Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России

Микрюкова, Тамара Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России"

Микрюкова Тамара Петровна

Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России

03.01.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 НОЯ 2012

Кольцово-2012

005055048

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Научный Терновой Владимир Александрович, кандидат

руководитель: биологических наук, ФБУН Государственный

научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий лабораторией молекулярной эпидемиологии ООН

Официальные Кочнева Галина Вадимовна - доктор

оппоненты: биологических наук, ФБУН Государственный

научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующая лабораторией вирусных гепатитов

Беклемишев Анатолий Борисович — доктор биологических наук, профессор, ФГБУ «Институт биохимии» СО РАМН, заведующий лабораторией генной инженерии

Ведущая организация Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Защита состоится «14» декабря 2012 г. в 11-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: р.п. Кольцове Новосибирского района Новосибирской области, 630599; тел: (383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Автореферат разослан « У » ноября 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Трощкова Галина Павловна

Актуальность проблемы. Инфекционные болезни, возбудители которых циркулируют в природе, остаются сложной проблемой, несмотря на все усилия по борьбе с ними. Нарастающая в последние десятилетия тенденция сосредоточения очагов природных инфекций на территориях, освоенных или осваиваемых человеком, заставляет искать закономерности их формирования и устойчивого функционирования.

Устойчивость паразитарной системы трансмиссивных заболеваний обеспечивается сложными взаимодействиями гетерогенных структур — популяций основных компонентов очага: возбудителей, переносчиков и прокормителей. Несмотря на большое количество исследований в этой области, представления о структурных компонентах природных очагов недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований, касающихся функционирования и контроля эпидемической напряжённости природных очагов и очагов, подвергшихся антропогенной трансформации.

Наиболее патогенными для человека из природно-очаговых трансмиссивных инфекций переносимых клещами являются флавивирусы. Для России наибольшую медицинскую значимость имеет вирус клещевого энцефалита (КогепЬе^ ЕЛ., Коуакуйкп У.У., 1999), который был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке как этиологический агент клещевого энцефалита (Павловский, 1940). ВКЭ принадлежит к группе вирусов одноимённого комплекса и вызывает у людей заболевание центральной нервной системы с уровнем смертности 1—2 % для европейского и сибирского генотипа и 30 % -для дальневосточного генотипа (Огкзип Т.8. е1 а1., 2003). Передача ВКЭ осуществляется членистоногими переносчиками - клещами семейства 1хосШае.

В настоящее время заболеваемость КЭ она остаётся стабильно высокой и составляет 2,4—2,6 чел. на 100 тыс. населения (3200-3700 случаев в год), но в некоторых регионах Урала, Сибири и Дальнего Востока она в несколько раз превышает среднюю по РФ и достигает 30-35 чел. на 100 тыс. населения. Ежегодно в РФ до 350 тысяч человек подвергаются нападению клещей, а значит, и риску заболевания клещевыми инфекциями, список которых

ежегодно увеличивается. Для одних, вновь выявленных инфекций, роль в инфекционной патологии человека установлена, а для других вопрос патогенности остаётся открытым.

В настоящее время существует несколько видов риккетсий, патогенность которых для человека не подтверждена. Требуются дополнительные исследования этой группы клещевых инфекций для уточнения спектра циркулирующих в России видов и уточнения их патогенности для человека.

Наиболее актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций являются уточнение их ареалов, генотипов возбудителей этих инфекций, а также видового состава и границ распространения переносчиков.

Известно, что членистоногие переносчики могут влиять на свойства ВКЭ (Вотяков, 2002), в силу чего знание их генетических характеристик может быть полезным при изучении механизмов адаптации возбудителей к различным видам хозяев и формирования их патогенетических свойств. При этом информация о генетических характеристиках иксодовых клещей, распространённых в России, практически полностью отсутствует.

Всё также остаётся актуальной проблема вакцинопрофилактики: доля привитых, подвергшихся нападению клеща, не превышает 10 % даже для районов, неблагополучных по КЭ. Если ранее вакцинопрофилактика проводилась только для людей профессионально связанных с лесом, то сейчас к группе риска можно отнести всё население эндемичных по КВЭ районов. Поэтому необходим генетический контроль производственных штаммов, используемых для вакцинации населения. Исходя из выше изложенного, нами было решено подойти к решению обозначенных проблем комплексно. Отсюда вытекает несколько поставленных целей для моего диссертационного исследования.

Цели исследования:

• оценить уровень заражённости клещей вида Ixodes persulcatus и определить спектр инфекций в иксодовых клещах, собранных в

пограничных районах ареала - на территории Республики Коми в 2010 году;

• определить генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита и риккетсий, циркулирующих в выбранных для исследования природных очагах;

• провести молекулярно-генетическую видовую идентификацию иксодовых клещей, участвующих в трансмиссии инфекций, в природных очагах Западной Сибири;

• дать генетическую характеристику производственного штамма 205 вируса клещевого энцефалита из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».

В связи с поставленными целями предстояло решить ряд задач.

Задачи исследования:

• создать коллекцию ДНК и РНК, выделенных из индивидуальных иксодовых клещей, собранных в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России;

• выявить РНК ВКЭ и ДНК бактерий в коллекционных образцах с помощью ПЦР;

• определить цуютеотидные последовательности фрагментов геномов, выявленных в образцах коллекции, вариантов ВКЭ и риккетсий и провести их молекулярно-генетический анализ;

• охарактеризовать межвидовую и внутривидовую вариабельность иксодовых клещей I. рах1о\^ку1 и I. регвикаШя, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг., участвующих в трансмиссии клещевых инфекций, по нуклеотидным последовательностям митохондриальных геномов;

• провести определение полной нуклеотидной последовательности генома референс-штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и его сравнительный анализ.

Научно-практическая значимость

• Впервые проведено комплексное исследование природного очага клещевых инфекций в Республике Коми. В клещах I. persulcatus обнаружен генетический материал возбудителей восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированности клещей для разных инфекций колебался от 11,3 % до 1,2 % в зависимости от вида возбудителя. Уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %.

• Впервые проведена оценка генетического разнообразия вируса клещевого энцефалита, РНК которого выявлена в иксодовых клещах, собранных в центральных и южных районах Республики Коми.

• Впервые показано, что в иксодовых клещах Республики Коми циркулирует сибирский и дальневосточный генотип ВКЭ, причём доминирует дальневосточный, доля которого достигает 81,2 % от числа клещей, генотипированных по ВКЭ. Во всех исследованных образцах иксодовых клещей европейский генотип ВКЭ обнаружен не был.

• Анализ нуклеотидной последовательности 5'-НТО геномной РНК ВКЭ, выделенной из индивидуальных клещей, показал высокий уровень вариабельности некоторых участков Y-структуры 5-НТО. Вариабельность элементов В2, CI, CS В наблюдалась в более чем 50% образцов. Анализ конформации района 5'-НТО геномной РНК ВКЭ показал, что наблюдаются существенные изменения вторичной структуры этого района РНК. Полученные данные подтверждают гипотезу, что вариабельность и конформация 5'-НТО геномной РНК ВКЭ имеют принципиальное значение для адаптации вируса к активной репликации в клетках различных видов.

установить, что на территории Республики Коми циркулируют два вида риккетсий - R. raoultii и R. tarasevichiae, на территории Томска - R raoultii, R. tarasevichiae, R slovaca. С помощью филогенетического анализа показано, что восемь томских изолятов кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), которая является кандидатной для выделения в новый вид риккетсий.

• Проведён анализ генома штамма 205 ВКЭ, используемого в настоящее время для производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита из двух вирусных коллекций, прошедщих разную пассажную историю. Анализ показал их высокую гомологию и высокий уровень консерватизма штамма 205. Полученные данные по генетическим характеристикам производственного штамма 205 ВКЭ могут быть использованы для стандартизации производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита.

• Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генов субъединицы 1 цитохромоксидазы (COI) и 16S рРНК митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и /. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей исследованных митохондриальных генов иксодовых клещей показал, что уровень межвидовых отличий клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus, варьировал от 8 до 12 %, а уровень внутривидовой изменчивости - от 0,58 % до 1,93 %. Полученные данные могут быть использованы для проведения генетических исследований биоразнообразия различных видов клещей, обитающих в Евразии.

Положения, выносимые на защиту

• В Республике Коми в клещах I. persulcatus обнаружены генетические маркёры восьми инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.

• Установлено, что на территории Республики Коми циркулируют ВКЭ дальневосточного и сибирского генотипа.

• Доказано, что элементы CI, В2, CS В Y-структуры 5-НТО геномной РНК ВКЭ природных образцов высоковариабельны, при этом вторичная структура 5'-НТО природных вариантов существенно отличается от вторичной структуры 5-НТО лабораторных штаммов.

• Генетические маркёры Rickettsia spp. выявлены в пробах клещей, грызунов и птиц, обитающих в биотопах г. Томска и его пригородах и в клещах Республики Коми.

• С помощью секвенирования показано, что полные нуклеотидные последовательности геномной РНК штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и производственного штамма 205 из коллекции НПО «Вирион», опубликованной в 1991 г., имеют высокий уровень гомологии.

• Установлено, что уровень межвидовых и внутривидовых отличий по нуклеотидным последовательностям генов COI и 16S рРНК митохондриального генома клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus подтверждает правильность таксономического разделения двух рассматриваемых видов и позволяет использовать фрагменты последовательностей этих генов в качестве генетического маркёра для видовой идентификации иксодовых клещей.

Вклад автора:

Расчёт и тестирование олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для генотипирования иксодовых клещей; создание коллекции образцов ДНК/РНК, выделенных из иксодовых клещей; проведение ПЦР; определение нуклеотидных последовательностей (секвенирование) и их анализ, выполнены лично автором.

Выявление РНК/ДНК-маркёров трансмиссивных инфекций в образцах коллекции, расчёт олигонуклеотидных праймеров для определения полной нуклеотидной последовательности штамма 205 вируса клещевого энцефалита выполнено совместно с канд. биол. наук Чаусовым Е.В. и Карташовым М.Ю.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы

«Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы и приложения. Библиография включает 150 работ: 54 - отечественных авторов, 96 -зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 13 таблиц.

Материалы и методы исследования

Иксодовые клещи. Республика Коми. В исследование взяты 1137 клещей I. persulcatus, собранных в южных и центральных районах Республики Коми в 2010 г. Отлов клещей проведён сотрудниками ФГУП «Дезинфекция», г.Сыктывкар Роспотребнадзора. Томск. В исследование взяты 1723 клеща I. persulcatus и I. pavlovskyi, собранных в городских и пригородных биотопах г.Томска в 2010-2011 гг. Отлов клещей проводили сотрудники кафедры зоологии позвоночных и экологии Томского государственного университета. Республика Молдова. В исследование взяты клещи I. ricinus — 78, Dermacentor spp. - 77, Haemaphisalis spp. — 34, собранные в 2011 г. Отлов клещей проведён сотрудниками Национального Центра Общественного Здоровья Республики Молдова.

Штаммы и изоляты ВКЭ. Лабораторные изоляты ВКЭ Tms-Ix6, Tms-M-83, Tms-M-202, Tms-PT-14, Tms-PT-12 получены из природных образцов, собранных в г. Томске, пассированием на культуре клеток СПЭВ и штамм ВКЭ № 205(2), полученный из Института вирусологии им. Д.И. Ивановского (г. Москва) в 1989 г., предоставлены к. б. н. Е.В. Протопоповой. Штамм ВКЭ №205(1) получен из НИИ ВС НПО «Вирион» (г.Томск) в 1989 г. Используется для производства инактивированной вакцины.

Полимеразную цепную реакцию проводили с помощью Taq-ДНК-полимеразы («Медиген», Россия); температурный профиль реакции для разных пар праймеров определяли индивидуально.

Определение нуклеотидных последовательностей (НП) проводили на автоматическом секвенаторе ABI 3130x1 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Все последовательности были определены дважды в независимых экспериментах, а для последовательностей I. pavlovskyi - не менее четырёх раз.

Анализ последовательностей. При проведении филогенетического анализа для сравнения использовали последовательности прототипных изолятов. Множественное сравнение последовательностей осуществляли с использованием пакета программного обеспечения LaserGene 8. Филогенетический анализ проводили с помощью программ MEGA5, также использовались программа BLAST (http://bjast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi); для расчёта вторичной структуры 5'-НТ0 в режиме on-line использовали программу http://www.bioirifo.rpi.edu.

Результаты исследований и их обсуждение Генетическое разнообразие вируса клещевого энцефалита в клещах L persulcatus в Северо-Восточном регионе Европейской части России. Для уточнения спектра инфекций, циркулирующих в Республике Коми нуклеотидный материал, выделенный из клещей, анализировали с помощью ОТ-ПЦР. Нами были обнаружены маркёры 8 клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ), лихорадки Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. (рис. 1).

чо 12,0 п 0s

'§ 10,0-g

I 8,0

ё 6,o-

| 4,0-«0

1 2,0-•§■ 0,0

■ И i

1,5 1,2

•il-

яГ 0)

4* /

& <0* ^

5,6 %

13,7%

ш неинфицированные ■ моноинфекция □ микст-инфекция

Рис. 1а. Инфицированность клещей по возбудителям (%), собранных в Республике Коми 2010 г.

Рис. 16. Суммарная (общая)

инфицированность клещей, собранных в Республике Коми в 2010 г.

Инфицированность клещей возбудителями инфекций распределялась в ряду в сторону уменьшения: боррелии (11,3 %) < риккетсии (8,4 %) < ВКЭ (4,6 %) < ВЗН (2,9%) < бартонеллы (2,1 %) < бабезии (1,8%) < анаплазмы (1,5%) < эрлихии (1,2 %).

Нуклеотидный материал ПЦР-положительных индивидуальных клещей с выявлением ВКЭ был использован для определения нуклеотидной последовательности фрагмента 5'-нетраслируемой области (5'-НТО) вирусного генома. Данный подход позволил избежать культивирования ВКЭ в лабораторных условиях с рисками адаптации вирусного изолята к лабораторным системам культивирования и возможному изменению вирусного генома. С помощью филогенетического анализа (рис. 2) установлено, что из 16 образцов 13 образцов (81,25 %) принадлежали к дальневосточному генотипу. Они распадаются на несколько кластеров, близких к высокопатогенным штаммам 205, Приморье-91 и Глубинное/2004. 3 образца (18,75 %) отнесены к сибирскому генотипу и попадали в один кластер со штаммом Заусаев (использован как прототип), способным вызывать развитие хронического клещевого вирусного энцефалита. Из этого следует, что на территории Республики Коми возможно обнаружение у пациентов хронической формы течения этого заболевания. Образцов, содержащих европейский генотип ВКЭ, обнаружить не удалось. Т.о., разнообразие генетических вариантов ВКЭ в таёжном клеще даёт основание утверждать, что ВКЭ длительный период времени эволюционировал в исследованных биотопах Республики Коми и на её территории сформировались стойкие природные очаги с доминированием дальневосточного генотипа вируса.

НП 5'-НТО, определённые прямым секвенированием из природных образцов, сравнивали с 5'-НТО последовательностей из 5 лабораторных изолятов ВКЭ, выделенных из органов птиц (Тгпб-НР!, Ттз-12Р1), млекопитающих (Ттз-83т, Ттэ-202т) и клещей (Ттз-1х6), собранных в г. Томске в 2006-2008 гг. и прошедших 5 пассажей на культуре клеток СПЭВ.

Анализ последовательностей 5-НТО в клещах I. persulcatus, отловленных в Республике Коми показал, что этот район генома высоко вариабелен. Уровень вариабельности для элементов CI, В2, CS В Y-структуры 5'-НТО превышал 50 % . Однако при этом некоторые элементы 5'-НТО (А2, CS A, AUG) были полностью консервативны.

Для уточнения влияния наблюдаемых нуклеотидных замен на вторичную структуру 5'-НТО генома ВКЭ исследованных вариантов, что включены в рис. 2, было проведено компьютерное моделирование вторичной структуры РНК. Полученные результаты показывают, что среди изолятов ВКЭ наблюдаются существенные изменения пространственной структуры этого района вирусного генома (рис. 3).

2. Молекулярно-генетический анализ полного генома вируса клещевого энцефалита дальневосточного генотипа референс-штамма 205.

Для получения новых данных, касающихся возможной изменчивости референс-штамма 205 дальневосточного генотипа, связанной с хранением и/или периодическим культивированием в лабораторных условиях, мы решили провести полноразмерное секвенирование штамма 205 из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор». Сравнить полученную НП генома с известными штаммами ВКЭ и штаммом 205 (DQ989336) из коллекции НПО «Вирион» (г. Томск), который секвенирован нами в 1991 году. Длина полного генома штамма 205 ВКЭ составила 10495 н.о.

Уровни гомологии, количество нуклеотидных замен и мутаций в выведенной аминокислотной последовательности штамма 205 в сравнении с прототипными штаммами флавивирусов колеблется от 90 до 99 % для полной НП и от 93 до 100% для аминокислотной. Вторичная структура РНК 5'-НТО - важного элемента для репликации вируса (Filamatori et al., 2006), у штамма 205 имеет обычный вид для дальневосточного генотипа ВКЭ. Филогенетический анализ полногеномных последовательностей показывает, что штамм 205 находится внутри ветви дальневосточного генотипа.

Последовательность депонирована gb JX498939.

Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе НП (240 но.) 5-НТО РНК ВКЭ методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимуры. НП, полученные в данном исследовании обозначены знаками • — для изолятов"КошГ' и А - для изолятов'Тотэк"

я у

- . ß''

■; 4

----------

Komi 10-04 Komi 10-03

C\ %

% %

% Y 4

, '......%

Komi 10-14 Tms Ptl4

Рис. 3. Вторичные структуры 5'-НТО ВКЭ различных генотипов: Komi 10-04 -сибирский генотип; Komi 10-03, Komi 10-14, Tms-Ptl4 - дальневосточный генотип. Изолят Tms-Ptl4, прошедший 5 пассажей на культуре клеток, имеет вторичную структуру, характерную для дальневосточного генотипа ВКЭ, у остальных образцов наблюдаются существенные отличия от прототипных штаммов

3. Исследование встречаемости ДНК-маркёров рода Rickettsia в иксодовых клещах и их прокормителях из различных эпидемически активных природных очагов. Для определения частоты встречаемости генетических маркёров риккетсий с помощью ПЦР исследованы образцы иксодовых клещей, собранных в городских и пригородных биотопах г. Томска, Республике Коми и Республике Молдова. Также использовали материал из органов мелких млекопитающих и птиц, отловленных в Томской области (табл. 1).

Для генетического типирования риккетсий использовали фрагменты двух генов - gltA и отрА длиной 260 и 466 и.о., кодирующих соответственно цитратсинтазу и белок А наружной мембраны. Определены НП gltA для 42 образцов (19 образцов - из Томска, 15 - из Респ. Коми и 8 - из Респ. Молдова).

Таблица 1

Выявление ДНК риккетсий в исследуемых образцах методом ПЦР

Место сбора Кол-во образцов Rickettsia spp. абс. (отн. %)

Томская область (клещи) 1723 102 (5,9 %)

Томская область (млек.) 289 28 (9,7 %)

Томская область (птицы) 84 23 (27,4 %)

Республика Коми (клещи) 1137 95 (8,4 %)

Республика Молдова (клещи) 189 24(12,7%)

Филогенетический анализ по gltA-тену (рис. 4) позволил установить, что доминирующим видом риккетсий на территории Томской области была R. tarasevichiae, патогенность которой для человека не установлена. В 6 образцах из Республики Коми также была обнаружена R tarasevichiae, в 9 образцах - ДНК R. raoultii, относящаяся к новым риккетсиозным патогенам. На филогенетическом дереве, построенном по НП гена gltA 14 образцов из Томска и 6 образцов из Респ. Коми, кластеризовались в одну ветвь с R. tarasevichiae и образовывали 3 субкластера. 3 изолята, выделенные на территории Респ. Молдова, группировались в одну ветвь вместе с R japónica, R. slovaca, R. conorii. Изолятов, выделенных в других регионах, в данной ветви нет. Ветвь, образованная образцами из группы R raoultii, включала 5 НП из Респ. Молдова, 9 - из Респ. Коми и 5 - из Томска.

НП гена отрА, кодирующего белок А наружной мембраны, были определены для 18 образцов, из них 9 образцов были из Томска, 4 - из Респ. Коми и 5 - из Респ. Молдова (рис. 5).

• КошИО-1179 ▲ Tom»k-10-131B

• Komi-10-114 ■ Moldova-11-272 — ATomsk-10-29M A Tomsk-10-01M A Tomsk-10-Э4В A Tomsk-10-28M

<• Komi-10-902

• Komi-10-913

• Komi-10-733

• Komi-10-916

• Komi-10-630 < • Komi-10-903

• Komi-11-092 ■ ■ Moldova-11-10 R.andeanae (GU169050) R. a esehl i m anni i {DQ235776) R. raoultii (DQ365803)

\ R. raoultii (DQ365804) Moldova-11-042

■ Moldova-11 -07

Moldova-11-09

■ Moldova-11-06 R.slovaca 13-B (CP002428)

■ Moldova-11-271 R. sibtrtca (HM050296) R. parken strain ApPR (JN126320) • R.japónica YM (AP011533) R.africae (X043505) R.COOOrii(HM050292)

■ Moldova-11-08 Komi-10-062

k. Tomsk-11-292 • Komi-10-917 I Komi-10-915 k Komi-10-810 Tomek-10-04 A Tom«k-11-27m Tomsk-11-242 Tom*k-11-262

• Komi-10-802 R.tarasevichiae (00168981) - A Tomsk-10-28 Tomsk-10-29 A Tomek-10-810 -A Tomsk-10-16

A Tofnsk-10-826 - ATomsk-10-38 Tomek-10-23 Tomsk-10-26 Tom»k-10-072 • Komi-10-819

R.helvetica(U59723) ■ R.asiatica (AB297808) I i- R.canadensis (AB 297809) ^HI R.tarasevicNae L40 (EU919263) вД Rickettsia sp HS20<JF 71421:

Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное по ДНК-фрагменту (260 н.о.) гена gltA риккетсий методом объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели Кимуры. НП ДНК риккетсий, секвенированные нами, обозначены как "Komi®" "Moldovae", "Tomsk А" в соответствии с местами сбора. Прототипные последовательности в оригинальной транскрипции GenBank

■ Мо1<Ю<«-11-06 (J3Œ78435) ■ Мо1Л>\в-11-09 <JXS78436)

• Komi-10-1179 (JXS78439)

- R raouttii isolate T6 (JQ796907) R. raoultii (JN 39848) • • Komi-10-733 (JXS78438) ■ Moldo\e-11-l0 (JXS78437) Rickettsia sp JL-02<AY093696) — R. cononi (JN944636) |- R. sibinca (Ц4Э807) _ — R. parkeri strain Toledo (EU715288) 94 • R. atncae (Uв3436) ▲ Tomsk-11-25 (JX972176) ■ МЫ dose-11-271 (JX978433) R. slovaca 13-B (CP00242B) 99 R. slovaca st.WBIO (HM161797) R.slovaca isolate TS (JQ798909) ■ Motdo«a-11-08 (JX978434) - R. amblyommii (EF194096) R. amblyommii is.75A(JQ690S38)

ÖL-—-Rickettsia sp.PoTiR634(HM 149288) |- Rickettsia sp(JF714220) I ▲ Tomsk-11 -292 (-1ХЭ46729) eej — ▲ Tomsk-11-242 (JX946728) ^ A Tomsk-11 -262 (JXS46730) ▲ Tomsk-11-243 (J>®72172 ) ▲ Tomek-11-52m (J>372171 ) ▲ Tomsk-11-248 (J>S72174) 1- A Tomsk-11 -27m (J>372173) бЛ-A Tomsk-11-232 (JX972175)

' о., 1

Рис. 5. Филогенетическое дерево, построенное по ДНК-фрагменту гена отрА

(466 н о ), кодирующим белок А наружной мембраны риккетсий, методом

объединения ближайших соседей с использованием 2-параметрической модели

Кимуры. НП ДНК риккетсий, секвенированные нами, обозначены как

■ Komi«", "Moldova«", "Tomsk А".

Последовательности депонированы gb JX946728, JX946729, JX946730, JX972171,

JX972172, JX972173, JX972174, JX972175, JX972176, JX97843, JX978434,

JX978435, JX978436, JX978437, JX978438, JX978439

Томские образцы 11-292, 11-232, 11-262, 11-243, 11-27m, 11-52шр и 11-248, выделенные из органов птиц и клещей /. persulcatus и кластеризовавшиеся по гену git А с R. tarasevichiae, по гену отрА оказались в одной ветви с последовательностью Rickettsia sp. П820 (JF714220), которая в 2011г. была обнаружена в клещах на Северо-Востоке Китая. Один томский образец, полученный из клеща I. persulcatus, генотипирован как R. slovaca - вид, встречающийся в Европе и являющийся классическим риккетсиозным патогеном, вызывающим тяжёлое заболевание у людей. Исследование

иксодовых клещей 1. ricinus и Dermacentor spp., отловленных на территории Респ. Молдовы, выявило наличие в организме переносчиков двух видов риккетсий — R. slovaca и R. raoultii.

4. Нуклеотидная последовательность генов 16SpPHK и субъединицы! цитохромоксидазы (COI) митохондриального генома иксодовых клещей Ixodes pavlovskvi и Ixodes versulcatus. В последнее десятилетие отмечается изменение видового состава иксодовых клещей, обитающих в городских биотопах г. Томска с увеличением доли, а на некоторых территориях полного доминирования клеща I. pavlovskyi и вытеснением I. persulcatus. Для доказательства этого был использован молекулярный метод, которые позволил провести идентификацию этих видов. Нами были определены НП митохондриальных генов клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus отловленных в Западной Сибири в 2011-2012 гг., а именно генов coxl, кодирующего субъединицу 1 цитохром-с-оксидазы (COI), и гена rrnL, кодирующего 16S рРНК. Выбор этих генов был во многом определён наличием информации по этим районам генома для других видов иксодовых клещей. Последовательности депонированы в GenBank под номерами JX288763 и JX288764. Полноразмерный ген COI содержит 1539 н.о. для обоих видов клещей. Уровень межвидовых отличий НП митохондриального гена COI между двумя видами клещей составляет около 10 %. Уровень межвидовых отличий по аминокислотной последовательности составил всего 4 аминокислоты, 3 из них кластеризуются в одном районе - в позициях 157, 161 и 176 (табл. 3). Без сомнения, именно этот район может быть рекомендован для разработки тест-системы для быстрого типирования этих видов клещей. Уровень внутривидовых отличий для двух известных полных нуклеотидных последовательностей генов COI составил 0,58 % для клещей I. pavlovskyi и 1,17% для I. persulcatus.

Таблица 2

Аминокислотные замены в гене, кодирующем COI

Позиция а о. в белке 157 161 176 447

/. persulcatus (AB073725) I I S A

1. persulcatus 1632 (JQ625687) I I s A

I. persulcatus-T(JX288764) I I s A

1. pavlovskyi (AB231669) M M L S

1. pavlovskyi -Ipvl(JQ823025) M M L s

I. pavlovskyi- Ipv2(JQ823024) M M L s

I. pavlovskyi-T (JX288763) M M L s

Последовательности, полученные нами, выделены жирным шрифтом.

Для филогенетического анализа нами был выбран фрагмент гена COI (640 н. о.), используемый для ДНК-штрихкодирования сельскохозяйственных животных. Его результаты представлены на рис. 6. Филогенетический анализ показал, что последовательности клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus формируют отдельные филогенетические ветви, обособленные от других видов иксодовых клещей. Полученные данные свидетельствуют о достаточно давнем разделении видов иксодид и о правомерности использования данного фрагмента митохондриального генома для определения видового состава иксодовых клещей.

НП гена 16S рРНК митохондриального генома была определена для клещей: /. pavlovskyi - Томск, 2011 г. (JX392858), I. persulcatus - Томск, 2011 г. (JX392859) и I. pavlovskyi - Новосибирск, 2012 г. (JX392860). Полноразмерный ген 16SpPHK содержит 1206 н.о. для обоих видов клещей, что соответствует размеру этого гена для многих видов иксодовых клещей. Уровень гомологии по гену rrnL с известными последовательностями, депонированными в GenBank, составляет: для клещей I. pavlovskyi /1. persulcatus - 90-93%; для I. pavlovskyi / I. ricinus - 82-84%; для I. pavlovskyi /1. scapularis — 89-90%. Результаты филогенетического анализа по гену 16S рРНК (рис. 7) аналогичны результатам, полученным при филогенетическом анализе последовательности гена COI (см. рис. 6). Естественная внутривидовая изменчивость по гену

16S рРНК составляла соответственно 1,44 % и 1,93 % для клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus.

Полученные результаты согласуются с данными об уровне внутривидовой изменчивости гена COI, полученные при исследованиях клещей, обитающих в других районах земного шара.

AtpwTItKJOTBI

■ ьидаяея)

■ додааоэд

(рвПДОЯге*)

ю! МягаААк mdHT АМ15(Н1ШЖ^ _Л|1Нити(*ВИ1674)

. tKiu ¿obla С36 (AYMSCS) ояШе UtfAV94S«27}

-1шМапот (««SKS)

-U«a(|B«stAF549W2)

- HMMfftjs* Ьв<АавНЭ54)

Рис. 6. Филогенетическое дерево, построенное по НП фрагмента гена COI мтДНК (640 но.) иксодовых клещей. НП, определённые в данном исследовании, обозначены как

р«Ыаи(АИ<31ВЕ| А1Ра-Т1(ЛШЙЭ) [рэ*»^!*"«®«!

уцр^ииротв) к"л1Р»Т1(ШЗаЯ)

sillscspüispraSOI^ I_!jü«s(AFS<9M2) —Lxaftns (A81S5C7) -l

«U

-MlynnitñguMnlABIIÜII) —Навш|*рАЬи1/Ш59И) -DenucatBrffi!ra£fcslFS2S493

Рис. 7. Филогенетическое дерево, построенное по НП фрагмента гена 165 рРНК мтДНК (437 н о.) иксодовых клещей. НП, определённые в данном исследовании, обозначены знаком ▲

Выводы

1. В клещах I. persulcatus, собранных в биотопах Республики Коми, обнаружен генетический материал восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ) и Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированное™ клещей колебался от 11,3% до 1,2% в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %. Анализ 5'-НТО геномной РНК ВКЭ из иксодовых клещей, собранных на территории Республики Коми в 2010 г. показал, что 81,3 % образцов относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, а 18,7% - к сибирскому генотипу. Варианты европейского генотипа не обнаружены.

2. Анализ 5-НТО геномой РНК ВКЭ из иксодовых клещей показал существенные изменения конформации Y-структуры и высокую вариабельность этого района. Вариабельность элементов CI, В2, CS В наблюдалась в более чем 50 % образцов, при этом А2 и ATG-элементы 5'-НТО оставались полностью консервативными.

3. Rickettsia spp. была обнаружена в пробах клещей, собранных в г. Томске - в 5,9%, Республике Коми — в 8,4% и Республике Молдова - в 12,7% образцов. Генетический материал риккетсий был выявлен в 9,7 % образцов, полученных из органов грызунов и в 27,4 % образцов - из различных видов птиц, обитающих в г. Томске и его пригородах.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов git Л и отрА риккетсий позволил выявить циркуляцию R. raoultii и R. tarasevichiae на территории Республики Коми и г. Томске. Восемь томских изолятов Rickettsia кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), выявленной в 2011 г. в Северном Китае и рассматриваемую как кандидата для выделения в новый вид риккетсий.

5. Определена нуклеотидная последовательность генов COI и 16S рРНК митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг. Уровень гомологии между этими видами клещей составил для гена 16S рРНК - 92 %, для гена COI - 90 %. Уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составил 0,58 % для клещей I. pavlovskyi и 1,17 % для I. persulcatus, по гену 16S рРНК - 1,44 % и Л,93 % соответственно. Филогенетический анализ генов COI и 16S рРНК показал, что последовательности мтДНК клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геногруппы и могут быть использованы в качестве генетических маркёров для видовой идентификации клещей рода Ixodes.

6. Генетический анализ полной нуклеотидной последовательности штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» (GenBank JX498939) показал, что уровень гомологии нуклеотидной последовательности с прототипными последовательностями дальневосточного генотипа составил 90-95 % и для аминокислотных последовательностей - 94-98 %. Уровень гомологии со штаммом 205 (GenBank DQ989336) из коллекции НПО «Вирион» - 100 %, за исключением З'-НТО, которая оказалась на 30 нуклеотидов длиннее, чем у штамма 205 из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Л.И. Глушкова, И.В. Корабельников, Ю.И.Егорова, В. А. Терновой, Е.В. Протопопова, Т.П. Микрюкова. Ю.В. Кононова, С.Н. Коновалова, H.JI. Тупота, М.Ю. Карташов, Е.В. Чаусов, В.Б. Локтев // Возбудители инфекционных заболеваний в таёжном клеще на территории Республики Коми // Дезинфекционное дело. - 2012. - № 1. - С. 52-56.

2. Л.И. Глушкова, И.В. Корабельников, В.А. Терновой, Е.В. Протопопова, Т.П. Микрюкова. Ю.В. Кононова, С.Н. Коновалова, Н.Л. Тупота, М.Ю. Карташов, Е.В. Чаусов, В.Б. Локтев, Ю.И. Егорова // Выявление возбудителей заболеваний в Ixodes persulcatus на территории Республики Коми // Сибирский мед. журнал. -2012. -№ 4. - С. 88-91.

3. П.Ф. Сафронов, C.B. Нетёсов, Т.П. Микрюкова. Блинов В.М., Е.Г Осипова, H.H. Киселева, Л.С. Сандахчиев. Нуклеотидная последовательность генов и

полная аминокислотная последовательность вируса клещевого энцефалита, штамм205//Молекул, ген.микробиол. вирусол,- 1991.-№4.-С. 23-29.

Тезисы

1. Семенцова А.О., Терновой В.А., ШиковА.Н., Чаусов Е.В., Микрюкова Т.П.. Протопопова Е.В., Локтев В.Б., Агафонов А.П., Сергеев А Н. - Дифференциальная диагностика флавивирусных инфекций методом ПЦР в реальном времени // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 2011 г. С. 71.

2. Микрюкова Т.П.. Карташов М.Ю., Протопопова Е.В., Тупота Н.Л., Кононова Ю.В., Терновой В.А., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. — Циркуляция патогенов, передающихся клещами на территории Западной Сибири в 2009-2011 гг. // 2-ая Международная конференция «Астана Биотех 2011». Астана, Казахстан. 2011 г. С. 158.

3. Глушкова Л.И, Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Терновой В.А., Микрюкова Т.П.. Протопопова Е.В., Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б. — Возбудители инфекционных заболеваний в таёжном клеще на территории Республики Коми // IV Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 2012 г. С. 100.

4. Микрюкова Т.П., Карташов М.Ю., Протопопова Е В., Коновалова Ю.В., Тупота Н.Л., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Корабельников И.В., Егорова Ю.И., Гори А.Ф., Москвитина Н.С., Локтев В.Б. - Генетические варианты риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки из различных эпидемически активных очагов // IV Ежегодный Всероссийский конгресс по инфекционным болезням. Москва. 2012 г. С. 249.

5. Микрюкова Т.П.. Шиков А.Н., Протопопова Е.В., Коновалова C H., Кононова Ю.В., Семенцова А О., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Романенко В.Н., Москвитина Н.С., Локтев В.Б. — Нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и CR-района митохондриальной ДНК иксодовых клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus. Международная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами». Иркутск—Листвянка. 2012 г. С. 35.

6. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Микрюкова Т.П.. Кононова Ю.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Карташов М.Ю., Чаусов Е.В., Локтев В.Б., Егорова Ю.И. - Выявление возбудителей заболеваний в Ixodes persulcatus на территории Республики Коми //Международная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами». Иркутск-Листвянка. 2012 г. С. 15.

7. Кононова Ю.В., Чаусов Е.В., Терновой В.А., Протопопова Е.В., Коновалова С.Н., Тупота Н.Л., Микрюкова Т.П.. Локтев В.Б. и др. - Инфицированность клещей I. persulcatus и I. pavlovskyi вирусами клещевого энцефалита и Западного Нила в биотопах г.Томска и его пригородах в период 2006-2010гг. Международная конференция «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами». Иркутск-Листвянка. 2012 г. С. 31.

Настоящая работа выполнена за счёт финансирования по грантам НШ-65387.2010.4, НШ-2996.2011.4, гранта РФФИ 12-04-00563-а, ФЦП № 63-Д/2 по Госконтракту № 01201175188, № 70-Д/1 по Госконтракту № 01201175183 и № 41-Д/2 по Госконтракту № 01201270193.

Подписано в печать 07.11.2012 г. Печать цифровая. Бумага офсетная. Формат 60x84/16. Тираж 100 экз. Заказ № 118.

Отпечатано в типографии «Срочная полиграфия» ИП Малыгин Алексей Михайлович 630090, Новосибирск, пр-т Академика Лаврентьева, 6/1, оф. 104 Тел. (383) 217-43-46, 8-913-922-19-07

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Микрюкова, Тамара Петровна

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15 1.1. Иксодовые клещи - переносчики трансмиссвных инфекций

1.1.1. Характеристика основных представителей семейства Ixodidae

1.1.2. Особенности биохимических взаимодействий клеща с организмом позвоночных при питании

1.1.3. Митохондриальный геном клещей

1.1.4. Использование молекулярно-генетических методов для видовой идентификации клещей

1.2. Возбудители клещевых инфекций. Вирус клещевого энцефалита

1.2.1. Общая характерис тика семейства Flaviviridae

1.2.2. Вирус клещевого энцефалита и особенности 5,-петраислируемой области

1.2.3. Основные генотипы вируса клещевого энцефалита

1.2.4. Новые генетические варианты вируса клещевого энцефалита

1.2.5. Эволюция и географическое распространение вируса клещевого энцефалита

1.2.6. Вакцинопрофилактика клещевого энцефали та

1.3. Возбудители клещевых инфекций. Генетическое разнообразие риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки

1.3.1. Риккетсии. Основные представители

1.3.2. Клещевые риккетсиозы

1.3.3. Методы идентификации риккетсий

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России"

Совершенно очевидно, что устойчивость трёхчленной паразитарной системы трансмиссивных заболеваний обеспечивается сложными взаимодействиями гетерогенных структур - популяций основных компонентов очага: возбудителей, переносчиков и прокормителей.

Несмотря па большое количество исследований в этой области, представления о структурных компонентах природных очагов недостаточно полны и требуют дополнительных комплексных исследований, касающихся функционирования и контроля эпидемической напряжённости природных очагов и очагов, подвергшихся антропогенной трансформации.

Для человека наиболее патогенными возбудителями из природно-очаговых трансмиссивных инфекций, переносимых клещами, являются флавивирусы.

Флавивирусы способны инфицировать широкий круг организмов, который включает в себя различные виды млекопитающих, насекомых, птиц, рептилий. Эти виды животных формируют природные очаги в различных географических регионах мира. Многие из флавивирусов вызывают заболевания у человека. Наиболее значимые для человека флавивирусные инфекции связаны с вирусами депге, жёлтой лихорадки, японского энцефалита, Западного Нила и клещевого вирусного энцефалита. Для клинической картины этих заболеваний характерны тяжёлые лихорадки, в том числе с выраженными геморрагическими проявлениями, менингиты и энцефалиты, сопровождающиеся очаговыми поражениями центральной нервной системы, тяжёлыми поражениями печени и других внутренних органов. Для России наибольшую медицинскую значимость имеет вирус клещевого энцефалита (Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V., 1999). BIO был открыт в 1937 году на Дальнем Востоке как этиологический агент клещевого энцефалита (Павловский, 1940). BIO принадлежит к группе вирусов одноимённого комплекса и вызывает у людей заболевание ЦНС с уровнем смертности 1-2 % для европейского и сибирского генотипа и 30 % - для дальневосточного генотипа (Gritsun T.S. et al., 2003).

Передача флавивирусной инфекции осуществляется членистоногим переносчиком - через укус комара или клеща, а 'также при употреблении молока от заражённых коров и коз.

В Российской Федерации с начала 90-х годов и до 2000 года отмечался резкий подъём заболевания КЭ (до 8000 случаев в год). Несмотря на то, что в настоящее время заболеваемость снизилась более чем в 3 раза и составляет 2,42,6 чел. на 100 тыс. населения (при этом число заболеваний по РФ находится в пределах 3200-3700 случаев в год), в некоторых регионах Урала, Сибири и Дальнего Востока она по-прежнему остаётся высокой - до 30-35 чел. на 100 тыс. населения. Ежегодно в РФ до 350 тысяч человек подвергаются нападению клещей, а значит, и риску заболевания клещевыми инфекциями. Наряду с ростом случаев присасывания клещей отмечается тенденция к нарастанию тяжести заболеваний, которые они передают, увеличивается доля менингеальных и очаговых форм КЭ (Волкова, Образцова, 2002), имеются сообщения о случаях заболевания IO с геморрагическим синдромом (Ternovoi et al., 2003). Кроме того, растёт список инфекций, передаваемых клещами. Для одних уже установлена роль в инфекционной патологии человека, а для других вопрос патогепности остаётся открытым, особенно это касается риккетсий. 'Гак, виды, считавшиеся ранее непатогенными, после антропогенного воздействия па природные очаги вызывали тяжёлые заболевания у людей. Примером может служить астраханская пятнистая лихорадка (Тарасович, 2005). В настоящее время существует несколько видов риккетсий, патогеппость которых для человека не установлена, - к сожалению, это не всегда означает, что её нет.

Требуются дополнительные исследования этой группы клещевых инфекций для уточнения спектра циркулирующих в России видов и уточнение их патогенпости.

В настоящее время наиболее актуальными вопросами молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций являются уточнение ареалов инфекций, генотипов возбудителей этих инфекций, а также видового состава и граииц распространения иереносчиков.

В последнее время во многих городах России отмечается увеличение количества иксодовых клещей в городских биотопах, изменение их видового состава, а также увеличение доли смешанных инфекций (Ромапепко и др., 2011; Ястребов и др., 2012).

Известно, что членистоногие переиосчики, а возможно, и их позвоночные прокормители могут влиять на свойства ВКЭ (Вотяков, 2002), в силу чего знание их генетических характеристик может быть полезным при изучении механизмов адаптации возбудителей и формирования их патогенетических свойств. Для доказательства этих изменений проводится видовая идентификация клещей с помощью морфологических методов, что является кропотливым и трудоёмким процессом и не всегда приводит к однозначной интерпретации результатов. Пет сомнения в том, что видовой состав переносчиков оказывает влияние на функционирование природного очага и при появлении таких случаев требует разрешения после проведения дополнительных исследований с применением молекулярпо-биологических методов.

Всё также остаётся актуальной проблема вакцинопрофилактики: доля привитых среди лиц, подвергшихся нападению клеща, не превышает 10 % даже для районов, неблагополучных по КЭ. Поэтому генетический контроль производственных штаммов, их соответствие наиболее перспективному по использованию для вакцинации населения генотипу необходимо, особенно после опубликования данных о существовании нескольких существенно отличающихся вариантов штамма Софьин дальневосточного генотипа, используемого в настоящее время как реферепс-штамма (Коуа1еу е1 а1., 2012).

Наибольшее внимание, как известно, уделяется природным очагам с традиционно высокой заболеваемостью (Сибирь, Дальний Восток) и инфекциям, наиболее распространённым и опасным для человека (клещевой вирусный энцефалит, клещевой боррелиоз). При этом об очагах, находящихся на границе ареала иксодовых клещей и в которых ранее регистрировались только единичные случаи клещевых инфекций, известно очень немного.

Учитывая существенный рост заболеваемости клещевым энцефалитом в Республике Коми, наблюдаемый в последние годы, а также отсутствие комплексных исследований этого природного очага, мы решили установить спектр переносимых клещами патогенов в этом регионе и генотипировать наиболее опасный из них - вирус клещевого энцефалита.

Заболеваемость клещевыми риккстсиозами в последние годы не имеет тенденции к росту и регистрируется в 17 областях, в то время как в соседних государствах (европейские страны, Япония) эти заболевания имеют высокую медицинскую значимость и активно исследуются. Появляются публикации о тяжёлых формах риккетсиозов (ОоЬес е1 а1., 2009) и выявлении новых видов риккетсий (Рудаков и др., 2012). Поэтому мы решили определить частоту встречаемости и генотипировать риккетсии в природных очагах, находящихся в различных по эпидемической напряжённости частях ареала и сравнить с природным очагом, для которого значимость этого патогена считается высокой.

В РФ иксодовые клещи, являющиеся неотъемлемой частью природного очага, активно и успешно изучаются только несколькими группами исследователей - зоологов. Информация об их генетических характеристиках отсутствует практически полностью, несмотря па то, что понимание структурно-функциональных особенностей природных очагов без точных генетических критериев невозможно.

Исходя из выше изложенного материала, нами было решено подойти к решению обозначенных проблем комплексно. Отсюда вытекает несколько поставленных целей для моего диссертационного исследования.

Цели исследования:

• оцепить уровень заражённости клещей вида Ixodes persulcatus и определить спектр инфекций в иксодовых клещах, собранных в пограничных районах ареала - па территории Республики Коми в 2010 году;

В связи с поставленными целями предстояло решить ряд задач.

Задачи исследования:

• выявить РНК ВКЭ и ДНК бактерий в коллекционных образцах с помощью ГИДР;

• определить нуклеотидпые последовательности фрагментов геномов, выявленных в образцах коллекции, вариантов ВКЭ и риккетсий и провести их молекулярно-генетический анализ;

• охарактеризовать межвидовую и внутривидовую вариабельность иксодовых клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг., участвующих в трансмиссии клещевых инфекций, по пуклеотидным последовательностям митохондриальпых геномов;

• провести определение полной нуклеотидной последовательности генома реферепс-штамма 205 ВКЭ из коллекции ПЩ ВБ «Вектор» и его сравнительный анализ.

Научно-практическая значимость

• Впервые проведено комплексное исследование природного очага клещевых инфекций в Республике Коми. В клещах I. persalcatus обнаружен генетический материал возбудителей восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень ипфицировапности клещей для разных инфекций колебался от 11,3% до 1,2% в зависимости от вида возбудителя. Уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %.

• Впервые показано, что в иксодовых клещах Республики Коми циркулирует сибирский и дальневосточный генотип ВКЭ, причём доминирует дальневосточный, доля которого достигает 81,2%) от числа клещей, генотипированных по ВКЭ. Во всех исследованных образцах иксодовых клещей европейский генотип ВКЭ обнаружен пе был.

• Анализ нуклеотидной последовательности 5'-НТО геномной РНК ВКЭ, выделенной из индивидуальных клещей, показал высокий уровень вариабельности некоторых участков Y-структуры 5'-НТО. Вариабельность элементов В2, С1, CS В наблюдалась в более чем 50 % образцов. Анализ копформации района 5'-НТО геномной РНК ВКЭ показал, что наблюдаются существенные изменения вторичной структуры этого района РНК. Полученные данные подтверждают гипотезу, что вариабельность и конформация 5'-НТО геномной РНК BIO имеют принципиальное значение для адаптации вируса к активной репликации в клетках различных видов.

• Установлено, что ДНК Rickettsia spp. встречается в клещах, грызунах и птицах, обитающих в г. Томске и его пригородах, Республике Коми и Республике Молдова. ДНК Rickettsia spp. была обнаружена в 12,7-5,9% образцов. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и отрА, кодирующих цитратсинтазу и белок А наружной мембраны, позволил установить, что на территории Республики Коми циркулируют два вида риккетсий - R. raoiiltii и R. tarasevichiae, на территории Томска - R. raoultii, R. tarasevichiae, R. slovaca. С помощью филогенетического аиализа показано, что восемь томских изолятов кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), которая является каидидатной для выделения в новый вид риккетсий.

• Проведён анализ генома штамма 205 ВКЭ, используемого в настоящее время для производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита из двух вирусных коллекций, прошедших разную пассажную историю. Анализ показал их высокую гомологию и высокий уровень консерватизма штамма 205. Полученные данные по генетическим характеристикам производственного штамма 205 ВКЭ могут быть использованы для стандартизации производства вакцины против клещевого вирусного энцефалита.

• Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генов субъедииицы 1 цитохромоксидазы (COI) и 16SpPIIK митохондриальной ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persidcalus, собранных па юге Западной Сибири в 2011-2012 гг. Анализ нуклеотидных последовательностей исследованных митохондриальпых генов иксодовых клещей показал, что уровень межвидовых отличий клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus, варьировал от 8 до 12 %, а уровень внутривидовой изменчивости - от 0,58% до 1,93%. Полученные данные могут быть использованы для проведения генетических исследований биоразнообразия различных видов клещей, обитающих в Евразии.

Положения, выносимые на защиту

• В Республике Коми в клещах 1. persulcatus обнаружены генетические маркёры восьми инфекций: вирусов клещевого энцефалита и Западного Мила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp.

• Установлено, что на территории Республики Коми циркулируют ВКЭ дальневосточного и сибирского генотипа.

• Доказано, что элементы С1, В2, CS В Y-структуры 5'-НТО геномной РНК ВКЭ природных образцов высоковариабельпы, при этом вторичная структура 5'-НТО природных вариантов существенно отличается от вторичной структуры 5'-НТО лабораторных штаммов.

• С помощью секвенировапия показано, что полные иуклеотидные последовательности геномной РНК штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» и производственного штамма 205 из коллекции НПО «Вирион», опубликованной в 1991 г., имеют высокий уровень гомологии.

Вклад автора:

Расчёт и тестирование олигодезоксирибонуклеотидных праймеров для геиотипироваиия иксодовых клещей; создание коллекции образцов ДНК/РЫК, выделенных из иксодовых клещей; проведение ПЦР; определение нуклеотидных последовательностей (секвепировапие) и их анализ, выполнены лично автором.

Выявление РНК/Д1 LK-маркёров трансмиссивных инфекций в образцах коллекции, расчёт олигонуклеотидных праймеров для определения полной нуклеотидной последовательности штамма 205 вируса клещевого энцефалита выполнено совместно с канд. биол. наук Чаусовым Е.В. и Карташовым М.Ю.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена па 133 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», главы «Результаты и обсуждение», выводов, списка литературы. Библиография включает 150 ссылок: 54 - отечественных авторов, 96 - зарубежных. Работа иллюстрирована 18 рисунками и включает 13 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Микрюкова, Тамара Петровна

выводы

1.В клещах I. persulcatus, с обрапных и биотопах Республики Коми, обнаружен генетический материал восьми клещевых инфекций: вирусов клещевого энцефалита (ВКЭ) и Западного Нила (ВЗН), Borrelia spp., Rickettsia s pp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированное™ клещей колебался от 11,3 % до 1,2 % в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 5,6 %. Анализ 5'-НТО геномной РНК ВКЭ из иксодовых клещей, собранных на территории Республики Коми в 2010 г. показал, что 81,25% образцов относится к дальневосточному генотипу ВКЭ, а 18,75% — к сибирскому генотипу. Варианты европейского генотипа не обнаружены.

2. Анализ 5ЧТГО геномой РНК ВКЭ из иксодовых клещей показал существенные изменения коиформации Y-структуры и высокую вариабельность этого района. Вариабельность элементов С1, В2, CS В наблюдалась в более чем 50 % образцов, при этом Л2 и ATG-элементы 5-НТО оставались полностью консервативными.

3. Rickettsia spp. была обнаружена в пробах клещей, собранных в г. Томске - в 5,9%, Республике Коми - в 8,4% и Республике Молдова - в 12,7% образцов. Генетический материал риккетсий был выявлен в 9,7 % образцов, полученных из органов грызунов и в 27,4 % образцов - из различных видов птиц, обитающих в г. Томске и его пригородах.

4. Анализ нуклеотидных последовательностей генов gltA и отрА риккетсий позволил выявить циркуляцию R. raoultii и R. tarasevichiae па территории Республики Коми и г. Томске. Восемь томских изолятов Rickettsia кластеризовались с последовательностью Rickettsia sp. Н820 (JF714220), выявленной в 2011 г. в Северном Китае и рассматриваемую как кандидата для выделения в новый вид риккетсий.

5. Определена нуклеотидная последовательность генов COI и 16SpPHK митохондриальиой ДНК клещей I. pavlovskyi и I. persulcatus, собранных на юге Западной Сибири в 2011-2012 гг. Уровень гомологии между этими видами клещей составил для гена 16S рРНК - 92 %, для гена COI - 90 %. Уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составил 0,58 % для клещей I. pavlovskyi и 1,17 % для I. persulcatus, по гену 16S рРНК - 1,44 % и 1,93% соответственно. Филогенетический анализ генов COI и 16SpPHK показал, что последовательности мтДНК клещей /. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геногруппы и могут быть использованы в качестве генетических маркёров для видовой идентификации клещей рода Ixodes.

6. Генетический анализ полной нуклеогидной последовательности штамма 205 ВКЭ из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор» (GenBank JX498939) показал, что уровень гомологии нуклеотидной последовательности с прототипными последовательностями дальневосточного генотипа составил 90-95 % и для аминокислотных последовательностей - 94-98 %. Уровень гомологии со штаммом 205 (GenBank DQ989336) из коллекции НПО «Вирион» - 100%, за исключением З'-НТО, которая оказалась на 30 нуклеотидов длиннее, чем у штамма 205 из коллекции ГНЦ ВБ «Вектор».

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние годы наблюдается очень существенный рост, более чем в 50 раз, заболеваемости клещевым энцефалитом в северных регионах европейской части страны. Он сопровождается изменением географии распространения таёжного клеща в этом регионе России (Tokarevich et al., 2011; Revich et al., 2012). Органами практического здравоохранения фактически регистрируются только две клещевых инфекции - это клещевой энцефалит и клещевой боррелиоз. Рост заболеваемости КЭ свидетельствует о возможном росте случаев заболевания другими клещевыми инфекциями. Для уточнения распространённости клещевых инфекций была предпринята попытка идентификации различных клещевых инфекций в таёжных клещах. Их сбор был проведён центральных и южных районах Республики Коми. Исследование собранных клещей Ixodes persulcatiis с помощью полимеразиой цепной реакции выявило генетические маркёры восьми инфекционных агентов: вирусов клещевого энцефалита и Западного Нила, Borrelia spp., Rickettsia spp., Ehrlichia spp., Babesia spp., Bartonella spp., Anaplasma spp. Уровень инфицированное™ клещей колебался от 0,4 до 13,4% в зависимости от вида возбудителя, а уровень смешанных клещевых инфекций достигал 6,3 %. Чаще всего встречалась микст-инфекция ВКЭ и Borrelia spp.

Для уточнения особенностей молекулярной эпидемиологии клещевых инфекций в этом регионе было проведено гепотигшроваиие современных вариантов ВКЭ и оценки возможной генетической вариабельности ВКЭ в таёжных клещах. С этой целыо были определены секвенированием нуклеотидные последовательности фрагментов генома ВКЭ, полученные в ходе ПЦР с геномной РНК вируса, изолированной из индивидуальных иксодовых клещей, и проведён анализ последовательности 5'-НТО генома ВКЭ. Нам удалось определить нуклеотидные последовательности 5'-НТО и 5'-концевого участка гена, кодирующего N-концевой фрагмент белка С, для 16 вариантов ВКЭ из иксодовых клещей, минуя стадию лабораторного культивирования возбудителя. Прямое определение вирусной пуклеотидной последовательности позволяет оценить генетическую вариабельность вирусного генома непосредственно в клеще. Это исключает адаптацию вируса к лабораторным системам культивирования и исключает селекцию жизнеспособных в лабораторных условиях вариантов ВКЭ. При таком подходе нам удавалось секвенировать вирусные последовательности приблизительно у трети ПЦР-положительпых клещей. Фактически, это косвенно отображало уровень вирусной РНК в клеще. Успешное секвепировапие было возможно только при достаточно высокой концентрации вирусной РНК. Видимо, эти клещи и были более эпидемиологически опасны, так как уровень нагрузки вирусной РНК может предопределять инфицирующую дозу при укусе клеща. Анализ филогенетических взаимоотношений изолятов вируса клещевого энцефалита из таёжных клещей позволил выявить циркуляцию только двух генетических вариантов ВКЭ - сибирского и дальневосточного. Неожиданно, но нам не удалось обнаружить в изолятах, полученных из Республики Коми, вариантов ВКЭ, относящихся к классическим штаммам европейского геиотипа. Практически все исследованные изоляты оказались оригинальными и не имели ближайших прототипов (геновариантов) среди известных ранее штаммов сибирского и дальневосточного генотипов ВКЭ. Только варианты Komi 10-13 и Komi 10-15 были генетически близки к известным и описанным ранее штаммам ВКЭ дальневосточного геиотипа. Это штамм 205 и Приморье-91. Фактически только эти последние два варианта можно рассматривать как «завозные» для этого региоиа. Остальные обнаруженные варианты были генетически разнообразны, кластеризовались в различные группы. Это позволяет высказать гипотезу о длительной и независимой эволюции сибирского и дальневосточного геиотипа ВКЭ на территории Северо-Востока Европейской части России.

Анализ пуклеотидной последовательности 5'-НТО вирусного генома показал, что этот район генома ВКЭ в иксодовых клещах весьма вариабелен.

Вариабельность для элемента А1 5-НТО наблюдалась по всех исследованных образцах (100%), а для элементов CI, В2, CS В - в более чем 50% положительных для секвенироваиия образцов. При этом некоторые элементы 5'-НТО оставались полностью консервативными. Компьютерное моделирование вторичной структуры 5'-НТО генома ВКЭ указывает па возможные существенные изменения в пространственной структуре РНК этого района вирусного генома в клещах I. persulcatus. Для лабораторных штаммов ВКЭ это не характерно, так как фактическое большинство лабораторных штаммов имеет стандартную вторичную структуру 5'-НТО, характерную для конкретного генотипа ВКЭ. Изменчивость 5'-НТО в РНК ВКЭ в таёжных клещах позволяет предположить, что обнаруженная нами вариабельность 5Ч1ТО генома ВКЭ может иметь принципиальное значение для обеспечения эффективной репликации ВКЭ в клеще, может изменяться при смене хозяина и сопровождать адаптацию ВКЭ к клеткам млекопитающих.

Следующий этап работы был связан с молекулярной эпидемиологией клещевых риккетсиозов. Для этого был использован материал, собранный в трёх различных регионах: Республике Коми, г. Томске и его пригородах, а также отдалённом от России районе - Республике Молдова как контрольном районе. Объектом для исследования были клещи, а для томских биотопов - ещё и биопробы от мелких грызунов и различных видов птиц. Отлов млекопитающих производился в тех же биотопах, где и сбор клещей. Большинство птиц было отловлено в июле на берегу реки Томь в границах г. Томска и его окрестностях.

В полевых материалах, представленных в основном иксодовыми клещами, собранными в г. Томске, Республике Коми и Республике Молдова, с помощью ПЦР определено наличие генетических маркёров с использованием праймеров к генам, кодирующим цитратсинтазу и белок А наружной мембраны Rickettsia spp. ДНК возбудителя обнаруживалась в полевых пробах в пределах от 5,6 до 14,7 %. Интересно отметить тот факт, что маркёры риккетсий были обнаружены у мелких грызунов, причём ДНК риккетеий выявлялась в 9,7 % случаев, что было несколько выше уровня этого же маркёра у иксодовых клещей в тех же биотопах г. Томска и его пригородах. Ещё более интересный факт был отмечен в случаях выявления ДНК риккетеий в биопробах, полученных от различных видов птиц. В птицах ДНК риккетеий была выявлена в 27,4 % случаев. Неожиданный результат навёл на мысль о роли птиц в переносе различных видов риккетеий на большие расстояния. Полученный результат косвенно подтверждает и филогенетический анализ, проведённый по гену отрЛ, когда было обнаружено, что все 8 изолятов, полученных из г. Томска, вошли в одну группу (кластер) и оказались фактически идентичными северо-восточному китайскому изоляту Rickettsia ¿'/?П820 (JF714220), выделенному ещё 2011 году.

Нуклеотидные последовательности гена, кодирующего цитратсиптазу, из 42 полевых образцов и гена, кодирующего белок А наружной мембраны, из 18 полевых образцов были использованы для проведения генотипирования клещевых риккетсиозов и филогенетического анализа. В клещах, собранных па территории Республики Коми и г. Томска, была обнаружена ДНК R. raoultii и R. tarasevichiae. Восемь томских изолятов образовывали кластер с последовательностью Rickettsia sp. Н820, которая является кандидатной для выделения в новый вид риккетеий и была описана ранее на Северо-Востоке Китая. На территории Республики Молдова были обнаружены риккетсии, близкие к R. slovaca и R. raoultii. С помощью филогенетического анализа нами было показано, что все последовательности оригинальны и образуют отдельные клайды. Картина филогенетического дерева, построенного на основе нуклеогидной последовательности фрагментов двух генов, показывает выраженное генетическое разнообразие риккетеий в полевых пробах, собранных в трёх различных и удалённых друг от друга районах Евразии.

В настоящее время в Российской Федерации для производства вакцин используется два (производственных) референс-штамма дальневосточного генотипа (Leonova, Ternovoi et al., 2007; Lehrer, Holbrook, 2011). Это штаммы 205 и Софьип. Недавно было установлено, что в полных пуклеотидных последовательностях штамма Софьин, полученных из различных коллекций, содержатся множественные нуклеотидпые и аминокислотные замены (Kovalev et al., 2012). Это поставило под сомнение идентичность рсференс-штамма Софьип дальневосточного генотипа, имеющихся в коллекциях различных лабораторий России. Автор сообщения объясняет эту генетическую неоднородность различной историей культивирования этого штамма в разных учреждениях. На наш взгляд, также нельзя исключить технические ошибки секвенирования, которые могли возникнуть в разных группах исследователей при определении пуклеотидпой последовательности этого референс-штамма.

Для получения новых данных о возможной изменчивости референс-штамма 205 дальневосточного субтина в лабораторных условиях проведено полноразмерпое секвенировапие штамма 205 из коллекции ГПЦ ВБ «Вектор», после чего полученную последовательность сравнили с пуклеотидпой последовательностью генома известных штаммов BIO и штаммом 205 (DQ989336) из коллекции НПО «Вириоп» (г. Томск), полная нуклеотидная последовательность которого была определена с помощью секвенирования нами в 1991 году.

Принципиально важная роль иксодовых клещей в обеспечении устойчивого функционирования природных очагов клещевых инфекций в пригородных и городских биотопах лесостепной зоны России требует проведения исследований с целью выявления особенностей строения генома иксодовых клещей как основного вектора для передачи и распространения клещевых инфекций. Знание пуклеотидпой последовательности митохондриальпого генома иксодовых клещей позволит использовать методы генетической диагностики для идентификации различных видов иксодид, даст возможность оценить их внутривидовую изменчивость и особенности молекулярной эволюции геномов клещей.

К сожалению, паши знания об особенностях строения генома иксодовых клещей на территории России весьма ограничены. Поэтому задачей данного исследования было определение нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов клещей I. pavlovskyi и /. persulcatus, а именно генов coxl, кодирующего субъединицу 1 цитохром-С-оксидазы (COI), и гена rrnL, кодирующего 16S рибосомальпую РЫК митохондриальиого генома. Выбор этих генов был во многом предопределён наличием информации по этим районам генома для других видов иксодовых клещей, представленым в базе данных GenBank.

Нам удалось обнаружить выраженный консерватизм исследованных генов при сохранении определённого уровня внутривидовой изменчивости. Уровень гомологии нуклеотидной последовательности между двумя видами клещей составил для гена 16S рРНК - 92 %, а для гена COI - 90 %. Уровень гомологии этих генов с последовательностями I. ricinus, другого значимого вектора для клещевых инфекций на территории Европы, находится также в пределах 89-90 %. Филогенетический анализ последовательностей генов COI и 16SpPHK также показывает, что последовательности мтДНК клещей I. pavlovskyi, I. persulcatus и I. ricinus кластеризуются в отдельные геиогруппы. По завершении данного исследования уровень внутривидовой изменчивости по гену COI составлял 0,58 % для клещей 1. pavlovskyi и 1,17 % для I. persulcatus, ио гену 16SpPHK - 1,44% и 1,93% соответственно. Эти результаты позволяют использовать гены COI и 16S рРНК в качестве маркёров для видового типироваиия иксодовых клещей I. pavlovskyñ и I. persulcatus. Данные о нуклеотидных последовательностях генов COI и 16S рРНК митохондриальиого генома хорошо согласуются с существующим таксономическим разделением этих видов клещей. Они позволяют надеяться, что эти гены можно будет использовать для дальнейшего изучения биоразпообразия и особенностей эволюции I. pavlovskyñ и I. persulcatus. Такой подход особенно важен в плане борьбы с клещевыми инфекциями, и хотелось бы надеяться, что будет востребован при конструировании противоклещевых вакцин (ЬаЬиёа е1 а1., 2006). Дальнейшее исследование генома этих двух видов клещей может также принести принципиально новые данные для создания нового поколения препаратов на основе биологически активных соединений иксодовых клещей, что вполне закономерно ставит вопрос о секвенировании полного генома иксодовых клещей I. рач1оУБку1 и I. регзи1са1т.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Микрюкова, Тамара Петровна, Кольцово

1. Алексеев A.M., АрумоваЕ.А., Буренкова Л.А., Чунихин С.П. Об особенностях распространения возбудителя болезни Лайма и поведения зараженных им клещей рода Ixodes // Паразитология. 1993. - Т. 27. - Вып. 6. — С. 389-398.

2. Аммосов А.Д. Клещевой энцефалит (информационно-методическое пособие). Кольцово: Отдел оперативной печати ЗАО «Вектор-Бест», 2006. 116 с.

3. Богданов И.И. Иксодовые клещи Западной Сибири. Типы населения иксодовых клещей // Вести. Омского гос. педагогического университета. -2006. URL: http://vvww.omsk.edu/ (дата обращения 28.10.2012).

4. Бахвалова В.Н., Pap В.А., Ткачук С.Е., Добрикова К.Ю., Морозова О.В. Генетический анализ штаммов вируса клещевого энцефалита Западной Сибири//Вопр. вирусол.-2000.-№ 5.-С. 11-13.

5. Глазко В.И., Столповский Ю.А., Глазко Т.Т. ДГГК-штрихкодирование сельскохозяйственных животных // Вести. Рос. акад. естеств. наук. 2010. -№ 1.-С. 107-113.

6. Глушкова Л.И., Корабельников И.В., Егорова Ю.И. Распространение клещей Ixodes persulcatus P. sch. в южных и центральных районах Республики Коми // Мед. паразитол. 2011. -№ 3. - С. 48-50.

7. Воробьева М.С. Современное состояние вакцинопрофилактики клещевого энцефалита С. 166-169. // В кн. Клещевой энцефалит (к 65-летию открытия) под ред. Г.Н. Леоновой, Л.М. Сомовой-Исачковой. Владивосток: ГУ11 «Примполиграфкомбипат», 2002. 186 с.

8. Вотяков В.И., Злобин В.И.,. Мишаева Н.П. Клещевые энцефалиты Евразии // В кн. Вопросы экологии, молекулярной эпидемиологии, нозологии, эволюции. Новосибирск: Наука, 2002. 438с.

9. Карганова Г.Г. Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита. Автореф. дис. д-ра биол. наук. Москва, 2009. 42 с.

10. Ковалёв С.Ю., Мухачёва Т. А., Кокорев B.C., Беляева И.В. Реферепсный штамм Софьин вируса клещевого энцефалита и проблема его аутентичности // Сибирский мед. журнал 2012. - № 4. - С. 48-51.

11. Коренберг Э.И., Горелова Н.Б., Ковалевский 10.В. Основные черты природной очаговости иксодовых клещевых боррелиозов в России // Паразитология. 2002. - Т. 36.-Вып. З.-С. 177-191.

12. Лашкевич В.А., Карганова Г.Г. Современные аспекты профилактики клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 2007. - № 5. - С. 31-32.

13. Ливанова H.H., Ливанов С.Г., Панов В.В. Особенности распределения клещей Ixodes persulcatus и Ixodes pavlovskyi на границе лесной и лесостепной зон Приобья // Паразитология. 2011. - Т. 45. - Вып. 2. - С. 94-103

14. Ливанова H.H., Боргояков В.Ю., Ливанов С.Г., Фоменко II.В. Характеристика природных очагов клещевых боррелиозов Новосибирского научного центра и Новосибирской области // Сибирский мед. журнал 2012. -№4.-С. 20-23.

15. Локтев В.Б., Терновой В.А., Нетесов C.B. Молекулярно-гепетическая характеристика вируса клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. 2007. - № 5. -С. 10-16.

16. Медяшшков O.IO. Клинико-эпидемическая характеристика клещевого риккетсиоза, вызываемого Rickettsia heolongjiangensis, на Дальнем Востоке России. Автореф. дис. канд. мед. паук. Москва, 2004. 24 с.

17. Нефедова В.В., Коренберг Э.И., Ковалевский Ю.В., Горелова Н.Б., Воробьева H.H. Микроорганизмы порядка Rickettsials у таёжного клеща (Ixodes persulcatus Sch.) в Предуралье // Вестник Рос. акад. мед. наук. 2008. -№ 7. - С. 47-50.

18. Павловский E.H. Организм переносчиков как среда обитания передаваемых ими возбудителей // Зоол. журнал. 1940. - Т. 19. - № 5. - С. 711 - 726.

19. Панова Т.С. Экологические и морфологические особенности популяции таёжного клеща в контрастных условиях обитания. Автореф. дис. канд. биол. наук. Иркутск, 2011. 24 с

20. Подборонов В.М. Возбудители болезней человека, животных и клещи. Москва: Медицина, 2004. 224 с.

21. Погодина В.В., Фролова М.П., Ерман Б.А. Хронический клещевой энцефалит. Новосибирск: Наука, 1986. 234 с.

22. Романенко В.Н., Чекалкина Н.Б. Видовой состав иксодовых клещей на территории г. Томска // Вестн. Томского гос. университета. Сер. Естественные науки. 2004. - № 11 Приложение. - С. 680-683.

23. Романенко В.В., Прохорова О.Г., Злобии В.И. Новая стратегия специфической профилактики клещевого энцефалита: опыт организации массовой вакцинации населения Свердловской области // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика 2005. - № 3. - С. 24-27.

24. Романенко В.Н. Мониторинг видового состава и численности иксодовых клещей (Parasitiformes, Ixodidae) в антропургических, биотопах // Вестн. Томского гос. университета. 2009. - № 324. - С. 376-379.

25. Романенко В.Н., Кондратьева Л.М. Заражённость иксодовых клещей, снятых с людей, вирусом клещевого энцефалита на территории города Томска и его окрестностей // Паразитол. 2011. - Т. 45. - Вып. 1. - С. 3-10.

26. Романенко B.FI. Многолетняя динамика численности и видового состава иксодовых клещей (Ixodidae) на антропогенно нарушенных и естественных территория // Паразитол. 2011. - Т. 45. - Вып. 5. - С. 384-390

27. Рудаков II.В., Оберт A.C. Клещевой риккетсиоз. Омск: ОмГМА, 2001. 120 с.

28. Рудаков Н.В., Шпыпов С.Ы., Купман JI.B., Рудакова С.А., Решетникова Т.А., Абрамова Н.В, Коломеец А.Н. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения риккетсиозов и сочетанпых иифекций в России // Сибирский мед. журнал.-2012,-№4.-С. 5-8.

29. Субботина E.JL, Локтев В.Б. Молекулярная эволюция вирусов клещевого энцефалита и Повассап // Мол. биол. 2012. - Т. 46. - № 1. - С. 82-92.

30. Тарасевич И.В. Астраханская пятнистая лихорадка. М.: Медицина, 2002. -176 с.

31. Тарасевич И.В. Современные представления о риккетсиозах // Клин, микробиол. аптимикроб. химиотер. 2005. - Т. 7. - № 2. - С. 119-129.

32. Тарасевич И.В., Медянников О.Ю. Экология риккетсий и эпидемиология риккетсиозов // Вести. Рос. акад. наук. 2008. - № 7. - С. 5-10.

33. Тюлько Ж.С., Якименко В.В. Вариабельность пуклеотидпых последовательностей геномов вируса клещевого энцефалита, связанная с их структурой // Сибирский мед. журнал. 2012. - № 4. - С. 27-30.

34. Чебышев Н.В., Воробьёв А.А, Пак С.Г. Трансмиссивные инфекции и инвазии. Москва: Медицинское информационное агентство, 2005. 440 с. (С. 3739,71-87).

35. Шнеер B.C. ДНК-пггрихкодирование видов животных и растений способ их молекулярной идентификации и изучения биоразнообразия // Ж. общ. биол. - 2009. - Т. 70. - № 4. - С. 296-315.

36. Шпынов С.Н., Рудаков Н.В. Современное состояние очагов клещевого риккетсиоза в Российской Федерации // Здоровье населения и среда обитания -2004. -№ 10(139)-С. 36-39.

37. Шпынов С.II., Рудаков Н.В., Ястребов В.К. Выявление новых генотипов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки па юге Урала, в Сибири, па Дальнем Востоке и в Казахстане // Эпидемиол. и ипфекц. бол. 2005. - № 1. -С. 23-27.

38. Ястребов В.К., Рудаков II.В., Шпынов С.II. Трансмиссивные природно-очаговые инфекции в Российской Федерации: тенденции эпидемического прицесса // Сибирский мед. журнал. 2012. -№ 4. - С. 91-93.

39. Alvarez D.E., Filomatori C.V., Gamarnik A.V. Functional analysis of dengue virus cyclization sequences located at the 5' and 3' UTRs // Virology. 2008. -V. 375.-№ l.-C. 223-235.

40. Attardi G. Animal mitochondrial DNA: an extreme example of genetic economy // Int. Rev. Cytol. 1985. - V. 93.-P. 93-145.

41. Barker S.C., Murrell A. Systematics and evolution of ticks with a list of valid genus and species names // Parasitology. 2004. - V. 129. - Suppl.: SI5-36.

42. Boore J.L. Animal mitochondrial genomes // Nucleic Acids Res. 1999. - V. 27. -P. 1767-1780.

43. Cahour A., Pletnev A., Vazielle-Falcoz M., Rosen L., Lai C.J. Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' non-coding region of the RNA genome // Virology. 1995. - V. 207. - № 1. - P. 68-76.

44. Chmelar J., Calvo E., PedraJ.H., Francischetti I.M., Kotsylakis M. Tick salivary secretion as a source of antihemostatics // J. Proteomics. 2012. - V. 75. - № 13. -P. 3842-3854.

45. Dana N. Diagnosis and treatment of tick in festation and tick-borne diseases with cutaneous manifestations // Dermatol. Ther. 2009. - V. 22. - № 4. - P. 293-326.

46. Dobec M., Golubic D., Punda-Polic V., Kaeppeli P., Sicvcrs M. Rickettsia helvetica in Dermacentor reticulatus ticks // Emerging Infect. Dis. 2009. -V. 15.-№ l.-P. 98-100.

47. Ecker M., Allison S.L., Meixner T., Heinz F.X. Sequence analysis and genetic classification of tick-borne encephalitis viruses from Europe and Asia // J. Gen. Virol. 1999.-V. 80. -Pt. l.-P. 179-185.

48. Filomatori C.V., Lodeiro M.F., Alvarez D.E., Samsa M.M., Pietrasanta L., GamarnikA.V. A 5' RNA enement promotes dengue virus synthesis on a circular genome // Genes Dev. 2006. - V. 20. -№ 16. - P. 2238-2249.

49. Felsenstein J. Confidence limits on phylogenies: an approach using the bootstrap // Evolution. 1985. - V. 39. - P. 787-791.

50. Fritz C.L., Kriner P., Garcia D., Padgett R.A., Espinosa A., Chase R., IIu R., Messenger S.L. Tick Infestation and Spotted-Fever Group Rickettsia in Shelter Dogs, California, 2009 // Zoonoses Public Health. 2012. - V. 59. - № 1. - P. 4-7.

51. Fukumoto S., Sakaguchi T., You M., XuanX., Fujisaki K. Tick troponin I-like molecule is a potent inhibitor for angiogenesis // Microvasc. Res. -2006. V. 71 -№3.- P. 218-221.

52. Fukunaga M., Yabuki M., Hamase A., Oliver J.FI., Nakao M. Molecular phylogenetic analysis of Ixodid ticks based on the ribosomal DNA spacer, internal transcribed spacer 2, sequences. J. Parasitol. 2000. - V. 86. - № 1. - P. 38^43.

53. Fussmann G.F., Loreau M., Abrams P.A Eco-evolutionary dynamics of communities and ecosystems // Funct. Ecol. 2007. - V. 21. - № 3. - P. 465-477.

54. Gaunt M.W., Sail A.A., de Lamballerie X., Falconar A.K., Dzhivanian T.I., Gould E.A. Phylogenetic relationships of fiaviviruses correlate with their epidemiology, disease association and biogeography // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82.- № 8. P. 1867-1876.

55. Gould E.A., Zanotto P.M. A., Holmes E.C. The genetic evolution of the fiaviviruses. In Factors in the Emergence of Arboviruses Diseases, eds. by J.F. Saluzzo, B. Dodet. Paris: Elsevier, 1997. P. 51-63.

56. Gritsun T.S., Lashkevich V.A., Gould E.A. Tick-borne encephalitis // Antiviral Res. 2003. - V. 57. - № 1-2. - P. 129-146.

57. Gritsun T.S., Gould E.A. Origin and evolution of flavivirus 5' UTRs and panhandles: trans-tenninal duplications? // Virology. 2007. - V. 366. - № 1. - P. 815.

58. Guy B., Guirakhoo F., Barban V., Higgs S., Monath T.P., Lang J. Preclinical andclinical development of YFV 17D-based chimeric vaccines against dengue, West Nile and Japanese encephalitis viruses // Vaccine. 2010. - V. 28. - № 3. - P. 632649.

59. Guy B., Saville M., Lang J. Development of Sanofi Pasteur tetravalent dengue vaccine // Hum. Vaccin. 2010. - V. 6. - № 9. - P. 696-705.

60. Hayasaka D., Goto A., Yoshii K., Mizutani T., Kariwa II., Takashimal. Evaluation of European tick-borne encephalitis virus vaccine against recent Siberian and far-eastern subtype strains // Vaccine. 2001. - V. 19. - № 32. - P. 4774-4779.

61. Heinz F.X., Mandl C.W. The molecular biology of tick-borne encephalitis virus // APMIS. 1993. - V. 101.-№ 10.-P. 735—745.

62. Hubalek Z., Rudolf I. Tick-borne viruses in Europe // Parasitol. Res. 2012.-V. 111. - № l.-P. 9-36.

63. Kelly E.P., Polo S., Sun W., Falgout B. Evolution of attenuating mutations in dengue-2 strain SI6803 PDK50 vaccine and comparison of growth kinetics with parent virus // Virus Genes. 2011. - V. 43. - № 1. - P. 18-26.

64. Khromykh A.A., Meka PI., GuyattK.J., Westaway E.G. Essential role of cyclization sequences in flavivirus RNA replication // J. Virol. 2001. - V. 75. -№ 14.-P. 6719-6728.

65. Khromykh A.A., Kondratieva N., Sgro J.Y., Palmenberg A., Westaway E.G. Significance in replication of the terminal nucleotides of the flavivirus genome // J. Virol.-2003.-V. 77.-№ 19.-P. 10623-10629.

66. Korenberg E.I., Gorban L.Y., Kovalevskii Y.V., Frizen V.I., Karavanov A.S. Risk for human tick-borne encephalitis, borrelioses, and double infection in the pre-Ural region of Russia // Emerging Infect. Dis. 2001. - V. 7. - № 3. - P. 459-462.

67. Korenberg E.I., Kovalevskii Y.V. Main features of tick-borne encephalitis eco-epidemiology in Russia // Zentralbl. Bakteriol. 1999. - V. 289. - V. 525-539.

68. Kovalev S.Y., Kokorev V.S., Belyaeval.V. Distribution of Far-Eastern tick-borne encephalitis virus subtype strains in the former Soviet Union // J. Gen. Virol. 2010. -V. 91.-Pt. 12.-P. 2941-2946.

69. Kovalev S.Y., Mukhacheva T.A., Kokorev V.S., Bclyaeva l.V. Tick-borne encephalitis virus: reference strain Soljin and problem of its authenticity // Virus Genes. 2012. - V. 44. - № 2. - P. 217-224.

70. Kovalev S.Y., Mukhacheva T.A. Phylogeographical structure of the tick Ixodes persulcatus: A novel view // Ticks Tick Borne Dis. 2012. - V. 3. - № 4. - P. 212218.

71. Kulakova N.V., Andaev E.I., Belikov S.I. Tick-borne encephalitis virus in Eastern Siberia: complete genome characteristics // Arch. Virol. 2012. Jul 25. Epub ahead of print: DOI: 10.1007/s00705-012-1412-x.

72. Krakowetz C.N., Lindsay L.R., Chilton N.B. Genetic diversity in Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) from six established populations in Canada // Ticks Tick Borne Dis.-201 l.-V. 2.-№3.-P. 143-150.

73. LabudaM., Trimnell A.R., Lickova M., Kazimirova M., Davies G.M., Lissina O., Hails R.S., Nuttall P.A. An antivector vaccine protects against a lethal vector-bome pathogen // PLoS Pathog. 2006. - V. 2. - № 4. - e27

74. Lehrer A.T., Holbrook M.R. Chapter 38. Tick-Borne Encephalitis. In Vaccines for Biodefense and Emerging and Neglected Diseases (1-st edition, eds Barrett A.D.T., Stanberry L.R.). Elsevier, 2009. P. 713-734.

75. Lehrer A.T., Holbrook M.R. Tick-Borne Encephalitis Vaccines // J. Bioterr. Biodef. 2011. - S l.-P. 1-7.

76. Li Yu., Nomaguchi M., Padmanabhan R., Marko ff L. Specific requirements for elements of the 5' and 3' terminal regions in flavivirus RNA synthesis and viral replication // Virology. 2008. - V. 374. - P. 170-185

77. Mandl C.W., Holzmann II., Kunz C., Heinz F.X. Complete genomic sequence of Powassan virus: evaluation of genetic elements in tick-borne versus mosquito-borne flaviviruses// Virology.- 1993. -V. 194.-№ 1.-P. 173-184.

78. Mitani II., Takahashi M., MasuyamaM., Fukunaga M. Ixodes philipi (Acari: Ixodidae): phylogenetic status inferred from mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene sequence comparison // J. Parasitol. 2007. - V. 93. - № 3. - P. 719— 722.

79. Norris D.E., KlompenJ.S., Keirans J.E., Black W.C. 4th. Population genetics of Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) based on mitochondrial 16S and 12S genes. J. Med. Entomol. 1996. - V. 33. - № 1. - P. 78-89

80. Noureddine R., Chauvin A., Plantard O. Lack of genetic structure among Eurasian populations of the tick Ixodes ricinus contrasts with marked divergence from north-African populations // Int. J. Parasitol. 2011. - V. 41. - № 2. - P. 183— 192.

81. Kunz C. TBE vaccination and Austrian experience // Vaccine. 2003. - V. 21. - Suppl 1: S50-55.

82. Pond S.L., Frost S.D. Datamonkey: Rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments // Bioinformatics. 2005. - V. 21. - № 10. -P. 2531-2533.

83. Poponnikova T.V. Specific clinical and epidemiological features of tick-borne encephalitis in Western Siberia // Int. J. Med. Microbiol. 2006. - V. 296. -Suppl. 40: 59-62.

84. Rar V.A., Livanova N.N., Panov V.V., Doroschcnko E.K., Pukhovskaya N.M., Vysochina N.P., Ivanov L.I. Genetic diversityof Anaplasma and Ehrlichia in Asian part of Russia // Ticks Tick Borne Dis. 2010. - V. 1. - № 1. - P. 57-65.

85. Revich B., Tokarevich N., Parkinson A J. Climate change and zoonotic infections in the Russian Arctic // Int. J. Circumpolar Health. 2012. - V. 71. -doi: 10.3402/iich.v71i0.187921.

86. Ribeiro J.M., Alarcon-Chaidez F., Francischetti I.M., Mans B.J. Mather T.N., Valenzuela J.G., Wikcl S.K. An annotated catalog of salivary gland transcripts from Ixodes scapularis ticks // Insect Biochem. Mol. Biol. 2006. - V. 36. - № 2. -P. 111-129.

87. Ribeiro J.M., Weis J.J., Telford S.R. 3rd. Saliva of the tick Ixodes dammini inhibits neutrophil function //Exp. Parasitol. 1990. - V. 70. -№ 4. - P. 382-388.

88. RzhetskyA., Nei M. Statistical properties of the ordinary least-squares, generalized least-squares, and minimum-evolution methods of phylogenetic inference // J. Mol. Evol. 1992. - V. 35. - № 4. - P. 367-375.

89. RudakovN., Shpynov S., Fournier P.E., Raoult D. Ecology and Molecular Epidemiology of Tick-Borne Rickettsioses and Anaplasmoses with Natural Foci in Russia and Kazakhstan // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2006. - V. 1078. - P. 299-304.

90. ShaoR., AokiY., Mitani H., Tabuchi N., Barker S.C., FukunagaM. The mitochondrial genomes of soft ticks have an arrangement of genes that has remainedunchanged for over 400 million years // Insect Mol. Biol. 2004. - V. 13. - № 3. -P. 219-224.

91. Shao R., Barker S.C., Mitani I I., Aoki Y., Fukunaga M. Evolution of duplicate control regions in the mitochondrial genomes of Metazoa: a case study with Australasian Ixodes ticks // Mol. Biol. Evol. 2005. - V. 22. - № 3. - P. 620-629.

92. Schräder C., Süss J. A nested RT-PCR for the detection of tick-borne encephalitis virus (TBEV) in ticks in natural foci // Zentralbl. Bakteriol. 1999. -V. 289.-№3.-P. 319-328.

93. Shpynov S.N., Fournier P.E., RudakovN.V., Tarasevich I.V., Raoult D. Detection of Members of the Genera Rickettsia, Anaplasma, and Ehrlichia in Ticks Collected in the Asiatic Part of Russia // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2006. - V. 1078. -P. 378-383.

94. Shpynov S., Fournier P.E., RudakovN., Raoult D. «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» in Ixodes persulcatus ticks collected in Russia // Ann. N.Y. Acad. Sei. 2003.-V. 990. - P. 162-172.

95. Schmidt H.A., StrimmerK., Vingron M., von Ilaeseler A. TREE-PUZZLE: maximum likelihood phylogenetic analysis using quartets and parallel computing // Bioinformatics. 2002. - V. 18.-№3.-P. 502-504.

96. SongS., ShaoR., Atwell R., BarkerS., Vankan D. Phylogenetic and phylogeographic relationships in Ixodes holocyclus and Ixodes cornuatus (Acari:1.odidae) inferred from COX1 and ITS2 sequences // Int. J. Parasitol. 2011. -V. 41.-№ 8.-P. 871-880.

97. Stothard D.R., FuerstP.A. Evolutionary analysis of spotted fever and typhus groups of Rickettsia using 16SrRNA gene sequences // Syst. Appl. Microbiol. -1995.-V. 18.- № l.-P. 52-61.

98. Suzuki Y. Multiple transmissions of tick-borne encephalitis virus between Japan and Russia // Genes Genet. Syst. 2007. - V. 82. - № 3. - P. 187-195.

99. TamuraK., Dudley J., Nei M., KumarS. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 // Mol. Biol. Evol. 2007. - V. 24. - № 8. - P. 1596-1599.

100. Tarasevich I.V., Makarova V.A., FetisovaN.F. ct al. Studies of a "new" rickettsiosis "Astraktan" spotted fever // Eur. J. Epidemiol. 1991. - V. 7. - № 3. -P. 294-298.

101. Tarasevich I.V., Mediannikov O.Y. Rickettsial Diseases in Russia // Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006. - V. 1078. - P. 48-59.

102. Ternovoi V.A., Protopopova E.V., Chausov E.V., Novikov D.V., Lconova G.N., Netcsov S.V., Loktev V.B. Novel Variant of TickBorne Encephalitis virus, Russia//Emerging Infect. Dis. 2007. - V. 13.-№ 10.-P. 1574-1578.

103. Tyson K., Elkins C., Patterson II., Fikrig E., de SilvaA. Biochemical and functional characterization of Salp20, an Ixodes scapularis tick salivary protein that inhibits the complement pathway // Insect Mol. Biol. 2007. - V. 16. - № 4. -P. 469-479.

104. Urakami II., Tamura A., Tarasevich I.V., Kadosaka T., Shubin F.N.// Decreased prevalence of Orientia tsutsugamushi in trombiculid mites and wild rodents in the Primorye region, Far East Russia // Microbiol. Immunol. 1999. -V. 43. -№ 10.-P. 975-978.

105. Zanotto P.M., Gao G.F., Gritsun T., Marin M.S., Jiang W.R., Vcnugopal K., Reid H.W., Gould E.A. An arbovirus cline across the northern hemisphere // Virology. 1995,-V. 210. - № 1. - P. 152-159.

106. Zanotto P.M., Gould E.A., Gao G.F. PlarveyP.H., Holmes E.C. Population dynamics of faviviruses revealed by molecular phylogenies // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - № 2. - P. 548-553.

107. Virus Taxonomy, 2005. 8th Reports of the International Committee on Taxonomy of Viruses; FauquetC.M., Mayo M.A., ManiloffJ., Desselberger U., Ball L.A. (eds) Academic Press. 1162 p.

108. Wikel S.K. Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission // Int. J. Parasitol. 1999. - V. 29. - № 6. - P. 851-599.

109. Wikel S.K., Alarcon-Chaidez F.J. Progress toward molecular characterization of ectoparasite modulation of host immunity // Vet. Parasitol. 2001. - V. 101. — № 3-4. - P. 275-287.

Информация о работе

Микрюкова, Тамара Петровна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярно-генетическая оценка возбудителей клещевых инфекций и их переносчиков в природных очагах Западной Сибири и Северо-Восточного региона Европейской части России - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы