Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические мутации микобактерии туберкулеза, ответственные за резистентность к рифампицину у больных туберкулезом: идентификация и характеристика

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Исаева, Елена Леонидовна

Список сокращений.

Введение.

Часть 1 .Обзор литературы.

Глава 1.Молекулярные механизмы устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину.

Глава 2.Лабораторные методы диагностики чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

2.1. Фенотигагческие методы диагностики.

2.1.1 .Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на плотных средах.

2.2.1.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулезным препаратам на жидких средах.

2.3.1.Pha В-анализ.

2.2.Генотипические методы диагностики.

Часть II. Собственные исследования.

Глава 3. Материал и методы.

3.1 .Обследованные пациенты.

3.2.Клинические культуры Mycobacterium tuberculosis.

3.3.Определение лекарственной чувствительности к рифампицину.

3.4.Обработка клинического материала.

3.4.1 .Забор материала.

3.5.Обработка биологических проб.

3 .б.Выделение ДНК из клинического материала.

3.6.1 .Выделение ДНК для проведения ПЦР на «Cobas Amplicor».

3.6.2.Выделение ДНК для «Неетед-ПЦР».

3.7.Выявление ДНК Mycobacterium tuberculosis в клиническом материале.

3.7.1.Реакция амплификации.

3.7.2.Регистрация и анализ продуктов амплификации.

3.7.3 .Анализ результатов.

3.8.Выявление гена гро В.

3.8.1.Получение универсального гетеродуплексного гене- 49 ратора.

3.8.2. «Хеминестед-ПЦР» туберкулезных образцов.

3.8.3. Гибридизация.

3.8.4.Вертикальный электрофорез.

3.8.5.Анализ результатов.

3.9.Прямое секвенирование ПЦР-фрагментов.

3.10.Стандартные характеристики системы.

Глава 4.Адаптация метода ПЦР-гетеродуплексного анализа.

4.1 .Первичная обработка биологического материала.

4.2.Лизис клеточной стенки с выделением ДНК.

4.3.«Хеминестед-ПЦР ».

4.4.0пределение чувствительности метода ПЦРгетеродуплексного анализа.

4.5.Определение специфичности метода ПЦРгетеродуплексного анализа.

Глава 5.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis методом ПЦР-гетеро дуплексного анализа и культуральными методами в клинических изолятах и образцах.

5.1.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis в клинических изолятах.

5.2.Сравнение эффективности выявления чувствительных и резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis в клинических образцах.

Глава б.Характеристика резистентных к рифампицину мутаций, выявленных методом ПЦР-гетеродуплексного анализа.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетические мутации микобактерии туберкулеза, ответственные за резистентность к рифампицину у больных туберкулезом: идентификация и характеристика"

Актуальность темы. Туберкулез - одна из глобальных проблем современного здравоохранения. В настоящее время треть человеческой популяции инфицирована микобактериями туберкулеза [Huebner R., Castro К., 1995, Lee S. et al., 1995]. Каждый год регистрируют от 8 до 10 млн новых случаев заболевания, 52 тысячи смертей в неделю или более 7 тысяч каждый день [Rattan A. et al., 1998].

В Рсхии впервые заболевают туберкулезом до 100 тыс. человек ежегодно, умирают до 25 тыс. [Богадельникова И.В., Перельман М.И., 1997]. Показатель заболеваемости туберкулезом населения (число больных с впервые в жизни установленным диагнозом на 100 тыс. населения), постоянно проживающего в Москве, составил в 1999 году 34,4 , в том числе подростков - 11,7, детей - 7,9 [Литвинов В.И. и др., 2000]. В Российской Федерации в 2000 году показатель заболеваемости туберкулезом составил 90,7 [Шилова М.В., 2000].

Особое значение приобрел туберкулез в связи с ростом заболеваемости синдромом приобретенного иммунодефицита. Риск заболеть туберкулезом в 170 раз больше для больных СПИДом, в 113 - для ВИЧ-инфицированных, в 3,6-16 раз из-за других иммунодефицитных заболеваний, чем для людей, не входящих в эти группы риска [Jacobs R., 1994].

Одной из основных причин увеличения заболеваемости туберкулезом является возрастание числа лиц, инфицированных Mycobacterium tuberculosis, устойчивыми к какому-либо противотуберкулезному препарату или обладающими множественной лекарственной устойчивостью. К последним относятся Mycobacterium tuberculosis, нечувствительные по меньшей мере к двум основным противотуберкулезным препаратам -изониазиду и рифампицину [Iseman М., Madsen D., 1989; Shinder D. et al., 1991; Kochi A. et al., 1993; Valerdzis B. et al., 1994; Lambregts-van Weezenbeek C., 1997].

D.Cohn и соавт. (1997) показали, что в период 1985-1994гг. средняя первичная устойчивость составила для изониазида 4,1%, для стрептомицина - 3,5%, для рифампицина - 0,2%, для этамбутола - 0,1%. По данным M.Moore и соавт. (1997) 10 % впервые заболевших в США имеют устойчивость хотя бы к одному из основных препаратов первого ряда (изониазиду и рифампицину), а в 2-3% случаях имеет место множественная лекарственная устойчивость. По данным ВОЗ в мире по крайней мере 50 млн людей инфицировано устойчивыми к лекарственным препаратам штаммами Mycobacterium tuberculosis [ВОЗ, 1998].

Одними из главных причин распространения полирезистентного туберкулеза являются его поздняя диагностика и неправильное или незавершенное лечение, следовательно, как можно более раннее выявление возбудителя и определение его чувствительности к противотуберкулезным препаратам имеет принципиальное значение для назначения больному своевременного и адекватного лечения.

Одним из основных химиопрепаратов при лечении туберкулеза в настоящее время является рифампицин. Механизм его действия на Mycobacterium tuberculosis и причины, вызывающие устойчивость к нему, достаточно изучены на молекулярно-генетическом уровне. Показано, что более 95% случаев резистентности к рифампицину у больных туберкулезом обусловлено мутациями в коротком фрагменте (81 н.п.) гена гроВ, кодирующего р-субъединицу РНК-полимеразы Mycobacterium tuberculosis [Telenti A. et al., 1993, Kapur V. et al., 1994]. На данный период времени известно более 40 мутаций в этом участке гена, ответственных за резистентность к рифампицину. Раннее выявление рифампицин-резистентных мутаций имеет важнейшее практическое значение, так как позволяет в значительном числе случаев осуществить своевременную коррекцию лечения. Кроме того, это может иметь и эпидемиологическое значение, поскольку, вероятно, по характеру выявлявмой мутации можно предположить пути экспансии туберкулезной инфекции.

Нельзя не отметить, что резистентность к рифампицину является своеобразным маркером множественной лекарственной устойчивости Mycobacterium tuberculosis [Telenti A. et al., 1993], поскольку резистентность к одному рифампицину - редкость (около 0,4% изолятов Mycobacterium tuberculosis в США по данным A.Bloch и соавт. (1994). Как правило, резистентные к рифампицину штаммы Mycobacterium tuberculosis устойчивы и к другим противотуберкулезным препаратам.

Существует несколько методов выявления мутаций гена гроВ Mycobacterium tuberculosis (секвенирование, конформационный полиморфизм однонитевых ДНК, дидезоксифингерпринтинг и др.). Особенно важно значение методов, которые можно применять в клинико-лабораторной диагностике. Нами для этой цели был использован метод ПЦР-гетеродуплексного анализа, так как он методически достаточно прост, относительно не дорог, его выполнение занимает около 6 часов и полученные данные легко интерпретировать.

Цель настоящей работы: идентификация и анализ аллельных вариантов гена гроВ, ответственных за устойчивость к рифампицину, среди клинических изолятов и образцов Mycobacterium tuberculosis, полученных от больных туберкулезом.

Задачи исследования:

1. Адаптировать гетеродуплексный анализ для выявления резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis в клинических изолятах и образцах, полученных от больных туберкулезом.

2. Сравнить возможности молекулярного (гетеродуплексный анализ) и культуральных (рост на плотных и жидких средах) методов по выявлению резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis в клинических изолятах и образцах.

3. Охарактеризовать варианты резистентных к рифампицину мутаций в изолятах Mycobacterium tuberculosis от больных туберкулезом Московского региона.

Научная новизна. В результате проведенных исследований выявлено 16 вариантов мутаций гроВ гена Mycobacterium tuberculosis, отвечающего за устойчивость к рифампицину среди больных туберкулезом одного региона - Москвы и Московской области. Для этой цели был использован модифицированный высоко эффективный молекулярно-биологический метод - гетеродуплексный анализ. На обширном клиническом материале показано процентное распределение выявленных мутаций, что имеет большое эпидемиологическое значение. Показана возможность метода идентифицировать одновременно два штамма Mycobacterium tuberculosis в биологическом образце.

Практическая значимость работы. Молекулярно-биологическая тест-система определения устойчивости Mycobacterium tuberculosis к рифампицину клинически адаптирована и может быть использована во фтизиатрии. Она характеризуется быстротой выполнения, простотой применения и относительной дешевизной. Данный метод позволяет диагностировать устойчивость к рифампицину больных туберкулезом уже в первые дни после поступления в клинику.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Показана возможность применения модифицированного гетеродуп-лексного анализа для выявления рифампицин-резистентных Mycobacterium tuberculosis в условиях специализированной клинико-диагностической лаборатории.

2. Чувствительность и специфичность гетеродуплекеного анализа выше, чем у культуральных методов выявления лекарственной чувствительности Mycobacterium tuberculosis к рифампицину.

3. Установлены варианты мутаций гена гроВ Mycobacterium tuberculosis, характерных для жителей Московского региона.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований были доложены на: Всероссийском съезде фтизиатров в Йошкар-Оле (1999), третьей Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика в современной медицине» (2000), конференции, посвященной памяти М.М. Авербаха «Туберкулез сегодня: проблемы и перспективы» (2000), научно-практической конференции «Химиотерапия туберкулеза» (2000), конференции молодых ученых ЦНИИТ РАМН «Актуальные вопросы туберкулеза и других гранулематозных заболеваний» (2001), первой Российской научно-практической конференции с международным участием «Нозокомиальная туберкулезная инфекция» (2001).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, 2-х глав литературного обзора, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов. В тексте содержится 8 таблиц и 6 рисунков. Библиография включает 123 источника литературы, из них 20 на русском и 103 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Исаева, Елена Леонидовна

Выводы

1. Модифицирован и адаптирован для клинико-диагностической лаборатории ПЦР-гетеродуплексный анализ, детектирующий мутации гроВ гена Mycobacterium tuberculosis, которые отвечают за устойчивость к рифампицину.

2. Модифицированный метод характеризуется легкостью воспроизведения, способностью выявлять все имеющиеся изменения в исследуемой области генома Mycobacterium tuberculosis, относительной дешевизной и быстротой получения результатов.

3. С помощью адаптированного метода для любого биологического образца, в котором полимеразной цепной реакцией установлено наличие Mycobacterium tuberculosis, можно в течение 6 часов определить, является ли чувствительным или устойчивым к рифампицину данный штамм микобактерий.

4. На основании проведенных исследований установлено, что: а) метод обладает высокой специфичностью и детектирует как положительные только образцы, содержащие М. tuberculosis, М. bovis и М. africanum; б) чувствительность метода составляет несколько клеток М. tuberculosis или геном-эквивалентов в образце; в) показана возможность метода выявлять в биологическом образце одновременно два штамма М. tuberculosis.

5. Используя ПЦР-гетеродуплексный анализ, установлены ал-лельные варианты гроВ гена М. tuberculosis, отвечающие за резистентность к рифампицину, и процентное соотношение выявленных мутаций, встречающихся среди больных туберкулезом Московского региона. Выявлено и подтверждено секвенированием 16 типов мутаций в данной области генома М. tuberculosis.

6. ПЦР-гетеродуплексный анализ не уступает современным культуральным методам определения чувствительности М. tuberculosis к рифампицину по основным критериям. В то же время молекулярно-биологический метод позволяет выявить более одного штамма М. tuberculosis и снизить сроки определения чувствительности к рифампицину от 2-3 месяцев до нескольких часов.

Заключение

Проблема распространения штаммов МВТ, резистентных и полирезистентных к специфическим химиопрепаратам, имеет в настоящее время огромное значение как для России, так и для всего мира. Эффективных противотуберкулезных препаратов известно мало и большинство из них (препараты первого ряда) были открыты довольно давно (в 5070-х гг.), поэтому неудивительно, что МВТ успела выработать к ним устойчивость. Другими причинами распространения резистентного туберкулеза являются поздняя диагностика, неправильное или незавершенное лечение [Iseman М., 1994; Chaulet P. et al., 1996]. Существуют также и социально-экономические причины: миграция населения, войны, снижение уровня жизни [Голубев Д.Н., 2000; Мельник В.М., 2000].

Основным химиопрепаратом при лечении туберкулеза в настоящее время является рифампицин. Это полусинтетическое производное натурального продукта рифамицина, получаемого из фильтрата культуры Streptomyces mediterranei, применяется как антитуберкулезный препарат с 1972 года. Р очень эффективный противотуберкулезный препарат (МИК 0,1 - 0,2 мкг/мл) и имеет быстрый бактерицидный эффект, помогающий даже при коротком курсе терапии [Blanchard J., 1996]. Механизм действия Р заключается в ингибировании элонгации транскрипции за счет избирательного связывания с (З-субъединицей ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

Устойчивость к Р в 95% случаев связана с мутациями в гене гроВ, кодирующем fl-субъединицу РНК-полимеразы МВТ. В настоящее время известно более 40 мутаций в этом гене, обусловливающих устойчивость к Р. Кроме того, выявить устойчивость к Р важно еще и потому, что она может служить суррогатным маркером МЛУ. Известно, что лечение больных с МЛУ обходится гораздо дороже, чем пациентов с сохраненной чувствительностью к ПТП [Хоменко А.Г. и др., 1999; Мишкинис К. и др., 2000]. Поэтому как можно более ранняя диагностика РР имеет первостепенное значение во фтизиатрической практике.

Культуральные методы для детекции МБТ и определения их чувствительности к ПТП требуют от 4 до 11 недель. Даже при использовании самых современных технологий, автоматизированных систем на жидких средах (ВАСТЕС, MGIT (Bekton Dickinson), МВ/ВасТ (Organon Teknika), среднее время выявления возбудителя и определения его лекарственной чувствительности составляет 2-3 недели. Генодиагностика позволяет сократить это время до считанных дней и даже часов. Существует несколько методов выявления мутаций гена гроВ МБТ. Эти методы включают прямое секвенирование ПЦР-продуктов, SSCP-анализ, ди-дезоксифингерпринтинг, обратную гибридизацию с олигонуклеотидны-ми зондами и др. Все эти методы основаны на использовании факта, что специфические полиморфизмы, найденные у резистентного штамма, отсутствуют у чувствительного.

Перечисленные выше различные варианты анализа мутаций либо весьма сложны в исполнении, либо дороги, либо требуют использования радиоактивных изотопов. Поэтому не все из них могут быть использованы для практической работы. Используя модифицированный нами метод ПЦР-ГДА, предложенный D.Williams и соавт. (1996), можно, по нашему мнению, достаточно точно, быстро и относительно недорого определить наличие и тип мутации.

Целью нашей работы явилось изучить с помощью ПЦР-ГДА ал-лельные варианты rpoB-гена, отвечающие за РР, среди клинических изо-лятов и образцов МБТ, полученных от больных туберкулезом в Москве.

В ходе работы были поставлены следующие задачи: адаптировать метод ГДА для работы в клинико-диагностической лаборатории, сравнить возможности генетических и бактериологических методов (ГДА, рост на плотных и жидких средах) по выявлению РР-штаммов МБТ в клинических изолятах и непосредственно из биологического материала, охарактеризовать варианты РР-мутаций в клинических изолятах МБТ от больных, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях Московского региона.

Для решения данных задач исследование было выполнено у 256 больных туберкулезом. Среди них - 30 человек с впервые выявленным туберкулезом, у остальных были рецидивы заболевания. С диагнозом инфильтративный туберкулез было 83 человека, фиброзно-кавернозный туберкулез - 74 человека, диссеминированный туберкулез - 22 человека, туберкуломы - 15, ТВГЛУ - 3, очаговый туберкулез - 10, генерализованный - 3, цирротический - 4, казеозная пневмония - 3, экссудативный плеврит туберкулезной этиологии - 3, хроническая туберкулезная эмпиема плевры - 8. Все остальные формы туберкулеза были представлены единичными случаями.

В качестве материала для исследования были взяты клинические штаммы МБТ, выделенные из мокроты (158 изолятов), бронхиального секрета (39), экссудата (10), промывных вод бронхов (1), смыва из каверны (3), тампона из полости эмпиемы (2), тампона из раны (2), тампона из свищевого хода (1), смыва со стенок натечника (1), мочи (1), смыва из полости эмпиемы (1), смыва из дренажа (1), мазка из полости эмпиемы (1), отделяемого из раны (1), содержимого туберкулезной кисты (1). Всего было проанализировано 223 клинических изолята МБТ, выращенных на плотной среде ЛЙ и/или на жидкой среде Миддлбрука 7Н9 (МВ/ВасТ). Штаммы МБТ были получены от 199 больных туберкулезом (клинические изоляты анализировали от одного человека 6 раз, от одного 5 раз, от четырех - 4 раза, от двенадцати - 3 раза, от 28 - 2 раза и все остальные по одному).

Также изучали образцы биологического материала, взятые непосредственно от больных. Было проанализировано 69 образцов мокроты, 2 спинномозговой жидкости, 2 смыва из каверны и 2 интраоперацион-ных биоптата.

Для методического выполнения работы мы использовали предложенный D.Williams метод ПЦР-ГДА, состоящий из следующих этапов: выделение ДНК МБТ из клинического материала; «хеминестед-ПЦР» с праймерами, специфичными в отношении RRDR; гибридизация полученных ампликонов с УГГ; анализ образованных гетеродуплексов при помощи вертикального электрофореза в полиакриламидном геле.

Преимущества данного метода, с нашей точки зрения, прежде всего заключаются в быстроте (время на его выполнение занимает без первичной обработки клинического материала около 6 часов), относительно небольшой себестоимости, простоте выполнения предлагаемой методики и, в подавляющем большинстве случаев, легкости интерпретации полученных данных.

В результате проведенной работы мы модифицировали ПЦР-ГДА, приспособив его к имеющимся у нас приборам, отработанному составу реакционной смеси, характерному для клинико-диагностической лаборатории потоку материала и необходимости его повторного анализа.

Модифицированным методом ГДА мы обследовали 202 клинических изолята, из которых по результатам культуральных методов 166 были РР и 36 РЧ. ГДА подтвердил наличие РР у 161 из 166 РР-изолятов и РЧ у 26 из 36 РЧ-изолятов. Случаи несоответствия могут быть объяснены следующими причинами: по литературным данным [Musser J., 1995] около 4% РР-штаммов МБТ не имеют мутации в RRDR, и их механизм устойчивости имеет другую природу; известно, что на среде ЛЙ вырастает только до 80-85% штаммов МБТ; существуют мутации, приводящие к резистентности с низким значением МИК.

Для сравнения метода ПЦР-ГДА с общепринятыми культураль-ными были использованы следующие критерии: чувствительность метода ГДА (98,2%), его специфичность (82,3%), эффективность (94,0%), прогностическая значимость по устойчивости (94,2%) и чувствительности (90,3%) (в качестве стандарта был взят метод абсолютных концентраций). С помощью этих критериев показано, что по основным показателям - специфичности и чувствительности ГДА не уступает результатам, полученным при росте культур на среде ЛЙ.

Затем была проведена работа на 76 клинических образцах с установленным культуральными или другими молекулярно-биологическими методами наличием МБТ. Было показано, что в 78 % случаев данные по определению чувствительности МБТ в биологических образцах, взятых непосредственно от больных, культуральными методами и ГДА совпали. В то же время с помощью культуральных методов мы смогли определить МБТ только в 41 из 76 случаев, а с помощью ГДА в 67. Таким образом показано, что молекулярно-биологический метод позволяет определить наличие и тип мутации в образцах ДНК, полученных непосредственно из биологического материала, и в значительно большем проценте случаев.

В нашей практике встречались редкие случаи несовпадения типа мутаций, выявленных в образцах и их клинических изолятах, которые заслуживают особого обсуждения.

Нами было выявлено три варианта таких случаев.

1. Когда в мокроте методом ГДА выявляется дикий тип, а в клиническом изоляте мутация - 4 случая: Ser 531>Leu - один случай; Ser531>Trp - один случай; His526>Asp - один случай; Asp516>Tyr -один случай.

2. Когда в мокроте одновременно выявляется и дикий тип, и мутация, а в изоляте только дикий тип - 2 случая: Ser531>Leu и His526>

Leu.

3. Когда в мокроте выявляется МВТ с мутацией Ser531>Leu, а в клиническом изоляте другая, двойная мутация (Leu511>Pro, Asp516>Gly) - один случай.

По всей вероятности, во всех трех вариантах в образцах присутствуют два штамма МВТ, дикий и резистентный; у одного больного (вариант 3) имеются два резистентных штамма МВТ с разными типами мутаций. В литературе описаны случаи наличия у одного больного двух и даже более различных штаммов МВТ [Mankiewicz Е., Liivak М., 1975; Bates J. et al., 1976; Hauer В. et al., 1999; Yeh R. et al., 1999]. В первом варианте в мокроте методом ГДА выявляется один штамм, поскольку он количественно превалирует над другим. В процессе выделения клинического изолята (культивирование МВТ на среде с рифампицином) чувствительный штамм погибает и остается (выявляется) резистентный штамм. Именно поэтому в первом варианте в мокроте мы выявили дикий штамм, а в изоляте - мутантный штамм.

Из литературы известно, что МИК рифампицина в зависимости от типа имеющейся мутации может быть разной, что очень важно для лечения больного [Bodmer Т. et al., 1995; Taniguchi Н. et al., 1996]. Аминокислотные замены в rpoB-гене в 526 и 531 кодонах приводят к высокому уровню резистентности (МИК составляет 64 мкг/мл) [Ohno Н. et al., 1996], следовательно, мутация Ser 531>Leu, казалось бы, требует больших доз препарата, но по нашим данным (вариант 2) она не выросла на среде ЛЙ с рифампицином. Такая же ситуация сложилась и для третьего варианта с таким же типом мутации в мокроте, а на жидкой среде был выявлен штамм с двойной мутацией. Повторное определение штамма в мокроте и в клиническом изоляте дало такие же результаты. Можно предположить, что в этих случаях резистентная форма МВТ погибла при росте на среде ЛЙ, потому что штаммы с мутациями могут быть менее жизнеспособны, чем дикий тип [Чернушенко Е.Ф., Клименко М.Т., 1999]. Некоторые исследователи даже считают, что МВТ с МЛУ могут быть менее вирулентны у иммунокомпетентных экспериментальных животных [Jacobs R., 1994].

В то же время существует и другое мнение, что жизнеспособность бактериальной клетки, устойчивой к 111 И, не только не снижается, но и увеличивается. Инфекционное заболевание, вызванное устойчивыми штаммами, протекает значительно тяжелее, чем обусловленное чувствительными штаммами [Хоменко А.Г. и др., 1999; Mildvan D., 1995]. A.M. Егоров (2000) пишет, что на примере грамотрицательных бактерий, а затем и других микроорганизмов продемонстрировано, что при продолжительном росте антибиотикорезистентных мутантов пояьляются варианты (secondary mutants), скорость роста которых достигает скорости роста диких (исходных) штаммов, причем без потери резистентного фенотипа. Возникновение таких вариантов - следствие компенсаторных мутаций, в результате которых не только возрастает скорость роста, но и многие показатели вирулентности. В результате этого резистентные клетки успешно конкурируют с чувствительными именно in vivo, то есть последними из популяции не вытесняются.

В настоящее время вопрос о жизнеспособности резистентных клеток остается открытым.

В нашей практике было 8 случаев, когда в гроВ гене, выросших на твердой среде без рифампицина штаммов МБТ, мы обнаружили мутацию, ответственную за резистентность к рифампицину, но при последующем культуральном исследовании на твердой среде с препаратом такие штаммы роста не давали. Среди этих штаммов МБТ выявлены следующие типы мутаций: His526>Asp, His526>Tyr, Ser531>Trp, His526>Asn, Asp516>Tyr. Из представленных мутаций His526>Asn [Moghazeh S. et al., 1996] упоминается в литературе, как обусловливающая средний уровень устойчивости (МИК = 16 мкг/мл). В свою очередь H.Ohno и соавт. (1996) также нашли штаммы с мутациями в положениях 516 и 526, приводящие к резистентности среднего уровня (МИК между 2 и 32 мкг/мл). Поскольку клинические изоляты выращивали только при двух достаточно высоких дозах рифампицина (20 и 50 мг/мл), можно предположить, что при более низких концентрациях химиопрепарата изоляты будут расти.

Важным моментом является изучение вопроса становления резистентности. Известно, что частота возникновения мутаций колеблется от 10"5"8 для стрептомицтина, 10*6"7 для этамбутола и до Ю'8"10 для рифампицина и изониазида [Mitchison D., 1984; Jacobs R., 1994]. Скорость развития резистентности коррелирует с частотой возникновения мутаций в ДНК МБТ. В литературе имеются лишь единичные сведения по анализу становления резистентности к лекарственным препаратам у больных. Понятно, что для каждого больного с его штаммом МБТ становление резистентности индивидуально. Известно, что у больных с обильным бак-териовыделением резистентность развивается в три раза чаще, чем у больных со скудным бактериовыделением. Кроме того, становление устойчивости зависит от концентрации применяемого препарата, правильности схемы лечения и регулярности приема лекарств. Т. Ovid и D. Chadee (1999) показали, что для развития резистентности к изониазиду МБТ требуется 3 года, а к рифампицину - 2,5.

В нашей практике был один случай, когда в начале лечения выявлялся чувствительный штамм, а после шести месяцев приема 11111 -штамм с мутацией Asp516>Val. В данной ситуации мы предполагаем становление резистентности, хотя и не исключена вероятность как нозо-комиальной инфекции, так и увеличения выявляемости резистентного штамма на фоне лечения рифампицином, который в первую очередь убивает штамм МБТ дикого типа.

Другим важным моментом является возможность обнаружения контаминации путем выявления мутаций в штаммах МБТ. Этот факт был отмечен, когда при исследовании образцов, обработанных за одни и те же дни (образцы от 21 больного), была выявлена одна и та же мутация

Ser531>Trp, хотя у этих же пациентов ранее или позже выявлялись штаммы с другими мутациями. Тип мутации достаточно редкий, по крайней мере, среди 256 обследованных больных он имелся только у 7 [совместно со Скотниковой О.И., Соболевым А.Ю., Носовой Е.Ю., Морозом A.M.]. По имеющимся в литературе данным контаминация обычно происходит на стадии обработки образца [van Duin J. et al., 1998], включающей в себя несколько этапов с переносом исследуемого материала, что увеличивает риск перекрестной контаминации исследуемого материала. Также мы встретили в литературе описание случая контаминации, обусловленного заражением М. abscessus дистиллированной воды, использовавшейся в лаборатории при приготовлении растворов [Lai К. et al., 1998].В исследовании М. Sebek (1999) в 3% случаев имела место внутрилабораторная контаминация клинического материала.

Таким образом, представленные данные позволяют сделать вывод о возможности применения молекулярно-генетических методов для выявления мутаций в гроВ гене МБТ, наличия у одного больного двух штаммов МБТ, а также для изучения становления резистентности МБТ к рифампицину и лабораторной контаминации исследуемых образцов. Представленные случаи демонстрируют важность изучения штаммов МБТ с определением типов мутаций не только с теоретической, но и практической точки зрения.

Среди проанализированных нами клинических изолятов мы смогли выявить и подтвердить секвенированием 17 аллельных вариантов последовательности RRDR, включая дикий тип (см. табл. 8), что позволило нам создать коллекцию штаммов с известным типом мутации.

Из таблицы видно, что большинство мутаций затрагивают кодоны 531, 526 и 516. По данным разных авторов [Bodmer Т. et al., 1995; Ohno Н. et al., 1996] аминокислотные замены в этих кодонах приводят к РР высокого уровня, а значит, эффективность лечения рифампицином пациентов, имеющих такой тип мутаций, весьма сомнительна. Следовательно, больным, имеющим МБТ с подобными мутациями, необходимы другие варианты лечения.

В то же время мутации His526>Leu, His526>Asn по данным S. Moghazeh и соавт. (1996) приводят к резистентности низкого уровня. Мутация Leu533>Pro по одним источникам [Taniguchi Н. et al., 1996] дает низкий МИК, а по другим [Moghazeh S. et al., 1996] высокий. На основании этих данных мы пришли к выводу, что для больных с этими мутациями рифампицин, несмотря на наличие изменений rpoB-гена, можно рассматривать как препарат выбора. Среди обследованных нами больных такой тип мутации rpoB-гена имелся у 11 человек (6,4%).

Кроме того, мутации Leu511>Pro, Asp516>Val, Asp516>Tyr, Ser522>Leu имеют низкий уровень перекрестной резистентности к ри-фабутину [Heifets L., 1991], а значит, вовремя выявив возбудителя туберкулеза с подобным типом мутации (такие были выявлены у 15 (8,8%) обследованных нами больных) и изменив схему лечения с включением в нее больших доз рифабутина, мы с большой долей вероятности сможем добиться клинического улучшения с меньшими затратами средств и времени.

Таким образом, определение типа мутации МБТ, приводящей к устойчивости к рифампицину, а затем и к другим лекарствам, может оказаться ключевым моментом в выборе схемы лечения. Необходимо до начала лечения понять, имеет ли смысл назначать данному пациенту рифампицин, или лучше сразу заменить его на рифабутин, или необходимо сразу переходить к препаратам второго ряда или к хирургическому вмешательству.

Из таблицы 1, приведенной в литературном обзоре, видно, что для разных стран и континентов характерна своя частота встречаемости отдельных мутаций. Так, для США (штаты Нью-Йорк, Техас, Нью-Мексика, Лос-Анжелес) мутации в 531 кодоне встречаются приблизительно в 30% случаев устойчивости к Р, что по сравнению со странами

Евразии является низким. Мутация Ser531>Leu составляет 27-29% от общего числа выявленных мутаций среди РР-изолятов. Исключение составляет штат Пенсильвания, где на 531 кодон приходится 52% мутаций, и все они представлены мутацией Ser531>Leu. В Греции на долю мутаций в 531 кодоне приходится до 41% (все 41% - Ser531>Leu), в России -46% (44% - Ser531>Leu) и в Западной Европе (Германия) - 36% при 30% мутации Ser531>Leu (Nachamkin I., 1997; Rinder H. et al., 1997). В Африке (Мозамбик) количество мутаций в 531 кодоне значительно ниже -24,3% (19,5% мутация Ser531>Leu) [Caugant D. et al., 1995].

В то же время процент мутаций в 526 кодоне максимален в Африке - 46,1% при 19,5% мутации His526>Tyr и 14.6% мутации His526>Asp. Несколько меньше он в США (по данным разных авторов 20-30%), причем наиболее распространенной в этом кодоне является мутация His526>Tyr (20-31%). В Евразии этот процент колеблется от 16 для Германии, где наиболее распространены мутации His526>Tyr (5%) и His526>Arg (8%), до 18% в Греции (12% His526>Asp и 6% His526>Arg) и 23% в России, где наиболее часто встречается мутация His526>Asp (10%) [Генерозов Э.В. и др., 1999; Kapur V. et al., 1994; Matsiota-Bernard P. et al., 1998].

Третьим по частоте встречаемости мутаций является 516 кодон: 23% в России, причем 18% приходится на долю мутации Asp516>Val, 12% в Мозамбике (7.3% Asp516>Val), 6% в Греции, где практически все случаи представлены мутацией Asp516>Val. В США и Германии мутации в этом кодоне встречаются крайне редко (0-4% всех случаев РР) [Генерозов Э.В. и др., 1999; Gingeras Т., 1998].

Удивительным является также факт, что для Германии характерен большой процент штаммов, фенотипически РР, но генотипически не имеющих мутации в RRDR - 33%, в то время как считается, что более 95% РР-штаммов имеют изменения в этой области [Rinder Н. et al., 1997].

Таким образом, можно сказать, что наибольшее распространение в мире получили мутации Ser531>Leu, His526>Tyr, His526>Asp, Asp516>Val. Их соотношение существенно меняется от континента к континенту.

Наши данные о частоте встречаемости различных мутаций в основном соответствуют приведенным данным, принципиально не отличаются от единичных работ, сделанных в России, и показывают место Москвы на этой карте.

В то же время можно отметить ряд особенностей, обнаруженных в наших исследованиях. Так, при сравнении частоты встречаемости мутаций по 531 кодону можно увидеть значительно больший процент случаев - 70%, в то же время мутации в других кодонах встречаются реже, чем по данным других московских исследователей. Из чего можно сделать вывод, что среди пациентов, поступивших на лечение в МНПЦБТ, выявлялось очень много РР-штаммов с высоким уровнем резистентности, что может быть связано с неэффективностью их лечения на доклиническом этапе: а) поздней диагностикой и соответственно накоплением таких мутаций; б) недостаточно интенсивным и комплексным лечением; в) частым отсутствием возможностей селективного выбора терапии; г) тем, что большинство больных, поступивших на лечение в МНПЦБТ являются хрониками с большим стажем и распространенными формами процесса.

Альтернативной или параллельной возможностью могут быть эпидемиологические особенности Московского региона, поскольку, вероятно, по характеру выявляемой мутации можно предположить пути экспансии туберкулезной инфекции.

Таким образом, предлагаемый метод ПЦР-ГДА при сравнении с культуральными методами практически не уступает им по основным критериям (чувствительности, специфичности, эффективности). В то же время ГДА имеет ряд преимуществ, заключающихся, в первую очередь, во времени, необходимом для проведения анализа; кроме того, на чувствительность к рифампицину может быть исследован биологический материал, полученный непосредственно от пациента, а не клинический изолят. В отличие от других молекулярно-биологических методов ГДА относительно недорог и прост в исполнении.

В результате, применение ГДА, нового высокоэффективного и быстрого молекулярно-биологического метода выявления РР МБТ, позволило определить наиболее характерные мутации МБТ, обусловливающие устойчивость к рифампицину среди больных туберкулезом в Московском регионе.

Таким образом, нами разработана диагностическая молекулярно-биологическая тест-система определения устойчивости МБТ к рифампицину, которая характеризуется быстротой выявления, простотой использования, относительной дешевизной и может быть легко адаптирована к применению в клинике туберкулеза. Кроме того, с ее помощью можно определить не только наличие, но и тип мутации, что важно для выбора адекватного лечения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Исаева, Елена Леонидовна, Москва

1. Богадельникова И.В., Перельман М.И. Туберкулез на пороге третьеготысячелетия. // Врач. 1997. - № 7 - с. 2-6.

2. Генерозов Э.В., Альтшулер М.Л., Говорун В.М. и др. Детекция и характеристика мутаций в гро В гене резистентных к рифампицину клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis.// Проблемы туберкулеза. 1999. - №2. - с.39-42.

3. Голубев В.Н. Выявление больных туберкулезом органов дыхания из групп повышенного риска в поликлинике общей лечебно-профилактической сети. // Проблемы туберкулеза. 2000. - № 6 - с. 16-19.

4. Горбунова В.Н., Баранов B.C. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. // Санкт-Петербург. -Спец. литература. -1997. 286 с.

5. Егоров A.M. Достижения фундаментальных наук и новые подходы к химиотерапии туберкулеза. // Проблемы туберкулеза. 2000. - № 5. -с. 11-15.

6. Иртуганова О.А., Смирнова Н.С., Слогоцкая JT.B. и др. Автоматизированные методы культурального определения Mycobacterium tuberculosis на жидких средах. // Проблемы туберкулеза. 2001. - № З.-с. 53-55.

7. Клименко М.Т. Биологические особенности и клиническое значениеполирезистентных Mycobacterium tuberculosis у больных хроническими деструктивными формами туберкулеза легких, // Автореферат диссертации канд. мед. наук. Киев. -1979. - 20 с.

8. Клинчева С.А., Николаева Н.П., Гнедой С.Н.и др. Множественное ДНК-зондирование: новый подход к лабораторной диагностике туберкулеза. // В сб. тезисов 4-го Рос. Нац. Конгр. «Человек и лекарство». М. - 1997. - с.191.

9. Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Сон И.М., Кочеткова Е.Я. Т, ер-кулез в Москве (1999 г.). М. - 2000.- 82 с.

10. Майерс Р., Шеффилд В., Кокс Д. Обнаружение единичных нуклео-тидных замен в ДНК: расщепление РНКазой и денатурирующий градиентный гель-электрофорез. // В кн.: Анализ генома. Методы.-М.: Мир.-1990.-с.123-175.

11. Мельник В.М. Туберкулез на Украине: состояние, проблемы и прогноз (медико-статистическое исследование). // Проблемы туберкулеза.-2000.-с. 28-31.

12. Мишкинис К., Каминскайте А., Пурванецкене Б. Результаты лечения полирезистентного туберкулеза по данным республиканской туберкулезной больницы Сантаришкес. // Проблемы туберкулеза. 2000 - № З.-с. 9-11.

13. Патрушев Л.И. Экспрессия генов. // М.: Наука. 2000. - 527 с.

14. Приказ МЗ СССР № 558. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулезе. 1978.

15. Хоменко А.Г., Голышевская В.И., Корнеев М.В. и др. Распространенность и микробиологическая характеристика штаммов Mycobacterium tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью. // В сб.: Туберкулез. 1999. - № 1. - с. 1-6.

16. Чернушенко Е.Ф., Клименко М.Т. Микробиологическая диагностика туберкулеза.// В сб.: Туберкулез. 1999. - № 3. - с. 1-5.

17. Шилова М.В. Туберкулез в России в 1999 г.// М. 2000. - 47 с.

18. Albert Н., Stupple М., Wilson S. et al. Rifampicin susceptibility results of Mycobacterium tuberculosis cultures in 48 hours using FAST plaque TB-Rif.//Int. J. Tubercle, and LungDis.-1999.-V.3. Suppl.l.-p.130.

19. Bakayev V., Bahrmand A., Samar G. CCM analysis of heteroduplexes of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis. // Int.J. Tubercle, and Lung Dis. 1999. - V.3. - N 9. - Suppl. 1. - p.123.

20. Bates J., Stead W., Rado T. Phage type of tubercle bacilli isolated from patients with two or more sites of organ involvement. // Am Rev Respir Dis. 1976. - V.l 14. - p. 353-358.

21. Beenhouwer H., Lhiang Z., Jannes G. et al. Rapid detection of rifampicin-resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. // Tubercle Lung Dis. -1995. V.76. - p. 425430.

22. Blanchard J.S. Molecular mechanisms of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. // Annu. Rev. Biochem. -1996. V.65. -p.215-39.

23. Bloch A., Cauthen G., Onorato I. et al. Nationwide survey of drug-resistant tuberculosis in the United States. // JAMA. 1994. - V.271. -p.665-671.

24. Brunello F., Fontana R. Reliability of the MB/BacT system for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis-complex isolates to antituberculous drugs. // J.Clin.Microbiol. 2000. - V. 38. - p. 872-873.

25. Brunello F., Favari F., Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC 460 ТВ systems for recovery of mycobacteria from various clinical specimens. // J.Clin.Microbiol. 1999. - V.37. - p.1206-1209.

26. Canetti G., Fox W., Khomenko A. Advances in techniques of testing mycobacterial drug sensitivity, and the use of sensitivity tests in Tuberculosis Control Programmes. // Bull.WHO. 1969. - № 41. - p. 2143.

27. Cangelosi G., Brabant W., Britschgi Т., Wallis C. Detection of rifampin-and ciprofloxacin-resistant Mycobacterium tuberculosis by using species-specific assays for precursor rRNA. // Antimicrob.Agents Chemother. -1996.-V.40.- p. 1790-1795.

28. Caugant D., Sandven P., Eng J. et al. Detection of rifampin resistance among isolates of Mycobacterium tuberculosis from Mozambique. // Microbial Drug Resistance. 1995. - V.l. - p. 321-326.

29. Chakrabarti P. Drug targets and drug resistance in mycobacteria.// Proc.Nat.Acad.Sci. (India, B). 1997. - V.67. - p.169-179.

30. Chaulet P., Bonlahbal F., Crosset J. Surveillance of drug resistance for tuberculosis control: why and how?// Int.J.Tubercle. and Lung Dis. 1995. -V.76.-p. 487-492.

31. Cohn D., Bustreo F., Raviglione M. Drug-resistant tuberculosis: review of the wordwide situation and the WHO/IUATLD global surveillance project. // Clin.Infect.Dis. 1997. - V.24. - p. 121-130.

32. Cooksey R., Crawford J., Jacobs W., Shinnick T. A rapid method for screening antimicrobial agents for activities against a strain of Mycobacterium tuberculosis expressing firefly luciferase. // Antimicrob.Agents Chemother. 1993. - V.37. - p. 1348-1352.

33. Cooksey R., Morlock G., Glickman S., Crawford J. Evaluation of a line probe assay kit for characterization of rpoB mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from New York City.// J.Clin.Microbiol. 1997. - V.35. - p.1281-1283.

34. Cousins D., Williams S., Liebana E. et al. Evaluation of four DNA typing techniques in epidemiological investigations of bovine tuberculosis.// J.Clin.Microbiol. 1998. - V.36. -p.168-178.

35. Diaz-Infantes M., Ruiz-Serrano M., Martinez-Sanchez L. et al. Evaluation of the MB/BacT Mycobacterium detection system for susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.// J.Clin.Microbiol. 2000. - V.38. -p.1988-1989.

36. Felmlee Т., Lin Q., Whelen A. et al. Genotypic detection of Mycobacterium tuberculosis rifampin resistance: comparison of single-strand conformation polymorphism and dideoxy fingerprinting.// J.Clin.Microbiol. 1995. - V.33. - p. 1617-1623.

37. Foddle R., Losekoot M. Mutation detection by denaturating gradient gel electrophoresis (DGGE).//Hum. Mutat. 1994. - V.3. - p.83-94.

38. Gale E., Cundliffe E., Reynolds P. et al. The molecular basis of antibiotic action. //1981. John Wiley & Sons, Inc., New York. p. 131-142.

39. Gali N., Dominguez J., McNerney R. et al. Rapid detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis clinical isolates using micobacteriophage D29. Preliminary study.// Int. J. Tubercle, and Lung Dis. 1999. -V.3. - Suppl.l. - c.129.

40. Gillespie S., Baskerville A., Davidson R. et al. The serum rifabutin concentrations in a patient successfully treated for multi-resistant Mycobacterium tuberculosis infection.// J. Antimicrob. Chemother. -1990. V.25. - p.490-491.

41. Gingeras Т., Ghandour G., Wang E. et al. Simultaneous genotyping and species identification using hybridization pattern recognition analysis of generic Mycobacterium DNA arrays.// Genome Research. 1998. - V. 8. -p. 435-448.

42. Glavac D., Dean M. Optimization of the single-strand conformation polymorphism (SSCP) technique for detection of point mutations.//Hum.Mutat.-1993. V.2. - p.404-414.

43. Go M., Kapur V., Graham D., Musser J. Population genetic analysis of Helicobacter pylori by multilocus enzyme electrophoresis: extensive allelic diversity and recombinational population structure.// J.Baeteriol. -1996. V.178. -p.3934-3938.

44. Grompe M. The rapid detection of unknown mutations in nucleic acids.// Nature Genet. 1993. - V.5. - p.l 11-116.

45. Hauer В., Serke M., Loddenkemper R. et al. Various polyresistant strains of Mycobacterium tuberculosis in one patient (case report).// Int.J. Tubercle. and Lung Dis. 1999. - V.3. - Suppl. 1. - p. 122.

46. Heifets L. Antituberculosis drugs: antimicrobial activity in vitro. In L.B. Heifets (ed.), Drug susceptibility in the chemotherapy of mycobacterial infections, 1st ed. CRC Press, Boca Raton, Fla. 1991. - p. 14-57.

47. Heifets L., binder Т., Sanchez T. et al. Two liquid medium systems, Mycobacteria Growth Indicator Tube and MB Redox Tube, for Mycobacterium tuberculosis isolation from sputum specimens.// J.Clin.Microbiol. 2000. - V.38. - p.1227-1230.

48. Heym В., Honore N., Truffot-Pernot C. et al. Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis: a molecular study.// Lancet. 1994. - V.344. - p.293-298.

49. Huebner R., Castro K. The changing face of tuberculosis.// Ann.Rev.Med. 1995. - V.46. - p. 47-55.

50. Hunt J., Roberts G., Stockman L. et al. Detection of a genetic locus encoding resistance to rifampin in mycobacterial cultures and in clinical specimens.// Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - V.18. - p.219-227.

51. Iseman M.D. Evolution of drug-resistant tuberculosis: a tale of two species.// Proc.Natl.Acad.Sci. (USA). 1994. - V.91. - p.2428-2429.

52. Iseman M., Madsen D. Drug-resistant tuberculosis.// Clin.Chest Med. -1989.-V.10.-p. 341-353.

53. Jacobs W., Barleta R., Udani R. et al. Rapid assessment of drug susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis by means of luciferase reported phages.// Science. -1993. V.260. - p.819-821.

54. Jacobs R.F. Multiple drug-resistant tuberculosis.// Clin Infect Dis 1994. -V.19.-p.l-8.

55. Jin D., Gross C. Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance.// J.Mol.Biol. 1988. -V.202. - p.45-58.

56. Kochi A.* Vareldris В., Styblo K. Multidrug-resistant tuberculosis and its control.// Res.Mycrobiol. 1993. - V.144. - p.104-110.

57. Lambregts-van Weezenbeek C.S.B. Drug-resistant tuberculosis.// Eur Respir Mon. -1997. V.4. - p.298-326.

58. Lee S., Tan K., Chew S., Snodgrass I. Multidrug-resistant tuberculosis.// Ann Acad.Med. Singapore. 1995. -V.24. - p.442-446.

59. Levin M., Hatflill G. Mycobacterium smegmatis RNA polymerase: DNA supercoiling, action of rifampicin and mechanism of rifampicin resistance.// MoLMicrobiol. 1993. - V.8. - p.277-285.

60. Lisitsyn N., Sverdlov E., Moiseyeva E. et al. Mutation to rifampin resistance at the beginning of the RNA polymerase beta subunit gene in Escherichia coli.// Mol.Gen.Genet. 1984. - V.196. - p. 173-174.

61. Luna-Herrera J, Reddy M., Gangadharam P. In vitro activity of the benzoxazinorifamycin KRM-1648 against drug-susceptible and multidrug-resistant tubercle bacilli.// Antimicrob Agents Chemother. 1995. - V.38.- p.440-444.

62. Maiden M., Bygraves J., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms.// Proc Natl Acad Sci (USA). 1998. - V.95. -p.3140-3145.

63. Mankiewicz E., Liivak M. Phage types of Mycobacterium tuberculosis in cultures isolated from Eskimo patients.// Am. Rev. Respir. Dis. 1975. -V.lll. -p.307-312.

64. Martin-Casabona N, Xairo Mimo D., Gonzalez T. et al. Rapid method for testing susceptibility of Mycobacterium tuberculosis using DNA probes.// J.Clin Microbiol. 1997. - V.35. - p. 2521-2525.

65. Matsiota-Bernard P., Vrioni G., Marinis E. Characterization of гро В mutations in rifampin-resistant clinical MTB isolates from Greece.// J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36. - p.20-23.

66. McClure W., Cech C. On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis.// J.Biol.Chem. -1978. V.253. - p. 8949-8956.

67. Mildvan D. Predictors and outcome of multidrug-resistant tuberculosis.// Clin.Infect.Dis. 1995. - V.21. - p.1245-1252.

68. Mitchison D. Drug resistance in mycobacteria.// Brit. Med. Bull. 1984.- V.40. p.84-90.

69. Moore M., Onorato I., McGray E., Castro A. Trends in drug-resistant tuberculosis in the United States, 1993-1996.// JAMA. 1997. - V.278. -p.833-837.

70. Musser J. Antimicrobial agent resistance in Mycobacteria: molecular genetic insights.// Clin.Microb.Rev. 1995. - V.8. - p. 496-514.

71. Nachamkin I., Kang C., Weinstein M. Detection of resistance to isoniazid, rifampin and streptomycin in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis by molecular methods.// Clin.Infect.Dis. 1997. - V.24. -p.894-900.

72. Nelson K., Selander R. Evolutionary genetics of the proline permease gene (putP) and the control region of the proline utilization operon in populations of Salmonella and E.coli.// J.Bacteriol. 1992. - V.174. -p.6886-6895.

73. Nelson K., Wang F-S., Boyd E., Selander R. Size and sequence polymorphism in the isocitrate dehydrogenase kinase/phosphatase gene (aceK) and flanking regions in Salmonella enterica and E.coil.// Genetics. 1997. -V. 147. - p. 1509-1520.

74. Ohno H, Koga H., Kohno S. et al. Relationship between rifampin MICs for and rpoB mutations of Mycobacterium tuberculosis strains isolated in Japan.// Antimicrob Agents Chemother. 1996. - V.40. - p. 1053-1056.

75. Orita M., Iwahana H., Kanazawa H., Sekya T. Detection of polymorphism of human DNA by gel electrophoresis as single cell conformation polymorphism.// Proc.Natl.Acad.Sei. USA. -1989. V.86. - p.2766-2770.

76. Ovehinnikov Y., Monastyrskaya G., Gubanov V. et al. Primary structure of Escherichia coli RNA polymerase. Nucleotide substitution in the beta subunit gene of the rifampicin resistant rpoB255 mutant.// Mol.Gen.Genet. -1981. -V.184. -p,536-538.

77. Ovchinnikov Y., Monastyrskaya G., Guriev S. et al. RNA polymerase rifampicin resistance mutations in Escherichia coil: sequence changes and dominance.// Mol.Gen.Genet. 1983. - V.190. - p.344-348.

78. Ovid Т., Chadee D. The evolution of multidrug resistance of Mycobacterium tuberculosis, Trinidad and Tobago 1998.// Int.J. Tubercle, and Lung Dis. 1999. - V.3- Suppl.l. - p. 120.

79. Pretet S., Lebeaut A., Parrot R. et al. Combined chemotherapy including rifabutin for rifamycin and isoniazid resistant pulmonary tuberculosis.// Eur.Respir.J. -1992. V.5. - p.680-684.

80. Ramaswamy S., Musser J.M. Molecular genetic basis of antimicrobial agent resistance in Mycobacterium tuberculosis: 1998 update.// Tubercle Lung Dis. 1998. - V.79. - p.3-29.

81. Rattan A., Awdhesh K., Nishat A. Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis: molecular perspectives.// Emerging Infect. Dis. 1998. - V.4. - p.l95-209.

82. Reddy M., Luna-Herrera J, Daneluzzi D, Gangadharum P. Chemotherapeutic activity of benzoxazinorifamycin KRM-1648 against Mycobacterium tuberculosis in C57BL/6 mice.// Tubercle Lung Dis. -1996. V.77. - p. 154-159.

83. Rinder H., Dobner P., Feldmann K. Disequilibria in the distribution of rpoB alleles in rifampiein-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from Germany and Sierra Leone.// Microbial Drug Resistance. 1997. -V.3.- p.195-197.

84. Rohner P., Ninet В., Metral C. et al. Evaluation of the MB/BacT system and comparison to the BACTEC 460 system and solid media for isolation of mycobacteria from clinical specimens.// J.Clin.Microbiol. 1997. -V.35. -p.3127-3131.

85. Rusch-Gerdes S, Domehl C., Nardi G. et al. Multicenter evaluation of the Mycobacteria Growth Indicator Tube for testing susceptibility of

86. Mycobacterium tuberculosis to first-line drugs.// J.Clin.Microbiol. 1999. - V.37. - p.45-48.

87. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - Book 1. -p. 1.25-1.28.

88. Sebek M. DNA fingerprinting and the contribution to contact investigation.// IntJ.Tubercle. and Lung Dis. 1999. - V.3. - Suppl.l. -p.10-11.

89. Shinder D., Cauthen G., Farer L. et al. Drug-resistant tuberculosis.// Amer.Rev.Resp.Dis. 1991. - V.141. - Pt. 1. - p.732-732.

90. Shinnik T. Molecular approach to the diagnosis of tuberculosis.// Tuberculosis: pathogenesis, protection and control. 1994. American society for microbiology. Washington. Chapter 30. p. 517-530.

91. Taniguchi H., Aramaki H., Nikaido Y. et al. Rifampicin resistance and mutation of the rpoB gene in Mycobacterium tuberculosis.// FEMS Microbiol Lett- 1996. V.144. -p.103-108.

92. Teixeira L., Palaci M., Canedo Rocha L. et al. Savety and early bactericidal activity of Rifalazil in patients with pulmonary tuberculosis.// Int. J. Tubercle, and Lung Dis. 1999. - V.3. - Suppl.l. - p.48.

93. Telenti A., Imboden P., Marchesi F. et al. Detection of rifampicin-resistanee mutations in Mycobacterium tuberculosis.// Lancet.- 1993. -V.341. -p.647-50.

94. Troesch A., Ngueyen H., Miyada C. et al. Mycobacterium species identification and rifampicin-resistant testing with high-dencity DNA probe arrays.// J Clin Microbiol. 1999. - V.37. - p.49-55.

95. Van Duin J., Pijnenburg J.E.M., van Ryswoud C. et al. Investigation of cross contamination in Mycobacterium tuberculosis laboratory using IS 6110 DNA fingerprinting.// IntJ.Tubercle. and Lung Dis. 1998. - V.2. -p.425-429.

96. Vareldris В., Grosset J., de Kantor I. et al. Drug-resistant tuberculosis: laboratory issues.// Tubercle Lung Dis. -1994. V.75. - p. 1-77.

97. Watterson S., Wilson S., Yates M., Drobniewski F. Comparison of three molecular assays for rapid detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis.// J. Clin. Microbiol. 1998. - V.36. -p.1969-1973.

98. Whelen A., Felmlee Т., Hunt J. et al. Direct genotypic detection of Mycobacterium tuberculosis Rifampin Resistance in clinical specimens by using single-tube hemi-nested PCR.// J.Clin.Microbiol. 1995. - V.33. -p. 556-561.

99. Williams D., Waguerpack C., Eisenach K. et al. Characterization of rifampin resistance in pathogenic mycobacteria.// Antimicrob Agents Chemother. 1994. - V.38. - p.2380-2386.

100. Williams D., Limbers C., Spring L. et al. PCR-heteroduplex detection of rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis // In: PCR protocols for emerging infectious diseases. D.Persing (ed.) -19%. p.122-129.

101. Williams D., Spring L., Collins L. et al. Contribution of гро В mutations to development of rifampicin cross-resistance in Mycobacterium tuberculosis.// Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - V.42. - p. 18531857.

102. Wilson S., Al-Suwaidi Z., McNerney R. et al. Evaluation of a new rapid bacteriophage-based method for the drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis.// Nat.Med. 1997. - V.3. - p.465-468.

103. Winder F. Mode of action of the antimycobacterial agents and associated aspects of the molecular biology of the mycobacteria.// In.: The biology of the mycobacteria C.Ratledge and J.Stanford (ed). 1982. -Academic Press, London. - V.l. - p.353-438.

104. The world Health Organizaton. Standartization of methods for conducting microbic sensitivity tests. WHO Tech.Rep.Ser.- 1961-N210-p.3-24.

105. The World Health Report, 1998// Life in the 21 -st century. A vision for all.-Geneva. 1998. - 54 p.

106. Yeh R., Leon A., Agasino C. et al. Stability of Mycobacterium tuberculosis DNA genotypes.// J. Infect. Dis. 1998. - V.177. - p.1107-11.

107. Yeh R., Hopewell P., Daley C. Simultaneous infection with two strains of Mycobacterium tuberculosis identified by restriction fragment length polymorphism analysis.// Int.J.Tubercle and Lung Dis. 1999. - V.3. -p.537-539.

108. Zwolska Z., Augustynowicz-Kopec E., Klatt M. New automated, non-radiometric system for the culture of mycobacteria MB/BacT.// Int. J. Tubercle, and Lung Dis. -1999. V.3. - Suppl.l. - p.l 12.