Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ Tn5-мутантов Rhizobium meliloti, обладающих повышенной симбиотической эффективностью

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ Tn5-мутантов Rhizobium meliloti, обладающих повышенной симбиотической эффективностью"

\ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ Тп5-МУТАНТОВ яшговшм МЕЫЬОТ!, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ СИМБИОТИЧЕСКОЙ

эффективностью

Специальности: 03.00.07 — микробиология 03.00.15 — генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

УДК: 576.851.155:576.24

На правах рукописи

ЧЕСНОКОВА

Ольга Николаевна

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1994

\

Работа выполнена в лаборатории генетики и селекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург).

Научный руководитель — доктор биологических наук, профессор Б. В. Симаров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук С. В. Каменева, кандидат биологических наук <Л. Н. Пароменская. "

Ведущее учреждение — кафедра микробиологии Санкт-Петербургского государственного университета.

Защита диссертации состоится »Р^Ка^Ы 1994 года в час. на заседании Специализированного Совета (К.020.26.01) по присуждению, ученой степени кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г. Санкт-Петербург, Пушкин-8, шоссе Подбельского, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан >и.о^1рЛ '994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук А. Н. Зарецкая

—.г:*'

. .ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Клубеньковые бактерии люцерны ) являются одним из наиболее удобных объектов для изучения механизмов бобово - ризобиального симбиоза. За последние годы у этих бактерий выявлено несколько десятков генов, контролирующих образование клубеньков и фиксацию атмосферного азота. Однако о генетическом контроле практически ценных признаков ризобий почти ничего не известно. К числу таких признаков относится симбиотическая эффективность - способность увеличивать урожай растений и накопление в нем азота. Сама методика отбора, тестирования природных штаммов ризобий и получения мутантов с повышенной • симбиотической эффективностью трудоемка и длительна. Знание механизмов генетических процессов, определяющих эффективность симбиоза, позволит упростить задачу получения эффективных штаммов ризобий, по крайней мере, за счет увеличения частоты возникновения таких мутантов при использовании направленного мутагенеза, либо за счет направленного конструирования штаммов.

К настоящему времени в лаборатории .генетики и селекции микроорганизмов ВНИИСХМ с помощью транспозонового мутагенеза получена большая коллекция мутантов н.шеШой с измененными симбиотическими свойствами. Наибольший интерес и практическую ценность представляют тп5-мутанты к.теШоМ с повышенной симбиотической эффективностью. Их изучение позволит понять, насколько разнообразны механизмы,, приводящие к повышению-симбиотической эффективности. Используя зти мутанты в качестве доноров, можно оценить возможность направленной передачи данного признака в наиболее перспективные штаммы -реципиенты. При этом открывается возможность объединения полезных свойств различных генотипов в одном штамме. Следует отметить, что до сих пор не проводили анализ наследования симбиотической эффективности при направленной передаче этого признака. Учитывались лишь результаты случайной рекомбинации генетического материала двух родителей, В связи с этим важно изучить характер проявления данного признака при введении

факторов эффективности в штаммы-реципиенты разного генотипа.

Удобным методом генетического переноса является трансдукция, С ее помощью передается не более 1% бактериального генома, что обеспечивает узкую направленность' генетических изменений и позволяет сохранить полезные свойства штамма - реципиента. К достоинствам трансдукции, как метода конструирования штаммов, можно отнести и стабильность-возникающих трансдуктантов, поскольку замещение фрагмента ДНК у штамма - реципиента происходит за счет гомологичной рекомбинации. К тому же возможно, что процесс трансдукции имеет место и в природе, поскольку ризобиофаги широко распространены в местах обитания бактерий.

Цель и задачи исследования. Целью исследований4 явился генетический анализ признака эффективности с помощью трансдукции, изучение наследования и проявление этого признака у разных тп5-мутантов к.теШ.о1:1, обладающих повышенной симбиотической активностью,и их трансдуктантов. Задачи работы состояли в следующем-.

- изучить способность фага Ш12 осуществлять . общую трансдукцию у штаммов и.теШ.сЛ1, полученных в лаборатории генетики и селекции ВНШСХМ; оценить возможность использования фага -0М12 для переноса симбиотических генов;

- с помощью трансдукции, осуществляемой бактериофагом Ш12, провести генетический анализ тп5 - мутантов 1*.теШ.оЪ1, обладающих повышенной симбиотической активностью;

- изучить проявление мутаций, повышающих симбиотическую эффективность, в зависимости от генетического фона штамма - реципиента;

- проанализировать эффективные тпб - мутанты л.теиго*;! . по способности к росту на средах с различными источниками углерода и специфическими красителями, провести фаготипиро-вание этих мутантов ;

- провести генетическое картирование тп5-мутаций, приводящих к повышению эффективности симбиоза, и определить их доложение по отношению к идентифицированным ранее генам

/V . й.ив1Иоъ1.

Научная новизна. В работе впервые показано, что:

- повыпение симбиотической эффективности ранее полученных тп5 - мутантов к.гаеШа«;! обусловлено мутациями в разных генах;

- у трансдуктантов, полученных в результате скрещивания эффективных тп5- мутантов со штаммами дикого типа, уровень эффективности определяется штаммом - донором, а размах изменчивости по данному признаку - штаммом-реципиентом,- у 6 из 15 изученных тп5 - мутантов повышение эффективности

связано с изменением культурзльных свойств или фаготила;

- на мегаплазмидах -I и -2 я-теШо*:! картировано 8 генов, участвующих в контроле симбиотической эффективности.

Практическая, ценность. С помощью трансдукции получены штаммы г!.те111о1:}., имеющие двойные мутации ауксотрофности.Эти штаммы отличаются более высокой стабильностью сохранения вуксотрофных маркеров и могут быть использованы• для проведения генетического картирования. Осуществлен перенос е£г++- мутаций от штамма СХМ1-188 в штамп СХМ1-105, который является генетически более стабильным, чем донорный штамм.Благодаря этому Eff+'^'~ признак проявляется более четко и имеет меньший размах изменчивости, что существенно как для проведения генетических исследований, так и для практического использования штаммов ризобий. С помощью трансдукции получены штаммы гмпеШои, объединяющие в своем геноме две независимо полученные - мутации, каждая из

которых вызывала повышение эффективности. Эти штаммы представляют интерес для дальнейшего изучения механизмов повышения эффективности бобово - ризобиального симбиоза и для практического использования. .Полученные результаты являются предпосылкой для направленного генетического конструирования штаммов,

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VII, ут и XI международных конгрессах по азотфиксации (ФРГ, Кельн, 1988! США, Ноксвилл, 1990; Мексика. Канкун, 1992); на-VII Всесоюзном. симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" ( Москва, 1990 ); на VIII Восточно -

Европейским симпозиуме по биологической азотфиксацни (Саратов, I9S2).

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела "Материалы и методы", глав, содержащих результаты экспериментальной работа, их обсуждения и выводов. Работа изложена на J.3-? страницах машинописного текста, содержит таблиц, рисунков. . , Список

литературы содержит наименования.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Условные сокращения и обозначения. Kmr, Gmr, smr- устойчивость к антибиотикам канамицину, гентамицину, стрептомицину соответственно. Чувствительность к антибиотикам обозначали индексом "s". Перед порядковым номером штамма добавлены буквы, обозначающие: Т - транспозант, Тд - трансдуктшг. Символы,-использованные для обозначения фенотипов ризобий; nod - вирулентность; Fix - азотфиксирующая активность; Eft - симбиотическая активность; Hoi - скорость клубенькообразования; comp - конкурентоспособность, . Степень проявления признака обозначали: "+" - на уровне исходного штамма;

"±" - достоверное снижение относительно исходного штамма; "++"- достоверное повышение относительно исходного штамма,"-" - утрата признака.

Штамш бактерий и бактериофаги. Основным объектом исследований служили штаммы клубеньковых бактерий люцерны Rhizobium meUioti из коллекции лаборатории генетики и селекции микрооргаш1змов ВНИИСХМ, а также из Всероссийской коллекции клубеньковых бактерий ВНИИСХМ. Фаготипирование клубеньковых бактерий люцерны проводили с использованием коллекции, включающей 48 ризобиофагов, выделенных из почвы и из лизогенных штаммов к.meiiioti.(Новикова Н%И).Для проведеюш трансдукщш использовали фаг Ш12, способный размножаться в широком круге штаммов -клубеньковых бактерий люцерны. Фаг был получен из отдела биологии Массачусетского института технологии.

Методы. Фаг размножали на индикаторном штамме ьз-зо

р..ие111оъ1. На первом этапе получал! трансдуцирующие лизатн

донорных шташов. Титр фаголизатов определяли методом

агаровых слоев. Для проведения трансдукции фагочувствительный

реютшгектниа штамм выращивали в течение 16 ч. в жидкой среде

ту на качалке при 23° С, разбавляя! до концентрации 1-3 х 10® '

кл/ил и смешивали I мл суточной суспензии с I мл

трансдуцирующего лиззта ( Ю9 <5.о.е. в I мл ). После

тщательного перемешивания смесь инкубировали в термостате при

2В° С в течение 30 - 40 минут. Затеи клетки бактерий с

адсорбированным фагом осаждали центрифугированием при 5000 д

в течение 20 минут. Осадок ресуспендировали в воде и высевали •

на чашки Петри с 'селективными средами. Частоту трансдукции

рассчитывали по соотношению трансдуктантов к общему числу

инфицированных фагом клеток штамма - реципиента. Количество

котрансдуктантов определяли путем перепечатывания выделенных

трансдуктантов на селективные среды, позволяющие выявить

неселективные маркеры донора. Частоту котрансдукции

определяли по соотношению количества котрансдуктантов к

общему числу выросших трансдуктантов. Частота котрансдукции

позволяв';' рассчитать расстояние между маркерами с помощью

з

Формулы Ву ( ич 1966): с-(1-(с!/ь)) , где а - расстояние между селективным и неселектившм маркерами, ь - размер фрагмента трансдударующей ДНК, равный по размеру объему фаговой головки, с - частота котрансдукции. В нашей работе селективным маркером служила устойчивость к кзнампцину, кодируемая тпб, а контрселективным маркером - устойчивость к гентамицину, кодируемая дериватом тп5. В качестве доноров при трансдукции служили кт-устойчивые штаммы к.теШоЪ!, а в качестве реципиентов бт-устойчивые штаммы н-теШо^. Количество котрансдуктантов определяли по количеству трансдуктантов, выросших на среде с канамицином и не выросших на среде с гентамицинсм.

Выделение тотальной ДНК я.те111сл.1, рестрикцию ДНК, перенос ДНК на нитроцеллюлозные фильтры и блоттинг -гибридизацию проводили по стандартной методике ( Маниэтис и

др., 1984).

Симбиотические свойства R.meXiioti изучали в стерильных микровегетационных опытах С люцерной ИЗМЙНЧИВОЙ ( Medicago varia) сорта Зайкевича. Каждый штамм проверяли в 6-кратной повторности.. Некоторые рекомбинанты были оценены также в вегетационных оштах в сосудах с почвой (5 кг). Эффективность симбиоза оценивали по сухой массе растений, инокулированных испытуемыми штаммами.

Статистическую обработку результатов проводили, используя общепринятые методы ( Доспехов, 1972; Лакин, 1Э80).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I.ИЗУЧЕНИЕ ПРИРОДЫ СИМБИОТИЧЕСКИХ МУТАНТОВ R.oeilleti С ПОМОЩЬЮ ТРАНСДУКЦИИ, ОСУЩЕСТВЛЯЕМОЙ БАКТЕРИОФАГОМ ДМ12.

В лаборатории генетики и селекции микроорганизмов у штаммов CXMI-I05 и CXMI-I68 R.meiiiati методом тп5-мутагенеза была получена коллекция мутантов по симбиозу. Для подтверждения транспозоновой природы полученных мутантов был применен метод транедукции с использованием бактериофага Ш12. Частоты транедукции составляли в среднем Ю~7-10"а на реципиент, Ю -Ю~7 на фаг. С помощью этого фага было проанализировано 15 тпб-мутантов (АихГ Nod", Fbi~, Noi+) Й показано, что у XI из них утрата прототрофности или нарушение симбиотических свойств обусловлены включением в их геном 'Транспозона тг>5. Гибридизационний анализ тотальной ДНК Тп5 - мутантов и. их транедуктантов показал идентичность локализации Тп5 у доноров и рекомбинантов. Это свидетельствует о том, что встраивание донорного фрагмента ДНК, несущего инсерцию тп5, происходит за счет гомологичной рекомбинации, а не за счет перемещения Tns в новый участок ризобиального генома.

Дальнейшая работа была посвящена генетическому анализу мутантов с повышенной симбиотической эффективностью (Etf ++), которые при выращивании растений на среде без азота вызывали повышение их массы по сравнение с родительским штаммом,

2.СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА.Тп5-МУТАНТ0В К.те111оЪ1 С ПОВЫШЕННОЙ СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ ПО ФЛГОТЙПУ И КУЛЬТУРАЛЬНЬМ СВОЙСТВАМ.

Эффективные тп5-мутанты к.тенго!:! были проверены по фаготипу и по способности к утилизации различных С-содержапцйс соединений. Эффективные тп5 - мутанты и исходные штаммы были проанализированы также на I) минимальной среде "с маннитом и алагашом ( в качестве источников N и с ) и с красителем Конго красный, используемым для отбора мутантов по полисахаридам,и 2) на среде Ормерода, которая содержит бромид трнфепилтетразолил и позволяет отбирать мутанты по окислительно -• восстановительным реакциям. Полученные результаты позволяют разделить тп5 - мутанты на несколько групп и высказать предположения относительно природы геяов, затронутых Тп5 -мутациями . '

Штамм Т54, возможно, несет мутацию, приводящую к изменению окислительно - восстановительного потенциала. Сам мутант и 9 полученных от него трансдуктантов образовывали на среде Ормерода колонии белого цвета, тогда как штамм - реципиент СХМ1-188 образовывал розовые колонии. Можно предположить, что у мутанта Т54 затронуты гены, кодирующие гидрогеназу, либо гены, кодфувщиэ цитохромы и оксидазы, участвующие в электрон - транспортной цепи.

Мутация у штамма ТЭ35 локализована, вероятно, в одном из генов, ответственных за синтез полисахаридов. К тому же," этот штамм значительно отличался от других исследованных штаммов по способности к утилизации некоторых источников углерода. Это единственный штамм, который хорошо растет на 1% ксилозе и инозите. На генетической карте района мегаплазмиды - 2, построенной нами, данная мутация расположена на расстоянии 80-100 т.п.и. от группы остальных ег^4" -мутаций.

Штамм Т868 характеризовался повышенной способностью к утилизации различных источников углерода и образованием колоний с большим количеством полисахаридов. Наряду с этим, штамм отличался большей изменчивостью фаготипа по.сравнению с

другими штаммами.

Штаммы Т462 и ТП8 характеризовались, как и штамм 1868, повышенной способностью к усвоению различных Сахаров и органических кислот, а также образованием колоний с повышенным содержанием полисахаридов. Однако по фаготипу они практически не отличались от родительских штаммов.

Мутанты Т74В, Т841 и Т828 таете можно условно отнести к . предыдущей группе мутантов, поскольку они тоже характеризовались хорошей способностью к усвоении различных источников углерода, хотя к несколько сниженной,по сравнению с предыдущим штампами. Мутации данного типа локализованы на хромосоме ( 3 мутации ) и на мегаплазмиде -1(3 мутации ).

Последнюю группу составляют мутанты Т716, 'Г728, Т747, 'Г 738, Т810, Т037, Т624. По фаготипу они почти не отличаются от родительских штаммов. Особенностью этой группы1 мутантов является то, что большинство мутаций ( 5 из 7 ) локализованы на мегаплазмиде - 2 илпеШои. Эти 5 мутантов'были однородны по утилизации различных источников углерода и по фаготипу. Н& генетической карте участка мегаилазмида - 2, построенной наш, все эти мутации были локализованы вместе в районе 30-50 т.п.н. Возможно, они образуют единый кластер генов.

Э.АНАЛИЗ НАСЛЕДОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ "ПОВЫШЁННАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ" (ЕегИ "УСТОЙЧИВОСТЬ К КАНАМЙЦИНУ" (К»иг).

Для того, чтобы установить, связано ли повышение эффективности зтих тпб - мутантов с инсерциямн т»5, мы изучили характер наследования симбиотичвской эффективности при трансдукции маркера ктг, определяемого тп5. В качестве реципиентов использовали родительские штаммы СХМГ-105 и СХМ1-18Э (табл.1).

Из семи проанализированных скрещиваний только в одном (Т707 х СХМ1-Т88 ) большинство составляли рекомбинанты, ни отличающиеся по эффективности от реципиента. В остальных скрещиваниях таких рекомвинантоь было значительно меньше, чем рекомбинантов с эффективностью донора (4,6% к 62* соответственно). На основании полученных результатов можно

Таблица I

Распределение по эффективности кпг -трансдуктантов из скрещивания ег£++-мутэнтов с родительским штаммом.

Донор Реципиент Количество рекомбинантов с эффективностью Масса сухих растений ( иг/пробирку ), инокулироваиных

донора реципиента промежуточной донором реци- |траисдук- пиеито^ таятами _1 ........

Т482 Т54 Т707 Т798 Т810 Т828 Т868 СХМ1-Ю5 СХМ1-108 5 0 0 8 0 2 I 5 3 27 22 21 6 I .3 4 0 1 4 I 2 22,0 15,8 22,8 19,3 14,0 19,9 20.6 - - 14,6 18,3 - - 18,7 19,5 - - 18,2 19.7 - - 20,1 18,3 - - 10,4

Всего 55 29 32 57,34 9,4% 33,3% НСР0(05 = 4,1 КГ ................. ,, „

предположить, что по крайней мере в шести скрещиваниях из семи иэученшх, перенос устойчивости к канамицину сопровождался переносом признака "повышенная эффективность". Таким образом, повышение эффективности у мутантов Т482, 154, Т798, Т810, Т828, ТЭ6Э з.лгШои обусловлено включением транспозона тп5. У штамма Т707- повышение эффективности вызвано другими притонами, возможно, активацией собственных те - элементов. Следует отметить, что при ап5 - нутагецчэп доля таких спонтанных мутантов может превышать 504 от общего числа киг -трянспозантов .

Для того, чтобы оценить вклад неконтролируемых рекомбинациошшх событий в образование - рекомбинйнтов,

были поставлены скрещивания между штаммами, но различающимися по своей эффективности. Подавляющее

Таблица 2

Распредьление по эффективности кшг -рекоыбпнантов из скрещивания -мутантов СХМ1-183 со штаммом СХМ1-105.

Донор Реципиент Количество рекомбинантов Масса сухих растений

с•эффективностью ( мг/пробирку)

инокулированных

донора реци- промежу- доно- реци- 'ггрансдук-

пиента точной ром пиентоц тантами

Т54 СХМ1-105 9 0 " I 18,2 13,4 17,9

Т707 — и — 5 I 4 ' 16,1 -и- 16,0

Т828 - и - 9 0 Г 17.1 -И- 18,0

Т837 _ „ - 9 0 I 18,3 -«■! 18,6

ТВ41 - 1, - 7 О 3 16,8 ---- 17,0

Т868 - 1, - Э I 6 16,2 - Н- 15,5

Всего 42 2 16 нср01 05 = 2., 56 мг

70,0% 3,4% 26,6%

большинство трансдуктантов (33 из 35) имело эффективность на уровне родительских штаммов и только два -достоверно отличались от них; один - в "+"сторону и один - в "-"сторону. Таким образом, частота возникновения Е££++-трансдуктантов составляла всего 2,9%. Тогда как при трансдукции признака эффективности частота возникновения аналогичных рекомбинантов составила более 60%. Это' является доказательством существования у клубеньковых бактерий отдельных генов, мутации в которых могут существенно повышать эффективность их симбиоза с растением - хозяином.

Следующим этапом в изучений мутаций был их

перенос из штамма СХМ1-188 в штамм СХМ1-105 и изучение проявления признака эффективности на ином "генетическом фоне". Штаммы СХМ1-105 и СХМ1-188 л.тетоЩ ведут свое происхождение от одного штамма СХМ1, однако штамм СХМ1-105

Таблица 3

Эффективность и размах изменчивости эффективности у трансдуктантов, полученных при переносе

мутации в штаммы CXf.il-105 и СШ-188

сухая масса инокуяи-рованных растений (мг) • Д Д % ш

Штамм т »гам

Т716 32,1

Хд716(105) 30,6 33 5 26 9 6,6 29,5

Тд716(10В) 29,3 32 I 22 X 10,0 41,3

Т798 30,6

ТД798Ц05) 33,1 35 4 27 0 в,4 . 37,6

Тд798(188) 32,8 38 6 24 4 14,2 58,7

Т868 30,3

Тд868(Ю5) 30,2 ,33 3 26 5 6,8 30,3

Тд868(183) 30,5 34 I 24 3 .9,8 40,5

Т482 34,9 1

Тд482(105) 30,8 30 5 28 4 2,1 9,4 '

ТД482Ц88) 30,2 33 3 26 0 7,3 32,5

Примечание: К б/ик. -12,1 мг,

СХМ1-105 - 22,4 НГ,

СХШ-188 - 24,2 МГ,

НСР0>05 -5,15 мг.

характеризовался более высокой генетической стабильностью,чеы штамм СХШ-188. Генетическая близость штаммов позволяла надеяться на гомологичное включение и проявление егг++-мутаций в геноме реципиента. Результаты анализа симбиотичес-^ ких свойств изученных трансдуктантов приведены в таблице 2.

В данном опыте была обнаружена достоверная корреляция между симбиотической эффективностью Тп5 - мутантов и их трансдуктантов. При переносе мутаций эффективности в родительский штамм CXf.ii-188 такой корреляции не было

выявлено. Это, вероятно, объясняется тем, что Ш11-188 генетически менее стабилен, чем штамм СХМХ-Х05, и его симбиотическая эффективность варьирует в более широких пределах.

Для того, чтобы оценить размах изменчивости этого признака в зависимости от генетического фона, мы сопоставили максимальное и минимальное значения эффективности у трансдуктантов, полученных при переносе ен++ . -мутаций в штаммы СХМ1-105 и СХМ1-188. Разность между максимальным и минимальным значениями ( л ) была выражена в процентах по отношению к среднему значению эффективности реципиента. Большинство трансдуктантов, полученных на основе штамма СХМ1-Ю5, имеют Фенотип штамма - донора и уровень их эффективности варьирует не так сильно, как у трансдуктантов, полученных на основе штамма СХШ-188 (табл.3). Таким образом, изменчивость эффективности при переносе вгIмутаций в родительский штамм оказалась выше, чем при переносе в неродительский штамм. Таким образом, при скрещивании -близкородственных штаммов размах изменчивости детерминируется штаммом - реципиентом, а средний уровень эффективности определяется штаммом - донором.

4.КАРТИРОВАНИЕ Тп5-МУТАЦИИ <е1гг++) ЛОКАЛИЗОВАННЫХ НА МЕГАПЛАЗМИДЕ - I И - 2 Я.лаШо11.

Для генетического картирования были использованы как исходные егг++ -мутанты, так и их производные, несущие вместо тп5 - кшг, тп5 - стг. Картирование проводили методом трансдукции, используя бактериофаг ВШ2. Было поставлено 18 комбинаций скрещивания для локализации 4 р£г++-мутаций на мегаплззмнде - I (табл.4) и 16 комбинаций - для локализации 4

мутаций на мегаплазмиде - 2 (табл.5). Ре?' "зти генетического анализа показали, что большинство мутаций не . обнаруживают тесного сцепления. Тем не менее, на обеих мегаилаэмйдах мутации располагаются не дисперсно, а в виде кластеров. Область мегаплазннды - I, включающая егг++ мутации, имеет размер около 25 т.п.н., не содержит никаких известных маркеров и располагается на расстоянии, превышающем

160 тлик. от no<i - генов (рис.1). Область магаплазмиды - 2, включавшая ei£++ - мутации, содержит ранее картированные гены тиамин - зависимости и транспорта дикарбоновых кислот. Три мутации, повышающие сиыС^отическую эффективность, локализованы в района, размером 30-50 т.п.н. по одау сторону от уже известных мутаций. Одна мутация (Т835) расположена, по другую сторону (рис.2).

nod

comp

eff

Iii

comp37 eff482

x x

efffl41 e£f748 eff716

_41_ 38

_3 0_ 26

_23_ 17

8

6

Рис Л Карта сцепления тп5-мутаций, локализованных на мегаплазмиде-I Rhizobium meiiioti (расстояние в т.п.н.)

Таблица 4

Трансдукционннй-анализ Тп5-мутаций, локализованных На мегаПЯаЗММДе-1 ЯМгоЫит те111оЪ1.

Анализируемые 1 скрещивания Количество проверенных рекомбинантов Расстояние между мутациями т.п.н.

1* всего Кт ИЗ НИХ бт1"

Т107 X Т716 56 33 41 ,

Т37 X Т716 26 12 30

Т482 X Т716 46 17 23

, Т841 X Т716 22 4 10

Т748 X Т716 23 5 13

Т107 X Т748 36 20 38

Т37 X Т748 17 7 26

Т482 X Т748 82 22 17

Т841 X Т748 38 5 8

Т716 X Т748 78 8 6

Т107 X Т748а1 15 15 >160

Т37 X Т748а1 30 30 >160

Т482 X Т748а1 16 16 >160

Т841 X Т748а1 20 . 20 >160

Т748 X Т74831 60 60 >160

Т716 X Т748а1 59 59 >160

Примечание:ТЮ7 и тз7 несут инсерцию тп5 в соир-локусах, Т748а1-несеТ инсерцию Тп5-Ст в пос!-ЛОКусе.

Таблица 5

Трансдукционшй анализ тп5-мутаций, локализованных на на мегаплаэмиде-2 шигоЫшп meliloti .

Анализируемые скрещивания Ктгх О»1 Количество проверенных рекомбинантов Расстояние между мутациями т.п.н.

т* всего Кт ИЗ НИХ СтГ

1111537 X Т835 кмБэза 26 10 24

Т1011 X Т835 18 9 33

Т798 х Т835 56 43 62 .

таю X Т835 54 51 99

Т728 X Т835 16 16 >160

М337 х т?д8 КМЭ938 43 35 65

Т1011 X Т798 29 21 44

Т8Э5 х Т798 31 30 109,

Т728 X Т798 33 23 5з'

К"337 X Т810 гаБэзз 18 18 >160

Т835 X таю 20 20 >160

Т1011 X Т810 43 36 73

Т798 X таю 28- 16 39

Т728 X Т810 16 6 • 23

т*31 X Т728 №3938 21 21 >160

Т835 X Т728 18 18 >160

Т1011 X Т728 12 12 >160

Т798 х Т728 23 14 43

Примечание ¡ш^з 7 и нмээзе несут инсерцию Тп5 в аск-локусв.

тюн-несет инсерцию тп5 в т-локусе.

Iß

dct.3 1

eff835 . dct938 thilOU eff798 effSlO eff728 _X_X_X_X_____X_X_

_24' 56 58

63_ 39__24

_3 3_;__7 3_

__83 _

13 0_ 160

Рис.2 Карта сцепления Tn5-нутаций,локализованных на мегаплазмиде-2 Rhizobium meiiioti (расстояние в т.п.н.)

ВЫВОДЫ

1. С помощью трансдукции, осуществляемой фагом йШ2, изучено 15 Тпб-МуТЭНТОВ раЗЛИЧНОГО TIffla ( ЛихГносГ, Fix", Woi- ) R.msliioti и показано, что у II из них мутации обусловлены включением в их геном транспозона Тп5.

2. С помощью трансдукции проведен генетический анализ семи Тп5 - мутантов r.meiiioti с повышенной симбиотической эффективностью ( ztt*+). В шести случаях перенос кт

- устойчивости, кодируемой тг>5, сопровождался -переносом признака "повышенная симбиотическая эффективность", что свидетельствует о транспозоновой природе данных eff++ -мутаций.

3. При анализе симбиотических свойств 172 трансдуктантов показано, что изменчивость проявления симбиотической эффективности зависит от генотипа штамма - реципиента, тогда как уровень симбиотической эффективности определяется генотипом штамма - донора. Обнаружено, что симбиотическая эффективность проявляется более четко и имеет меньший

размах изменчивости при переносе мутаций в штамм CXMI-Í05, чем при при проявлении мутации на "генетическом фоне" родительского штамма СИЯ-108.

4. Проведено генетическое картирование восьми Тп5-мутаций (Eft"1"1}, локализованных на мегапла'^шдах -I и -2 R.meiiloti. Определены расстояния между е££++-мутациями и генами, контролирующими образование клубеньков, транспорт дикарбонсвых кислот и метаболизм тиамина. Показано, что eff++- мутации на мегаплазмидах расположены не дисперсно, а в виде групп,

5. Обнаружено, что у некоторых Etf1 '"-мутантов изменен характер роста на сро\ах с определенными источниками углерода и специфически!in красителями, что мохет свидетельствовать о различной природе генов, мутации в которых приводят к повышению симбпотической эффективности.

6. Проведено фаготшшрование эффективных тпэ-мутантов R.meiiloti. Показано,что большинство Eff++-мутантов наследуют фаготнл родительских штаммов, за исключением штамма Т868, который обладает сниженной чувствительностью к группе бактериофагов. Сравнительный анализ Eff+4" - мутантов позволил разделить мутанты на несколько групп, различающихся по фаготипу и куяьтуральным свойствам.

Работы, опубликованные по материалам диссертации: •

I.Simarov В.V., L. A.ßharypova, О.N.Chesnokova, O.P.Onischuk, T.B.Rumyantseva, A.A.Aronshtam. Identification of Rhizobium meliloti genes responsible for symbiotic efficiency. Abstracts of 7th International Congress of Nitrogen Fixation. Koln,F.R.G., March 13-20,1988, N10-40, p835.

2.Новикова Н.И., О.Н.Чеснокова, В.И.Сафронова, Л.А.Шарыпова , Б.В.СииарОВ. Трансдукция генов Rhizobium »sliloti, маркированных Тп5, с помощью фага аМ12. Генетика,1989,Т.25, N12, С,2121-2125. З.Ошадук О,П., О.Н.Чеснокова^, Л.А.Шарыпова, Б.В.Симаров. Генетический анализ мутанта' Т37 Rhizobium meliloti,

обладающего сниженными скоростью клубенькообразования и конкурентоспособностью. Генетика, 1990, т.26, №3, с.560-562.

4.Спмаров Б.В., Л.А.Шарыпова, О.Н.Чеонокова, О.П.Оцшцук, В.В.Кучко. Анализ Тп5 мутантов Rhizobium meiiioti о повышенной симбиотической эффективностью. Генетика, 1990, т.26, М, с.630-635.

5. Опишу к 0.II., Л.А.Шарыпова, О.Н.Чеонокова, Б.В.Симаров, Взаимосвязь между скоростью образования клубеньков и конкурентоспособностью у Rhizobium meiiioti. УП Всесоюзный симпозиум "Молекулярные моханизш генетических процессов", Москва, 27-30 марта 1990, с.249-250.

6.Simarov B.V., Ь.A.Sharypova, О.Р.Onischuk, O.N.Chesnokova. Isolation and genetic characterization of Rhizobium meiiioti T37 mutant with delayed nodulation and decreased competitiveness. Abstracts of 8th International Congress of Nitrogen .Fixation. Knoxvill, USA, May 20-26, 1990, p. 585.

7.Chesnokova O.N., Savioh H., Sharypova L.A.,. Simarov B.V. Pine mapping and. molecular cloning of Tn5 mutations, enhancing symbiotic effectiveness of Rhizobium meiiioti. Abstracts of 9th International Congress of Nitrogen Fixation, Cancun/Mexico, December, 1992» p. 836.

8.Sharypova L.A., Onishchuk O.P., Chesnokova O.N., Fomina-Eshchenko J.O,, Simarov B.V. Isolation and characterization of Rhizobium meiiioti Tn5 mutants showing enhanced Bymbiotio.effectiveness. Microbiology, 1994, N 140, p. 463-470.

о