2,25; С,=12,6-10,35=2,25; С2=9,9-10,35=-0,45; d,=-l ,8-2,25=4,05; d2=-2,03; f,=6,3; f2=l,57; D=-l,8; E=2,8; N=7,6.

Моделирование (замена Pi на PiM) не изменило характера выявляемых генетических взаимодействий: сверхдоминирования малого значения признака (D=-l,8) и перекрывающего его положительного сверхэпистаза (Е=2,8), дающих в F, иллюзию доминирования большого значения признака (положительного доминирования). При этом получена более правдоподобная оценка числа генов, участвующих в расщеплении.

Наследование межвидовых различий по размеру цветка. Все изученные растения F. esculentum формировали более крупные цветки, по сравнению с растениями линии С9139 F. homotropicum. Варьирование величины радиуса венчика в популяции вида-перекрестника было значительно шире, чем у линии С9139. Относительная изменчивость также была выше у F. esculentum (табл. 4.3). Популяция гибридов F,(Ck.86 х С9139) была небольшой и относительно однородной, с промежуточным наследованием признака. Популяция гибридов F2(Ck.86 х С9139) существенно отличалась от популяции гибридов F,(Ck.86 х С9139) по среднему выражению признака (табл. 4.3; t=7.8), что свидетельствует об участии неаддитивных взаимодействий в контроле варьирования признака. Размах изменчивости среди гибридов F2 был значительно меньше, чем между родительскими формами (lim = 2,07...4,71 мм) из-за отсутствия среди проанализированных гибридных растений второго поколения наиболее мелкоцветковых форм, что свидетельствует об участии в расщеплении большого числа генов.

Таблица 4.3 - Наследование различий между Г. езсикпШт (Ск. 86) и Р.кото^орюит (С9139) по признаку "радиус цветка" (1999 г.).

Родительская форма, гибрид n Радиус цветка, мм Cv, % f2ph, мм2 мм D Е Число генов

Х±т lim

Pi, Ск.86 23 4,1410,06 3,46...4,71 7,3 0,0934 0,0715

Р2, С9139 22 2,19±0,01 2,07...2,31 3,4 0,0055 -

F,(P,xP2) 5 3,ЗОЮ,04 3,24...3,41 2,4 0,0063 -

F2(P,xP2) 93 3,69±0,03 2,80...4,68 8,9 0,1079 0,1000 2,02 -1,88 12

Оценка величины и характера генетических взаимодействий, а также числа генов, участвующих в расщеплении, была сделана по схеме H.A. Соболева (1976) (табл. 4.3). Таким образом, близкое к промежуточному (по сравнению с родительскими формами) проявление признака в F, связано с

разнонаправленностью аллельного и неаллельного взаимодействия генов. Подтвержден полигенный характер расщепления в F2 (12 генов), но следует отметить, что в данной ситуации точное определение числа генов невозможно.

Эволюция размера цветка и соцветия у F. esculentum и F. homotropicum (обсуждение). Генетическим анализом выявлено, что размер цветка и размер соцветия демонстрируют разные направления эволюционных изменений, и, следовательно, их изменения вызваны разными селективными факторами. Поскольку плюс-аллели доминируют в локусах, контролирующих размер цветка, и рецессивны в локусах, контролирующих число элементарных соцветий в соцветии, "диким типом" для гречихи можно считать фенотип с крупными, хорошо заметными цветками, в сочетании с небольшим числом элементарных соцветий. Эволюция самоопыляющегося вида F. homotropicum сопровождалась только уменьшением размера цветка. С другой стороны, сортовая популяция перекрестноопыляющегося вида F. esculentum поддерживает генетическую систему, обеспечивающую формирование крупного цветка (исходный, или "дикий" признак) и крупного соцветия (приобретенный, или мутантный признак).

Крупное соцветие, очевидно, необходимо для возделываемых сортов. Селекция на урожайность ведет к увеличению числа метамеров в соцветии. В данной работе использован сорт Скороспелая 86 F. esculentum, который не селектировался на увеличение размера соцветия, но внутрисортовой полиморфизм по этому признаку оказался достаточно высоким. Изменчивость числа метамеров соцветия в пределах сорта Скороспелая 86 обусловлена локусами с более сильным эффектом, чем полигены, контролирующие межвидовые различия. Высокая генетическая гетерогенность по размеру соцветия, возможно, является компонентом генетической системы внутрипопуляционного гетерозиса, необходимой для поддержания продуктивности сорта. В то же время, показано возможность успешной селекции на дальнейшее увеличение размера соцветия (Мартыненко Г.Е., 1996).

Энтомофильным видам необходимы крупные цветки, заметные для насекомых. С другой стороны, a priori, крупное соцветие выполняет те же функции. Однако, как показано в нашей работе, увеличение размера соцветия обусловлено накоплением рецессивных генов, и, по-видимому, является результатом вторичной эволюции, возможно, уже после доместикации. Остается открытым вопрос, почему перекрестноопыляющийся предок F. homotropicum поддерживал генетическую систему, которая контролировала развитие соцветия небольшого размера?

Экспериментально установлено (Harder L.D., Barrett S.C.H., 1995), что одновременное распускание множества цветков в соцветии приводит к гейтеногамии (опылению пыльцой соседних цветков). Таким образом, поддержание комплекса генов, обеспечивающего формирование небольшого числа метамеров в соцветии, характерного для диких форм, вероятно,

оптимизирует пыльцевой режим, когда плотность популяции становится низкой. В культивируемых популяциях плотность ценоза всегда достаточна для нормального функционирования перекрестного опыления, и вероятность гейтеногамии сводиться к минимуму. Поддержание небольшого числа элементарных соцветий в соцветии F. homotropicum может рассматриваться также в рамках концепции экономии затрат на репродукцию.

Гены, определяющие тип цветка, в геноме F. homotropicum

Локус S4. Расщепление по типу цветка в F2 гомостильного межвидового гибрида F. esculentum х С9606 достоверно соответствует 3:1 (х2=0,01; Р=0,91): все 512 гомостильных (Гд) растений были не устойчивы к опадению семян по разделительному слою, 169 длинностолбчатых (Д) гибридов были устойчивы к опадению. Расщепление по типу цветка среди гибридов BQF^F. esculentum х С9606) достоверно соответствовало 1:1 (^=0,39; Р=0,53): 78 Гд (75опад. : 3 уст.к опад.) и 86Д (1 опад. : 85 уст.к опад.). Частота рекомбинации варьировала от 0% (в F2) до 1,2...3,9 % (для BCiF,). Аналогичные результаты были получены в экспериментах с участием образца С9139 F. homotropicum (Fesenko N.N. et al., 1998). Гибриды F, (C9139 x C9606) были гомостильными и опадающими. В комбинации F. esculentum, Д х F,(C9139 х С9606) было получено 61 гибридное растение, каждое из которых формировало гомостильные цветки. Это прямо подтверждает, что локусы, контролирующие гомостилию цветка линий С9139 и С9606 идентичны. Локус SHT по нашим данным сцеплен с геном WL (группа сцепления №4): 5,3...9,5 % рекомбинации. Следовательно, ген гомостилии F. homotropicum также относится к группе сцепления №4. В дальнейшем этот локус будет обозначаться S4.

Рецессивный аллель локуса (5) гетеростилии. Прямые данные о том, что гомостилия F. homotropicum и гетеростшшя F. esculentum контролируются разными локусами, получены анализом расщепления в F2 короткостолбчатых гибридов F. esculentum, К х С9139: кроме ожидаемых короткостолбчатых и гомостильных растений, здесь был обнаружен третий фенотипический класс -длинностолбчатые растения (табл. 4.5). Поскольку короткостолбчатые межвидовые гибриды, которые несут доминантный аллель локуса гетеростилии, не могут одновременно нести рецессивный аллель того же локуса, полученный от того же родителя, можно заключить, что рецессивный аллель локуса гетеростилии мог быть получен только от F. homotropicum. Таким образом, этот автогамный вид несет рецессивный аллель 5 локуса гетеростилии, «замаскированный» эпистатическим геном S4.

Мультиаллелизм субгена Р. Если оба доминантных гена (S F. esculentum и S4 линии С9139) включают в себя один и тот же доминантный аллель субгена Р, то гомостильные (Гд) и короткостолбчатые (К) гибриды F! (F. esculentum х С9139) должны были бы иметь одинаковые характеристики пыльцы. Однако,

пыльца K-гибридов (V=44,7±0,8 мкм3 х Ю3) оказалась крупнее пьшьцы гомостильных (V=34,3±l,l мкм3 х ю3). Таким образом, аллель субгена Р, определяющий размер пыльцы линии С9139, отличается от доминантного и рецессивного аллелей этого субгена у F. esculentum. Он был обозначен Рсявя-Количественный эффект замены Р на Рслзч может быть определен как разница между объемами пыльцевых зерен К- и Гд- гибридов F, (А =44,7 - 34,3=10,4 мкм3 х ю3). Доля участия полимерных генов в контроле изменчивости этого признака эквивалентна разнице между растениями, несущими одинаковые аллели главных локусов. Она может быть оценена как разница между К-растениями F. esculentum и K-гибридами Fi (F. esculentum х С9139) (А =52,2 -44,7 = 7,5 мкм3 х Ю3), или между Гд-гибридами F, (F. esculentum х С9139) и гомостильными растениями образца С9139 (А =34,3 — 27,2=7,1 мкм х Ю3).

Аллельные варианты субгенов, входящих в состав локуса S4. Локус S4 образцов С9139 и С9606 включает в себя рецессивный аллель g и доминантный аллель А, однако, аллели субгена Р различаются. Образец С9606 несет супераллель gPA (длинный столбик, крупная пыльца и длинные тычинки); образец С9139 несет супераллель gPc9i3<?A (длинный столбик, пыльца промежуточного размера, длинные тычинки). Формы F. esculentum с пыльцой промежуточного размера выделялись и ранее (Фесенко H.H., 1995), но вывода о мультиаллелизме субгена Р сделано не было. Это стало возможным благодаря сравнительному анализу эффектов локусов S и S4.

Дополнительные доказательства аллополиплондной природы

тетраплоидного F. homotropicum

Все гибриды F, F. esculentum (4х), Д х Н#4 были автофертильны, с гомостильными (Гд) цветками и опадающими (по разделительному слою) семенами. Тот же характер наследования в F] в этой комбинации наблюдался и на диплоидном уровне. Анализ гибридов расщепляющихся поколений проводился в полевых условиях, где часть гибридных растений заметно поразилась болезнями (как и линия Н#4), из-за чего фенотип некоторых из них не удалось идентифицировать.

В популяции F2 (F. esculentum (4х), Д * Н#4) проанализировано 101 растение, и зарегистрированы следующие фенотипы: 99 растений с опадающим и семенами (70 гомостильных, 25 длинностолбчатых и 4 неидентифицированных по типу цветка) и 2 - с неопределенным фенотипом по опадению (1 длинностолбчатое и 1 неидентифицированное по типу цветка).

В скрещивании F. esculentum (4х), Д х F,(F. esculentum х Н#4) получено 11 опадающих гибридов (5 с гомостильными цветками и 6 с длинностолбчатыми) (Таблица 4.7). В результате самоопыления гомостильных гибридов BClF,(F.e. (4х), Д х н#4) получено 47 опадающих растений (27 Гд : 16Д : 4?) и 2 устойчивых к опадению длинностолбчатых растения.

Самоопыление Гд-растений из этой популяции позволило выделить потомства, расщепляющиеся по типу цветка, в которых все гомостильные растения были опадающими, а все длинностолбчатые - устойчивыми к опадению (Fesenko N.N., Fesenko I.N., 2007).

Эти результаты могут быть интерпретированы следующим образом: в генотипе линии Н#4 поддерживается четыре доминантных аллеля локуса S HT, два из которых сцеплены с геном гомостилии цветка (как у диплоидных образцов F. homotropicwn), а два других - не сцеплены с генами, определяющими тип цветка (как у F. esculentum subsp. ancestrale)(¥ esenko N.N., Fesenko I.N., 2007). Такие особенности генотипа линии Н#4 согласуются с гипотезой о гибридном происхождении тетраплоидных вариантов F. homotropicum, предложенной О. Ohnishi и N. Asano (1999). Эта гипотеза, основанная на результатах анализа изоферментов, предполагает, что тетраплоидная ветвь F. homotropicum имела две предковые формы: одна из них - диплоидный F. homotropicum, другая - F. esculentum subsp. ancestrale (Ohnishi О., Asano N., 1999).

Наследование (и локализация) новых мутаций

Мутация articulation (atl). Моногенная рецессивная мутация (расщепление в F2(wt (дикий тип) х at!) - 215wt : 66atl, у_ 2=0,34; в F2(atl х wt) -I42wt : 36atl, % 2=2,16), блокирует формирование разделительного слоя на цветоножке (эпистатирует доминантный ген S HT, сцепленный с локусом S4 (гомостилия F. homotropicum))'. в популяции, расщепляющейся одновременно по atl и гаплотипу SHT-S4, все гомостильные растения мутантной формы были устойчивы к опадению семян, тогда как все гомостильные растения дикого типа были опадающими. Кроме того, мутация вызывает ряд морфологических изменений, например, формирование под цветком чешуевидной или лепестковидной структуры. Иногда один лепесток отсутствует в околоцветнике, но формируется несколько ниже, сбоку от цветоножки (Фесенко А.Н. и др., 2009). Эти данные пока не интерпретированы в рамках классической модели развития цветка (Soltis D.E. et al., 2007). Для определения локализации гена ATL также необходимы дополнительные эксперименты.

Мутация tepal-like bract (tlb) вызывает лепестковидность брактеи (кроющего листа цветка). В скрещиваниях с диким типом наследуется рецессивно моногенно (в F2 (tlb х wt) соотношение мутантов и растений "дикого типа" составило 131:376, х 2=0,19; в F2 (wt х tlb) - 25:104, 2=2,17). Сделан вывод, что ген TLB контролирует базальную границу экспрессии генов класса В (Фесенко А.Н. и др., 2005; Logacheva M.D. et al., 2008). По нашим данным, ген тесно сцеплен с локусами S4 и SHT. В F2 (tlb х SHT-S4) получено расщепление 217wt : 67 tlb: все мутанты были длинностолбчатыми и устойчивыми к опадению, все растения дикого типа — гомостильными и опадающими. Среди гибридов F2(tlb х F. esculentum subsp. ancestrale) также не

было обнаружено рекомбинантных классов по генам TLB и S! 1Т\ соотношение составило 177 wt :56 tlb.

Форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов выделена нами из популяции, расщепляющейся по мутации tlb. В отличие от ранее известной формы carpelloid (Sabitov A.M., 1989) или fagopyrum apetala2 (Lagacheva M.D. et al., 2008), эта рецессивная моногенная (в F2 соотношение мутантов и растений "дикого типа" составило 71:237, х 2=0,43) мутация вызывает замену 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов. Как и две вышеупомянутые мутации, эта форма не имеет известных аналогов на других объектах. Ее интерпретация в рамках ABC-модели развития цветка пока представляется затруднительной (Soltis D.E. et al., 2007).

5. ПРОГАМНАЯ НЕСОВМЕСТИМОСТЬ ВИДОВ РОДА

FAGOPYRUM: МЕХАНИЗМЫ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ

Несовместимость видов на стадии роста пыльцевых трубок может контролироваться как генами действующих систем самонесовместимости, так и дополнительными генами, влияние которых на внутривидовую систему несовместимости не установлено (de Nettancourt D., 1977; Li W. et al., 2010). Закономерности ггрогамной несовместимости скрещиваний между видами рода Fagopyrum в большинстве случаев соответствуют правилу "односторонней несовместимости" (Lewis D., Crow L.K., 1958) между самонесовместимыми (СН) и самосовместимыми (СС) видами. В этой главе изложены результаты экспериментов по генетическому анализу выявленных прогамных барьеров между видами гречихи.

Закономерности роста пыльцевых трубок

В иллегитимных комбинациях внутривидовых и межвидовых скрещиваний с участием длинностолбчатых (Д) растений пыльцевые трубки преодолевают расстояние, достаточное или большее, чем необходимо для преодоления пестика в легитимной (для этой пыльцы) комбинации (табл. 5.1; для сравнения см. табл. 5.2).

Пыльца F. homotropicum и F. tataricum также прорастает в длиных (Д) пестиках обоих гетеростильных видов расстояние, как минимум достаточное для преодоления столбика собственного вида (табл. 5.1, 5.3). Приведенные данные, по-видимому, свидетельствуют об отсутствии каких-либо специфических механизмов торможения пыльцевых трубок другого вида в пестиках Д-растений F. esculentum и F. cymosum. Это предположение подтвердилось в экспериментах по гибридизации F. esculentum (Д) х С9139: когда в качестве материнской формы были отобраны длинностолбчатые

растения с генетически укороченным пестиком, результативность скрещиваний в этой комбинации повысилась с 3,1 до 46,3%. Аналогичным образом, цветки длинностолбчатой (Д) формы Р. giganteum (пестик короче, чем у Д-формы Р. сутотт) завязывали семена при опылении пыльцой Р. ¡аШгкит: результативность таких скрещиваний составила 26,7 %.

Таблица 5.1 - Длина пыльцевых трубок в пестиках длинностолбчатых (Д) цветков видов гречихи (2009, 2011гг.).

$ Пыльца Размер пыльцы мкм3хЮ3 Год $ (Д-Пестик)

F. esculentum С9143 F. cymosum к-4231 F. cymosum

F. esculentum, Д 18,3...25,8 2009 951...1256 456... 1235 809...1476

2011 897...1271 621...1197 923.„1221

F. esculentum, К 37,6...59,1 2009 1744...2398 601...2143

2011 1829...2354 721. „2314

С9143 F. cymosum, Д 17,3...25,4 2009 1287.. .1479 1263.„1397

2011 1121...1416 1227...1421

С9143 F. cymosum, К 39,7...54,9 2009 1614...1849

2011 1687...2014

к-4231 F. cymosum,Д 16,8.„33,3 2009 1193...1239

2011 1154...1247

к-4231 F. cymosum,К 35,0...65,0 2009 1763...2401 2189...2414

2011 1920...2217 1975...2116

к-17 F. tataricum 10,0...21,3 2009 826...915 667...895

2011 801...912 760...872

к-108 F. tataricum 11,0...17,8 2009 576...822

2011 601.„858

С9139 F. homotropicum 22,1...35,6 2009 909...1366

2011 1007...1351

С2026 F. homotropicum 18,0...31,1 2009 1111...1315 1122...1237

2011 921...1219 900...1198

В большинстве комбинаций опыления коротких (К) пестиков Г. е$си1епШт и Р. сутотт пыльцевые трубки прорастали на очень короткое расстояние, останавливаясь в большинстве случаев в пределах рыльца (табл. 5.2). В комбинации Р. сутотт (К) х Р. еэсикпШт (Д) торможение трубок происходило в столбике. Единственная комбинация из этой серии, в которой не зафиксировано прогамных барьеров несовместимости — Р. схсик'Ыит (К) х К сутохит (Д).

В пестиках Р. Ьотсйгорк-ит и Р. 1а1апсит не зафиксировано активности известных 5-генов: пыльцевые трубки во всех случаях достигали микропиле, .или прорастали расстояние, превышающее необходимое для преодоления пестика в совместимых внутривидовых скрещиваниях (или самоопылении) (табл. 5.3); в некоторых комбинациях получены гибридные семена.

Таблица 5.2 - Длина пыльцевых трубок в пестиках короткостолбчатых (К) цветков видов гречихи (2009,2011гг.).

S Пыльца Размер пыльцы мкм3х103 Год $ (К-Г1естик)

F.esculentum С9143 F. cymosum к-4231 F. cymosum C2049 F. cvmosum

F. esculentum, д 18,3.„25,8 2009 831...886 157...429 211...649 190...277

2011 850...892 161...451 241...560 210...302

F. esculentum, К 37,6...59,1 2009 112...134 64...90

2011 105...121 72... 103

F. cymosum, к-4231, Д 16,8...33,3 2009 954...998 989... 1003 1095...1217

2011 895...922 880...1037 1148...1192

F. cymosum, С2049, Д 20,0...26,8 2009 958...1001 976...998

2011 943...1020 970...1180

F. talaricum, 2х 10,0...21,3 2009 61...96 90...144 106...118 94...126

2011 70...101 80... 127 100... 122 100...119

F. homotropicum С9139 22,1...35,6 2009 102...107 101...112 91...97

2011 100... 112 99...112 85...101

F. homotropicum С2026 18,0...31,1 2009 77...88

2011 83...98

Таблица 5.3 - Длина пыльцевых трубок в пестиках образцов F. homotropicum

(FA)(2011 г.).

cJ Пыльца Размер пыльцы мкм3х]03 $ Длина пыльцевой трубки, мкм

С9139 С9606 С2026 Н#4

F.h. C9139 22,1...35,6 861...954 1248...1312 772...855 934...954

F.h. C9606 34,6...65,8 865...921 1521.„1609 1015...1024

F.h. C2026 18,0...31,1 854...965 686...742 882...937

F.h. H#4 53,9...67,4 869... 976 1424...1615 880...920

F.tataricum k-108 11,0...17,8 922...995

F.esculentum, Д 18,3...25,8 913...1003

F.esculentum, К 37,6...59,1 779...814 1001.„1046

Генетический анализ прогамных барьеров несовместимсти

Комбинация Р. е$си1еп(ит (К) х С9139 /**. ¡ктипгоршт. Отторжение пыльцевых трубок в этой комбинации контролируется генами несовместимости гаметофитного типа, ассоциированными с локусом Б4 (гомостилия цветка) Р. ИотоКорш/т и доминантным аллелем локуса 5 К евси1епШт. Анализом расщеплений установлено, что при скрещивании Р. е.чсикпШт (К) х Р, (Р. еяайемит х С9139) признаки "гомостилия" и "опадение (ген 5ЯГ, тесно сцепленный с 54)" почти не передаются потомству; у гибридов Г. с.чси1еп1ит (Д) х Р, {Р. ехси!стит х С9139) по этим признакам наблюдаются менделевские соотношения. Таким образом, можно заключить, что пыльцевые трубки

гибридов ¥\(Р. еьсгЛепПт х С9139), проявившие несовместимость в тканях рыльца короткостолбчатых цветков Р. е.чси1епШт, несли гены Б4 и БНТ.

Комбинация Р. сутошт (К) х Р. ¡а!агкит . В комбинациях Р. ¡Шапсит х Р. сутоьит (Д, К) на диплоидном и тетраплоидном уровнях были получены длинностолбчатые и короткостолбчатые гибриды (см. главу 3). Результативность реципрокных скрещиваний оказалась нулевой: пыльцевые трубки прорастают, но останавливаются обычно в тканях рыльца (табл. 5.2). Такая же картина наблюдается при опылении пыльцой Т7. гагапсит короткостолбчатых цветков Г. gigantenm и гибридов Р^/7. giganteum х рш ¡асагкит).

Гибриды Р2 (Р. гшапсит (4х) х р. giganteum) несут два полных гаплоидных набора хромосом Р. ?Шапсит, но расщепляются по генам Р. сутозит. При опылении цветков короткостолбчатых гибридов Р2 (Р. /Шапсит (4х) х р_ giganteum) пыльцой К /Шапсит (к-108) наблюдалось торможение пыльцевых трубок в пестиках каждого из 34 проанализированных гибридных растений: ген, контролирующий несовместимость пестика К-формы Р. сутоиит с пыльцой Р. ШШгкит, не рекомбинирует (жестко сцеплен) с доминантным аллелем локуса гетеростилии.

Комбинации Р. сутохит (К) х С9139 Р. /юто&ортт и Р. ехси/ешит (К) х Р. кИапсит. В пестиках Д-цветков Р. еясикпШт и Р. сутотт пыльцевые трубки Р. ¡аШпсит и Р. Ьотокоркит прорастают расстояние, достаточное для преодоления собственного пестика при самоопылении (табл. 5.1). В Д-столбиках Р. giganteum трубки пыльцы обоих видов достигают микропиле. В К-пестиках Р. еясикпШт, Р. сутохит и Р. giganteum происходит четко выраженное торможение трубок пыльцы обоих автогамных (гомостильных) видов.

Цветки К-растений Р2 (Р. ¡аШгкит (4х) х Р. giganteum) опыляли пыльцой линии С9139. В столбиках каждого из 34 проанализированных гибридных растений наблюдалось торможение трубок пыльцы линии С9139. Таким образом, ген, контролирующий прогамную несовместимость комбинации Р. сутотт, К х Р. /юто!гор1сит, так же, как и ген, контролирующий несовместимость К-пестика Р. сутотт с пыльцой Р. ¡а/апсит, тесно сцеплен с доминантным аллелем локуса гетеростилии Р. сутохит. Следовательно, можно предположить, что несовместимость К-пестика Р. сутохит с пыльцой Р. ¡Шагкит и Р. коток оркит контролируется одним и тем же геном, и, с другой стороны, К Гаки-¡сит и Р. котокоркит несут один и тот же ген несовместимости пыльцы. Дополнительным свидетельством в пользу идентичности генов несовместимости пыльцы Р. ¡аШг1сит и Р. котокор1сит может служить прогамная несовместимость на стадии роста пыльцевых трубок комбинаций Р. вБсикпШт (К) х г, Шагкит и Р. ехсикШит (К) х С9139 Р. котоЬ'оркит.

Комбинация F. cymosum (К) x F. esculentum (Д). Влияние доминантного S-гена F. cymosum per se на совместимость К-пестика наглядно проявилось в условиях гибридной генетической среды: анализ несовместимости комбинации F. cymosum (К) х F. esculentum (Д) был проведен на тех же короткостолбчатых растениях F2 (F. tataricum (4х) х F. giganteum), что и анализ предыдущих комбинаций. Цветки межвидовых гибридов опыляли пыльцой длинностолбчатых растений F. esculentum и наблюдали рост пыльцевых трубок. В пестиках 12 из 34 изученных растений пыльцевые трубки достигали микропиле. В остальных случаях (22 растения) наблюдалось остановка роста пыльцевых трубок, в основном в тканях столбика (как и в комбинациях F. cymosum, к-4231 (К) х F. esculentum (Д) и F. giganteum (К) х F. esculentum (Д)). Таким образом, прогамная несовместимость комбинации F. cymosum (К) :< F. esculentum (Д) контролируется геном, не сцепленным жестко с локусом гетеростилии, но, по-видимому, проявляющимся только в присутствии его доминантного аллеля (короткостолбчатый цветок).

Комбинация F. giganteum (Д) х F. esculentum (ДУ). В комбинации F. cymosum (Д) х F. esculentum (К) не выявлено прогамных барьеров; в иллегитимной комбинации F. cymosum (Д) х F. esculentum (Д) пыльцевые трубки не достигают микропиле, но прорастают расстояние, большее, чем в легитимной комбинации F. esculentum (К) х F. esculentum (Д) (табл. 5.1, 5.2). Исходя из цитологической картины несовместимости иллегитимной комбинации F. cymosum (Д) х F. esculentum (Д) можно предположить, что недостаточная длина пыльцевых трубок в данном случае связана с нехваткой в пыльцевых зернах пластических веществ, необходимых для роста пыльцевых трубок, то есть ген, вызывающий торможение трубок в комбинации F. cymosum (К) х F. esculentum (Д), не экспрессируется в пестике Д-формы F. cymosum. Эта гипотеза не подтвердилась применительно к комбинации F. giganteum (Д) х F. esculentum (Д), где пыльцевые трубки прорастали расстояние 181...768 мкм, то есть меньшее, чем в комбинациях F. esculentum (К) х F. esculentum (Д) и F. cymosum (Д) х F. esculentum (Д). Это можно связать с активизацией гена, контролирующего несовместимость комбинации F. cymosum (К) х F. esculentum (Д). В случае с F. cymosum экспрессия этого гена, по-видимому, зависит от присутствия в генотипе доминантного аллеля локуса гетеростилии, то есть этот 5-ген утратил элементы, необходимые для его самостоятельной экспрессии. Поэтому его экспрессию в пестике Д-формы F. giganteum можно объяснить только тем, что недостающие для этого компоненты в данном случае получены от F. tataricum.

Пыльца длинностолбчатых гибридов F? (Гд1 х С9606) несовместима с пестиком короткостолбчатой формы F. cymosum. F. homotropicum (линии С9139 и С9606) несет рецессивный аллель локуса гетеростилии, гипостатичный по отношению к гену S4, контролирующему гомостилию цветка. Ген S4 ассоциирован с одним из аллелей утраченной гаметофитной системы,

проявляющимся при опылении пыльцой этого вида короткостолбчатых цветков К esculentum и F. cymosum. Для ответа на вопрос, несет ли F. homotropicum второй (экспрессирующийся в пыльце Д-формы F. esculentum) аллель реликтовой системы несовместимости, были получены гибриды F2 (F. esculentum (линия Гд1) х С9606). Поскольку ген гомостилии цветка линии Гд1 аллелен локусу гетеростилии (5) F. esculentum, Д-растения, выщепляющиеся в F2 (Гд1 х С9606), могли получить рецессивный ¿-аллель только от F. homotropicum. Пыльца этих Д-растений тестировалась на совместимость с пестиками K-форм F. cymosum и F. esculentum. Всего протестировано 11 растений. Пыльца каждого из них успешно прорастала K-пестик F. esculentum, но прекращала рост в K-пестике F. cymosum. Таким образом, по-видимому, F. homotropicum также несет 5'-ген, идентичный по специфичности гену, вызывающему несовместимость пыльцы Д-формы F. esculentum с К-пестиком F. cymosum.

Обозначения генов, контролирующих прогамную несовместимость видов

В изложенных экспериментах было выявлено два гена несовместимости, которые не являются аллелями одного локуса, но, по-видимому, представляют собой компоненты одной системы несовместимости, которая предположительно была утрачена в процессе эволюции и заменена гетеростилией. Ген, контролирующий несовместимость комбинаций F. cymosum (К) х /г tataricum, F. cymosum (К) х С9139 F.homotropicum и F. esculentum (К) x C9139 F. homotropicum полностью функционален. Экспрессия второго гена, контролирующего прогамную несовместимость комбинации F. cymosum (К) х F. esculentum (Д), зависит от наличия в генотипе первого гена. По-видимому, элементы, отвечающие за самостоятельную экспрессию этого S-гена, были утрачены, но сохранились фрагменты, определяющие специфичность реакции несовместимости.

Таким образом, эти гены реликтовой гаметофитной системы несовместимости можно обозначить S1 и S2, с указанием их видовой принадлежности. Это будет выглядеть следующим образом: S!C, S2c — гены Si и S2 в геноме F.cymosum-, S!T- ген S, в геноме F. tataricum; Sie и S2e — гены S/ и S2 в геноме F. esculentum", Sm, S2h — гены Sj и S2 в геноме F.homotropicum.

Характеристики совместимости пыльцы и пестика амфидиплоида F. giganteum в межвидовых и внутривидовых скрещиваниях

Амфидиплоид F. giganteum поддерживается в коллекции ВИР с момента его появления (Кротов A.C., Драненко Е.Т., 1973) как самофертильный гомоморфный (Д-форма) образец. Его короткостолбчатый аналог,

синтезированный скрещиванием F. tataricum х F. cymosum (К) (Fesenko I.N., 2005), также оказался самофертильным. Завязываемость семян в легитимных и иллегитимных скрещиваниях между растениями F.giganteum существенно не различалась.

Ген Sit неактивен в пыльце F. giganteum. Самофертильность короткостолбчатой формы амфидиплоида выглядит неожиданной на фоне полной несовместимости короткого пестика F. cymosum с пыльцой F. tataricum. Поскольку в F. giganteum представлены полные наборы генов обоих видов, то необходимо признать, что, или ген несовместимости K-пестика F. cymosum, или ген несовместимости пыльцы F. tataricum должен быть инактивирован в геноме F. giganteum. Поскольку совместимость комбинации F. giganteum (К) х F. tataricum оказалась нулевой, можно заключить, что ген несовместимости со стороны пестика у амфидиплоида не инактивирован. Следовательно, инактивируется ген несовместимости пыльцы, полученный амфидиплоидом от F. tataricum.

В качестве дополнительного подтверждения инактивации гена несовместимости пыльцы, полученного амфидиплоидом от F. tataricum, можно рассматривать результаты сравнения цитологических картин роста пыльцевых трубок, полученных в комбинациях F. esculentum (К) х F. tataricum и F. esculentum (К) х F. giganteum (Д). Поскольку в первом случае происходит торможение пыльцевых трубок в пределах рыльца, а во втором — беспрепятственное прорастание, можно заключить, что ген, вызывающий реакцию несовместимости в первом случае (пыльца F. tataricum), инактивирован в пыльце, несущей полные наборы генов F. tataricum и F. cymosum (F. cymosum не несет генов, препятствующих прорастанию его пыльцы в пестике короткостолбчатой формы F. esculentum).

Ген Syr, по-видимому, активен в пыльце F. giganteum. Инактивирование гена несовместимости пыльцы F. tataricum (Sir) в геноме F. giganteum хорошо объясняет совместимость комбинации F. esculentum (К) х F. giganteum (Д), и отчасти объясняет самосовместимость короткостолбчатой формы F. giganteum. Однако, в таком случае, абсолютная несовместимость комбинации F. cymosum (К) х f_ giganteum (Д) становится объяснимой, только если предположить, в пыльце F. giganteum (Д) активен ген S2c■ В пестике этот ген функционален только в присутствии гена Sic', в пыльце длинностолбчатой формы F. cymosum этот ген, очевидно, также не активен. Возможно, его активизация в пыльце F. giganteum связана с присутствием в ее генотипе гена несовместимости F. tataricum (Sir).

С чем связана совместимость комбинаций F. giganteum (К) х F. giganteum (Д) и F. giganteum (К) х F. giganteum (К) (включая самоопыление)? Высокая совместимость этих комбинаций отчасти противоречит некоторым ранее изложенным данным, согласно которым в пыльце Д-растений и пестике К-

растений амфидиплоида экспрессируется ген S;C, и К-растения F. giganteum не должны завязывать семена при опылении пыльцой Д- и, вероятно, К-растений F. giganteum. Однако, результативность таких комбинаций достаточно высока. Цитологическая картина роста пыльцевых трубок отчасти проясняет ситуацию: большинство трубок, как правило, прекращают рост в рыльце или в столбике, а микропиле достигают одна или две. Вероятно, в этом случае имеет место нестабильность функционирования генов несовместимости: в большинстве трубок эти гены срабатывают, но отдельные трубки почти всегда успешно прорастают.

Пыльца некоторых растений BCjFS (F. cvmosum х F. ximnteum) избирательно прорастает в столбиках К-формы F. cymosum. Комбинация F. cymosum (К) х F. giganteum (Д, К) несовместима. В качестве популяции, расщепляющейся по генам F. tataricum, в эксперименте были использованы гибриды BCiFj (F. cymosum х F. giganteum), несущие приблизительно 12% генетического материала F. tataricum, но представляющие собой фактически потомство анализирующего скрещивания, поскольку два набора хромосом F. cymosum здесь a priori не участвуют в межвидовой рекомбинации. Пыльцой длинностолбчатых растений BC,F](F. cymosum х F. giganteum) опыляли короткостолбчатые цветки F. cymosum, после чего проводили наблюдение роста пыльцевых трубок. Трубки пыльцы некоторых из этих растений избирательно тормозились в рыльце короткого пестика F. cymosum. Это очевидно свидетельствует о гаметофитном контроле несовместимости комбинации F. cymosum (К) х F. giganteum, причем, учитывая результаты вышеизложенных экспериментов, можно предполагать, что торможение трубок в данном случае связано с действием гена S2c, который активен в пыльце, несущей ген S]T.

Фрагменты реликтовой гаметофитной системы несовместимости в

роде Fagopyrum. Эволюционные взаимосвязи между разными

системами самонесовместимости (обсуждение)

Ген SL. Резкое нарушение в передаче потомству признаков «обязательное опадение семян» и «гомостилия», наблюдаемое в двух вариантах комбинации F. esculentum (К) х F,(F. esculentum х С9139), наряду с цитологическими картинами роста пыльцевых трубок, свидетельствует о наличии эффективного селективного процесса, связанного с отторжением пыльцевых трубок, несущих доминантные гены S4 и SHT дикого вида F. homotropicum. При этом пыльцевые трубки, несущие рецессивные аллели этих генов, растут в нормальном режиме. Такой гаметофитный эффект полностью объясняет фактическую несовместимость комбинации F. esculentum (К) х F. homotropicum. Гаметофитный эффект совершенно отсутствовал при опылении цветков Д-растений. Установлено, что несовместимость комбинации F. esculentum (Д) х

С9139 полностью определяется морфологическим несоответствием родительских форм по длине пестика и размеру пыльцы.

Можно предположить, что выявленный нами гаметофитный ген, ассоциированный с локусом 54, является реликтом предковой системы несовместимости. Вероятно, это первая такая находка в гетеростильных таксонах, позволяющая напрямую увязать филогенез гетеростилии с другими системами несовместимости. По-видимому, тот же ¿'-аллель реликтовой гаметофитной системы активен в пыльце Шапсит и в пестике К-формы Г. сутояит, у которого функциональный ген несовместимости, вызывающий отторжение пыльцы К ¡Шапсит и Р. ЪотоКорюит, сцеплен с доминантным аллелем локуса гетеростилии (табл. 5.4).

Ген Б?. Второй ген несовместимости выявлен анализом прогамного барьера в комбинации К сутозит (К) х Р. еясикпШт (Д). Этот ген не сцеплен с локусом гетеростилии К сутоБит, но проявляется только на фоне доминантного аллеля гетеростилии: картина роста пыльцевых трубок в комбинации К сутохит (Д) х Г. еясик'п/ит (Д) аналогична таковой во внутривидовых иллегитимных скрещиваниях (табл. 5.1). Этот ген функционален в пыльце К '¿¡£ап1еит, по-видимому, за счет присутствия там гена 5,7- В то же время, ген не проявляет активности в пыльце Р. giganteum.

Таблица 5.4 - Фрагменты 5-аллелей реликтовой системы несовместимости в геномах видов Fagopyrum.

Вид Локусы, сцепленные с фрагментами реликтовых 5-генов 5/ Локусы, сцепленные с фрагментами реликтовых 5-генов

I, ¡2 I, 12

К езсикШит, Д $2-12Е

/<". езсикШит, К вРА ?

К 1юто1гор1сит Б4 ^¡-¡¡Н 51-12Н $2-1 2Н

К сутозит, К СРА 5,-11 с ? 52-1,с 32-12С

К 1а1аг1сит 5

/¡, ¡2 - компоненты 5-локуса гаметофитной системы, контролирующие специфичность реакции несовместимости со стороны пестика и пыльцы, соответственно * предполагаемый локус

Являются ли эти гены фрагментами одной и той же утраченной системы несовместимости? Во-первых, если предположить, что нет, то придется постулировать существование двух независимых систем несовместимости, по одному фрагменту каждой из которых сохранилось до настоящего времени. Во-вторых, эти гены явно способны результативно взаимодействовать между собой: ген 52С экспрессируется в пестике К суто.чит только в присутствии гена с, а в пыльце К giganteum - в присутствии гена Б, г-

Первая попытка разработать универсальную концепцию, объединяющую различные системы несовместимости, принадлежит Д. Льюису (1954), который дополнил формулу GPA супергена гетеростилии компонентами 5"-локуса мультиаллельных гомоморфных систем несовместимости I¡ и /2, контролирующими соответственно специфичность реакции несовместимости пестика и специфичность реакции несовместимости пыльцы. Такая формула супергена гетеростилии вошла в генетическую литературу (Richards A J., 1986), в т.ч. и по гречихе (Sharma K.D., Boyes J.W., 1961). Однако, в экспериментах с Fagopyrum esculentum не было обнаружено каких либо генов, контролирующих собственно "реакцию несовместимости", характерную для видов с гомоморфной спорофитной и гаметофитной системами. С использованием линий, различающихся по размеру пыльцы и длине пестика была подтверждена морфологическая гипотеза X. Шох-Бодмер (1934), допускающая самодостаточность диморфизма по длине/плотности пестика и размеру пыльцы для поддержания несовместимости самоопылений и иллегитимных скрещиваний (Fesenko N.N., 1995).

Данные, представленные в настоящей работе, свидетельствуют о возможности унификации понятия "5-локус" в гетероморфной и гаметофитной системах. Гаметофитные гены, проявляющиеся в скрещиваниях между видами рода Fagopyrum, скорее всего являются реликтами, доставшимися этим видам от их общего предка. Остатки утраченной гаметофитной системы послужили своеобразным каркасом для формирования гетеростилии, а также стали компонентами репродуктивной изоляции между вновь сформировавшимися видами гречихи.

6. ЭВОЛЮЦИОННЫЕ СОБЫТИЯ В РОДЕ FAGOPYRUM

(ОБСУЖДЕНИЕ)

Предположительная последовательность событий на ранних

стадиях дивергенции F. esculentum и F. homotropicum

Очевидно, что комплементарные гены гаметофитной несовместимости пыльцы и пестика, проявляющиеся в межвидовых скрещиваниях F. esculentum х F. homotropicum, были компонентами единой гаметофитной системы, которая принадлежала общей для обоих видов предковой форме. В ходе дальнейшей эволюции, приведшей к формированию современных видов Fagopyrum, гаметофитная система была утрачена и заменена гетероморфной системой несовместимости F. esculentum. В другом случае, потеря самонесовместимости привела к формированию самофертильного вида F. homotropicum.

Чтобы понять, каким образом фрагменты одного и того же 5-аллеля реликтовой гаметофитной системы оказались в геномах двух разных видов, и стали компонентами системы репродуктивной изоляции между этими видами, можно попытаться восстановить ход событий, связанных с эволюцией F.

esculentum и F. homotropicum на основе генетической изменчивости общей предковой формы.

Начало нового витка видообразования, завершившегося появлением этих видов, было связано, по-видимому, с тем, что дальнейшее функционирование гаметофитной системы несовместимости в популяции предковой формы стало невозможным. Потеря системы несовместимости меняет направление эволюции рекомбинационной системы. При перекрестном опылении селективными преимуществами обладают генные комплексы с хорошей комбинационной способностью. При переходе к самоопылению, под давлением отбора на инбредную жизнеспособность, закрепляются генетические системы, способные нормально функционировать в условиях гомозиготности большинства локусов. Возврат к перекрестному опылению после адаптации к самоопылению считается маловероятным (Jain S.K., 1976; Takebayashi N.. Morrell P.L., 2001).

Что же позволило этой популяции остановить необратимые изменения в своей генетической системе и стать основателем двух видов с противоположными системами размножения? Разрушение гаметофитной системы несовместимости скорее всего было связано с потерей всех 5-аллелей, кроме двух. В такой ситуации, следующее поколение сформировали растения, мутантные по локусу несовместимости. Если судить по результатам этой работы, такие растения несли мутацию, вызывающую потерю контроля несовместимости со стороны пестика (рис 6.1).

Очевидно, что уже в следующем поколении все растения в такой популяции были гетерозиготны по гену самофертильности. Потомство этих растений состояло из двух принципиально различных по реакции на длительный инбридинг классов генотипов — гомозигот и гетерозигот по S-локусу. При самоопылении гомозиготы по мутантному 5-аллелю в течении нескольких поколений происходила гомозиготизация большинства локусов, что, скорее всего, вызывало сильную инбредную депрессию. В потомстве от самоопыления гетерозигот поддерживался и второй (не мутантный) ¿'-аллель (рис 6.1). Это, очевидно, позволяло более длительное время поддерживать в гетерозиготном состоянии по крайней мере один, сцепленный с локусом несовместимости, участок генома, и тем самым смягчало последствия быстрой гомозиготизации остальных локусов.

Наличие генетического механизма, способного служить частичной заменой перекрестному опылению, по-видимому, избавило популяцию от необходимости немедленно адаптироваться к инбридингу, и, таким образом, позволило сохранить потенциал для разнонаправленной эволюции рекомбинационной системы и создало условия для постепенной дифференциации по инбредной жизнеспособности. По-видимому, такая дифференциация стала основным механизмом видообразования. Генотипы, избавившиеся от инбредной депрессии, стали основателями автогамного вида

Л Ното&ор1сит, а генотипы, не утратившие зависимость от гетерозиса — основателями перекрестноопыляющегося вида Р. езси1епШт с гетероморфной системой несовместимости.

Мутация Si(hh)—>-.Vi(/ /') трапслокацня S-локуса в группу сцепления №4

F. homotropicum

S>(, h)/S2(nh)/S> (i: I2)/Sl(i I Ii)

[S\{i h)=S4~\

S\{hIi)!S2{hh)

Мутация

S\(hh)ISi{iJi)

Самоопыление

S\{I\h)ISiQ\h) S2(hl2)/Sl(h/2)

Формирование ( гетеростилии

F. esculentum

S\{I\l2)ISi{isk) S2(hh)/S2(hh)

Рис. 6.1. Схема инициации видообразования F. esculentum и F. homotropicum, основанная на данных генетического анализа прогамных барьеров, действующих на стадии роста пыльцевых трубок.

Функциональные фрагменты гаметофитной системы несовместимости послужили своеобразным каркасом для накопления мутаций, формирующих гетероморфизм цветков (рис 6.1). Считается, что первым шагом эволюции гетеростилии, как правило, становится мономорфная геркогамия (пестик, как правило, становится несколько длиннее тычинок) (Charlesworth D., Charlesworth В., 1979; Lloyd D.G., Webb C.J., 1992). По-видимому, в популяции, состоящей из гомозигот и гетерозигот по 5-локусу, возникновение геркогамии, увеличивающей вероятность перекрестного опыления, было более значимым (и вероятным) для гомозигот. Таким образом, фрагмент популяции, в котором аккумулировались плюс-аллели модификаторов, влияющих на длину пестика рецессивной гомозиготы, стал частью системы, эволюционировавшей в направлении реставрации аллогамии. Логично предположить, что следующим шагом стало возникновение реципрокной геркогамии для оптимизации

переноса пыльцы (см. Lloyd D.G., Webb C.J., 1992). Форма с пестиком короче тычинок могла контролироваться только генами, сцепленными с немутантным аллелем 5-локуса, или проявляющимися только в присутствии этого гена. В частности, такая схема объясняет, почему длинностолбчатая форма обычно контролируется рецессивной гомозиготой по S-локусу, а короткостолбчатая -гетерозиготой Ss, но полностью не исключает и обратный вариант, также иногда встречающийся (OrndufF R., 1979).

Изложенная схема вполне согласуется с экспериментальным материалом, полученным при изучении наследования разнообразных гомостильных форм гречихи. Так, известно не менее четырех полимерных генов, регулирующих длину пестика длинностолбчатой формы F. esculentum (Fesenko N.N., 1989). Минус-аллели аналогичных генов обусловливают гомостилию цветка автогамного вида F. tataricum (см. главу 3). В геноме F. esculentum идентифицировано два гена-модификатора, регулирующих длину пестика короткостолбчатой формы: плюс-аллели одновременно двух этих генов превращают короткий пестик в длинный даже при наличии доминантного аллеля субгена G (Fesenko N.N., 1989).

Поскольку о генах, контролирующих гетероморфизм, на молекулярном уровне практически ничего неизвестно, сложно определенно судить о взаимосвязи мутаций, влияющих на функциональность гаметофитных генов и мутаций, изменяющих соотношение длины пестика и тычинок. Однако, имеющиеся экспериментальные факты позволяют сделать некоторые предположения. Так, длинностолбчатые формы всех изученных видов Fagopyrum полностью пропускают трубки достаточно крупной пыльцы (в том числе в межвидовых комбинациях). Мелкая пыльца прорастает в них расстояние, превышающее необходимое для преодоления столбика своего вида в легитимной комбинации. На примере F. esculentum показано, что сокращение длины пестика длинностолбчатой формы за счет накопления минус-аллелей модификаторов, или некоторое увеличение размера пыльцы, приводит к многократному повышению совместимости скрещиваний, в том числе межвидовых. Таким образом, можно предположить, что мутация, инактивирующая функцию несовместимости пестика в рамках гаметофитной системы одновременно создает преадаптацию для возникновения длинностолбчатой формы цветка, формирование которой происходит путем накопления плюс-аллелей модификаторов, функциональных на фоне этой мутации. Эту гипотезу, однако, можно поставить под сомнение на том основании, что в пестике длинностолбчатой формы F. giganteum, по-видимому, экспрессируется ген, препятствующий прорастанию пыльцы длинностолбчатой формы F. esculentum. Таким образом, существующих экспериментальных данных недостаточно для исчерпывающего ответа на этот вопрос.

Возникновение автогамного вида F. homotropicum было связано с транслокацией аллеля Sj в другую группу сцепления (№4), и мутацией S;(///2)—»

0/6), вызывающей потерю контроля несовместимости пестика. Эта транслокация - первый идентифицированный элемент структурной гетерозиготности, вероятно способствовавший адаптации вида к самоопылению.

Предположительная последовательность событий на ранних стадиях дивергенции К супитип и Р. ¡Шапсит

В наших экспериментах получено достаточно информации, чтобы составить представление и о дивергенции двух других конгруентных видов - Р. сутохит и Р. ¡Шаг¡сит. Установлено, что Р. Шапсит не несет функциональных аллелей локусов, гомологичных субгенам С7 и А (Ре$епко 1.1\'., 2005), но несет функциональный, хотя и отличающийся от соответствующего доминантного аллеля Р. сутоэит, аллель субгена Р (Фесенко И.Н., Лазарева Т.Н., 2011). Кроме того, Р. ?Шапсит несет ген несовместимости пыльцы, взаимодействующий с геном несовместимости пестика, сцепленным с доминантным аллелем локуса гетеростилии сутояит. Таким образом, гипотетический аналог локуса гетеростилии в геноме Р. ¡а1апсит имеет следующий вид: gPiailÍ2 ( = gP^clSlт)■ Очевидно, что здесь есть две позиции, которые явно противоречат предположению о происхождении Р. 1а1апсшп напрямую от Д-формы Р. супю.чит или от Д-формы их общего предка. Это доминантный аллель Р, и экспрессирующийся в пыльце Р. Ш!апсит ген, вызывающий прогамную несовместимость скрещивания Р. сутоэит (К) х Р. tatar¡cum.

Вид Р. сутозит несет еще один ген несовместимости, активность которого зависит от присутствия в генотипе доминантного аллеля гетеростилии. По-видимому, такая ситуация возникла в результате транслокации второго аллеля утраченной системы несовместимости, в результате которой сохранились фрагменты этого 5-гаплотипа, определяющие специфичность реакции несовместимости, но утрачены фрагменты, отвечающие за его экспрессию.

Вид Р. ¡аШпсшп скорее всего отделился от популяции общей предковой формы раньше остальных видов, и это произошло в результате мутации —* (///?), вызывающей потерю контроля несовместимости со стороны пестика. Минимальная молекулярная изменчивость этого вида подтверждает предположение, что в его эволюционной истории имел место эффект основателя (Уатапе К. ег а1., 2004; Лазарева Т.Н. и др., 2007; Лазарева Т.Н., Фесенко И.Н., 2010). У Р. /агапсит выявлено 4 мутации с морфологическими эффектами: две из них влияют на форму семян, две другие блокируют развитие функционального разделительного слоя на плодоножке. Важно отметить, что ни одна из перечисленных мутаций, включая ^¡{¡¡¡у)—^ 5, '(¡¡/у), не участвовала в формировании вида Р. сутовит, который несет другую мутацию, определяющую форму зерна, и не несет мутаций (рецессивных генов),

вызывающих устойчивость к опадению. То есть, мутация Sjiljl^—* S1 (¡¡h), по-видимому, не закрепилась в популяции, ставшей основой для видообразования F. cymosum. Это может служить еще одним свидетельством в пользу возникновения F. tataricum по схеме квантового видообразования, вероятно, с географическим отделением от исходной популяции.

Эволюция F. cymosum сопровождалась увеличением генома, одним из элементов которого стала транслокация S-локуса. Так же, как и в случае с F. esculentum, перспективы дальнейшего воспроизводства популяции с двумя аллелями гаметофитной системы несовместимости, очевидно, были связаны с генетическими изменениями, вызывающими автофертильность. Однако, частичная потеря несовместимости в этом случае была вызвана другими причинами. Поскольку в итоге (то есть, у современного вида F. cymosum) одна из гетеростильных форм (длинностолбчатая), по-видимому, не несет функционирующих 5-генов (ген S?c не активен в отсутствии других 5-генов), а вторая (короткостолбчатая) - несет два активных 5-гена, можно предполагать, что транслокация Sy в другую группу сцепления вызвала появление ряда S-генотипов, из которых отбором было подхвачено два: SjS2*h S2* и — S*!~ S2*.

По-видимому, генотип S,S2 */—S2 * был подхвачен отбором, поддерживающим хотя бы частичную гетерозиготность. При его самоопылении выщеплялся генотип —S2*/~S2*, менее устойчивый к длительному инбридингу, и более склонный к накоплению мутаций, вызывающих частичную геркогамию (превышение пестика над уровнем тычинок), позволяющую увеличить вероятность перекрестного опыления (см. Lloyd D.G., Webb С.J., 1992). В дальнейшем произошло накопление мутаций, формирующих короткостолбчатый тип цветка для оптимизации переноса пыльцы.

Независимость эволюции гетеростилии F. esculentum и F. cymosum

Примечателен факт, что доминантные аллели супергена гетеростилии GPA F. esculentum и F. cymosum ассоциированы, по-видимому, с одним и тем же аллелем реликтовой гаметофитной системы. Результаты анализа двух видов, конечно, вряд ли могут составить репрезентативную картину. Однако, возможно, что именно вокруг этого аллеля были состредоточены гены, предопределившие возможность формирования доминантного аллеля супергена цветка.

Картина распределения реликтовых аллелей несовместимости между современными автогамными (гомостильными) и перекрестноопыляющимися (гетеростильными) видами Fagopyrum (с учетом уровней филогенетической близости между тми) позволяет сделать заключение, что гетеростилия F. esculentum эволюционировала независимо от гетеростилии F. cymosum, хотя начало обоим эпизодам ее эволюции положил коллапс гаметофитной системы несовместимости, по-видимому, одной и той же предковой формы.

Остается открытым вопрос, с чем связаны различия в степени филогенетического родства между разными видами (особенно если исходить из того, что эволюция всех четырех видов (Р. еиайепшт, кото1горкшп, Р. сутонит и Р. ¡аШгкит) началась одновременно)? По-видимому, популяция, ставшая основой для формирования Р. ехсикпШт и Иотокоркит, оказалась географически изолированной от популяции, в которой возникли К сутояит и Р. ¡Шапсит. Причем разделение между Р. ехсикпШт и Р. Иотокоркит произошло уже после наиболее значительных событий, связанных с увеличением генома за счет сегментной полиплоидии (геномы Р. е$си1епШт и Р. Иотокоркит примерно в 2 раза крупнее генома К ¡Шапсит, который в данном случае можно считать исходным вариантом). В нашей работе также идентифицирована одна транслокация, которая произошла во время или после разделения Р. еясгйепШт и Р. Иото(горкит, и затронула ген Я4 (группа сцепления №4), контролирующий гомостилию цветка Р. Иотс^горкит и ассоциированный с тем же аллелем реликтовой гаметофитной системы, что и доминантный аллель локуса гетеростилии (группа сцепления №1) (см. Главу 4).

Геном Р. супккит примерно в 1,5 раза крупнее генома Р. Шаг кит. С одной стороны, это свидетельствует о том, что эти виды существуют независимо друг от друга дольше, чем Р. ехсикпШт и Р. \юто1горкит. С другой стороны, скорость сегментной полиплоидизации генома Р. сутояит оказалась приблизительно вдвое ниже, чем у Р. езси1епШт (и Р. ¡ютокоркит). В настоящее время не представляется возможным идентифицировать причины таких различий.

7. РЕЗУЛЬТАТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРАКТИЧЕСКОГО

ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕЖВИДОВОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

ГРЕЧИХИ.

Использование К Ьопкнгоркит в селекции К е.чси1епиип

Вид Р. Ъотокоркит рассматривался как перспективная основа для создания автогамного сорта гречихи обыкновенной. Сообщений о получении автогамного материала, конкурентоспособного в сортоиспытании, пока нет. Но исследования дикого вида дали некоторые результаты. Было установлено, что соцветие Р. ¡ютокоркит характеризуется дружностью цветения и созревания, отцветая вдвое быстрее соцветия гречихи обыкновенной (Фесенко Н.В. и др., 2009). Дикий вид характеризуется повышенной экологической пластичностью формирования плода: плод формируется 13-26 дней (Фесенко А.Н., 2004); для сравнения, у сортов Р. ехсикп/ит - 20-21 день (Фесенко Н.В., 1983).

Нами разработана методика межвидовой гибридизации, что позволило в большом объеме получить межвидовые гибриды Р. ехсикпШт с К Иотокоркит (образец С9139): для скрещиваний с диким видом из сортовых популяций визуально отбирались растения с укороченным пестиком, что позволило существенно повысить эффективность межвидовой гибридизации.

Межвидовые гибриды наследовали многие нежелательные признаки и характеристики дикого вида, в том числе замедленное развитие на ранних стадиях, мелкозерность и т.д. Детерминантные растения Р2 (Р. е.чси1епШт х С9139) в основной массе отличались резко сниженным (до 1-2) числом соцветий на побегах (см. главу 4). Для ускорения селекционной проработки этого материала нами был разработан метод отбора, основанный на конкуренции межвидовых гибридов с растениями индетерминантного сорта Молва при выращивании в смеси. Семена с детерминантных растений высевали на изолированных делянках, и проводили выбраковку потомства, полученного от переопыления с индетерминантами. Среди детерминантных растений проводили отбор длинностолбчатых, формировавших семена только при опылении пыльцой гомостильных растений, что способствовало рекомбинации аллелей, обеспечивающих повышенную устойчивость к инбредной депрессии и интенсифицировало формообразовательный процесс. Три раунда такого отбора позволили создать материал, сочетающий культурный габитус (не характерный для непроработанных межвидовых гибридов) с ускоренным ритмом развития, повышенной инбредной жизнеспособностью и сокращенной продолжительностью вегетационного периода.

На основе полученного селекционного материала был создан дружносозревающий сорт Темп, в настоящее время допущенный к использованию в Центрально-Черноземном и Северо-Кавказском регионах (патент на селекционное достижение №5456).

Создание селекционного материала на основе наследственной

изменчивости Г. Шапсит, К сутомип и К ^аШеит

Характеристики видовой формы Р. ыеаМеит К го К) у. Этот амфидиплоид отличается высокой биологической продуктивностью, самофертилен, отселектирован на устойчивость к осыпанию и устойчив к полеганию (укороченность нижних междоузлий и толстый жесткий стебель дают такой эффект). Его гигантизм проявляется ближе к концу вегетационного периода; на ранних стадиях развития (от всходов до 4-5 настоящих листьев) рост и развитие происходят замедленно, хотя и чуть быстрее, чем у отцовского вида Р. сутохит (4х=32). Межгеномные взаимодействия при аллополиплоидии обеспечивают стабильное воспроизводство гетерозиса и поддержание высокой жизнеспособности в течение ряда поколений. Оборотной стороной такой стабильности является невозможность быстрого эффективного отбора, исправляющего недостатки морфологии этого растения (замедленное развитие на ранних стадиях и позднеспелость, зерно со скульптурой на оболочке и др.).

Скрещивания Р. 1Шаг1сит (4х=32) х Р. '¿1<гап1еит позволили инициировать формообразовательный процесс. Гибриды Б] были мощные, самофертильные, но с признаками генетической несбалансированности (пониженная фертильность пыльцы, массовое отмирание завязей). Гибриды Р2

и последующих поколений отличались большим генетическим разнообразием, чем родительские формы.

Схема работы предполагала создание условий для спонтанной гибридизации этих гибридов с /\ giganteum, Р. суто$ить а также гибридами Р. giganteum * Р. сутохит. Спонтанные гибриды росли среди остальных растений на делянках до уборки, чтобы их пыльца могла участвовать в формировании семенного потомства соседних растений. Таким образом, линии с частично открытой рекомбинационной системой служили основным источником жизнеспособных генотипов. В таких семьях ежегодно проводился отбор на скороспелость и технологические качества зерна. Это позволило получить гибридные потомства поздних поколений (Рп-.-Рн) с различным габитусом (от позднеспелого до более скороспелого, чем исходные линии Р. 1а1апсит (4х=32)) и морфотипом зерна (от крупного грубого зерна giganteum-типa, до мелкого зерна 1а1апсит-тииа, включая гладкозерный). Лучшие потомства в настоящее время проходят предварительное испытание на урожайность: по этому показателю они вполне сравнимы с возделываемыми сортами гречихи.

Рециггрокные скрещивания Р. сутонит х /г. ятаШеит (4х=32) позволили получить формы с семенами сутояшп-типа, сходные с giganteum по метамерийному строению вегетативной сферы. В связи с низкой фертильностью гибридов Р[(/\ суточит х /г giganteum), для получения большой популяции, расщепляющейся по числу вегетативных узлов и форме семян (сутозшп-тип семян контролируется одним рецессивным геном, см. Главу 3), были получены популяции Р2 ([ВС,Р2 (Р. суто.тт х Г. giganteum)] х Р. giganteum). Каждая из этих популяций при анализе разделялась на два фенотипических класса по форме зерна (сутоБшп-тип и giganteum-тип), каждый из которых анализировался по числу узлов в зоне ветвления главного побега и ветвей. В одной из гибридных популяций число вегетативных узлов на главном побеге варьировало от 9 до 19 (среднее значение 14,7±0,19) для выборки с зерном giganteum-типa, и от 10 до 18 (среднее значение 14,0±0,28) -для выборки с зерном сушоБиш-типа; Среднее число узлов в контрольной популяции F.giganteum составило 14,6±0,42 (варьирование — от 11 до 19). Таким образом, получены формы с семенами сушовит-типа, аналогичные К giganteum по продолжительности вегетационного периода. Эти формы включены в программу гибридизации, направленную на создание более скороспелых форм гречихи с зерном сушозиш-типа.

выводы

1. Гомостилия цветка морфологически различных образцов С9139 и С9606 F. homotropicum контролируется локусом S4 (группа сцепления №4), который включает в себя рецессивный аллель g (длинный пестик) и доминантный аллель А (длинные тычинки). У линии С9606 этот суперген включает доминантный аллель Р. Линия С9139 несет аллель Ротч, отличающийся по влиянию на размер пыльцы как от доминантного, так и от рецессивного аллелей субгена Р, характерных для гетеростильных популяций F. esculentum.

2. F. tataricum несет рецессивные аллели g и а, и функциональный аллель Р^ отличающийся по влиянию на размер пыльцы от доминантного аллеля Р F. cymosum. Проявление аллеля g F. tataricum модифицировано минус-аллелями полигенов, влияющих на длину пестика. На экспрессию элементов синдрома гетеростилии гибридов F. tataricum с F. cymosum заметно влияет цитоплазма.

3. Суперген цветка у представителей рода Fagopyrum ассоциирован с функциональными генами несовместимости гаметофитного типа, проявляющимися в межвидовых скрещиваниях. Исходя из этого: а) формула Д. Лыоиса, в которой были объединены идентифицированные компоненты S-локуса гомоморфных систем несовместимости (/]/2) и супергена гетеростилии (G, Р и А), впервые получила экспериментальное подтверждение; б) гетеростилия возникла в роде Fagopyrum Mill, взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости.

4. Доминантные аллели локуса гетеростилии F. cymosum и F. esculentum ассоциированы с одним и тем же аллелем утраченной гаметофитной системы (5/); тот же аллель присутствует в геноме F. homotropicum (в составе локуса S4) и F. tataricum: у обоих автогамных видов ген S, активен только в пыльце. В пестиках длинностолбчатых цветков F. esculentum и F. cymosum не обнаружено активности известных S-генов.

5. Несовместимость пестика короткостолбчатой формы F. cymosum с пыльцой длинностолбчатой формы F. esculentum контролируется геном S2c, рекомбинируюшим с локусом гетеростилии, но проявляющимся только на фоне его доминантного аллеля. Этот ген - второй аллель утраченной гаметофитной системы несовместимости. Ген (аллель) S2c F. cymosum доминирует над геном (аллелем) Sn-F. tataricum в диаллельной пыльце амфидиплоида F. giganteum.

6. Виды F. esculentum и F. homotropicum начали формироваться одновременно (после утраты функциональной гаметофитной системы самонесовместимости), и разделились в результате дифференциации предковой популяции по инбредной жизнеспособности. Система из гомозигот и гетерозигот по 5-локусу стала "каркасом" для накопления мутаций, формирующих гетеростилию.

7. Эволюция гетеростильного вида F. cymosum сопровождалась транслокацией одного из двух сохранившихся аллелей гаметофитной системы. F. tataricum отделился от популяции предковой формы до возникновения этой

транслокации; начало его формирования связано с мутацией аллеля S/ утраченной гаметофитной системы, инактивирующей его функцию в пестике.

8. Сорта F. esculentum несут рецессивные шпос-аллели генов, контролирующих размер соцветия (число элементарных соцветий) и число соцветий на побеге мутантной формы с детерминантным типом роста (мутация d (del)). F. homotropicum несет рецессивные минус-аллели генов, контролирующих размер цветка, что объяснимо переходом этого вида на самоопыление.

9. Мутации F. esculentum tlb, atl и форма с заменой 2-3 лепестков химерными структурами, сочетающими признаки лепестков и генеративных органов, наследуются моногенно. Ген TLB локализован в группе сцепления №4.

10. Изученные устойчивые к опадению семян образцы F. tataricum различного географического происхождение несут по два рецессивных гена, каждый го которых способен блокировать развитие функционального разделительного слоя на плодоножке.

11. Качественная изменчивость F. tataricum по форме семян контролируется генами SMK (smooth kernel) и SPL (split). Тип семян, характерный для F. cymosum (ровные грани и четко выраженные ребра), в скрещиваниях с F. tataricum наследуется как рецессивный моногенный признак.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ ПРАКТИКИ

1. Использовать амфидиплоид F. giganteum в качестве основы для создания материала с высокой инбредной жизнеспособностью, поддерживаемой за счет межгеномных взаимодействий.

2. Использовать возвратные скрещивания амфидиплоида F. giganteum с родительскими видами для инициирования формообразовательного процесса за счет рекомбинации между геномами двух видов.

3. Использовать длинностолбчатые формы с укороченным пестиком для массового получения гибридов F. esculentum с диким автогамным видом F. homotropicum.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Фесенко, И.Н. Получение межвидового гибрида гречихи татарская (4х) х гречиха гигантская / И.Н. Фесенко, JI.B. Голышкин // Известия ТСХА. - 1997. -Вып. 1.-С. 201-204.

2. Фесенко, А.Н. Участие гена TEPAL-LIKE BRACT (TLB) в определении границы между брактеями и околоцветником у Fagopyrum esculentwn Moench. / А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко, М.Д. Логачева, A.A. Пенин // Генетика. - 2005. -Т.41, №12.-С. 1644-1649.

3. Лазарева, Т.Н. Изменчивость гречихи татарской Fagopyrum tataricum Gaertn. по белкам семян, выявляемая электрофорезом в ПААГ / Т.Н. Лазарева, И.Н. Фесенко, Н.Е. Павловская // Известия ТСХА. - 2007. - Вып. 3. - С.93-97.

4. Лазарева, Т.Н. Полиморфизм районированных сортов гречихи обыкновенной, выявляемый электрофорезом белков семян / Т.Н. Лазарева, Н.Е. Павловская, И.Н. Фесенко, А.Н. Фесенко // Доклады РАСХН. - 2007. - №6. -С.14-15.

5. Logacheva, M. D. Genetic and morphological analysis of floral homeotic mutants tepal-like bract and fagopyrum apétala of Fagopyrum esculentwn / M.D. Logacheva, I.N. Fesenko, A.N. Fesenko, A.A Penin // Botany. - 2008. - Vol. 86, № 4. — P.367-375.

6. Penin, A.A. Some characteristics of genetic control of Fagopyrum esculentum flower development / A.A. Penin, A.N. Fesenko, I.N. Fesenko, M.D. Logacheva // Wulfenia.-2009.-Vol. 16.-P.1-11.

7. Фесенко, H.B. Новые методы создания скороспелых сортов гречихи / Н.В. Фесенко, А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко [и др.] // Вестник ОрелГАУ. - 2009. -№ 3.-С.26-29.

8. Лазарева, Т.Н. Сравнительный анализ электрофоретических спектров белков семян Fagopyrum cymosum Meisn. И F. tataricum Gaertn. / Т.Н. Лазарева, И.Н. Фесенко // Вестник ОрелГАУ. — 2010. - №4 (25). — С. 67-70.

9. Фесенко, И.Н. Новая видовая форма гречихи - Fagopyrum hybridum / И.Н. Фесенко, H.H. Фесенко // Вестник ОрелГАУ. - 2010. - № 4 (25) . - С.78-81.

10. Гуринович, И.А. Мутантная форма гречихи с блокированным ветвлением: наследование и продукционные особенности / И.А. Гуринович, А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко // Вестник ОрелГАУ. -2010. - № 4 (25). - С. 8285.

11. Фесенко, А.Н. «Эволюционный» метод отбора на повышение устойчивости гречихи посевной к инбридингу / А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко, И.А. Гуринович // Вестник ОрелГАУ. - 2010. - №6. - С. 111-115.

12. Фесенко, А.Н. Генетический контроль числа соцветий на побегах детерминантной формы гречихи / А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко, О.В. Бирюкова, O.A. Шипулин //Доклады РАСХН,-2010.-№ I.-С. 9-10.

13. Фесенко, И.Н. Наследование гомостилии цветка автогамного вида Fagopyrum tataricum Gaertn. в межвидовых скрещиваниях с гетеростильным перекрестноопылителем F. cymosam Meisn. / И.Н. Фесенко // Доклады РАСХН. -2010,-№5,- С. 5-7.

14. Фесенко, H.H. Функциональные фрагменты реликтовой гаметофитной системы самонесовместимости ассоциированы с локусами, определяющими тип цветка Fagopyrum esculentum Moench. (гетеростильный перекрестноопылитель) и F. homotropicum Ohnishi (самоопылитель с гомостильными цветками) / H.H. Фесенко, И.Н. Фесенко // Генетика. - 2011 -Т. 47, № 1,-С. 48-56.

15. Фесенко, А.Н. Перспективы использования мутации lsb в селекции детерминантных сортов гречихи / А.Н. Фесенко, O.A. Шипулин, И.Н. Фесенко // Доклады РАСХН.- 2011.-№3.-С.11-13.

16. Фесенко, А.Н. Особенности динамики цветения растений мутантных морфотипов гречихи / А.Н. Фесенко, О.В. Бирюкова, И.Н. Фесенко [и др.] // Вестник ОГАУ. - 2011. - № 3. - С.9-13.

17. Лазарева, Т.Н. Сравнительный анализ спектров запасных белков Fagopyrum esculentum и двух морфологически различных линий F. homotropicum / Т.Н. Лазарева, И.Н. Фесенко // Ученые записки Орловского государственного университета. Серия естественные, технические и медицинские науки. - 2010. - № 3 (41). - С. 130-133.

18. Фесенко, И.Н. Генетические и биохимические исследования эволюционной истории близкородственных видов Fagopyrum cymosum Meisn. и F. tataricum Gaerth. / И.Н. Фесенко, Т.Н. Лазарева // Ученые записки Орловского госуниверситета, 2011. - №5 (43). - С.243-249.

19. Фесенко, А.Н. Перспективы использования мутации determinate floret cluster в селекции гречихи / А.Н. Фесенко, О.В. Бирюкова, O.A. Шипулин, И.Н. Фесенко // Вестник ОрелГАУ. - 2012. - № 3(36). - С.41-44.

20. Бирюкова, О.В. Потенциал ремонтантности и плодообразования сортов гречихи различного морфотипа / О.В. Бирюкова, А.Н. Фесенко, O.A. Шипулин, И.Н. Фесенко // Вестник ОрелГАУ. - 2012. - №3(36). - С.65-69.

21. Фесенко, А.Н. Продукционные особенности детерминантных растений гречихи / А.Н. Фесенко, O.A. Шипулин, И.Н. Фесенко, О.В. Бирюкова // Земледелие. - 2012. - № 5. - С.42-44.

22. Фесенко, И.Н. Генетический анализ изменчивости по форме семян, доступной для использования в селекции гречихи татарской (Fagopyrum tataricum Gaertn.) / И.Н. Фесенко // Доклады РАСХН. - 2012. - № 3. - С.10-12.

Глава в книге

23. Фесенко, H.H. Генетический контроль гетероморфной несовместимости у гречихи Fagopyrum esculentum Moench. / H.H. Фесенко, И.Н. Фесенко // В кн.: Идентифицированный генофонд растений и селекция. Под ред. Б.В. Ригина, Е.И. Гаевской- СПб.: ВИР, 2005. - С. 290-302.

Статьи в других изданиях

24. Fesenko, I.N. Study of F2 generation of interspecific hybrid in combination Fagopyrum tataricum(4x) x F. giganteum / I.N. Fesenko, N.N. Fesenko // Proc. 7th Int. Symp. Buckwheat. - 1998. - Part 6. - P.36-40.

25. Fesenko, I.N. Compatibility and congruity of interspecific crosses in Fagopyrum / I.N. Fesenko, N.N. Fesenko, O. Ohnishi // Proc. 8th Int. Symp. Buckwheat. - 2001. - Vol. 1. - P.404-410.

26. Fesenko, N.N. Wide hybridization as a way of accelerating exotic buckwheat species adaptation under collection / N.N. Fesenko, I.N. Fesenko // Proc. Intl. Conf. "Genetic collections, izogenic and alloplasmic lines, ICG, Novosibirsk. - 2001. -P.155-157.

27. Fesenko, I.N. Flower homostyly of Fagopyrum tataricum Gaertn. is determined by minus-alleles of polymeric genes which related to the loci of heterostyly background in F. cymosum Meisn. / I.N. Fesenko // Fagopyrum. - 2005. -V.20. — P.7-12.

28. Fesenko, I.N. Non-shattering accessions of Fagopyrum tataricum Gaertn. carry recessive alleles at two loci affecting development of functional abscission layer / I.N. Fesenko // Fagopyrum. - 2006. - V. 23. -P.7-10.

29. Fesenko, N.N. Homostyly of two morphologically different lineages of Fagopyrum homotropicum Ohnishi is determined by locus S4, which is an S-locus related gene in the linkage group #4 / N.N. Fesenko, I.N. Fesenko, O. Ohnishi // Fagopyrum. - 2006. - № 23. - P. 11-15.

30. Fesenko, N.N. Study of interspecific cross F. esculentum Moench. (2n=4x=32) x F. homotropicum Ohnishi (2n=32) and some reflections about different views on crop evolution of buckwheat / N.N. Fesenko, I.N. Fesenko// Proc. 10th Intl. Symp. Buckwheat at Yangling (China). -2007. - P. 120-122.

31. Lazareva, T.N. Seed protein variability of Fagopyrum tataricum Gaertn. is limited by two types of electrophoresis spectrum, which differ by the presence/absence of one band / T.N. Lazareva, I.N. Fesenko // Fagopyrum. - 2007. -Vol. 24.-P.9-13.

32. Фесенко, H.H. Генетические доказательства аллоиолиилоидной природы тетраплоидной линии Н#4 Fagopyrum homotropicum Ohnishi и некоторые размышления о различных взглядах на культурную эволюцию гречихи / Н.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко // В сб.: «Повышение устойчивости производства сельскохозяйственных культур в современных условиях», Орел, ПФ «Картуш» . — 2008. — С.195-201.

33. Фесенко, А.Н. Новые мутации влияющие на развитие репродуктивной сферы растений гречихи / А.Н. Фесенко, И.Н. Фесенко, О.В. Бирюкова [и др.] // Материалы семинара «Научные основы создания высокоэффективных технологий производства гречихи и проса» (Орел, 7-11 июля 2009 г.). — Орел, 2009. - С. 92-99.

34. Fesenko, I.N. Genes regulating inflorescences number in buckwheat with a determinate growth habit (homozygote at the recessive allele det) / I.N. Fesenko, A.N. Fesenko, O.V. Biryukova, O.A. Shipulin // Fagopyrum. - 2009. - Vol. 26. -P.21-24.

35. Fesenko, N.N. Polygenic system determining quantitative features of style length in pin morph of common buckwheat Fagopyrum esculentum Moench. / N.N. Fesenko, I.N. Fesenko //Proc. 11th Intl. Symp. Buckwheat. -2010. -P.419-424.

36. Fesenko, A.N. A new mutation of buckwheat - "determinant floret cluster" / A.N. Fesenko, O.V. Biryukova, O.A. Shipulin, I.N. Fesenko // Proc. 11th Intl. Symp. Buckwheat. - 2010. - P.386-388.

37. Lazareva, T.N. Comparative study of SDS-PAGE spectra of Fagopyrum esculentum and two morphologically different lineages of F. homotropicum / T.N. Lazareva, I.N. Fesenko // Proc. 11th Intl. Symp. Buckwheat. - 2010. - P. 119-122.

38. Fesenko, I.N. Fagopyrum hybridum: a procecc of the new buckwheat crop development / I.N. Fesenko, N.N. Fesenko // Proc. 11th Intl. Symp. Buckwheat. -2010.-P.308-313.

39. Fesenko, I.N. Genes SMK (smooth kernel) and SPL (split) determine the qualitative distinctions between different forms of seeds of F. tataricum / I.N. Fesenko // Fagopyrum. - 2010. - Vol. 27. - P.9-11.

40. Fesenko, I.N. Genetic basis of interspecific diversity of floral display size between cultivated outcrosser Fagopyrum esculentum Moench. and wild selfer F. homotropicum Ohnishi / I.N. Fesenko, A.N. Fesenko // Fagopyrum. - 2011. - Vol. 28. — P. 17-21.

Методические рекомендации

41. Методика получения межвидовых гибридов гречихи (методические рекомендации) / И.Н. Фесенко, Н.Н. Фесенко, А.Н. Фесенко. - Орел. — 2011.— 20с.

Патенты и авторские свидетельства

42. Авторское свидетельство: РФ №46923 на сорт Темп / Фесенко И.Н. [и др.], заявитель ГНУ ВНИИ ЗБК. -№9360068 с датой приоритета 19.12.2006. - 1 с.

43. Патент РФ на селекционное достижение №5456 на сорт Темп / Фесенко И.Н. [и др.], заявитель ГНУ ВНИИ ЗБК. - №9360068 с датой приоритета 19.12.2006.-1 с.

Подписано в печать 28.06.2013 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Тайме. Усл. печ. л. 2,0. Заказ 77. Тираж 100 экз.

Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2013, Орел, бульвар Победы, 19

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Фесенко, Иван Николаевич, Санкт-Петербург

На правах рукописи

05201352065

Фесенко Иван Николаевич

Специальность 03.02.07 - генетика

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: д.б.н., профессор Б.В. Ригин

Санкт-Петербург 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений. 5

Введение. 7

ГЛАВА 1. Генетические основы репродуктивных барьеров между

видами. Филогения видов рода Fagopyrum. (Обзор литературы). 13

1.1. Постзиготические барьеры. 15

1.2. Прогамные барьеры (генетика несовместимости пыльцы и

пестика). 24

1.2.1. Гаметофитная система несовместимости. 24

1.2.2. Спорофитная система несовместимости. 39

1.2.3. Гетеростилия. 42

1.2.4. Эволюционные взаимосвязи между гаметофитной и

гомоморфной спорофитной системами. 57

1.2.5. Локализация ¿¡"-гена на хромосоме. 58

1.2.6. Несовместимость пыльцы и пестика в межвидовых

скрещиваниях. 60

1.3. Филогения видов рода Га^оругит. 68

ГЛАВА 2. Условия проведения опытов, материал и методы. 74

2.1. Условия проведения опытов. 74

2.2. Материал. 79

2.3. Методы. 81

ГЛАВА 3. Сравнительная генетика признаков цветка и семян

видов Т7. 1Шапсит и К сутоБит. 85

3.1. Генетический контроль полиморфизма по форме семян. 89

3.2. Устойчивые к опадению семян образцы /Шапсит

гомозиготны по рецессивным аллелям двух локусов, влияющих на

развитие функционального разделительного слоя. 96

3.3. Генетический контроль гомостилии цветка Т7. 1Шапсит. 103

ГЛАВА 4. Генетическая детерминация особенностей системы размножения видов F. esculentum и F. homotropicum. Ill

4.1. Генетический контроль числа соцветий на побегах детерминантной формы гречихи. 114

4.2. Генетика различий между F. esculentum и F. homotropicum по признакам, ассоциированным с типом системы размножения. 120

4.3. Гены, определяющие тип цветка, в геноме F. homotropicum. 129

4.4. Дополнительные доказательства аллополиплоидной природы тетраплоидного F. homotropicum. 135

4.5. Наследование (и локализация) новых мутаций. 139 ГЛАВА 5. Прогамная несовместимость видов рода Fagopyrum: механизмы и генетический контроль. 142

5.1. Закономерности роста пыльцевых трубок. 144

5.2. Генетический анализ прогамных барьеров несовместимости. 153

5.2.1. Комбинация F. esculentum х F. homotropicum. 153

5.2.2. Комбинация F. cymosum х F. tataricum. 160

5.2.3. Комбинации F. cymosum (К) х С9139 F. homotropicum и

F. esculentum (К) х F. tataricum. 163

5.2.4. Комбинация F. cymosum х F. esculentum. 164

5.2.5. Пыльца длинностолбчатых гибридов F2 (Гд1 х С9606) несовместима с пестиком короткостолбчатой формы F. cymosum. 167

5.3. Обозначения генов, контролирующих прогамную

несовместимость видов. 168

5.4. Характеристики совместимости пыльцы и пестика амфидиплоида F. giganteum в межвидовых и внутривидовых скрещиваниях. 169

4 5.5. Фрагменты реликтовой гаметофитной системы

несовместимости в роде Fagopyrum. Эволюционные взаимосвязи

между разными системами самонесовместимости (обсуждение). 175

ГЛАВА 6. Эволюционные события в роде Fagopyrum

(обсуждение). 181

6.1. Необратимые эволюционные процессы как критерии

относительного возраста таксономических видов. 181

6.2. Предположительная последовательность событий на ранних

стадиях дивергенции F. esculentum и F. homotropicum. 187

6.3. Предположительная последовательность событий на ранних

стадиях дивергенции F. cymosum и F. tataricum. 193

6.4. Независимость эволюции гетеростилии F. esculentum и F.

cymosum. 197

6.5. Эволюция системы несовместимости и видообразование у

растений. 199

ГЛАВА 7. Результаты и перспективы практического

использования межвидовой гибридизации гречихи. 201

7.1. Использование F. homotropicum в селекции F. esculentum. 201

7.2. Создание селекционного материала на основе F. tataricum,

F. cymosum и F. giganteum. 205

Выводы. 208

Рекомендации для селекционной практики. 210

Литература.

211

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Д-растения длинностолбчатые растения

Д-цветок длинностолбчатый цветок

Д-форма длинностолбчатая форма гетеростильного вида

Д-пыльца пыльца длинностолбчатых растений

Д-пестик пестик длинностолбчатых растений

К-растение короткостолбчатое растение

К-цветок короткостолбчатый цветок

К-форма короткостолбчатая форма гетеростильного вида

К-пыльца пыльца короткостолбчатых растений

К-пестик пестик короткостолбчатых растений

Гд - растение растение с гомостильными цветками с длинными

(Гд -цветок) тычинками и пестиком ("длинная" гомостилия)

Гк - растение растение с гомостильными цветками с короткими

(Гк -цветок) тычинками и пестиком ("короткая" гомостилия)

wl (пг) willow leaf (син. narrow leaf) (моногенная мутация,

вызывающая узколистность);

маркер группы сцепления №4 (Ohnishi О., 1990)

tlb tepal-like bract (моногенная мутация, вызывающая

лепестковидность брактеи)(Фесенко А.Н. и др.,

2005)

atl articulation (моногенная мутация, вызывающая

блокирование развития разделительного слоя на плодоножке (эпистатирует доминантный ген SHT), в сочетании с некоторыми нарушениями развития

цветка)

S= GPA локус гетеростилии - суперген, состоящий из трех

неразрывно сцепленных субгенов (единиц

мутации), контролирующих длину пестика (G),

размер пыльцы (Р) и длину тычинок (А)

S4 ген, детерминирующий гомостильный тип цветка

вида/7, homotropicum

(Fesenko N.N. et al., 2006)

Si, S2 гены несовместимости гаметофитного типа,

проявляющиеся в межвидовых скрещиваниях

d (det) determinate growth habit (моногенная мутация,

вызывающая прекращение развития побега после

формирования нескольких соцветий, обычно 2-

5)(Фесенко Н.В., 1968)

spl split (мутация F. tataricum, вызывающая

формирование на грани плода продольного

выступа вместо бороздки)

smk smooth kernel (мутация F. tataricum, вызывающая

отсутствие скульптурных образований (шипов) на

плодах)

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Гречиха является важной продовольственной культурой: в России ее посевы занимают около 1 млн. га. Все возделываемые в России сорта представлены одним видом - Fagopyrum esculentum МоепсЬ.(гречиха обыкновенная). Этот вид обладает классической гетеростилией, обеспечивающей облигатное перекрестное опыление, которое считается одной из причин нестабильности урожая зерна (Campbell С., 2003) и обусловливает сложность селекционной работы с культурой. Попытки использования самофертильных форм в селекции гречихи не имели успеха из-за свойственной виду сильной инбредной депрессии. В Юго-Восточной Азии в качестве зерновой культуры возделывается также автогамный вид F. tataricum Gaertn. (гречиха татарская): в Китае его посевы занимают треть площадей под гречихой (Wang Y., Campbell С., 2004). В России этот вид не возделывается из-за его несоответствия местным условиям и потребительским традициям.

Объединение ценных качеств возделываемых видов в одном генотипе оказалось невозможным (Samimy С. et al., 1996).

Для проведения эффективной работы по межвидовой гибридизации и использования полученных гибридов в селекционной работе необходимо: а) выяснение генетических механизмов, обусловливающих репродуктивные барьеры между видами; б) исследование особенностей генетического контроля признаков, ассоциированных с типом системы размножения в роде Fagopyrum; в) экспериментальное определение возможности интрогрессии интересующих генов (и признаков) одного вида в другой. Немаловажное значение имеет выяснение закономерностей эволюции системы размножения видов крупносемянной группы рода Fagopyrum.

Цель работы

Изучить генетику репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum в связи с исследованиями процессов видообразования и возможностей обмена генами между видами.

Задачи исследований

1. Изучить генетику барьеров несовместимости между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum, действующих на стадии роста пыльцевых трубок.

3. Разработать эффективную методику получения и использования в селекции межвидовых гибридов К еБсиЫпШт с К кото^оркит.

4. Исследовать формообразовательный процесс у гибридов амфидиплоида К giganteum с родительскими формами К 1а1аг1сит и К сутоБит.

Научная новизна

1. Впервые для таксонов с гетероморфной системой несовместимости у видов крупносемянной группы рода Fagopyrum выявлены функциональные гены несовместимости гаметофитного типа, один из которых ассоциирован с доминантным аллелем супергена гетеростилии. Показано, что гетеростилия в роде Fagopyrum возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости. Получено прямое экспериментальное доказательство формулы Д. Льюиса (1954), объединившей известные компоненты супергена гетеростилии и ^-локусов гомоморфных систем несовместимости.

2. На основе анализа морфологии и генетических механизмов системы несовместимости F. еяси1епШт, F. кото^оргсит, Р. сутозит и Р. ¡Магюит предложены вероятные последовательности событий на начальных стадиях их дивергенции.

3. Установлено, что окультуривание Р. езсиЫпЫт сопровождалось накоплением рецессивных генов, увеличивающих размер соцветия; переход к

самоопылению дикого вида F. homotropicum сопровождался накоплением рецессивных генов, уменьшающих размер цветка.

4. Установлено, что ген S4, контролирующий гомостилию цветка морфологически различных образцов F. homotropicum, находится в группе сцепления №4. Выявлен мультиаллелизм по субгену Р.

5. Гомостилия цветка F. tataricum обусловлена рецессивными аллелями субгенов G и А, в сочетании с минус-аллелями модификаторов, влияющих на длину пестика. Аллель субгена Р в геноме F. tataricum отличается от аллелей этого субгена, характерных для F. cymosum.

7. Выявлены гены, контролирующие число соцветий у детерминантной формы гречихи (гомозигота по аллелю det).

Практическое значение работы

1. Амфидиплоид F. giganteum рассматривается как перспективная основа для создания материала с высокой инбредной жизнеспособностью, поддерживаемой за счет межгеномных взаимодействий. Созданы предпосылки для селекционной работы с F. giganteum: путем гибридизации с родительскими формами (F. tataricum и F. cymosum) получены межвидовые рекомбинанты с почти оптимальной продолжительностью вегетационного периода и улучшенными характеристиками зерна.

Разработаны методики массового получения межвидовых гибридов F. esculentum х F. homotropicum и их ускоренной селекционной проработки. Это позволило создать селекционный материал, на основе которого был выведен и передан в производство сорт Темп.

Основные положения, выносимые на защиту

3. Гетеростилия в роде Fagopyrum Mill, возникла взамен утраченной гаметофитной системы несовместимости.

5. Формирование F. homotropicum сопровождалось мутацией доминантного аллеля 5*-локуса, изменением его локализации, и накоплением рецессивных минус-аллелей генов, влияющих на размер цветка.

Апробация работы

Результаты работы доложены на следующих симпозиумах и конференциях: 7-м (Канада, 1998), 8-м (Корея, 2001), 9-м (Чехия, 2004), 10-м (Китай, 2007) (публикации в сборниках трудов) и 11-м (Орел, Россия, 2010)(публикации и доклад) международных симпозиумах по гречихе; 3-м международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" (Москва - Пущино, 1999); 2-м (С.Петербург, 2000), 3-м (Москва, 2004)(доклад), 4-м (Москва, 2009) съездах ВОГиС; международной конференции "Генетические коллекции, изогенные и аллоплазматические линии" (Новосибирск, 2001); 2-й конференции московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Москва, 2003); 1(1Х) международной конференции молодых ботаников (С.Петербург, 2006); 2nd Meeting of the European Society for Evolutionary Developmental Biology, (Belgium, 2008); семинаре "Научные основы создания высокоэффективных технологий производства гречихи и проса" (Орел,

2009); региональной научно-практической конференции "Инновационный потенциал молодых ученых - АПК Орловской области" (Орел, 2010).

Публикации

Личный вклад автора

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ БАРЬЕРОВ

МЕЖДУ ВИДАМИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ. ФИЛОГЕНИЯ

ВИДОВ РОДА FAGOPYRUM. (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Межвидовая гибридизация - перспективный метод создания исходного материала для селекции, особенно в случаях, когда необходимы более существенные изменения культурных сортов, чем это позволяет внутривидовая изменчивость (Wang Y., Campbell С., 1998; Жученко A.A., 2001; Фесенко А.Н., Фесенко H.H., 2002; Соловьев A.A., 2007; Alwala S. et al., 2009; Chetelat R.T. et al., 2009; Herrera J.C. et al., 2009).

Межвидовая гибридизация подразумевает преодоление последствий видообразования и дивергенции видов, проявляющихся в форме барьеров несовместимости. Виды, дивергировавшие настолько, что обмен генами между ними невозможен, называются инконгруентными; соответственно, виды, между которыми возможен обмен генами, считаются "конгруентными" (Карпеченко Г.Д., 1935).

Низкая результативность межвидовых скрещиваний может быть связана также с прогамными (или предзиготическими) барьерами, действующими на стадии роста пыльцевых трубок (Суриков И.М., 1991). Однако такие барьеры в большинстве случаев бывают односторонними (Lewis D., Crowe L.K., 1958). Кроме того, практически любая система несовместимости иногда дает сбои, и некоторые из большого числа опыленных цветков могут сформировать завязи.

В природе имеют место также механизмы изоляции видов, основанные на различиях в строении и размере цветков (специализация опылителей), времени цветения (Грант В., 1984; Grant V., 1994). Превентивное самоопыление у автогамных видов также рассматривается как вероятный изолирующий механизм (Kay K.M., Sargent R.D., 2009). В реальных

ситуациях основные формы изоляции обычно действуют в различных сочетаниях (Levin D., 1978; Bedinger Р.А. et al., 2011).

Существует мнение, что репродуктивные барьеры могут возникать в процессе доместикации, между культурными формами и их дикими предками (Dempewolf Н. et al., 2012). Однако корректность идентификации предковой ф�

Информация о работе

Фесенко, Иван Николаевич
доктора биологических наук
Санкт-Петербург, 2013
ВАК 03.02.07

Диссертация

Генетика репродуктивных барьеров и морфологических различий между видами крупносемянной группы рода Fagopyrum Mill. - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы