Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004

Чаусов, Евгений Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004"

На правах рукописи

Чаусов Евгений Владимирович

Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологичсский анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2009

003466208

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Терновой Владимир Александрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор,

Щелкунов Сергей Николаевич

кандидат биологических наук, Бахвалова Валентина Николаевна

Ведущая организация: Институт химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Защита диссертации состоится «¿4» О/у^ил 2009 г. в '-3 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово, Новосибирская область, 630559, тел. 8 (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»»

Автореферат разослан 2009

Ученый секретарь диссертационного совета д.б.н.

Карпенко Л.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке СССР и в настоящее время является прототипным представителем одноименного серокомплекса, в который включают ВКЭ, вирус Омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), вирус Лангат, вирус Повассан (ВП), вирус Киассанурской лесной болезни, вирус шотландского энцефаломиелита овец и др. Основными переносчиками ВКЭ являются иксодовые клещи видов Ixodes persulcalus и Ixodes ricinus; заражение происходит при присасывании и питании зараженного клеща, и в редких случаях - при употреблении молока от зараженных коров и коз. ВКЭ вызывает у людей заболевание центральной нервной системы, называемое клещевым энцефалитом (КЭ), с уровнем смертности 1-30%.

В Российской Федерации в период с 1990-х по 2000 год отмечен подъем заболеваемости КЭ вплоть до 11 ООО случаев в год. К настоящему времени средняя заболеваемость КЭ в Российской Федерации снизилась, однако в ряде регионов Урала, Сибири и Дальнего Востока рост заболеваемости (до 30 случаев КЭ на 100 тыс. населения) наблюдался и в 2008 году. Ежегодно в Российской Федерации регистрируется от 232 тыс. до 318 тыс. человек, укушенных клещами. На низком уровне остается дифференциальная диагностика клещевых инфекций и мониторинг энтомологического состояния природных очагов. Настороженность вызывает также выявление новых форм КЭ, таких как КЭ с геморрагическим синдромом.

Актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии ВКЭ в настоящее время являются уточнение ареала и встречаемости в разных регионах его генотипов, отслеживание изменений в географическом распространении генотипов, изучение вариабельности ВКЭ на уровне генотипа, а также изучение свойств штаммов, существенно отличающихся от основных 3 генотипов.

Кроме того, важными проблемами связанных с клещами заболеваний в настоящее время являются продолжающийся рост заболеваемости КЭ в ряде регионов и выявление полного спектра генетического разнообразия возбудителей других инфекций, переносимых клещами, и установление уровня встречаемости смешанных инфекций.

К настоящему времени известно, что иксодовые клещи также являются переносчиками возбудителей ряда других инфекционных заболеваний человека и животных, вызываемых простейшими, бактериями и вирусами: энцефалита Повассан, клещевого боррелиоза, клещевого риккетсиоза, моноцитарного эрлихиоза человека, бабезиоза и др., клинические проявления которых в ряде случаев могут ошибочно трактоваться как КЭ. У иксодовых клещей выявляются также вирус Западного Нила и возбудитель бартонеллеза, однако не доказана роль клещей в передаче данных инфекций человеку. В природных очагах (Европа и Европейская часть России, Урал, Сибирь, Дальний Восток, Казахстан, Япония) у клещей выявлено совместное наличие двух и более возбудителей инфекций и показано возникновение микст-инфекций у человека. Ценными в научном и клиническом плане являлись бы сведения о степени распространенности различных возбудителей, а также их уточненный видовой состав в очагах клещевых инфекций на территории Российской Федерации. Учитывая тот факт, что комплексных исследований встречаемости клещевых инфекций в Томской области до настоящего времеии не проводилось, мы решили не ограничиваться ВКЭ в изучении спектра переносимых клещами патогенов.

Наконец, важной и пока нерешенной проблемой является установление на молекулярном уровне факторов, влияющих на патогенность ВКЭ. Небольшое на сегодняшний день количество полностью определенных последовательностей вирусных РНК различных штаммов ВКЭ (менее 30 полноразмерных последовательностей, опубликованных в базе данных GenBank) не отражает широкого спектра генетического разнообразия вируса, и не позволяет определить мутации, приводящие к повышению

патогенности вируса. Определение полных нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ современных, в особенности - необычных штаммов ВКЭ, проявляющих высокую патогенность, является важной задачей для установления ключевых моментов в молекулярной биологии ВКЭ и патогенезе КЭ. Таким образом, детальный анализ генома нового высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004 в сравнении с геномами известных штаммов и природных вариантов ВКЭ также представляется важной научной задачей.

Частью этой проблемы является выявление роли нетранслируемых областей генома в репликации вируса. В ряде работ 5'-нетранслируемая область генома (5'-НТО) флавивирусов идентифицирована как промотор репликации. В опубликованных данных, однако, содержатся указания на то, что вариабельность 5'-НТО флавивирусов составляет до 55,5%, что может обусловливать адаптацию вируса к различным хозяевам. Исследование вариабельности 5'-НТО до нашей работы было проведено лишь для вариантов ВКЭ европейского генотипа, выделенных из клещей /. ricinus. Для сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ у клещей I. persulcatus и I. Pavlovskiy подобных данных до нашего исследования не было опубликовано. Между тем, Томская область является одним из самых высокоэндемичных регионов России по клещевым инфекциям, и в силу этого представляет большой интерес для изучения вариабельности 5'-НТО у природных вариантов ВКЭ и их генетического разнообразия.

Цели и задачи исследования. Целями работы являлись изучение встречаемости и генетического разнообразия ВКЭ и других переносимых клещами инфекций в городских и пригородных биотопах г. Томска, а также секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома нового штамма ВКЭ, вызвавшего особо тяжелую быстротекущую форму заболевания энцефалитом (штамм Глубинное/2004). В связи с этими целями основными задачами исследования были:

1. Создание коллекции ДНК и РНК, выделенных из икеодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска.

2. Выявление РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших в образцах икеодовых клещей, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске, и определение соотношений встречаемости данных патогенов в клещах.

3. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов вновь выявленных вариантов ВКЭ, фрагментов ДНК бактерий и простейших и их молекулярно-биологический анализ.

4. Изучение генетического разнообразия 5'-нетранслируемой области геномной РНК в природных вариантах ВКЭ и анализ нуклеотидных замен, появляющихся в процессе адаптации изолятов ВКЭ к клеткам почки эмбриона свиньи (РКЕ cells).

5. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.

Научная новизна и практическая значимость работы:

1. Впервые комплексно определена встречаемость геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp. (в том числе в виде совместных инфекций) в икеодовых клещах, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске и его пригородах.

2. На территории г. Томска обнаружены варианты ВКЭ дальневосточного генотипа.

3. Впервые изучена изменчивость 5'-концевой (промоторной) области генома природных вариантов ВКЭ сибирского и дальневосточного генотипов при пассировании их на культуре клеток РКЕ.

4. Определена полная нуклеотидная последовательность генома нового высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004, проведен молекулярно-биологический анализ его генома и описаны области генома, замены в которых, возможно, и определяют его высокую патогенность для человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В исследованных образцах клещей встречаемость геномов ВКЭ составила 6,5±1,9%, Borrelia spp. - 8±3%, Rickettsia spp. -4,5±2,4%, Ehrlichia spp. -1,67%;

2. Уровень гомологии 5'-НТО геномной РНК ВКЭ составляет 95% для дальневосточного и 89% для сибирского генотипов. Среди 36 исследованных вариантов ВКЭ мутации были выявлены в следующих участках Y-структуры 5'-НТО: А2 - у 20 вариантов (55,5%), С1 - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), CS В - у 9 (25%), Al - у 5 (13,9%), CS А -у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%);

3. Штамм Глубинное/2004 относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, формируя в нем отдельную ветвь. Последовательность полипротеина штамма, по сравнению со штаммами 205 и Софьин, несет соответственно 53 и 57 аминокислотных замен. Наибольшие изменения обнаружены в вирусных белках NS3 (10/12 аминокислотных замен), NS5 (по 16 замен) и CTHD (по 5 замен на последовательность в 20 а.о.). Изменены сайты процессинга вирусного полипротеина C/CTHD, CTHD/prM, ргМ/М, E/NS1, NS2B/NS3. В участке Р Y-структуры 5'-НТО обнаружены замены Т30—>С и Тз5-С.

Апробация работы:

Результаты работы были представлены на конференциях:

1. Российско-британский семинар молодых ученых "Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza". Россия, г. Новосибирск, 2006.

2. Юбилейная конференция, посвященная 70-летию открытия клещевого энцефалита. Россия, г. Владивосток, 2007.

3. XIV International Congress of Virology, Турция, г. Стамбул, 2008.

Публикации, По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Полученные в работе нуклеотидные последовательности штамма Глубинное/2004 и фрагментов геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp. депонированы в базу данных GenBank (номера DQ862460, EU715139 - EU715174, EU919251 - EU919255, EU919256 - EU919263, EU919248 - EU919250, FJ640555).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 143 страницах, содержит 30 рисунков и 12 таблиц. Список использованной литературы включает 191 источник, в том числе 138 опубликованных в иностранных журналах.

Вклад автора. Изложенные результаты, за исключением сбора клещей, работ по культивированию ВКЭ и иммуноферментному анализу, получены непосредственно автором.

Материалы и методы

Иксодовые клещи. В исследование были взяты иксодовые клещи, собранные в городских и пригородных биотопах г. Томска в 2006-2007 гг. Отлов клещей проводился сотрудниками кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета в 2 городских и 2 пригородных районах г. Томска, после чего устанавливалась их видовая принадлежность (Ixodes persulcatus и Ixodes pavlovskyi). В ходе проведенных работ было собрано 1960 клещей. Собранных клещей хранили при -70°С. Гомогенизацию образцов осуществляли растиранием в ступке с 300 мкл фосфатно-солевого буфера.

Штамм ВКЭ Глубинное/2004. Штамм был выделен из головного мозга пациента, погибшего от тяжелой быстротекущей формы КЭ в 2004г. в Приморском крае. Трехкратно пассирован на культуре клеток РКЕ и очищен центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Штамм любезно предоставлен Е.В. Протопоповой. Определение полной

нуклеотидной последовательности штамма ВКЭ Глубинное/2004 осуществляли амплификацией взаимно перекрывающихся фрагментов генома с использованием олигонукпеотидных праймеров. Праймеры были рассчитаны на основе сравнения известных полных нуклеотидных последовательностей геномов ВКЭ с помощью пакета программного обеспечения Vector NTI 8.

Выделение нуклеиновых кислот. Выделение РНК/ДНК производили из 100 мкл гомогената с использованием наборов РИБО-сорб (Интерлабсервис, Россия) согласно инструкции производителя.

Обратная транскрипция. Комплементарные ДНК синтезировали на матрице суммарной РНК с использованием синтетического праймера dN6. Синтез проводили в 20 мкл раствора состава: 50 мМ Трис-НС1, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, по 1 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 2,5 мкМ гексамера dN«, 50 е.а. обратной транскриптазы Mo-MuLV (Медиген, Россия) при 37°С в течение 1 часа. Перед добавлением обратной транскриптазы смесь прогревали при 65°С в течение 2 минут.

Полимеразная цепная реакция. Амплификацию кДНК ВКЭ, ВП, а также ДНК бактерий и простейших осуществляли в 30 мкл смеси, содержащей 60 мМ Трис-НС1, 25 мМ KCl, 1,5 мМ MgC12, 10 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,1% Тритона Х-100, 0,2 мМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 0,15 мкМ праймеров, 2 ед. Taq ДНК-полимеразы (Медиген, Россия). Температурные условия амплификации для разных пар праймеров подбирали экспериментально (типичные условия: 95 С-1 МИН, Тогжига "1 МИН, 72°С -1 мин, 40 циклов).

Электрофоретический анализ и выделение ампликонов из геля. Продукты амплификации разделялись в 2% агарозном геле в однократном буфере ТАЕ (Трис: 40 мМ, КагЭДТА: 1мМ, уксусная кислота). Для визуализации ДНК гель окрашивался бромистым этидием (10 мг/мл). Гель рассматривали на УФ-трансиллюминаторе ТСР-20 MC (Wilber Lourmat, Франция) и фотографировали с использованием системы видеодокументирования КРС-650 ВН (КТ&С, Южная Корея) Для выделения продуктов амплификации из агарозного геля использовали набор Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США).

Определение нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации проводили с использованием автоматического секвенатора Beckman Coulter CEQ2000 XL. Использовали наборы реактивов CEQ DTCS Kit (Beckman-Coulter, Cat# 608000) согласно инструкции производителя. Определение проводили дважды, в независимых экспериментах.

Анализ последовательностей. Для генотипирования выявленных вариантов ВКЭ проводили филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 5'-НТО и фрагмента гена белка С длиной 255 н.о., исключая последовательность праймеров. Для генотипирования Borrelia spp., Rickettsia spp. и Ehrlichia spp. использовали фрагменты генов флагеллина (333 и.о.), цитратсинтазы (586 н.о.) и дисульфид оксидоредуктазы (377 н.о.) соответственно, исключая последовательность праймеров. Для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов из базы данных GenBank. Множественное сравнение последовательностей осуществляли с использованием пакета программного обеспечения Vector NTI 8. Филогенетический анализ и расчет молекулярных часов проводили с помощью программ MEGA 4 и TREE-PUZZLE. Для оценки достоверности группирования применяли тест на стандартную ошибку длин ветвей и бутстреп-тест.

Построение и анализ возможных вторичных структур РНК и белков, выявление потенциальных сайтов модификации белков. Для реконструкции вторичной структуры РНК использовали программу MFold v.3.2 (http://www.bioinfo.rpi.edu). Реконструкцию вторичной структуры белков осуществляли с помощью программ PSIPRED v.2.6 (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred /psiform.html) и nnPredict (http://www.cmpharm.ucsf.edu/~nomi/nnpredict.html). Для определения сайтов О- и N-гликозилирования в белках использовали программы NetOGlyc 3.1

(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/) и NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/ NetNGlyc/). Для поиска трансмембранных доменов в белках использовали программу ТМНММ Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/).

Основное содержание работы

1.1 Исследование встречаемости и генетического разнообразия переносимых клещами патогенов в биотопах г. Томска

1.1.1 Встречаемость и генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита

Методом ОТ-ПЦР с использованием разработанных нами олигонуклеотидных праймеров собранные клещи были исследованы на наличие РНК ВКЭ. Среди 1806 исследованных иксодовых клещей, РНК ВКЭ была выявлена у 118 (6,5±1,9%). При исследовании встречаемости генетических маркеров ВКЭ у иксодовых клещей нами было выявлено изменение этого показателя в зависимости от месяца эпидемического сезона. Например, положительными на наличие РНК ВКЭ в 2006 г. в биотопе «Коларово» в мае оказались 3 из 52 клещей всех стадий развития (5,8%), в июне 4 из 228 (1,8%), в июле 5 из 107 (4,7%). При этом зараженными в мае-июне оказываются перезимовавшие имаго обоих полов, а появляющиеся в июне личинки и нимфы практически стерильны. Напротив, в июле основной вклад в уровень зараженности вносят уже личинки и нимфы, инфицирование которых произошло, по-видимому, при совместном с зараженными имаго питании на животных, а имаго вообще встречаются единичными особями, и ВКЭ у них не обнаруживается (табл. 1).

Таблица 1. Встречаемость ВКЭ у клещей различных стадий развития на примере биотопа «Коларово».___

Стадии развития клещей Процент инфицированных клещей

май июнь июль

имаго 4,1% 4,4% 0

нимфы нет* 8,1% 11,8%

личинки нет* 0 4,4%

нет* - в указанный период времени клещи данной стадии развития не обнаружены.

Аналогичная картина наблюдалась и для других биотопов в 2006 и 2007 гг. Изменение уровня вирусофорности в зависимости от месяца связано с появлением новых особей иксодовых клещей, поскольку эффективность трансовариальной и трансфазовой передачи вируса далека от 100%, а передача вируса в основном происходит при совместном питании зараженных и стерильных особей на прокормителях. В среднем, частота встречаемости РНК ВКЭ у клещей составила 6,5%.

Для 36 выявленных в 2006-2007 гг. вариантов ВКЭ была определена нуклеотидная последовательность 5'-НТО, последовательности были депонированы в базу данных ОепВапк под номерами ЕШ15139 - Е11715174. Проведенный филогенетический анализ показал (рис. 1), что 10 (27,8%) из них принадлежат к дальневосточному генотипу ВКЭ, а 26 (72,2%) - к сибирскому.

Варианты ВКЭ сибирского генотипа показали существенное генетическое разнообразие, формируя 3 подветви в пределах ветви генотипа, что свидетельствует о значительном времени существования и эволюции ВКЭ сибирского генотипа на территории г. Томска и его пригородов. При этом, 4 выявленных варианта ВКЭ группировались с прототипным штаммом Заусаев, формируя отдельную подветвь. Данный штамм был выделен от больного с хронической прогрессирующей формой КЭ, который был укушен клещом в 1973г. в г. Томске, после чего заболел хронической формой ВКЭ, приведшей к летальному исходу в 1985г. в Москве. Факт обнаружения четырех новых вариантов этой геногруппы в Томске подтверждает данные о

происхождении штамма Заусаев из природных очагов ВКЭ в г. Томске. Важно отметить, что варианты этой геногруппы, способные вызывать хронические формы КЭ, продолжают циркулировать в этом районе до сих пор.

Е1Л15141* Е1)715148* Е1Я15174*

—Е1Я15155*

_гЕи715140*

'--£11715146*

(--Еи715149*

- I-Е11715151*

Ц-Е1Л15152*

" Еи715153* |-ЕЧ715142*

'-Еи715143*

-£11715150»

--—ЕК715154»

""Е11715147* -Е11715162А

~Еи715139* | Е1Я15144* £1)715145*

10(

--УавПсЬепко

I-Е11715158*

рЕи715157* П|— Е0715163* Т— 2аигаеу £11715156» -ек328

£1)715160« ЕЦ7151в1*

11 ЫеийоегА

" Нург

- ОэМтаБИО ЭофпНО 74|МОч1-01 ЭепгЬапд

0!уЫппов-2004

Е1Я15173* £11715169*

IС1

Е0715171» Е11715165* Е11715168 А 61*715166* Еи7А5А72*

Рисунок 1. Филогенетическое дерево выявленных вариантов ВКЭ, построенное на основе нуклеотидных последовательностей 5'-НТО. Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Линия отражает генетическую дистанцию. * - биотоп ТНХК, ♦ - Южное кладбище, • - Коларово, А - ТГУ.

В пригородных биотопах сибирский генотип ВКЭ обнаруживался чаще, чем в городских (89,5 и 53% от общего количества выявленных вариантов ВКЭ в пригородных и городских биотопах соответственно, табл. 2).

Хотя Томская область считается областью преимущественного распространения сибирского генотипа ВКЭ, нами было обнаружено значительное число вариантов дальневосточного генотипа. Данный генотип был наиболее широко представлен в городских биотопах, хотя встречался и в пригородных (47 и 10,5% от общего количества выявленных вариантов ВКЭ в городских и пригородных биотопах соответственно, табл. 2). Такое распределение генотипов позволяет предположить, что сибирский генотип ВКЭ действительно является эндемичным для Томска и области, а дальневосточный сравнительно недавно проник на территорию города, возможно, в результате деятельности человека, а в настоящее время постепенно распространяется и на территорию пригородов.

Генетическое разнообразие выявленных вариантов ВКЭ дальневосточного генотипа не так велико, как у сибирского, они формируют только 2 подветви (рис. 1).

Одна из подветвей образована вариантом, идентичным (по исследованному нами участку) прототипному штамму 205 ВКЭ, в настоящее время использующемуся для производства вакцины от КЭ в НПО «Вирион» в г. Томске, а вторая объединяет все остальные выявленные варианты дальневосточного генотипа, что свидетельствует об общности их эволюции и происхождения.

1.1.2 Встречаемость и генетическое разнообразие Borrelia spp.

Генетическое разнообразие Borrelia spp. в природных очагах Томской области было описано в работе Стронина с соавторами, где была показана принадлежность единичного изолята боррелии в Томской области к В. garinii, и в работе Фоменко с соавторами, где в Томской области была показана встречаемость В. garinii и В. afzelii. Поскольку клещевой боррелиоз, наравне с ВКЭ, является одной из самых распространенных в РФ клещевых инфекций, в нашей работе мы, в свою очередь, тоже изучили встречаемость и генетическое разнообразие Borrelia spp.

ДНК Borrelia spp. была обнаружена в 123 из 1540 исследованных клещей. Так же, как и у ВКЭ, с мая по июль наблюдались изменения в уровне зараженности клещей. Так, в мае в биотопе «Коларово» ДНК Borrelia spp. определялась у 9,6% имаго, в июне также у имаго, но не у личинок и нимф (4,8% от суммарного количества клещей всех стадий развития). В июле ДНК Borrelia spp. определялась у 4,7% личинок и нимф, но не у имаго (табл. 3). В других биотопах наблюдалась аналогичная картина.

Таблица 3. Встречаемость Borrelia spp.y клещей различных стадий развития на примере биотопа «Коларово». _

Стадии развития клещей Процент инфицированных клещей

май июнь июль

имаго 9,6 % 6,7 % 0%

нимфы нет* 0% 11,7%

личинки нет* 0% 2,9%

нет* - в указанный период времени клещи данной стадии развития не обнаружены.

Таблица 2. Частота встречаемости дальневосточного и сибирского генотипов ВКЭ в городских и пригородных биотопах

Городские биотопы Пригородные биотопы

Дальневосточный генотип ВКЭ 47% 10,5 %

Сибирский генотип ВКЭ 53% 89,5%

Для 5 случайно выбранных вариантов Borrelia spp. (из разных биотопов) была определена нуклеотидная последовательность гена флагеллина, используемого для филогенетического анализа (номера последовательностей в базе данных GenBank EU919251- EU919255). Сравнение с нуклеотидными последовательностями Borrelia spp. в базе данных GenBank с помощью поисковой системы BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) показало 100% гомологию с различными штаммами подвида В. garinii (данные не показаны).

Филогенетический анализ данных нуклеотидных последовательностей также показал, что выделенные варианты Borrelia spp. принадлежат к В. garinii (рис. 2).

4Garinii-D63370 Garinü-D63371 Garinii-AB001717 EU919255 EU919251

801 Garinii-D86617 G3MM,i-AB001716 19254 EU919252 ärinü-D88293 EU919253

-Garrnii-D63372

Garinii-DQ650336 Garinii-DQ650331

E" ' rferi-X69608

Burgdorferi-L42881 ,=,=,o,ana-AB178331

-Afzelü-AB178780 j Lusitaniae-AB091811 4»lLusitaniae-AB091812 - Japonica-D82852 -Japonica-D82853

o.oos

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента гена флагеллина Borrelia spp. Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Линия отражает генетическую дистанцию. Для прототипных последовательностей указан подвид и номер в базе данных GenBank. Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе.

В филогенетическом дереве выявленные варианты В. garinii образовали три подветви в пределах подвида, группируясь с прототипными изолятами, выделенными от иксодовых клещей в Японии, отдельно от изолятов, выделенных в Европе. Это свидетельствует о существовании различных генетических групп В. garinii на территории Томской области и их потенциальном родстве с вариантами, циркулирующими в Японии и на Дальнем Востоке РФ.

Таким образом, суммарная инфицированность клещей всех стадий развития Borrelia spp. в биотопах г. Томска и его пригородов в 2006-2007 гг. составила в среднем 8,0±3%, а выявленные варианты Borrelia spp. были отнесены нами к В. garinii.

1.1.3 Встречаемость и генетическое разнообразие Rickettsia spp.

Данных о встречаемости и генетическом разнообразии Rickettsia spp. в Томской области в литературе до настоящего времени не опубликовано. Имея своей целью комплексное изучение встречаемости и генетического разнообразия переносимых

клещами патогенов, мы исследовали образцы клещей из городских и пригородных биотопов г. Томска на наличие генетических маркеров Rickettsia spp.

ДНК Rickettsia spp. была выявлена у 39 из 1540 исследованных клещей. В биотопе «Коларово» в мае 2006 г. зараженность имаго составила 2%, в июне (всех стадий развития) - 4,8%, причем ДНК Rickettsia spp. выявлялась как у имаго, так и у личинок и нимф, в июле инфицированных клещей обнаружено не было (табл. 4).

Для 8 случайно выбранных вариантов Rickettsia spp. (из разных биотопов) была определена нуклеотидная последовательность гена цитратсинтазы, используемого для филогенетического анализа Rickettsia spp. (номера последовательностей в базе данных GenBank EU919256-EU919263). Согласно данным анализа последовательностей в базе данных GenBank с помощью системы BLAST, из 8 вариантов Rickettsia spp. 5 были отнесены к R. tarasevichiae и 3 к R. raoultii.

Таблица 4. Встречаемость Rickettsia spp. у клещей различных стадий развития на примере биотопа «Коларово»._

Стадии развития клещей Процент инфицированных клещей

май июнь июль

имаго 2% 4,4 % 0%

нимфы нет* 8,3 % 0%

личинки нет* 2,7 % 0%

нет* - в указанный период времени клещи данной стадии развития не обнаружены.

Однако при построении филогенетического дерева варианты, первоначально отнесенные к R. raoultii, образовали отдельную ветвь, достоверно (индекс поддержки ветвей = 99) отличную от прототипных штаммов R. raoultii (рис. 3).

Возможно, данные варианты Rickettsia spp. являются новым подвидом рода Rickettsia, поскольку известных прототипных последовательностей, группирующихся с ними, нет. Варианты, отнесенные нами к R. tarasevichiae, образовали 3 подветви в пределах подвида. 2 варианта были близкородственны прототипным вариантам, выделенным на территории РФ, в том числе в соседней Новосибирской области. Можно предположить наличие единого ареала R. tarasevichiae на территории Западной Сибири. Варианты R. tarasevichiae, циркулирующие в пределах Западной Сибири, включают в себя как генетически однородную группу штаммов, так и геноварианты, отличные от этой группы.

Таким образом, суммарная инфицированность клещей всех стадий развития Rickettsia spp. в биотопах г. Томска и его пригородов в 2006-2007 гг. составила в среднем 4,3±2,4%, выявленные варианты были отнесены нами к R. tarasevichiae и, возможно, новому подвиду рода Rickettsia.

88^ Asiat

-Л—

i Hei

961 Hei

j7j RickeHsii-DQ115890 ' Ricke»sn-DQ150689 Sibirica-U59734 -Sibirica-DQ 127824 Mw\go(oi>mona6-D0423370 Mongolotimonae-DQ097081 iSlovaca-DQ176434 "siovaca-U59725 Sibirica-D0124930

{He ilongj iangensi s-E LI665234 Japonica-A£35945a Hei Ion gjia nge nsi s-A Y285776 Heilongjiangensis-AF178034 Japontca-U59724 Raou II"-DQ365803 Rao ulti i-DQ365804 Г— EU919261 sjrEUS19260

8?"-EU919262

As i a tica-AB297808 As¡atica-AB297812 Helvetica-DQ131912 Helvet/ca-U59723

j EU919256 EU919257 EU919263

Tarasevichae-DQ191466 Tarase vicha e-DQ 168982 T ara se vichae-AF503167 Ta rase vi chae-DQ 168981 -EU919258 - CanadensisAB297809

Рисунок 3. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидной последовательности фрагмента гена цитратсинтазы Rickettsia spp.. Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Линия отражает генетическую дистанцию. Для прототипных последовательностей указан подвид и номер в базе данных GenBank. Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе.

1.1.4 Встречаемость и генетическое разнообразие Ehrlichia spp.

В рамках нашего исследования в числе переносимых клешами патогенов нами были изучены встречаемость и генетическое разнообразие Ehrlichia spp.

ДНК Ehrlichia spp. были обнаружены у 3 из 180 (1,67%) исследованных клешей, собранных в июле 2007 г. Для 3 выявленных вариантов Ehrlichia spp. была определена нуклеотидная последовательность гена дисульфид оксидоредуктазы, используемого для филогенетического анализа Ehrlichia spp. При филогенетическом анализе все выявленные варианты (номера последовательностей в базе данных GenBank EU919248- EU919250) были отнесены к Е. muris (рис. 4).

Таким образом, у иксодовых клещей в биотопах г. Томска и его пригородов было показано наличие ДНК Ehrlichia spp, выявленные варианты были отнесены нами к Е. muris.

§EU919249 1919250 S-AY236484 EU91924B

- Chaffeensis-AF403711

_| Canis-AF403710

lool Canis-DQ124260

Рисунок 4. Филогенетическое дерево, построенное по нуклеотидпой последовательности фрагмента гена дисульфид оксидоредуктазы Ehrlichia spp. Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Линия отражает генетическую дистанцию. Для прототипных последовательностей указан подвид и номер в базе данных GenBank. Жирным шрифтом выделены последовательности, полученные в данной работе.

1.1.5 Микст-инфекции

Наличие у одного клеща сразу нескольких патогенов и, возможно, одновременное заражение ими человека, представляет особую опасность, поскольку при этом усложняется постановка правильного диагноза и назначение адекватного лечения. Для изучения частоты встречаемости микст-инфекций у иксодовых клещей в Томской области мы сравнили полученные данные по инфицированности клещей отдельными возбудителями.

Из 1540 проанализированных проб клещей при ПЦР-анализе на наличие генетических маркеров возбудителей инфекций, переносимых клещами, в 35 пробах было обнаружено наличие двух и более патогенов (табл. 5).

При микст-инфекциях наиболее часто встречаются ВКЭ и боррелии. Они были обнаружены в 32 пробах со смешанными инфекциями. Клещевые риккетсиозы встречаются реже, всего в 12 пробах. Микст-инфицирование характерно для имаго, личинки и нимфы за единичным исключением моноинфицированы, что может объясняться низкой эффективностью трансовариального пути передачи инфекции при преимущественно алиментарном пути заражения.

Таблица 5. Сочетанные инфекции в проанализированных пробах.

Сочетания маркеров Кол-во положительных проб (на 1540 проанализированных) Частота встречаемости сочетанной инфекции (процент от общего числа проб)

ВКЭ + риккетсия 3 0,19

ВКЭ + боррелия 23 1,49

Боррелия + риккетсия 5 0,32

ВКЭ + боррелия + риккетсия 4 0,26

1.2 Вариабельность 5'-НТО вариантов ВКЭ, обнаруженных в г. Томске и его пригородах

Одной из основных задач нашего исследования было изучение генетического разнообразия 5'-НТО природных вариантов ВКЭ. В последовательности 5'-НТО и прилегающего фрагмента гена белка С важными участками являются: фрагменты Y-образующей структуры (А1: 4-16н., А2: 91-104н., В1: 20-29н., В2: 36-45н., С1: 46-65н„ С2: 69-75н.), 2 области, ответственные за циклизацию генома ВКЭ (CS А: 110-128н. и CS В: 164-175н.) и сайт начала трансляции полипротеина AUG (133-135н.).

Анализ важных для репликации участков 5'-НТО выявленных нами вариантов ВКЭ позволил выявить мутации в последовательностях, формирующих У-структуру, а также в обеих областях циклизации (рис. 5). В сайте инициации трансляции мутаций не выявлено. Наибольшее количество замен, в том числе генотип-характерных, было обнаружено в последовательностях участков: А2 - у 20 вариантов (55,5%), С1 - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), Св В - у 9 (25%), А1 - у 5 (13,9%), СБ А - у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%). Участок В2 и сайт начала трансляции полипротеина оказались консервативными у всех изученных вариантов ВКЭ. Несмотря на нуклеотидные замены, вторичная структура РНК, рассчитанная при помощи программы МРоМ V. 3.2, сохранялась для всех вариантов.

Характерных нуклеотидных замен, отличающих варианты ВКЭ, выявленные у клещей I. рекикаШв, от выявленных у I. рау1оуяку1 нами выявлено не было. Было определено влияние генотип-характерных нуклеотидных замен на формирование вторичной структуры РНК 5'-НТО (рис. 6). Как полученные нами варианты, так и прототипные штаммы дальневосточного генотипа ВКЭ имели характерную замену АС вместо ТТ в позициях 40-41 нт и образовывали более прямую шпильку в левом плече У-структуры. Множественные замены в правом плече У-структуры (А», А58в59, Об4, А67ТСТТ71, делеция75, Су^ТТОАТСвг) у штаммов и вариантов дальневосточного генотипа приводят к значительным изменениям её вторичной структуры по сравнению с сибирским и европейским генотипами ВКЭ.

Сибирский генотип А1

AGATTTTCTTGCACGTGC

Zauzaev

Vasilchenko:

ek328

Б0715139*

EU715140*

EU715141*

EU715142*

EU715143*

EU715144*

EU715145*

EU715148*

EU715149*

ËU715150*

EU715151*

EU715152*

EU715174*

EU715154*

EU715155*

EU715156»

EU715157*

EU715158*

EU715159*

EU715160*

EU715161*

EU715163*

EU715146** :

EU715147** :

EU715153** :

Е0715162** :

Сибирский генотип

CS А

* 120 _

Zauzaev : ACAGC Vasilchenko: ek328 EU715139*

ATG

3ATGGCCAGGAAGGCCATTCTGAAAGGAAAC

es В

.GGGGGœGGTéCCC!

:::::::::::::

ICTCGACGAGTGTCGAAAGAGACCGCAAAGAAGACGCG

EV715140* EU715141* EU715142* EU715143* EU715144* EU715145* EU7J5148* EU715149*

EU715154* EU715155* Е0715156* Е0715157* EU715158* EU715159* EÜ715160* EU715161* Е0715163* EU715146** EU715147** EU715153** Е0715162**

А. .GA. CG . А .А.-GA.. CG А A. .GA. . .CG. А :

GA ACG. A

A GA С CGT A

A G. CG AA : A GA CG. A :

Дальневосточный гсногни

20S Glybinnoe MDJ-01 OshimaS-lO : Senzhanq Sof цпНО EU715164* E07X5166* E0715167* EU715168* EP715J73* EÜ715165«* : EU715169** : EO715170** : EU715171** : EU715172** :

Европейский генотип

Рисунок 5. Сравнение нуклеотидных последовательностей 5'-НТО и ]Ч-концевого фрагмента белка С различных штаммов ВКЭ. Выделены области циклизации С8 А и СБ В, фрагменты У-структуры и сайт начала трансляции. Генотипы (сибирский, европейский и дальневосточный) разделены пустыми строками. В названиях природных вариантов обозначен источник выделения: *-1. рекикаШБ, **- /. рау1оу$ку1.

6 \

V/ А

1 >

й а

I L

! v

/ V

' 1

А-

ч / >

V/ л> u

{ !,

rr-rf

J¿

r<y

/0 &

strain 205, dG--31.5 kcalimole

strain Zausaev, dG--32.30: strain Neudoarfl. dG • -3150

Рисунок 6. Вторичные структуры 5'-HTO ВКЭ различных генотипов.

Четыре варианта ВКЭ (два - дальневосточного, два - сибирского генотипа) были троекратно пассированы на культуре клеток РКЕ. В трех случаях (EU715168, EU715164, EU715162) цитопатический эффект не наблюдался и пассирование проводилось вслепую, на четвертом пассаже РНК ВКЭ методом ОТ-ПЦР не обнаруживалась. Четвертый вариант (Коларово-2008) проявил цитопатическое действие уже на втором пассаже и успешно прошел третий пассаж. Нуклеотидные последовательности 5'-НТО адаптированных вариантов были определены дважды в независимых экспериментах. Сравнение нуклеотидных последовательностей исходных (для изолята Коларово-2008 нуклеотидная последовательность исходного варианта определена не была ввиду низкой концентрации вирусной РНК в пробе) и адаптированных вариантов ВКЭ показало, что в процессе адаптации к репликации в культуре клеток 5'-НТО претерпевает существенные изменения, касающиеся в основном элементов Y-структуры (рис. 7). Пассированные варианты Protl, Prot2 и Prot3 приобрели соответственно 14, 21 и 31 нуклеотидную замену в 5'-НТО по сравнению с дикими вариантами. У изолята Коларово-2008 Y-структура в 5'-НТО имеет типичный для сибирского генотипа вид, показанный на рис. 6 (данные не показаны). Некоторые замены, возникающие у адаптированных вариантов по сравнению с исходными, наблюдаются у прототипных штаммов ВКЭ, имеющих большую пассажную историю на животных и культурах клеток. По всей вероятности, эти замены отражают приспособление ВКЭ к репликации в клетках позвоночных хозяев.

Дальневосточный генотип

SoEjinHO

EU715168

PROT1

EU715164

PROT2

AGATTTTCTTGCACGTGCC

Сибирский генотип

Vasilchenkc EU715162 PROT3 Kolarovo

G. .Т. Д.С. .GTT. .Т.СТ. . .С..GTT.СТ.СТ.. ...GGTTACT.CT.. G.C..GTT.СТ.СТ..

Дальневосточный генотип

CS А АТС

SofjinHO

Е0715168

PROT1

EÜ715164

PROT2

CTTAGGÄGAACAAGAGGTGGGGA1:

CS В

* 160 * 180 * 200 * 220 LTGGCCGGGAAGGCCATTCTGAAAGGAAAAGGGGGCGGTCCCCCTCGACGAGTGTCGAAAGAGACCGCGAAGAAGACGCGTCAATCTA : 219

Сибирский генотип

Vasilchenko: E0715162 PROT3 Kolarovo

Рисунок 7. А - выровненные нуклеотидные последовательности 5'-НТО и Ы-концевого фрагмента гена белка С диких и адаптированных вариантов ВКЭ, а также прототипных штаммов Софьин и Васильченко. Выделены области циклизации СБ А и СБ В, фрагменты У-структуры и сайт начала трансляции; В - вторичные структуры 5'-НТО диких (сверху) и адаптированных (снизу) вариантов ВКЭ.

1.3 Описание биологических свойств и анализ генома штамма Глубинное/2004

Для анализа полной нуклеотидной последовательности нами был выбран штамм Глубинное/2004 ВКЭ.

Исследования динамики роста штамма Глубинное/2004 в культуре клеток РКЕ (рис. 8), проведенные Е.В. Протопоповой путем определения титра вируса и измерением уровня синтеза белка Е при помощи меченых антител, показали, что через 12 часов после инфицирования урожай вируса составил 6,2 log ТЦПД50МЛ"' (для штамма 205 этот показатель составил 3,7 log ТЦЦДомл"'), а через 24 часа - 7,5 log ТЦПД50МЛ"1 (6,5 log ТЦПД50МЛ"1 для штамма 205). Таким образом, на ранних сроках инфицирования клеток (12-24 часа) штамм Глубинное/2004 дает урожай инфекционного вируса до 250 раз больший, чем штамм 205 ВКЭ.

Нами была определена полная нуклеотидная последовательность генома штамма Глубинное/2004 и проведен анализ выведенной из нее аминокислотной последовательности.

Нуклеотидная последовательность штамма Глубинное/2004 составила 10886 н. (номер последовательности в базе данных GenBank - DQ862460). При сравнении с прототипными штаммами ВКЭ процент гомологии составил 82,7-95,2% для нуклеотидной и 91,0-98,4% для аминокислотной последовательностей.

Филогенетический анализ показал, что штамм Глубинное/2004 относится к дальневосточному субтипу ВКЭ, формируя в нем отдельную подветвь (рис. 9). Оценка времени дивергенции с использованием средней частоты синонимичных мутаций показала, что расхождение штамма Глубинное/2004 с группой MDJ-Senzhang произошло 300-470 лет назад, а с группой Oshima-Софьин - 320-490 лет назад.

I 12 15 18 24 36 часы после инфицирования

Рисунок 8. Динамика роста штаммов Глубинное/2004 и 205 в культуре клеток РКЕ. ■ -Глубинное/2004, урожай вируса, ♦ - 205, урожай вируса, • - Глубинное/2004, оптическая плотность, А - 205, оптическая плотность.

юр [ Рптогуе-86 Рптогуе-270 Рптогуе-212 Рптогуе-253 Рптогуе-69 0зЫта5-Ю 205

Нург ЫеисЗоегА

[.оирюд ¡1 ЗрагизИ эЬеер

Рисунок 9. Филогенетическое дерево известных на декабрь 2008 г. полноразмерных нуклеотидных последовательностей ВКЭ. Анализ проведен методом «объединения ближайших соседей» с использованием двухпараметрической модели Кимуры. Линия отражает генетическую дистанцию. Штамм Глубинное/2004 выделен жирным шрифтом.

В нуклеотидной последовательности 5'-НТО штамм Глубинное/2004 по сравнению со штаммом 205 имеет нуклеотидные замены Т30—>С и Т35—>С, находящиеся в функционально важной области петли левого плеча Y-структуры (участок Р). Вторичная структура при этом осталась неизменной, однако известно, что мутации в данной области способны сильно влиять на уровень репликации вируса в клетках. Данные замены, вероятно, также могут являться одним из факторов, обусловливающих повышенную скорость репликации штамма Глубинное/2004 в культуре клеток РКЕ.

Был выявлен ряд различий в аминокислотной последовательности полипротеина штамма Глубинное/2004 в сравнении со штаммами 205 и Софьин. При сравнении с штаммом Софьин было выявлено 57 аминокислотных замен, с штаммом 205 - 53 замены (табл. 6). Большая их часть локализуется в последовательностях белков NS3, NS5 и CTHD. Изменения коснулись сайтов процессинга полипротеина в областях C/CTHD, CTHD/prM, ргМ/М, E/NS1, NS2B/NS3. Заменами в сайтах процессинга структурных вирусных белков, в особенности в области CTHD, может также объясняться повышенная скорость репликации штамма Глубинное/2004 в культуре клеток РКЕ.

Таблица 6. Аминокислотные замены в полипептиде штамма ВКЭ Глубинное/2004 по сравнению со штаммами 205 и Софьин. __

ген Аминокислотные замены Глубинное/2004 —> 205 или Софьин Измененные сайты процессинга Всего замен 205/Софьин

205 Софьин

С Нет М„ — L; A,4 — V; Nu-К Нет 0/3

CTHD A,»'-V;I,„,,-V; Mül —|;МШ« —V; F,„--L А»»'-V; !,„»-. V;M,„ — L;M,,3* — V;F,u*-> L С/СТНО (RGKRR/SAA*DW) С/ргМ (GM*TF*A/ATVRK) 5/5

ргМ Нет Her Нет 0/0

М R:,o* - Р R2io*-P; 1246 —M; 1.« — v ргМ/М (SRTRR/SVL1R*) 1/3

Е Ksok —♦ R; I597 —' Т; Тнй — N; V„, — А A433 -» V; Ts46 — N; M™ — V; G„, — S Нет 4/4

NS1 G7K0 — С; K.:.¡ —» R; -* Р; 'mí' — т 1,»5з-T; V„22-l М«1 (ЕОУОАЛЭУСО'А) 4/2

NS2A Rimo — К; Ri;i7 —S; G[2SO —* S; G1277 — Е; Сим — Y Rlixo-* Kj R1227 —'> S; G|2so —* S; G1277 Е; !,,<* —T: Ai:97-V Нет 5/6

NS2B V.421 - М V,423 — M Нет 1/1

NS4A D,„, — Ii — А DD-J.I —* E; A2J73 —* G Нет 2/2

NS4B M2213 — L; l23i4-> M; A2331 — V; V2349 — I; A,4„ — V м2283 - V; F2347 - L; S2457 —* А Нет 5/3

NS5 K2625 — R; A2757—> G; G275K —» D; E3013 —» G; S3014 — P; G3033 —* L; K3074 — R; V30S0 —* l; S,i«, — G; P3251 — R; V32W — I; 13297 -V; V3342 — I; K33X9 — E; Y,.,,,, — D; N«»,— E KJ526 -R;M264,-V; A2757 — G; G2758 — D; E3013 — G; Y3030 — H; Vioxo — I. R31K8 — G; P3251 - R; '32.7 - V; V3342 — 1; v¡343 — A; R3384 — К. K1344 — E; Y,4„, — D; N,4„6 — E Нет 16/16

всего 5 53/57

* - замены в сайтах процессинга полипротеина.

Выводы

1. Изучена временная динамика выявления генетических маркеров ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., и Ehrlichia spp. в иксодовых клещах, собранных в течение эпидемического сезона в городских и пригородных биотопах г. Томска. Показано, что пик зараженности клещей всех стадий развития вирусом клещевого энцефалита приходится на май и июль (уровень зараженности 4,7-5,8%), Borrelia spp. - на май (9,6%), Rickettsia spp. - на июнь (4,8%). Встречаемость Ehrlichia spp. составила 1,67%. В 2,3% проб выявлены два и более инфекционных агента. При этом генетические маркеры Babesia spp., Bartonella spp. и ВП в исследованных образцах нами обнаружены не были.

2. Определены нуклеотидные последовательности и проведен филогенетический анализ 5'-НТО геномов выявленных вариантов ВКЭ, фрагментов ДНК бактерий и простейших. Показано присутствие в городских и пригородных биотопах г. Томска представителей двух генотипов ВКЭ, Borrelia garinii, Ehrlichia muris и Rickettsia spp. (R. tarasevichae и риккетсии, близкие к R. raoultii, возможно, являющиеся представителями нового подвида рода Rickettsia). Для вариантов ВКЭ, выявленных в пригородных биотопах, сибирский генотип определен в 89,5% случаев, дальневосточный в 10,5%, а в городских биотопах соответственно в 53,0% и 47,0% случаев.

3. Уровень гомологии 5'-НТО геномной РНК ВКЭ составил 95% для дальневосточного и 89% для сибирского генотипов. Сибирский генотип представлен тремя генетическими группами, дальневосточный - двумя. Среди 36 исследованных вариантов ВКЭ мутации были выявлены в следующих участках Y-структуры 5'-НТО: А2 - у 20 вариантов (55,5%), С1 - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), CS В - у 9 (25%), А1 - у 5 (13,9%), CS А - у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%).

4. Секвенирование и последующий анализ генома высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004 показали, что он относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, предположительно формируя в нем отдельную ветвь. Оценка времени дивергенции с использованием средней частоты синонимичных мутаций показала, что расхождение штамма Глубинное/2004 с группой MDJ-Senzhang произошло 300-470 лет назад, а с группой Oshima-Софьин - 320-490 лет назад.

5. Последовательность полипротеина штамма Глубинное/2004 по сравнению со штаммами 205 и Софьин имеет, соответственно, 53 и 57 аминокислотных замен. Наибольшие изменения выявлены в последовательностях вирусных белков NS3 (10 и 12 аминокислотных замен по сравнению со штаммами 205 и Софьин, соответственно), NS5 (по 16 замен, соответственно) и функционально важном домене CTHD белка С (по 5 замен на последовательность в 20 а.о., соответственно). Выявлены замены в сайтах процессинга вирусного полипротеина C/CTHD, CTHD/prM, prM/M, E/NS1, NS2B/NS3. В нуклеотидной последовательности участка Р Y-структуры 5'-НТО обнаружены замены Тзо—»С и Т35—>С.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V. and Loktev V.B. Novel variant of Tick-borne encephalitis virus, Russia // Emerg. Infect. Dis.- 2007.- 13- P. 1574-1578.

2. Москвитина H.C., Романенко B.H., Терновой B.A., Иванова Н.В., Протопопова Е.В., Кравченко Л.Б., Кононова Ю.В., Куранова В.Н., Чаусов Е.В., Москвитин С.С., Першикова Н.Л., Гашков С.И., Коновалова С.Н., Большакова Н.П., Локтев В.Б. Выявление вируса Западного Нила и его генотипирование в иксодовых клещах (Parasitiformes: Ixodidae) в Томске и его пригородах // Паразитология,- 2008.- 42(3)-С.210-225.

3. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Bondarenko T.Yu., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V., Loktev V.B. Novel Variant Of Tick-Borne Encephalitis Virus From Far-Eastern Region Of Russia. // Российско-британский семинар молодых ученых "Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza". Россия, г. Новосибирск, 2006. Тезисы опубликованы в сборнике материалов конференции.

4. Терновой В.А., Протопопова Е.В., Чаусов Е.В., Бондаренко Т.Ю., Новиков Д.В., Леонова Г.Н., Нетесов С.В., Локтев В.Б. Нуклеотидная последовательность генома нового варианта клещевого энцефалита, изолированного в Приморском крае. // Юбилейная конференция, посвященная 70-летию открытия клещевого энцефалита. Россия, г. Владивосток 2007. Тезисы опубликованы в Дальневосточном журнале инфекционной патологии, 2007, 11:119.

5. Chausov E.V., Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V., Loktev V.B. Novel variant of tick-borne encephalitis virus from far eastern region of Russia. // XIV International Congress of Virology, 10-15 August 2008, Istanbul, Abstract Book, - P. 74-75.

Благодарности

Автор выражает благодарность своим коллегам, в тесном сотрудничестве с которыми

была выполнена диссертационная работа, а именно: д.б.н., проф. С.В. Нетесову, д.б.н. В.Б.

Локтеву, к.б.н. С.Н. Коноваловой, Ю.В. Кононовой, Н.Л. Першиковой, д.б.н. Г.Н.

Леоновой. Автор благодарен Е.В. Протопоповой за помощь в части культивирования

ВКЭ. Автор благодарен сотрудникам кафедры зоологии позвоночных и экологии

Томского государственного университета Н.С. Москвитиной, С.С. Москвитину, В.Н.

Романенко, Н.В. Ивановой, Н.П. Большаковой, Н.В. Курановой, И.Г. Коробицину, С.И.

Гашкову, О.Ю Тютенькову за предоставленные образцы клещей.

Чаусов Евгений Владимирович

Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.

Автореф. дисс. на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать 11.03.2009. Заказ № 12. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Чаусов, Евгений Владимирович

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Характеристика вируса клещевого энцефалита

2.2. Строение и свойства ВКЭ

2.3. Репликативный цикл флавивирусов

2.4. Генетическое разнообразие ВКЭ и географическое распределение генотипов

2.5. Клиническая характеристика КЭ

2.6. Клинические особенности заболевания в зависимости от генотипа ВКЭ

2.7. Молекулярные основы патогенности ВКЭ

2.8. Методы филогенетического и эволюционного анализа

2.9. Патогенные бактерии и простейшие, переносимые клещами

2.9.1. Клещевой боррелиоз

2.9.2. Клещевой эрлихиоз

2.9.3. Клещевой риккетсиоз

2.9.4. Клещевой бабезиоз

2.9.5. Клещевые бартонеллезы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004"

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) был открыт в 1937 г. на Дальнем Востоке СССР (Зильбер, 1939) и является прототипным представителем одноименного серокомплекса, в который включают ВКЭ, вирус омской геморрагической лихорадки (ОГЛ), вирус Лангат, вирус Повассан (ВП), вирус Киассанурской лесной болезни, вирус шотландского энцефаломиелита овец и др. Основными переносчиками ВКЭ являются иксодовые клещи Ixodes persulcatus и Ixodes ricinus; заражение происходит при присасывании зараженного клеща, а также при употреблении молока от зараженных коров и коз (Погодина, 1958). ВКЭ вызывает у людей заболевание центральной нервной системы с уровнем смертности 1-30% (Погодина и др., 1986, Злобин и Горин, 1996), называемое клещевым энцефалитом (КЭ).

В Российской Федерации в период с 1990-х по 2000 год отмечен резкий подъем заболеваемости КЭ вплоть до 11000 случаев в год (Львов и Злобин, 2007). В настоящее время средняя заболеваемость КЭ в Российской Федерации снизилась, однако в ряде регионов Урала, Сибири и Дальнего Востока рост заболеваемости (до 30 случаев КЭ на 100 тыс. населения) наблюдается и в настоящее время (Львов и Злобин, 2007). По данным Роспотребнадзора, ежегодно в Российской Федерации регистрируется от 232 тыс. до 318 тыс. человек, пострадавших от укусов клещей (http://www.rospotrebnadzor.ru). Среди пострадавших доля привитых лиц составляет не более 7-9%, а экстренную серопрофилактику получает не более 53-57%. Роспотребпадзором РФ охват населения вакцинацией и экстренной профилактикой КЭ признан недостаточным. На низком уровне остаются также экстренная дифференциальная диагностика клещевых инфекций и мониторинг энтомологического состояния природных очагов.

Наряду с увеличением количества случаев КЭ также имеется тенденция к нарастанию тяжести заболевания с увеличением доли менингеальных и очаговых форм

Волкова и Образцова, 2002). Настороженность вызывает и возникновение новых форм КЭ, таких как КЭ с геморрагическим синдромом (Ternovoi et al., 2003).

Актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии ВКЭ в настоящее время являются уточнение ареала распространения его генотипов, отслеживание изменений в географическом распространении генотипов, изучение вариабельности ВКЭ на уровне генотипа, а также изучение свойств штаммов, существенно отличающихся от основных 3 генотипов (Злобин и др., 2007).

Небольшое на сегодняшний день количество полностью определенных последовательностей вирусных РНК различных штаммов ВКЭ (менее 30 полноразмерных последовательностей, опубликованных в базе данных GenBank) не отражает широкого спектра генетического разнообразия вируса и не позволяет определить мутации, приводящие к повышению патогенности вируса. Определение полных нуклеотидных последовательностей и молекулярно-генетический анализ современных, в особенности -необычных штаммов ВКЭ, проявляющих высокую патогенность, является важной задачей для установления ключевых моментов в молекулярной биологии ВКЭ и патогенезе КЭ. Таким образом, детальный анализ генома нового высокопатогенного штамма Глубинное/2004 в сравнении с известными штаммами и природными вариантами ВКЭ также представляется важной научной задачей.

Еще одной актуальной проблемой молекулярной биологии ВКЭ в настоящее время является изучение роли нетранслируемых областей генома в репликации вируса. В ряде работ (Filomatori et al., 2006; Alvarez et al., 2008; Li et al., 2008) 5'-нетранслируемая область генома (5'-НТО) флавивирусов идентифицирована как промотор репликации. В опубликованных данных, однако, содержатся указания на то, что вариабельность 5'-НТО флавивирусов составляет до 55,5% (Casati et al., 2006), что может обуславливать адаптацию вируса к различным хозяевам (Gritsun et al., 2006а-с, Gritsun et al., 2007a-b, Khromykh et al., 2003). Исследования вариабельности 5'-НТО были проведены лишь для вариантов ВКЭ европейского генотипа, выделенных из клещей I. ricinus. Для сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ у клещей I. persulcatus и I. Pavlovskiy подобных данных не опубликовано. Томская область является регионом, высокоэндемичным по клещевым инфекциям, и в силу этого представляет большой интерес для изучения вариабельности 5'-НТО у природных вариантов ВКЭ и их генетического разнообразия.

Иксодовые клещи также являются переносчиками возбудителей многих других инфекционных заболеваний человека и животных (простейших, бактерий и вирусов): энцефалит Повассан, клещевой боррелиоз, клещевой риккетсиоз, моноцитарный эрлихиоз человека, бабезиоз и zip.(Aleksecv et al., 2004), клинические проявления которых в ряде случаев могут ошибочно трактоваться как КЭ (Коренберг, 2002, Korenberg and Likhacheva, 2006). У иксодовых клещей выявляются также вирус Западного Нила (Львов и Ильичев, 1979, Москвитина и др., 2008) и возбудитель бартопеллеза (Morozova et al., 2004), однако роль клещей в передаче данных инфекций человеку не доказана.

В природных очагах (Европа и Европейская часть России, Урал, Сибирь, Дальний Восток, Казахстан, Япония) у клещей выявлено совместное наличие двух и более возбудителей инфекций и показано возникновение микст-инфекций у человека (Alekseev et al., 2004, Hilpertshauser et al., 2006, Majlathova et al., 2006, Shpynov et al., 2004, Shpynov et al., 2006, Tabara et al., 2007, Zamoto et al, 2004). Ценными в научном и клиническом плане являются сведения о степени распространенности различных возбудителей, а также их уточненный видовой состав в очагах клещевых инфекций на территории Российской Федерации (Злобин и др., 2007). Учитывая тот факт, что комплексных исследований встречаемости клещевых инфекций в Томской области до настоящего времени не проводилось, мы решили не ограничиваться ВКЭ в изучении спектра переносимых клещами патогенов.

Эти данные представляют практическую ценность для развития и совершенствования дифференциальной диагностики переносимых клещами инфекций у лиц, пострадавших от укусов клещей.

Цели и задачи исследования:

Целями работы являлись изучение встречаемости и генетического разнообразия ВКЭ и других переносимых клещами инфекций в городских и пригородных биотопах г. Томска, а также секвенирование и молекулярно-генетический анализ генома нового штамма ВКЭ, вызвавшего особо тяжелую быстротекущую форму заболевания энцефалитом (штамм Глубинное/2004).

В связи с этими целями, основными задачами исследования были:

1. Создание коллекции ДНК и РНК, выделенных из иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска.

2. Выявление РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших в образцах иксодовых клещей, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске, и определение соотношения встречаемости данных патогенов в клещах.

3. Секвенирование и молекулярно-генетический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.

4. Изучение генетического разнообразия 5'-НТО геномной РНК в природных вариантах ВКЭ и анализ нуклеотидных замен, появляющихся в процессе адаптации изолятов ВКЭ к клеткам почки эмбриона свиньи (РКЕ. cells).

5. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов геномов вновь выявленных вариантов ВКЭ, фрагментов ДНК бактерий и простейших и их молекулярно-генетический анализ.

Научная новизна и практическая ценность работы:

1. Впервые комплексно определена встречаемость геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp. (в том числе в виде совместных инфекций) в иксодовых клещах, собранных в течение эпидемического сезона в г. Томске и его пригородах.

2. На территории г. Томска обнаружены варианты ВКЭ дальневосточного генотипа.

3. Изучена изменчивость 5'-концевой (промоторной) области генома природных вариантов ВКЭ сибирского и дальневосточного генотипов при пассировании их на культуре клеток РКЕ.

4. Определена полная нуклеотидная последовательность нового высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004, проведен молекулярно-генетический анализ его генома и описаны области генома, замены в которых, возможно, определяют его высокую патогенность для человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методами ПЦР-анализа с последующим секвенированием установлено, что в исследованных образцах клещей встречаемость ВКЭ составила 6,5±1,9%, Borrelia spp. - 8±3%, Rickettsia spp. -4,5±2,4%, Ehrlichia spp. -1,67%.

2. Уровень гомологии 5'-НТО геномной РНК ВКЭ составляет 95% для дальневосточного и 89% для сибирского генотипов. Среди исследованных вариантов ВКЭ мутации были выявлены в следующих участках Y-структуры 5'-НТО: А2 - у 20 вариантов (55,5%), С1 - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), CS В - у 9 (25%), AI - у 5 (13,9%), CS А - у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%).

3. Штамм Глубинное/2004 относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, формируя в нем отдельную ветвь, и по сравнению со штаммами 205 и Софьин несет соответственно 53 и 57 аминокислотных замен. Наибольшие изменения обнаружены в вирусных белках NS3 (10 и 12 аминокислотных замен, по сравнению со штаммами 205 и Софьин, соответственно), NS5 (по 16 замен) и CTHD (по 5 замен на последовательность в 20 а.о.). Изменены сайты процессинга вирусного полипротеина C/CTHD, CTHD/prM, prM/M, E/NS1, NS2B/NS3. В участке Р Y-структуры 5'-НТО обнаружены замены Тзо—>С и Т35—»С.

Вклад автора:

1. Создание коллекции образцов ДНК и РНК, выделенных из иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска.

2. Расчет и тестирование олигонуклеотидных праймеров для генодиагностики и генотипирования РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших, переносимых иксодовыми клещами.

3. Выявление РНК ВКЭ и ДНК бактерий и простейших в образцах иксодовых клещей и определение нуклеотидных последовательностей выявленных вариантов.

4. Филогенетический анализ фрагментов геномов вариантов ВКЭ, бактерий и простейших, выявленных в городских и пригородных биотопах г. Томска.

5. Определение полной нуклеотидной последовательности и молекулярно-генетический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004.

Апробация работы:

По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных для опубликования основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Результаты работы были представлены на конференциях:

• Российско-британский семинар молодых ученых "Emerging Diseases: Tick-transmitted and influenza". Россия, г. Новосибирск, 2006.

• Юбилейная конференция, посвященная 70-летию открытия клещевого энцефалита. Россия, г. Владивосток, 2007.

• XIV International Congress of Virology, Турция, г. Стамбул, 2008. Полученные в ходе выполнения работы нуклеотидные последовательности штамма

Глубинное/2004 и фрагментов геномов ВКЭ, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp. депонированы в базу данных GenBank (номера DQ862460, EU715139 - EU715174, EU919251 - EU919255, EU919256 - EU919263, EU919248 - EU919250, FJ640555).

Структура и объем диссертации:

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 143 страницах, содержит 30 рисунков и 12 таблиц. Список использованной литературы включает 191 источник, в том числе 138 опубликованных в иностранных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Чаусов, Евгений Владимирович

6. Выводы

- на июнь (4,8%). Встречаемость Ehrlichia spp. составила 1,67%. В 2,3% проб выявлены два и более инфекционных агента. При этом генетические маркеры Babesia spp., Bartonella spp. и ВП в исследованных образцах нами обнаружены не были.

2. Определены нуклеотидные последовательности и проведен филогенетический анализ 5'НТО выявленных вариантов ВКЭ, фрагментов ДНК бактерий и простейших. Показано присутствие в городских и пригородных биотопах г. Томска представителей двух генотипов ВКЭ, Borrelia garinii, Ehrlichia muris и Rickettsia spp. (R. tarasevichae и риккетсии, близкие к R. raoiillii, возможно, являющиеся представителями нового подвида рода Rickettsia). Для вариантов ВКЭ, выявленных в пригородных биотопах, сибирский генотип определен в 89,5% случаев, дальневосточный в 10,5%, а в городских биотопах соответственно в 53,0% и 47,0% случаев.

3. Уровень гомологии 5'-НТО геномной РНК ВКЭ составил 95% для дальневосточного и 89% для сибирского генотипов. Сибирский генотип представлен тремя генетическими группами, дальневосточный — двумя. Среди 36 исследованных вариантов ВКЭ мутации были выявлены в следующих участках Y-структуры 5'-НТО: А2

- у 20 вариантов (55,5%), С1 - у 18 (50%), С2 - у 12 (33,3%), CS В - у 9 (25%), AI - у 5 (13,9%), CS А - у 3 (8%), В1 - у 1 (2,8%).

4. Секвенирование и последующий анализ генома высокопатогенного штамма ВКЭ Глубинное/2004 показали, что он относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, формируя в нем отдельную ветвь. Оценка времени дивергенции с использованием средней частоты синонимичных мутаций показала, что расхождение штамма Глубинное/2004 с группой М0.1-8епг1шщ произошло 300-470 лет назад, а с группой ОзЫта-Софьин - 320-490 лет назад.

5. Последовательность полипротеина штамма Глубинное/2004 по сравнению со штаммами 205 и Софьин имеет, соответственно, 53 и 57 аминокислотных замен. Наибольшие изменения выявлены в последовательностях вирусных белков N83 (10 и 12 аминокислотных замен по сравнению со штаммами 205 и Софьин, соответственно), N85 (по 16 замен соответственно) и функционально важном домене СТНБ белка С (по 5 замен на последовательность в 20 а.о. соответственно). Выявлены замены в сайтах процессинга вирусного полипротеина С/СТНГ), СТТГО/ргМ, ргМ/М, Е/7Ч81, ^2В/№!3. В нуклеотидной последовательности участка Р У-структуры 5'НТО обнаружены замены Тзо—>С и Т35—>С.

5. Заключение

Актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии ВКЭ в последние годы являются уточнение ареалов распространения его генотипов, изучение вариабельности ВКЭ на уровне генотипов и отдельных генов и некодирующих областей генома, а также изучение биологических свойств и особенностей генома штаммов, проявляющих особые свойства. Весьма ценными в научном и практическом плане являются также сведения о распространенности других переносимых клещами инфекций, их видовом разнообразии и устойчивости к лекарственным препаратам.

В соответствии с этим, нами была исследована распространенность и генетическое "разнообразие ВКЭ, боррелий, риккетсий и эрлихий в городских и пригородных биотопах г. Томска, а также определена и проанализирована нуклеотидная последовательность высокопатогенного для человека штамма ВКЭ Глубинное/2004 (дальневосточный генотип).

В биотопах г. Томска обнаружены варианты ВКЭ сибирского и дальневосточного субтипов и установлена преимущественная локализация дальневосточного субтипа ВКЭ в городской черте. Данный факт дает основания предположить, что дальневосточный субтип ВКЭ распространился в регионе, эндемичном для сибирского субтипа, посредством деятельности человека. По всей вероятности, штаммы дальневосточного субтипа были завезены в г. Томск с инфицированными грызунами и/или клещами, находящимися в грузах, идущих с Дальнего Востока РФ, и нашли благоприятную экологическую нишу в городских биотопах, распространяясь в настоящее время и на территорию пригородов. Большую настороженность вызывает факт обнаружения варианта ВКЭ, весьма схожего по секвенированному нами фрагменту генома со штаммом 205, в черте г. Томска, где на базе именно этого штамма в течение около 25 лет производится и тестируется на животных вакцина от клещевого энцефалита. Для других регионов Сибири публикации о степени распространенности дальневосточного генотипа

ВКЭ в настоящее время отсутствуют, хотя фиксируются отдельные летальные случаи КЭ, вызванного штаммами именно дальневосточного генотипа (Ternovoi V.A. et al., 1999). Учитывая потенциально более высокую патогенность для' человека штаммов дальневосточного субтипа ВКЭ по сравнению с сибирским, их дальнейшее распространение в густонаселенных городских районах может серьезно ухудшить эпидемиологическую обстановку по этому возбудителю. В связи с этим представляется целесообразным проведение молекулярпо-эпидемиологического мониторинга по этому возбудителю в пригородах и парках сибирских городов и усиление мер по профилактике заболеваемости КЭ в виде вакцинации с охватом более значительной, чем сейчас, части населения в этих районах.

Выявленное нами разнообразие генетических групп вариантов сибирского субтипа ВКЭ свидетельствует о продолжительной эволюции данного субтипа (эндемичности) на территории г. Томска и области. Так, среди выявленных вариантов сибирского субтипа ВКЭ обнаружены представители генетической группы, прототипным представителем которой является штамм Zausaev, что подтверждает происхождение данного штамма именно из г. Томска. Циркуляция Zausaev-подобных вариантов ВКЭ на территории г. Томска и его пригородов продолжается, и таким образом сохраняется возможность появления новых случаев долговременного хронического инфицирования ВКЭ человека, что является еще одним доводом в пользу проведения широкомасштабной вакцинации населения.

Нами также было выявлено, что иксодовые клещи в городских и пригородных биотопах г. Томска также являются переносчиками таких патогенов как Borrelia garinii (генетически приближенных к японским вариантам), Rickettsia spp. (R. tarasevichae, генетически близких к сибирским вариантам, и риккетсий, близких к R. raoultii, возможно являющихся представителями нового подвида рода Rickettsia) и Ehrlichia muris. Вместе с тем, вирус Повассан, бабезии и бартонеллы у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска нам обнаружить не удалось, несмотря на использование описанных в литературе пар праймеров для ПЦР.

Необходимо отметить, что в ходе работы нами выявлено совместное носительство иксодовыми клещами сразу нескольких патогенов, опасных для человека. Это указывает на возможность развития микст-инфекций у людей, подвергшихся укусу клеща, и доказывает необходимость дифференциальной лабораторной диагностики возбудителей переносимых клещами инфекций с целью их полной идентификации и проведения адекватного лечения.

У ряда штаммов ВКЭ определены генотип-характерные пуклеотидные замены в 5'-НТО и показана изменчивость последовательности 5'-НТО при пассировании вариантов ВКЭ, выделенных из иксодовых клещей, на культуре клеток млекопитающих. Эта изменчивость вернее всего отражает процесс отбора вариантов ВКЭ, более приспособленных для репликации в клетках позвоночных, из популяции квазивида. Отобранные варианты ВКЭ содержат мутации, характерные для штаммов, неоднократно пассированных на лабораторных животных и/или культурах клеток млекопитающих.

Нами определена полная нуклеотидная последовательность штамма Глубинное/2004 ВКЭ, и проведен анализ его генома с целью выявления мутаций, обусловливающих быстрое течение инфекции, вызванной данным штаммом. По нашим предположениям, высокая патогенность штамма Глубинное/2004 может быть объяснена усилением скорости репликации РНК, связанным с изменениями в промоторной области (мутации Тзо—^С и Т35—>С), белках NS3 и NS5 и/или ускоренным созреванием вирионов, вызванным мутациями в сайтах процессинга структурных вирусных белков. Это подтверждается повышенной (в сравнении с штаммом 205) скоростью репликации штамма Глубинное/2004 в культуре клеток на ранних сроках (12-24 часа) после инфицирования (см. рис. 21). В результате, скорость развития инфекции существенно опережает ответ иммунной системы, что и может приводить к ускоренному летальному исходу.

Следует отметить, что штамм Глубинное/2004 стоит особняком в генетической ветви дальневосточного генотипа. Проведенная нами оценка времени дивергенции с использованием средней частоты синонимичных мутаций показала, что расхождение штамма Глубинное/2004 с группой МВ1-8епг11аг^ произошло 300-470 лет назад, а с группой ОяЫта-Софьин — 320-490 лет назад. Это, в свою очередь, свидетельствует о возможности существования и других вариантов дальневосточного генотипа, промежуточных по набору генетических отличий и биологических свойств.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Чаусов, Евгений Владимирович, Кольцово

1. Алексеев А.Н. Современное состояние знаний о переносчиках клещевого энцефалита // Вопр. Вирусол.- 2007.- №5- С. 22-26.

2. Аммосов А.Д. Клещевой энцефалит. -Кольцово, 2002.

3. Бахвалова В.Н., Pap В.А., Ткачев С.Е., Добрикова Е.Ю., Морозова О.В. Генетический анализ штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири // Вопр. Вирусол.- 2000,- №5- С. 11-13.

4. Бахвалова В.Н., Караванов A.C., Матвеев Н.Э., Матвеева В.А., Морозова О.В. Исследование с помощью моноклональных антител антигенов Е и NS1 штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири // Вопр. Вирусол.- 2001.- №6- С. 33-36.

5. Богачек М.В., Протопопова Е.В., Терновой В.А., Качко A.B., Иванова A.B., Иванисенко В.А., Швалов А.Н., Локтев В.Б. Иммунохимические свойства белка ргМ и С-концевого фрагмента белка M вируса Западного Нила // Молекул, биол.-2007.- №41- С.8-17.

6. Борисов В.А., Ющук Н.Д., Малов И.В., Аитов К.А. Особенности клещевого энцефалита в различных регионах. // Эпидемиология и инфекц. бол.- 2000.- №2- С. 43-47.

7. Волкова Л.И., Образцова Р.Г. Клиническая картина острого клещевого энцефалита на Среднем Урале // Клещевой энцефалит. Владивосток, 2002.- С. 88-98.

8. Воробьева М.С. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита // Клещевой энцефалит. Владивосток, 2002.- С. 166-170.

9. Вотяков В.И., Злобин В.И., Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии. -Новосибирск, 2002.

10. Временные методические указания по изучению природных очагов клещевого энцефалита и оценке эффективности противоэнцефалитных мероприятий. Министерство здравоохранения РСФСР. М., 1959.

11. Гайдамович С.Я. Клещевой энцефалит // Здоровье населения и среда обитания -1996.-№4- С. 19-22.

12. Гурарий P.M. Клиническая характеристика клещевого энцефалита в Приморском крае по материалам вспышки 1956г. / Тезисы доклада научной конференции по вопросам краевой патологии АМН СССР в Иркутске. -М. 1957, е. 22.

13. Зильбер JI.A. Весенний (весеннее-летний) клещевой энцефалит // Арх. биол. наук -1939,- Т. 56- Вып. 2- С. 9-37.

14. Злобин В.И., Горин О.З. Клещевой энцефалит. Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири. -Новосибирск, Наука, 1996.

15. Злобин В.И., Газо М.Х., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Верхозина М.М., Козлова И.В., Адельшин Р.В., Дорощенко Е.К. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого энцефалита // Вопр. Вирусол.- 2001,-№4- С. 43-47.

16. Злобин В.И. Клещевой энцефалит в Российской Федерации: современное состояние проблемы и стратегия профилактики // Вопр. Вирусол.- 2005.- №3- С. 26-32.

17. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Адельшин Р.В., Козлова И.В., Беликов С.И., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Исаева Е.И., Гришечкин А.Е. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита // Вопр. Вирусол.- 2007.-№6-С. 4-13.

18. Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Руководство для врачей. -Новосибирск, 2001.

19. Карань JI.C., Браславская С.И., Мязин А.Е. Развитие методов детекции и генотипирования вируса клещевого энцефалита на основе амплификационных технологий. // Вопр. Вирусол. 2007, №6, с. 17-22.

20. Коренберг Э.И. Микст инфекции, передающиеся иксодовыми клещами: актуальные аспекты изучения и профилактики. // Клещевой энцефалит. Под ред. Леоновой Г.Н., Сомовой-Исачковой Л.М. 2002, Владивосток.

21. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М., Кругляк С.П., Майстровская О.С. Патогенетические критерии оценки вирулентности штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на юге Дальнего Востока. // Вопр. вирусол., 1995, №4, 165-169.

22. Леонова Г.Н. Клещевой энцефалит в Приморском крае. // Владивосток, 1997.

23. Леонова Г.Н., Исачкова Л.М., Борисевич В.Г.,' Фисенко А.Ю. Экспериментальный клещевой энцефалит у золотистых хомячков на фоне специфической иммунотерапии. // Вопр. Вирусол. 2000, №4, с. 28-33.

24. Леонова Г.Н., Беликов С.И., Павленко Е.В., Кулакова Н.В., Крылова Н.В. Биологическая и молекулярно-генетическая характеристика дальневосточной популяции вируса клещевого энцефалита и ее патогенетическое значение. // Вопр. Вирусол. 2007, №6, с. 13-17.

25. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов C.B. Молекулярно-генетическая характеристика вируса клещевого энцефалита. // Вопр. Вирусол. 2007, №5, с. 10-16.

26. Львов Д.К., Ильичев В.Д. Миграции птиц и перенос возбудителей инфекций. // М.: Наука, 1979.

27. Львов Д.К., Злобин В.И. Стратегия и тактика профилактики клещевого энцефалита на современном этапе. // Вопр. Вирусол. 2007, №5, с. 26-30.

28. Мельникова О.В., Ботвинкин А.Д., Данчинова Г.А. Зараженность голодных и питавшихся таежных клещей вирусом клещевого энцефалита (по данным иммуноферментного анализа). //Журн. инфекц. патол. 1996, Т.З, №1, 14-18.

29. Морозова О.В., Фоменко H.A., Бургышева Ю.В., Максимова Т.Г., Белавин П.А., Репкова М.Н., Добрикова Е.Ю. Взаимодействие РНК вируса клещевого энцефалита с белками. // Вопр. Вирусол. 2001, №2, с. 13-17.

30. Морозова О.В. Свойства некоторых белков вируса клещевого энцефалита. Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук. -Кольцово, 20016.

31. Москвитина Н.С., Романенко В.Н., Терновой В.А., Иванова Н.В., Протопопова Е.В., Кравченко Л.Б., Кононова Ю.В., Куранова В.Н., Чаусов Е.В., Москвитин С.С., Першикова Н.Л., Гашков С.И., Коновалова С.Н., Большакова Н.П., Локтев В.Б.

32. Выявление вируса Западного Нила и его генотипирование в иксодовых клещах (Parasitiformes: Ixodidae) в Томске и его пригородах // Паразитология.- 2008.- 42(3)-С.210-225.

33. Онищенко Г.Г. Распространение вирусных природно-очаговых инфекций в Российской Федерации и меры по их профилактике //Эпидемиол. и инфекц. бол.-2000.- №4- С. 4-8

34. Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Пакскина Н.Д. Организация надзора за клещевым энцефалитом и меры по его профилактике в Российской Федерации // Вопр. Вирусол.- 2007.- №5- С. 8-10.

35. Онищенко Г.Г. приказ от 25.03.2008 № 01/2659-8-32.

36. Погодина В.В. Устойчивость вируса клещевого энцефалита к воздействию желудочного сока// Вопр. Вирусол.- 1958.- №3- С. 295-299.

37. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. -Новосибирск, 1986.

38. Погодина В.В. М.П. Чумаков: посмертный вклад в изучение хронического клещевого энцефалита / Международная научная конференция «Вирусные, риккетсиозные и бактериальные инфекции, переносимые клещами», Иркутск 1996, стр. 102-103.

39. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Карань Л.С., Фролова М.П., Маленко Г.В., Левина Л.С., Платонов А.Е. Сравнительный анализ вирулентности сибирского идальневосточного подтипов вируса клещевого энцефалита // Вопр. Вирусол.- 2004.-№6- С. 24-30.

40. Погодина В.В. Мониторинг популяций вируса клещевого энцефалита и этиологической структуры заболеваемости за 60-летний период // Вопр. Вирусол.-2005.-№3-С. 7-13.

41. Покровский В.И., Лобан K.M. (ред.) Руководство по инфекционным болезням. -Москва, 1986.

42. Романенко В.В., Прохорова О.Г., Злобин В.И. Новая стратегия специфической профилактики клещевого энцефалита: опыт организации массовой вакцинации населения Свердловской области // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика.- 2005.-№3- С. 24-27.

43. Фоменко Н.В., Сабитова Ю.В., Хаснатдинов М.А., Гольцова H.A., Данчинова Г.А., Батаа Ж., Амбед Д., Стронин О. В. Гетерогенность гена р83/100 комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato // Молекуляр. генет. микробиол. вирусол.- 2007.- №4- С. 31-37.

44. Чебышев Н.В., Воробьев A.A., Пак С.Г. Трансмиссивные инфекции и инвазии. -Москва, 2005.

45. Чунихин С.П., Стефуткина Л.Ф., Королев М.Б., Решетников И.А., Хозинская Г.А. Половая передача вируса клещевого энцефалита у иксодовых клещей (Ixodidae) // Паразитология,- 1983,- Т.17,- вып. 3- С. 214-217.

46. Чунихин С.П., Решетников И.Н., Ляпустин В.Н. Изменчивость вируса клещевого энцефалита при пассировании через иксодовых клещей и мелких млекопитающих // Мед. паразитол. и паразитарн. болезни.- 1986.- №6- С. 58-61.

47. Шаповал А.Н. Клещевой энцефаломиелит. Москва, 1980.

48. Alekseev A.N., Dubinina H.V., Jushkova O.V. First report on the coexistence and compatibility of seven tick-borne pathogens in unfed adult Ixodes Persulcatus Schulze (Acarina:Ixodidae) // Int. J.Med. Microbiol.- 2004.- Vol. 293.- Suppl. 37- P. 104-108.

49. Allison, S. L., J. Schalich, K. Stiasny, C. W. Mandl, C. Kunz, and F. X. Heinz. Oligomeric rearrangement of tick-borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH // J. Virol.- 1995,- 69- P.695-700.

50. Allison S.L., Schlalich J., Stiasny K. Mandl C.W., Heinz F.X. Mutational evidence for an internal fusion peptide in flavivirus envelope protein E // J. Virol.- 2001,- 75- P. 42684275.

51. Alvarez D.E., Filomatori C.V., Gamarnik A.V. Functional analysis of dengue virus cyclization sequences located at the 5' and 3' UTRs // Virology.- 2008.- 375- P. 223-235.

52. Amberg, S. M., A. Nestorowicz, D. W. McCourt, and С. M. Rice. NS2B-3 proteinase-mediated processing in the yellow fever virus structural region: in vitro and in vivo studies // J. Virol.- 1994.- 68- P. 3794-3802.

53. Arias C.F., Preugscat F., Strauss J.H. Dengue 2 virus NS2B and NS3 form a stable complex that can cleave NS3 within the helicase domain // Virology.- 1993.- 193- P. 888899.1. T*

54. Barrett P.N., Schober-Bendixen S., Ehrlich H.J. History of TBE vaccines // Vaccine.-2003.- 21- S1/41-S1/49.

55. Blaskovic D, Pucekova G, Kubinyi L. An epidemiological study of tick-borne encephalitis in the Tribec region: 1956-1963 // Bull. WHO.- 1967.- 36- P. 89-94.

56. Bormane A., Lucenko I., Duks A., Mavtchoutko V., Ranka R., Salmina K., Baumanis V. Vectors of tick-borne diseases and epidemiological situation in Latvia in 1993-2002 // Int. J. Med. Microbiol.- 2004.- Vol. 293(37)- P. 36-47.

57. Cahour A., Pletnev A., Vazielle F.M., Rosen L.,Lai C.J. Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome // Virology.-1995,- 207- P. 68-76.

58. Casati S., Gern L., Pifaretti J-C. Diversity of the population of tick-borne encephalitis virus infecting Ixodes ricinus ticks in an endemic area of central Switzerland (Canton Bern) // J. Gen. Virol.- 2006,- 87- P. 2235-2241.

59. Cavalli-Sforza L.L., Edwards A.W.F. Phylogenetic analysis: models and estimation procedures // Evolution.- 1967.- 32- P. 550-570.

60. Chambers T.J., Hahn C.S., Galler R, Rice C.M. Flavivirus genome organization, expression, and replication // Annu. Rev. Microbiol.- 1990.- 44- P. 649-688.

61. Chang C.C., Hayashidani H., Pusterla N., Kasten R.W., Madigan J.E., Chomel B.B. Investigation of Bartonella infection in ixodid ticks from California // Comp. Immunol. Microbiol. Infect. Dis.- 2002.- 25- P. 229-236.

62. Colombage G., Hall R., Pavy M., Lobigs M. DNA-based and alphavirus-vectored immunisation with prM and E proteins elicits long-lived and protective immunity against the flavivirus, Murray Valley encephalitis virus //Virology.- 1998.- 250- P- 151-163.

63. Corver J., Lenches E., Smith K., Robison R.A., Sando T., Strauss E.G., and Strauss J.H. Fine mapping of a cis-acting sequence element in yellow fever virus RNA that is required for RNA replication and cyclization // J. Virol.- 2003.- 77- P. 2265-2270.

64. Csango P.A., Blakstad E., Kirtz G.C., Pedersen J.E. and Czettsel B. Tick-borne encephalitis in Southern Norway // Emerg. Infect. Dis.- 2004.- 10- P. 533-534.

65. Dumpis U., Crook D., Oksi J. Tick-borne encephalitis // Clin. Inf. Dis.- 1999.- 28- P. 882-890.

66. Ebel G.D., Kramer L.D. Short report: duration of tick attachment required for transmission of Powassan virus by deer ticks // Am. J. Trop. Hyg.- 2004.- 71(3)- P. 268271.

67. Ecker M. Allison S.L., Meixner T. and Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol.-1999.- 80-P. 179-185.

68. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution.- 1985.- 39- P. 787-791.

69. Felsenstein J. Phylogenies from molecular sequences: inference and reliability // Annu. Rev. Genet.- 1988.- 22- P. 521-565.

70. Felsenstein J., Churchill G.A. A Hidden Markov Model approach to variation among sites in rate of evolution // Mol. Biol. Evol.-1996.-.13- P. 93-104.

71. Filomatori C.V., Lodeiro M.F., Alvarez D.E., Samsa M.M., Pietrasanta L., Gamarnik A.V. A 5' RNA enement promotes dengue virus synthesis on a circular genome // Genes Dev.- 2006.- 20- P. 2238-2249.

72. Fitch W.M. Towards defining the course of evolution: Minimum change for a specific tree topology // Systematic Zoology.- 1971.- 20- P. 406-416.

73. Gorbalenya A.E., Donchenko A.P., Koonin E.V., Blinov V.M. N-terminal domains of putative helicases of flavi- and pestiviruses may be serine proteases // Nucl. Acids Res.-1989,- 17- P. 3889-3897.

74. Gould E.A. Virus cryopreservation and storage // Meth. Mol. Biol.- 1995.- 38- P. 7-20.

75. Gray J.S. Babesia sp.: emerging intracellular parasites in Europe // Pol. J. Microbiol.-2004.- 53- P. 55-60.

76. Gritsun T.S., Lashkevich V.A. and Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res.-2003a.- 57- P. 129-146.

77. Gritsun T.S. Gould E.A. The 3' unrtanslated region of tick-borne flaviviruses originated by the duplication of long repeat sequences within the open reading frame // Virology.-2006a.- 350- P. 269-275.

78. Gritsun T.S. Gould E.A. The 3' untranslated regions of Kamiti River virus and cell fusing agent virus originated by self-duplication // J. Gen. Virol.- 2006b.- 87- P. 2615-2619.

79. Gritsun T.S. Gould E.A. Direct repeats in the 3' untranslated regions of mosquito-borne flaviviruses: possible implications for virus transmission // J. Gen. Virol.- 2006c.- 87- P. 3297-3305.

80. Gritsun T.S. Gould E.A. Direct repeats in the flavivirus 3' untranslated region; a strategy for survival in the environment // Virology.- 2007a.- 358- P. 258-265.

81. Gritsun T.S. Gould E.A. Origin and evolution of flavivirus 5' UTRs and panhandles: trans-terminal duplications? // Virology.- 2007b.- 366- P. 8-15.

82. Haglund M., Gunther G. Tick-borne encephalitis — pathogenesis, clinical course and long-term follow-up //Vaccine.- 2003.- 21- Sl/11-S1/18.

83. Hanada K., Suzuki Y., Gojobori T. A large variation in the rates of synonymous substitution for RNA viruses and its relationship to a diversity of viral infection and transmission modes // Mol. Biol. Evol.- 2004.- 21- P. 1074-1080.

84. Hayasaka D., Ivanov L., Leonova G.N., Goto A., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa H. and Takashima I. Distribution and characterization of tick-borne encephalitis viruses from Siberia and Far-Eastern Asia// J. Gen. Virol.- 2001.- 82- P. 1319-1328.

85. Hayasaka D., Goto A., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa H., Takashima I. Evaluation of European tick-borne encephalitis virus vaccine against recent Siberian and far-eastern subtype strains //Vaccine.- 2001,- 19- P. 4774-4779.

86. Hendy M.D., Penny D. Branch and bound algorithms to determine minimal evolutionary trees // Mathematical Biosciences.- 1982.- 59- P. 277-290.

87. Heinz F.X. and Kunz C. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: peptide mapping of large non-structural proteins of European isolates and comparison with other flaviviruses // J. Gen. Virol.- 1982.- 62- P. 271-285.

88. Heinz F.X. Molecular aspects of TBE virus research // Vaccine.- 2003.- 21- S1/3-S1-10.

89. Heinz, F. X., and S. L. Allison. Flavivirus structure and membrane fusion // Adv. Virus Res.- 2003.- 59-P. 63-97.

90. Heinz F.X., Kunz C. Tick-borne encephalitis and impact of vaccination // Arch. Virol.-2004,- 18- P. 201-205.

91. Hewson R.A. RNA viruses: emerging vectors for vaccination and gene therapy // Molecular Medicine Today.- 2000.- 6- P. 18-35.

92. Hilpertshauser H., Deplazes P., Schnyder M., Gern L., Mathis A. Babesia spp. identified by PCR in ticks collected from domestic and wild ruminants in Southern Switzerland // Appl. Environ Microbiol.- 2006.- 72(10)- P. 6503-6507.

93. Hillis D.M., Bull J.J. An empirical test of bootstrapping as a method for assessing confidence in phylogenetic analysis // Syst. Biol.- 1993.- 42- P. 182-192.

94. Heibz F.X. Molecular epidemiology of tick-borne encephalitis virus: cross-protection between European and Far Eastern subtypes // Vaccine.- 1992.- 10- P. 345-349.

95. Holzmann H., Stiasny K., Ecker M. Kunz C, Heinz F.X. Characterization of monoclonal antibody-escape mutants of tick-borne encephalitis virus with reduced neuroinvasiveness in mice // J. Gen. Virol.- 1997.- 78- P. 31-37.

96. Jenkins G.M., Rambaut A., Pybus O.G., Holmes E.C. Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis // J. Mol. Evol.- 2002,- 54- P. 156-165.

97. Jones L.D., Davies C.R., Steele G.M., Nuttal P.A. A novel mode of arbovirus transmission involving a nonviremic host // Science.- 1987.- 237- P. 775-777.

98. Jukes T.H., Cantor C.R. Evolution of protein molecules / Mammalian Protein Metabolism. Edited by H. N. Munro. -Acad. Press., NY London, 1996, P. 21-132.

99. Karabatsos N. General characteristics and antigenic relationships / Monath T.P. (Ed.), St. Louis Encephalitis., -APHA, Washington DC.- 1980.- P. 159-200.

100. Karbowiak G., Stanko M., Rychlik L., Nowakowski W., Siuda K. The new data about zoonotic reservoir of Babesia Microti in small mammals in Poland // Acta Parasitologic^- 1999.- 44- P. 142-144.

101. Kjemtrup, A.M., Conrad P.A. Human babesiosis: an emerging tick-borne disease // Int. J. Parasitol.- 2000,- 30- P. 1323-1337.

102. Khromykh A.A., Meka H., Guyatt K.J., Westaway E.G. Essential role of cyclisation sequences in flavivirus RNA replication // J. Virol.- 2001,- 75- P. 6719-6728.

103. Khromykh A.A., Kondratieva N., Sgro J-Y., Palmenberg A., Westaway E.G. Significance in replication of the terminal nucleotides of the flavivirus genome // J. Virol.- 2003,- 77(19)- P. 10623-10629.

104. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol.- 1980.- 16- P. 111120.

105. Koonin E.V. Computer-assisted identification of a putative methyl transferase domain in NS5 protein of flaviviruses and lambda 2 protein of reovirus // J. Gen. Virol.- 1993.- 74-P. 733-740.

106. Korenberg E.I.,Kovalevskii Y.V. Main features of tick-borne encephalitis eco-epidemiology in Russia//Z. Bakteriol.- 1999a.- Bd. 289- P. 525-539.

107. Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V., Karavanov A.S., Moskvitina G.G. Mixed infection by tick-borne encephalitis virus and Borrelia in ticks // Med. Vet. Entomol.- 1999b.- 13- P. 204-208.

108. Korenberg E., Likhacheva T. Analysis of the long-term dynamics of tick-borne encephalitis (TBE) and ixodid tick-borne borrelioses (ITBB) morbidity in Russia //Int. J. Med. Microbiol.- 2006,- 296- P. 54-58.

109. Kuno G., Chang G.-J., Tsuchiya K.R., Karabatsos N., Cropp C.B. Phylogeny of the genus Flavivirus // J.Virol.- 1998,- 72- P. 73-83.

110. Kunz C. TBE vaccination and the Austrian experience // Vaccine.- 2003.- 21- Sl/50-Sl/55.

111. Li, W.H., Wu C.I., Luo C.C. A new method for estimating synonymous and nonsynonymous rates of nucleotide substitution considering the relative likelihood of nucleotide and codon changes // Mol. Biol. Evol.- 1985.- 2- P. 150-174.

112. Li W.H., Tanimura M. The molecular clock runs more slowly in man than in apes and monkeys //Nature.- 1987.- 326- P. 93-96.

113. Li W.H., Tanimura M., Sharp P.M. Rates and dates of divergence between AIDS virus nucleotide sequences // Mol. Biol. Evol.- 1988,- 5(4)- P. 313-330.

114. Li Yu, Nomaguchi M., Padmanabhan R., Markoff L. Specific requirements for elements of the 5' and 3' terminal regions in flavivirus RNA synthesis and viral replication // Virology.- 2008,- 374- P. 170-185.

115. Mackensie J.M., Khromykh A.A., Jones M.K., Westaway E.G. Subcelluar localization and some biochemical properties of the Flavivirus Kunjin nonstructural proteins NS2A and NS4A //Virology.- 1998.- 245- P. 203-215.

116. Majlathova V., Majlath I., Derdakova M., Vichova B., Pet'ko B. Borrelia lusitaniae and green lizards (Lacerta viridis), Karst Region, Slovakia // Emerg. Infect. Dis.- 2006.- 12-P. 1895-1901.

117. Mandl C.W., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses// Virology.- 1993.- 194-P. 173-184.

118. Mandl C.W., Ecker M., Holzmann H., Kunz C., Heinz F.X. Infectious cDNA clones of tick-borne encephalitis virus European subtype prototypic strain Neudoerfl and high virulence strain Hypr // J.Gen. Virol.- 1997.- 78- P. 1049-1057.

119. Mandl C.W., Alison S.L., Holzman H., Meixner T., Heinz F.X. Attenuation of tick-borne encephalitis by sructure-based site-specific mutagenesis of putative flavivirus receptor binding site //J. Virol.- 2000,- 74(20)- P. 9601-9609.

120. McMinn P.C. The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses // J. Gen. Virol.- 1997.- 78- P. 2711-2722.

121. Mediannikov O.Y., Sidelnikov Y., Ivanov L., Mokretsova E., Fournier E.L., Tarasevich I., Raoult D. Acute tick-borne rickettsiosis caused by Rickettsia Heilongjiangensis in Russian Far East // Emerg. Infect. Dis.- 2004.- 10(5)- P. 810-817.

122. Mediannikov, O., Matsumoto, K., and Fournier, P.-E. Rickettsia raoultii, a potential human pathogen // Submitted (16-JAN-2006) Unite des Rickettsies, Universite de la Mediterranee, 27 Blvd. Jean Moulin, Marseilles 13385, France.

123. Meer-Scherrer L., Adelson M., Mordechai E., Lottaz B., Tilton R. Babesia microti infection in Europe // Curr. Microbiol.- 2004.- 48(6)- P. 435-437.

124. Monath T.P., Heinz F.X. Flaviviruses / Fields Virology, 3-d Edition ed. by B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, et al. -Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996- P. 961-1034.

125. Morozova O.V., Cabello F.C., Dobrotvorsky A.K. Seminested PCR detection of Bartonella henselae in Ixodes persulcatus ticks from Western Siberia, Russia // Vector Borne Zoonotic Dis.- 2004.- 4- P. 306-309.

126. Mukhopadhyay, S., R. J. Kuhn, and M. G. Rossmann. A structural perspective of the flavivirus life cycle //Nat. Rev. Microbiol.- 2005.- 3- P. 13-22.

127. Muylaert I.R., Galler R.G., Rice C.M. Mutagenesis of the N-linked glycosylation sites of the yellow fever virus NS1 protein: Effects on virus replication and mouse neurovirulence // Virology.- 1996,- 222- P. 159-168.

128. Muse S.V. Evolutionary analysis of DNA sequences subject to constraints on secondary structure // Genetics.- 1995.- 139- P. 1429-1439.

129. Ng M.L., Hong S.S. Flavivirus infection: Essential ultrastructural changes and association of Kunjin virus NS3 protein with microtubules // Arch.Virol.- 1989.-106- P. 103-120.

130. Pletnev A.G. Yamshchikov V.F. and Blinov V.M. Tick-borne encephalitis virus genome //FEBS.- 1986.- 200(2)- P. 317-321.

131. Popovnikova T.V. Specific clinical and epidemiological features of tick-borne encephalitis in Western Siberia // Int. J. Med. Microbiol.- 2006.- 296- P. 59-62.

132. Protopopova E.V., Sorokin A.V., Konovalova S.N., Kachko A.V., Netesov S.V., Loktev V.B. Human laminin binding protein as a cell receptor for the tick-borne encephalitis virus // Zent. Bl. Bakteriol.- 1999.- 289- P. 632-638.

133. Rey F.A., Heinz F.X., Mandl C., Kunz C., Harrison S.C. The envelope glycoprotein from tick-borne encephalitis virus at 2A resolution //Nature.- 1995.- 375- P. 291-298.

134. Rice C.M. Flaviviridae: The Viruses and Their Replication // Fields Virology. 3-d Edition ed. by D.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley, et al. -Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, p. 931- 959.

135. Roehrig J.T. Antigenic structure of flavivirus proteins // Adv. Virus Res.- 2003.- 59- P. 141-175.

136. Russell P.K., Brandt W.E., Dalrymple J.M. Chemical and antigenic structure of flaviviruses / Schlesinger RW, eds. The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. -New York: Academic Press, 1980, P. 503-529.

137. Ruzek D., St'asna H., Kopecky J., Golovljova I., Grubhoffer L. Rapid subtuping of tickborne encephalitis virus isolates using multiplex RT-PCR // J. Virol. Methods.- 2007.-144-P. 133-137.

138. Rzhetsky A. Nei M. A simple method for estimating and testing minimum-evolution trees // Mol. Biol. Evol.- 1992.- 9- P. 945-967.

139. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol.- 1987.- 4- P. 406-425.

140. Sanderson M.J. Objections to bootstrapping phylogenies: A critique // Syst. Biol.- 1995.44- P. 299-320.

141. Sanderson M.J. Wojciechowski M.F. Improved bootstrap confidence limits in large-scale phylogenies, with an example from Neo-Astragalus (Leguminosae) // Syst. Biol.- 2000.-49-P. 671-685.

142. Schmidt H.A., Strimmer K., Vingron M., von Haeseler A. TREE-PUZZLE: maximum likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing // Bioinformatics.-2002.- 18- P. 502-504.

143. Shimodaira H., Hasegawa, M. Multiple comparisons of log-likelihoods with applications to phylogenetic inference // Mol. Biol. Evol.- 1999.- 16- P. 1114-1116.

144. Schräder C., Suss J. A nested RT-PCR for the detection of tick-borne encephalitis virus (TBEV) in ticks in natural foci // Zentralbl. Bakteriol.- 1999,- 289- P. 319-328.

145. Smith R.P., Muzaffar S.B.,Lavers J., Lacombe J.H., Cahill B.K., Lubelczyk B.K, Kinsler A., Mathers A.J., Rand P.W. Borrelia garinii in seabird ticks (Ixodes uriae), Atlantic Coast, North America//Emerg. Infect. Dis.- 2006,- 12- P. 1909-1912.

146. Skarpaas T., Ljostad U. and Sundoy A. First human cases of tick-borne encephalitis, Norway // Emerg. Infect. Dis.- 2004,- 10- P. 2241-2243.

147. Stadler, K., S. L. Allison, J. Schalich, and F. X. Heinz. Proteolytic activation of tickborne encephalitis virus by furin // J. Virol.- 1997.- 71- P. 8475-8481.

148. Stiasny K., Kossl C., Lepault J., Rey F.A., Heinz F.X. Characterization of a structural intermediate of flavivirus membrane fusion // PLOS Feb.- 2007.- 3(2)- P. 191-199.

149. Suss J. Epidemiology and ecology of TBE relevant to the production of effective vaccines // Vaccine.- 2003.- 21 S1 /19-S1 -35.

150. Suzuki Y. Multiple transmissions of tick-borne encephalitis virus between Japan and Russia // Genes Genet. Syst.- 2007.- 82- P. 187-195.

151. Tajima F. Simple methods for testing the molecular evolutionary clock hypothesis // Genetics.- 1993.- 135- P. 599-607.

152. Tamura K., Nei M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees // Mol. Biol. Evol.- 1993.- 10-P. 512-526.

153. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Novikov D.V., Leonova G.N., Netesov S.V. and Loktev V.B. Novel variant of Tick-borne encephalitis virus, Russia // Emerg.

154. Infect. Dis.-2007,- 13-P. 1574-1578.

155. Thorne J.L., Kishino H., Felsenstein, J. Inching toward reality: an improved likelihood model of sequence evolution // J. Mol. Evol.- 1992.- 34- P. 3-16.

156. Thorne J.L., Goldman, N., Jones, D.T. Combining protein evolution and secondary structure // Mol. Biol. Evol.- 1996.- 13- P. 666-673.

157. Wallner G., Mandl C.W., Ecker M., Holzmann H., Stiasny K., Kunz C. and Heinz F.X. Characterization and complete genome sequences.of high- and low- virulence variants of tick-borne encephalitis virus // J. Gen. Virol.- 1996.- 77- P. 1035-1042.

158. Westaway E.G., Khromykh A.A., Kenney M.T., Mackenzie J.M., Jones M.K. Proteins C and NS4B of the Flavivirus Kunjin translocate independently into the nucleus // Virology.- 1997,- 234- P. 31-41.

159. Zanotto P.M., Gao G.F., Gritsun T., Marin M.S., Jiang W.R., Venugopal K., Reid H.W., Gould E.A. An arbovirus cline across the northern hemisphere // Virology.- 1995.- 210-P. 152-159.

160. Zanotto P.M., Gould E.A., Gao G.F., Harvey P.H., Holmes E.C. Population dynamics of flaviviruses revealed by molecular phylogenies // Proc. Nat. Acad. Sei. USA.- 1996.- 93-P.548-553.

161. Zharkikh A., Li W.H. Statistical properties of bootstrap estimation of phylogenetic variability from nucleotide sequences: II. Four taxa without a molecular clock // J. Mol. Evol.- 1992.-35- P. 356-366.

Информация о работе

Чаусов, Евгений Владимирович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2009
ВАК 03.00.03

Диссертация

Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) и других инфекционных агентов у иксодовых клещей в городских и пригородных биотопах г. Томска. Секвенирование и молекулярно-биологический анализ генома штамма ВКЭ Глубинное/2004 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы