Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические эффекты у линейных мышей СС7w|Mv индуцированных малыми дозами хронического ионизирующего облучения

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические эффекты у линейных мышей СС7w|Mv индуцированных малыми дозами хронического ионизирующего облучения"

РГБ ОД

АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ КЛІТИННОЇ БІОЛОГИ ТА ГЕНЕТИЧНОЇ ІНЖЕНЕРІЇ

На правах рукопису УДК 675.167 + 575.224 + 575.17

СТОЛІНА Марнів Романівна

ГЕНЕТИЧНІ ЕФЕКТИ У ЛІНІЙНИХ МИШЕЙ 0С57И/Иу, ІНДУКОВАНІ МАЛИМИ ДОЗАМИ ХРОНІЧНОГО ІОНІЗУЮЧОГО ОПРОМІНЕННЯ

03.00.15 - генетика

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1994

Дисертаціє» е рукопис.

Робота виконана у відділі біохімічної генетики Інституту молекулярної біології 1 генетики АН України.

Науковий керівник - кандидат біологічних наук

О.П. Соломко

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук С.М. Храпунов

кандидат біологічних наук Б.В. Сорочинський

Провідна організація - Інститут удосконалення лікарів МОЗ України, м.Київ

Захист відбудеться ^________________ ідд4 р. о -¿1—- год. на

засіданні спеціалізованої ради Д.01.19.01 Інституту клітинної біології та генетичної Інженерії АН України за адресою: 252143, КиІв-143, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної Інженерії АН України ва адресою: 252143, КиІв-143, вул. Заболотного, 148.

Автореферат розіслано р

Вчений секретар спеціалізованої ради, кандидат біологічних наук

Л.В.Малишева

■ - 1 -

Актуальність проблеми. Відомо, що багато мутагенів в малих концентраціях Істотно впливають на спадковість організмів при накопичені сумарної дози та хронічному використанні. Дослідження генотоксичної дії Іонізуючого випромінення має два напрямки. Один - вивчення наслідків гострої дії значних доз опромінювання на індивідуальному і популяційному рівнях. Цей напрям відносно добре опрацьовано і результати відповідних досліджень широко репрезентовано в публікаціях міжнародних організацій (UNSCAR, USA; ICRP і т.і.) Значно менш дослідженим залишається напрям вивчення генетичних ефектів, індукованих внаслідок хронічного Іонізуючого опромінювання в малих дозах /Oftedal P., 1991/, та їх віддалених наслідків в поколіннях.

Труднощі в цьому напрямку пов’язані зі складністю моделювання умов хронічного опромінювання та невивченністю спричинюваних ними змін в біологічних об’єктах. Останнє зумовлює відсутність характеристик, які можна було б використовувати як стандартні специфічні показники наявності певних змін.

Експериментальні дані, отримані на різних біологічних об’єктах, підданих опроміненню в зв’язку з аварією на Чорнобильській АЕС, вказують на неспівпадання рівня генетичних ефектів . та їхньої динаміки Із встановленими раніше класичними закономірностями, які мали місце при Інших умовах опромінення /Gould, Goldman, 1990/. Добре відомо, що генотоксична дія іонізуючого випромінювання реалізується на рівні мутацій як соматичних, так 1 статевих клітин. Для вивчення радіаційно Індукованого мутагенезу в статевих клітинах ссавців найчастішй використовують гамети та ембріони мишей Інбредних ліній. Саме за таких умов стає можлиеим відділення різноманітних аспектів Ініціації мутагенних процесів, таких, як рівень дози,, стать, лінійні особливості тварин; дослідження Індукції генетичної нестабільності в статевих клітинах та зиготах; проведення експериментів в системах in vivo та in vitro.

Мета та завдання досліджень. Метою цієї роботи було вивчення генетичних наслідків хронічного Іонізуючого опромінення в малих дозах на репродуктивну функцію ряду поколінь лінійних мишей CC57W/MV та виявлення специфічних ознак ге-ном-дестабілівуючих радіонуклідних ефектів на рівні статевих 1 соматичних клітин.

До конкретних завдань роботи входили: •

1. Створення модельної системи а одночасним використанням в експериментах мишей різних ліній для виявлення генотипічних та феноменологічних ефектів хронічного опромінення в малих дозах на ряд показників репродуктичної функції.

2. Проведення порівняльного аналізу репродуктивної функції трьох послі давни* поколінь тварин з чорнобильської та київської експериментальних популяцій за рядом показників.

3. Вивчення генотиксичного впливу хронічного Іонізуючого

опромінення в малих дозах на рівень ембріональних втрат у трьох поколінь мишей Ліні! CC57V/MV а чорнобильської експериментальної популяції та на успіх розвитку зигот різного популяційного походження в системі in Vitro. '

.4. Проведення порівняльного аналізу ряду показників репродуктивної функції мкшей Лінії CC57W/MV з чорнобильської експериментальної популяції з такими, отриманими для тварин батьківських генотипів BALB/c і С57В1/6 та мишей CC57W/MV з київської експериментальної популяції.

6. Тестування каріотипічної стабільності геному соматичних клітин кісткового мозку тварин-донорів гамет з чорнобильської та київської експериментальних популяцій.

Наукова новизна та практична цінність роботи. Вперше для дослідження генотоксичного впливу хронічного іонізуючого опромінення в малих дозах на репродуктивну функцію ссавців вапропоновано модельну систему, основу якої складають миши Інбредних ліній - CC57W/Mv, C57BL/6, BALB/c. Завдяки тому, що генотип мишей CC57W/MV є похдним від батьківських - BALB/c та С57В1/6 - стає можливим виділення з феноменологічних ефектів генотиксичної дії мутагенів генотипічних та епігенетичних аспектів на організменому та клітинному рівнях.

Показано достовірне зниження плідності тварин лінії CC57W/MV з чорнобильської експериментальної популяції, пов'язане зі зменшенням кількості погонів протягом життя та кількосте народжених в погоні. Останнє в значній мірі обумовлено зростанням в 2-3 рази рівня доімплантаційних втрат у опромінених тварин обох статей. Критичним періодом при формуванні гамет мишей лінії CC57W/MV є стадія первинних статевих клітин. В основі порушень раннього ембріонального розвитку можуть бути дефекти нормального поділу клітин, оскільки в клітинах кісткового мозку мишей генотипу CC57W/MV

- З -

під впливом хронічного низькодобового іонізуючого опромінювання спостерігаються зміни багатьох каріотипІчних характеристик.

За різними показниками в системах in vivo та in vitro зниження плідності хронічно опромінюваних мишей лінії CC57W/MV може реалізуватися на епігенетичному рівні.

Запропонована нова модельна система та використані методи досліджень можуть застосовуватися при дослідженні у ссавців генетичних ефектів, Індукованих хронічною дією мутагенів в малих дозах.

Апробація. Матеріали дисертації доповідались на: Міжнародній конференції "Medical consequences of the Chernobyl accident" (м.Київ) в 1992 p.; Конференції С.НД "Актуальные

проблемы влияния ионизирующих излучений на репродуктивную функцию" (Росія, м.ОбнІнськ) в 1992 р.; Радіобіологічному з'їзді (м.Київ) в 1993 р.; Конференції Ради Європи "Potential long-term ecological impact of genetically modified organisms" (м.Стразбург, Франція) в 1993 p.

ПублікаціI. За темою дисертації опубліковано 9 робіт. Структура та об'єм роботи. Дисертаційна робота складається

з вступу, 3 частин, заключения, висновків, списку літератури, викладена на 113 сторінках 1 має 7 Малюнків та 11 таблиць. Список літератури включає 157 бібліографічних посилань, 110 з яких - Іноземні.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ Об’єктами проведених генетичних та ембріологічних досліджень були миші інбредних ліній С57В1/6, BALB/c та CC57W/MV. Миші генотипу CC57W/MV виведені від схрещування: BALB/c х С57В1/6 /Медведев, 1964/. В 1990 р. було засновано 2 експериментальні популяції моногамних родин мишей лінії CC57W/MV - Чорнобильську ( Ч - спецвіварій Інституту в зоні впливу ЧАЕС) та контрольну ( К - віварій Інституту в м.Києві)

- які підтримуються синхронно у ряді поколінь шляхом братерсько-сестринських схрещувань нащадків 2-3 місячного віку з дру-гого-третього погонів . З цих же погонів брали тварин для генетичних та ембріологічних досліджень. Відносною біологічною нормою эа рядом генетичних, ембріологічних та цитологічних показників вважали такі, отримані на мишах лінії CC57W/MV з київської експериментальної популяції (К). Догляд за тваринами обох експериментальних популяцій проводили протягом всього

їхнього життя.

За даними регулярних вимірювань радіаційний фон у приміщенні чорнобильського спецвіварію складав 40-80 мкР/год, а у приміщенні київського - 5-10 мкР/год, Внутрішнє радіаційне навантаження у тварин а Чорнобильської експериментальної популяції (Ч) створювалося за рахунок радіонуклідів, що надходили до організму мишей Інгаляційним та перкунанним шляхами, а також з харчовими додатками. .Склад харчового раціону в обох віваріях не відрізнявся за винятком зеленої маси кормів (паростки злаків), яку тварини (Ч) отримували з Прип’ятьського тепличного господарства. Сумарна . концентрація (визначали радіометром типу КРК-1-01) бета-активних Ізотопів в паростках злаків та тушках мишей з чорнобильської експериментальної популяції перевищувала контрольний рівень на 2 порядки 1 складала 4,0x10а Бк/кг та 2,4x10* Бк/кг. Ізотопний склад радіонуклідів, які мали гама-активність, вимірювали за допомогою багатоканального’ аналізатора AFORA LP4900 В "Nokia" (Фінляндія). Питома активність основних радіонуклідів (Cs-137, Ra-226, Th-232, К-40) в зеленій масі кормів та тушках тварин з чорнобильського віварія не відрізнялась від контрольних показників.

Гострі досліди проводились на статевозрілих 3-5 місячних мишах. Тварин лінії CC57W/MV з Чорнобильської популяції брали в експерименти через 3 доби після закінчення експозиції.

Сезонну мінливість плідності самиць визначали протягом 2 років. Потенційну плідність оцінювали за кількістю зародків, що знаходилися в кумулюсній масі яйцепроводів самиць першого дня вагітності, або за числом жовтих тіл в яєчниках.

Рівень ембріональних втрат в потомстві експериментальних 1 контролних тварин визначали за рівницею між числом жовтих тіл в яєчниках 1 місць імплантації в рогах матки (доімплантаційні втрати) самиць 16-18 доби вагітності, 1 за різницею між кількістю місць Імплантації й живих ембріонів (постімплан-таційні втрати) /Шевченко, Померанцева, 1985, Балонов и др., 1992/. ■

Для синхронізації проведення досліджень в системі in vitro яйцеклітини та зиготи вимивали а ампул яйцепроводів суперо-вульованних самиць /Hogan et al., 1986/. Отримані одноклітинні зародки культивували за методикою /Hogan et al., 1986/. Для

підрахунку кількості клітин в бластоцистах готували фіксовані препарати за модифікованим методом / Паткин и др., 1992/. Препарати фарбували барвником Гімза ("Merk"). Препарати клітин кісткового мозку готували без застосування колхіцину за методикою /Макгрегор, Варли, 1986/, фарбували барвником Гімза ("Merk"). Дитогенетичний аналіз матеріалу ' проводили на

мікроскопі "Ampleval". ......... ~

Достовірність різниці між двома середніми величинами визначали за допомогою крітерія Ст'юдента /Плохинский, 1980/.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ОБГОВОРЕННЯ .

1. Створення модельної системи для проведення комплексних генетично-ембріологічних досліджень та її основні характеристики. Для проведення комплексний генетичних експериментів було створено модельну систему, до'якої увійшли миші ЛІНІЙ BALB/c і С57В1/6, а також лінії ÖC57W/MV, отриманої в результаті схрещування перших двох. За нашими даними (табл.1) миші генотипу CC57W/MV не відрізнялися від мишей генотипу С57В1/6 за сезонною мінливістю репродуктивних характеристик. Самиці генотипу BALB/c характеризуються високим рівнем пропустову-вань, цей показник є сезонностабіьним (35-49%). ! Частка вагітних самиць С57В1/6 була більшою (80-90%), ніж цей показник для лінії BALB/c;- Миші CC57W/Mv характеризуються не тільки сезонного стабільністю за цією ознакою, але й високим рівнем вагітностей - 75-90% від кількості фертильних самиць. Показник потенційної плідності виявився сезонно стабільним і обумовлен-ним лінійною приналежністю самиць : він достовірно нижчий у

мишей лінії С57В1/6 1 не відрізняється для ліній CC57W/MV та BALB/c. Поряд з цим у мишей генотипу CC57W/MV найнижча середня кількість народженних у погоні 1 найвищий піказник загибелі мишенят в перший місяць життя.

Для мишей генотипів С57В1/6 і CC57V/Mv рівень доімплан-таційних втрат складав 4-5%, а для тварин лінії BALB - 11-12%. Суто генотипічною ознакою для мишей лінії CC57W/MV виявився високий рівень постімплантаційних втрат.(35%), відмінний від такого'для мишей двох інших ліній (11-14%). , ,

Культивування з одноклітинної стадії до бластоцисти понад 100 лінійних зародків кожного генотипу дало можливість визначити рівень доімплантаційної загибелі на трьох основних

- 6 -

Таблиця 1. Порівняльні генетичні та ембріогенетичні особливості мишей інбредних ліній ВАЬВ/с, С57В1/6 1 СС57У/Му.

Генетичні та ембріологічні характеристики Лінія ВАЬВ/с С57В1/6 СС57У//Му

Гаплотип Н2-к Н2-Ь Н2-Ь

Гени кольору шерсті Ь,с а а,ь,с

Відмінності за:

- рівнем сезонної фертильності + - -

- потенційною плідністю - + -

- рівнем ембріональних втрат

а/до імплантації + - -

б/після Імплантації - - ' +

- кількістю мишенят в погоні - - +

- життєздатністю доімплантацій-

них зародків при культивуванні + “

"+" - відмінність однієї лінії від двох інших за вказаним показником

- дві лінії з трьох мають співставимі значення за показником

стадіях: зиготи, двоклітинного аародку та бластоцисти . Для зародків ліній СС57У/Му та С57В1/6 відсоток загиблих на стадії зиготи становив 3-5%, а кількість двоклітинних зародків, які пройшли послідовні поділи 1 стали бластоцистами, була близька до 90%. Отже, рівень доімплантаційних втрат коливався в межах 10 - 15%. Після запліднення яйцеклітин генотипу ВАЬВ/с

доімплантаційні втрати при культивуванні зигот до бластоцист досягали 60%.

То ж, для мишей генотипу СС57У/Му на рівні в суто лінійними особливостями (високий рівень постімплантаційних втрат та відмінність за кількістю мишенят в погоні при народженні і після періоду лактації) існує ряд генетичних характеристик, що успадковані від батьківських лінійних мишей ВАЬВ/с та С57В1/6.

Таким чином, використання запропонованої модельної системи робить можливим виділення з феноменологічних ефектів генотоксичного епливу хронічного іонізуючого опромінення в малих

дозах епігенетичних аспектів на органІзменому, клітинному та молекулярно-генетичному рівнях.

2. Аналіз плідності ряду поколінь моногамних родин мишей лінії 0С5ТО/Му а чорнобильської та київської експериментальних популяцій. Чорнобильську та київську експериментальні популяції лабораторних мишей лінії СС57\//Му було започатковано в 1990р. Підтримання обох популяцій велося за схемою , яка забезпечувала порівняльний комплексний аналіз репродуктивної функції тварин протягом всього їхнього життя (мал.1).

За нашими даними (табл.2) тварини з двох експериментальних популяцій не відрізнялися за тривалістю життя, а їхні нащадки

- за кількістю загиблих в перший місяць після народження. Серед тварин з (Ч) та (К) мишей з фенотипічними аномаліями не виявлено. В результаті зворотних схрещувань рецесивних мутацій не отримано.

У мишей СС57М/Ш з чорнобильської експериментальної популяції нами було зафіксовано зниження репродуктивних функцій за показниками "кількість погонів на самицю" та "кількість народжених у погоні" (табл.2). Якщо самки, які належали до (К), мали в середньому 4-5 погонів протягом життя, то чорнобильські миші тільки 3, і така різниця зберігалася в трьох поколіннях тварин. Від 80-90% самиць (К) було отримано 3 погони, від 60-70% - чотири, й від 30-50% - п’ять (мал.2). Ці показники для мишей з (Ч) були достовірно нижчими і складали 50-60%, 30-40% та 20-25% (відповідно до кількості погонів).

РпРп

І І

Т.л/1 Г».і/г

Р2Р’

Рз/і Гі/г ї"з/з Гз/ч

РІ1

УЛ—Г-+

Ггл Гг/г К г/з Гг/ч

Гг/к

РоРоТ

//—Г->

Гі'і ґ і/ї Гі/з Кі/ч

Мал.1. Схема підтримки та розплоду мишей лінії СС57У/Му в київській та_чорнобильській експериментальних популяціях.

Таблиця 2. Плідність в досліджених моногамних родинах мишей лінії СС57>//М\’ б чорнобильської'(Ч) та київської (К) експериментальних популяцій. .. ' " •: ;■ .

Гене- рація Попу- ляція Кіль- кість самиць Кількість ПОГОНІВ Кількість народжених Результат відсадки - ■Трива- •' ДІСТЬ ЖИТТЯ ( МІС.)

всього на 1 самицю ВСЬОГО на 1 ПОГОН ВСЬОГО на 1 . ПОГОН СПІВ- . відношення о:о '•

F1 ч 44 131 3,2+0,2*** 580 4,4+0,1** 358 2,7+0,2 1,1 12,7+0,3

к 40 167 4,2+0,2 799 4,8+0,1 466 2,8+0,1 1.0 13,4+0,3

F2 ч 35 116 3,3+0,2* 468 4,0+0,2** 284 2,4+0,3 1,3 13,1+0,4 .

к . зо 127 4,2+0,3 623 4,9+0.1 308 2,4+0,3. 1,2. 13,6+0,4.

F3 ч 32 96 3,0+0,3*** 386 4,0+0,1** 221 2,3+0,4 1,4 . із,8+о,з:

к 24 119 4,9+0,2 548 4,6+0,1 322 2,7+0,3 1,2 13,8+0,4

* р>0,95 **р>0,99 ***р>0,999

Проведений аналіз фертильності самиць різного віку показав, що в віці до 1 року дві третини самиць (К) і (Ч) залишаються плідними 1 дають погони, Таким чином, зниження кількості погонів за репродуктивний період життя у самиць (Ч) не пов’язано

з передчасною втратою фертильності, а обумовлено нижчою частотою вагітностей в порівнянні з тваринами (К).

Відомо / Шевченко, Померанцева, 1985, Померанцева и др., 1990, Балонов и др., 1992/ що подібний ефект може.

обумовлюватися зростанням рівня до- або післяїмплантаційних втрат в потомстві тварин, які перебували під впливом Іонізуючого опромінення. Тому, наступним етапом досліджень стаз аналіз ембріональних втрат в потомстві мишей лінії ССЬТ^/Му з чорнобильської експериментальної популяції.

КІЛЬКІСТЬ ІЙГ ФЕРТИЛЬНИХ

самиць (У.)

ш- к ш- ч

«- р>0/95 »»- р>0,99

Мал.2. Порівняльна плідність за кількістю лінії СС57У/Му з чорнобильської (4) експериментальних популяцій.

КІЛЬКІСТЬ погонів ПРОТЯГОМ ЖИТТЯ

погонів у самиць та київської (К)

3. Аналіз ембріональних втрат в потомстві ряду поколінь милей ліні! ОС57И/Му з чорнобильської експериментальної популяції. При порівняльному дослідженні рівня ембріональних втрат виявилося (табл.З), що у мишей з (Ч) доімплантаційна загибель ембріонів достовірно вища (10-12%) того ж показника в контрольних схрещеннях (4-5%). Таким чином, рівень доімплан-таційної загибелі нащадків опромінених мишей генотипу СС57У/Му

стає співставимим з таким показником для мишей генотипу ВАІ-В/с. За показником постімплантаційної загибелі ембріонів дані, отримані в схрещуваннях трьох поколінь тварин з обох експериментальних популяцій, не відрізнялись. Отже, зміни в показнику доімплантаційних втрат виявилися "Індикатором" генотоксичного впливу хронічного Іонізуючого опромінення в малих дозах на репродуктивну функцію мишей лінії СС57ї/Му.

Подібний ефект може зумовлюватися втратою здатності до запліднення частиною статевих клітин внаслідок дестабілізації геномів гамет. Для відокремлення внеску гамет самців та сє^иць в рівень ембріональних втрат було здійснено синхронні міжпопу-ляційні схрещування (табл.З). Незалежно від покоління 1 статі мишей з (Ч) рівень доімплантаційної загибелі їхнього потомства був достовірно вищий контрольного (4-5%) 1 складав 10-12%. Постімплантаційні ж втрати виявилися стабільними але дещо нижчими когтрольного рівня 1 значно меньшими в порівнянні з цим показником у випадку схрещування тєарин, які належали до чорнобильської експериментальної популяції . Але стабільність цього показника для трьох поколінь тварин а обох експериментальних популяцій 1 відсутність розбіжностей за цією характеристикою при внутрішньопопуляційних паруваннях мишей робить правомірним висновок: присутність рецесивних леталей являє гене-

тичне навантаження Інбредно! лінії мишей СС57И/Му.

Залежність рівня доімплантаційних втрат в потомстві трьох поколінь самців від стадії, до якої проходив сперматогенез в умовах експозиції тварин в Чорнобильському спецвіварії, представлено на мал.З. Стабільність цього показника (9-13%), на нашу думку, свідчить про наявність генотоксичного ефекту хронічного Іонізуючого опромінення в малих дозах на стадіях сперматогенезу, які передують формуванню стовбурових спермато-гоніїв.

. Ми прийшли до висновку, що генотоксична дія опромінення реалізується в умовах нашої модельної системи до початку стадій формування стовбурових сперматогоніїв у самців 1 до настання статевої зрілості у самиць. У зв’язку з цим було проведено серію експериментів (табл.4). Рівень доімплантаційних втрат у самиць, народжених в чорнобильському спецвіварії, складав 11-12% незалежно від популяційної належності їх батьків, в той час, як аналогічний показник для самиць, які народилися в

- І1 -

Таблиця 3. Ембріональна загибель потомства самців та самиць лінії СС5’Л//Му при міжпопуляційних схрещуваннях .

Поко- ління Тип схрещування Кількість .вагітних. самиць Кількість в аналізі Загибель зародків (7.)

самиця X самець її Т М І Ж Е до імплантації після імплантації

Ч ч 15 129 114 72 11,6+2,8* 36,8+5,7

ч к 14 139 121 90 12,2+2,8* 25,6+4,0

Р1 к ч 104 964 872 612 9,5+1г0** 29,8+1,5

к к 29 256 246 170 4,5+1,3 ЗО,6+2,9

ч ч 15 146 131 77 10,3+2,3* 41,2+4,3

ч к 18 157 137 90 12,7+2,7* 34,3+1,4

ГС к ч 136 1315 1152 778 12,4+0,9*** 32,5+1,4

к к • 20 186 177 106 4,8+1,5 40,0+3,7

ч ч 17 162 145 82 10,5+2,4* 43,4+4,1

ч к 24 224 201 140 10,3+;2 , 0* 30,4+3,2

РЗ к ч 112 1071 966 634 9,3+0,9** 34,4+1,5

к к 35 304 289 182 4,9+1,2 37,0+2,8

К - миші лінії СС57У/Му з київської експериментальної популяції; Ч - миші лінії СС57а'/Му з чорнобильської експериментальної популяції; ЖТ - жовті тіла в яєчниках, МІ

- місця імплантації в рогах матки, ЖЕ - живі ембріони. *р>0,95, **р>0,99, ***р>0,999

таціині

втрати

<н>

1 — спЕрматозоі'Зм та спЕрматмЗн

2 - спЕрматоцкти 2 поряЗку

, 3 - спЕрматоцнтм 1 поряЗку

4 - стойбуробі спЕрматогонії Мал.З. Доімплантаційні втрати в потомстві самців мишей лінії СС57^/Му з чорнобильської ' експериментальної популяції відповідно стадії, до якої проходив сперматогенез в чорнобильському спецв1 варII.

"чорнобильських" родинах, але в умовах київського віварію, не відрізнявся від контрольного (4-5%).Засновуючись на отриманих даних ми прийшли до висновку, що генотоксична дія хронічного Іонізуючого опромімення в малих дозах реалізується на стадіях закладання, поділення 1 визрівання жіночих гоноцитів протягом ембріонального розвитку самок 1 в ранній постнатальний період

- час початку визрівання ооцитів. При дослідженні ембріональних втрат в потомстві 3,5-5м1сячних самців, пренатальний розвиток і лактація яких проходили у спецвіварії м.Чорнобиля в родинах, зформованих із статевозрілих тварин київської експериментальної популяції, виявилося, що рівень доімплантаційної загибелі їхніх нащадків (6-7%) близький до контрольного показника. За умов проведення нашого експерименту в заплідненні яйцеклітин Інтактних самиць СС57"»//Му (К) брали участь сперматозоїди "чорнобильських" самців, гаметогенез яких, починаючи зі стадії сперматогоніїв А1 проходив в київському віварії. Отже, в умовах нашої модельної системи критичним періодом при форму-

Таблиця 4.

Аналіз чутливості первинних статевих клітин (на стадіях розмноження та росту) до хронічної дії іонізуючого опромінювання в малих дозах за показником доімплан-таційних втрат в потомстві мишей лінії СС57\І/Ш з київської (К) та чорнобильської (4) експериментальних популяцій.

Популя-Умови утри- Стать Віварій,в Популя- Кіль- Кількість Ембріональні втрати

ційна мання Р1 з якому го- ційна кість (%)

прина- моменту зап- ноцити прина- Еагі- Ж Т МІ ЖЕ

леж- ліднення до проходили лежність тних до після

ність закінчення стадії ви- партнера самиць Імплантації '

родин періоду ла- зрівання в схре-

РоРо ктації і росту щуванні

К К • самка к к 20 186 177 106 4,8+1,6 40,1+3,7

К Ч Ч к 19 165 146 95 11,5+2,5* 34,9+3,9

К Ч самець к к 64 610 570 362 6,6+1,0 36,5+3,7

Ч К самці та к внутрішньо- 14 129 123 79 4,7+1,9 35,8+4,3

самиці групові

Ч Ч ч _ и _ 15 129 114 72 11,6+2,8* 36,8+5,7

К - приналежність мишей лінії СС57У до київської експериментальної популяції, умови утримання у київському віварії ІМБ1Г АН України.

Ч - приналежність мишей лінії СС57У до чорнобильської експериментальної популяції, умови •• утримання в спецвіварИ ІМБ1Г АН України в м.Чорнобилі. ' - ...

ЖТ - жовті тіла в яєчниках, МІ - місця імплантації, ЖЕ - живі ембріони.

*р>0,95 ,

ванні статевих клітин самців є стадії стовбурових спермато-гоніїв А1-А4 в сперматогенному епітелії, який за останніми даними /Vergounfen et al., 1990, Агарков и др., 1991/ є найбільш радіаційно чутливим у сім'янику Сто може бути підтвердженням наших висновків).

Таким чином, зниження плідності та продуктивності мишей генотипу CC57W/MV э (Ч) обумовлено зростанням в 2-3 рази рівня доімплантаційних втрат. Але на рівень доімплантаційних втрат в потомстві опроміненних тварин можуть впливати як пошкодження в генетичному апараті статевих клітин та бластомірів ембріонів, так і фізіологічні, біохімічні та генетичні порушення в системі материнського організму. Вирішення цього питання можливе при проведенні культивування зигот CC57W/MV різної популяційної приналежності до пізніх доімплантаційних стадій з дослідженням динаміки клітинних поділів та формування бластоцист.

4. Аналіз культивування зигот, отриманнях в схрещуваннях мишей лінії OC57V/Mv різного популяційного походження. При

культивуванні зигот CC57W/MV (мал. 4) ембріони контрольної групи (K) успішно розвивалися до стадії бластоцисти і зупинялись у розвитку на стадії зиготи в 3-4% випадків, а на двоклітинній - в 9% випадків (Р>0,99). Для зародків, отриманих від схрещування самця (Ч) і самиці (К) характерна інша тенденція - дроблення достовірно частіше зупинялося на стадії зиготи (13%), ніж на двоклітинній стадії (5%). Але сумарна кількість зупинок була близькою до контрольного рівня (17% і 12%, відповідно). Участь у схрещенні самиці (Ч) з самцем (К) приводила до більш глибоких пошкоджень процесів дроблення. Так само, як і у випадку участі самця (Ч) - різко зростала кількість зупинок розвитку на стадії зиготи (11%). Крім того, спостерігалося істотне збільшення відсотка ембріонів, які зупиняються у розвитку на двоклітинній стадії (20%).Таким чином, хронічне (протягом неонатального розвитку) опромінювання в малих дозах мишей обох статей дає свій внесок у порушення проходження стадій доімплантаційного ембріогенезу нащадків. Найвищі ж втрати при культивуванні фіксувалися для зигот, отриманих від обох опромінених батьків, тобто спостерігалося складання ефектів опромінення. , .

. Аналогічні за наслідками результати (мал. 5) було отримано

1

зароЭок

¿-КЛ. OiliCTO-

зароЭок циста

і

оласто-

цмста

іил схрЕщубаннд Р К* К а КхЧ П ЧхК

а чхч

Зоімпгіантзціині с т э. д І Ї

Мал.4. Успіх культивування зигот CC57W/Mv різного популяційного походження.

при культивуванні контрольних гомо- та гетерозигот генотипів С57В1/6, BALB/c, Fl(C57BlxBALB) і Fl(BALBxC57Bl): наявність

материнського генотипу BALB/c значно знижувала життєздатність зародків при культивуванні, найвищий же рівень доімплан-таційних втрат було зафіксовано для гомозигот BAL.B/C. Таким чином, нами було показано, що зниження плідності мишей лінії CC57W/MV з (Ч) за різними характеристиками в системах in vivo та in vitro співпадає з описаними нами міжлінійними відмінами таких характеристик у батьківських ліній BALB/c і С57В1/6. Отже, успішне проходження доімплантаційного ембріогенезу забезпечується генотипІчними факторами геному зародка, а порушення чи дестабілізація геномів гамет можуть впливати на зародкові клітинні лінії у тварин 1 передаватися нащадкам, як постійний стан генетичної структури.

Відомо, що зародки миші можуть суттєво відрізнятися за кількістю бластомірів, знаходячись на одній стадії розвитку /Whitten, Dagg, 1962/. На процеси раннього ембріогенезу

кількість лг зупинок у рообмтку Е1Г зароЗкіб (X) 5Г1

ЧГ

аг

ЕГ

10-

Аіш.

і е а м 5 зигота

і е з ч з

2кл.заро0ок і

O- BALB/c епа- С57В1/6 зЕЗ- CC57W/MW ЧЕр- F1CC57B1XBALB: SEI- F1<BALBxC57B1:

І Е 3 *t 5 , ЛІНІЯ МИШЕЙ

отаЗі'і розвитку зигот & культурі

2кл.зароЗок бластоциста бластоциста

t

Мал.Б. Лінійні особливості рівня доімплантаційних втрат при культивуванні ембріонів зі стаді І -зиготи

суттєво впливають рівні кількісні та структурні хромосомні аберації /Dyban, Baranov, 1987/.. Однак, при збереженні бластомірами життєздатності нормально здійснюються процеси формування бластоцисти. Тому можна було припустити, що хронічне опромінювання статевих клітин in.vivo призведе до загального пригнічення швидкості клітинного поділу зародків, яке мало б проявлятися на всіх стадіях доімплантаційного ембріогенезу. За нашими даними (табл.5) кількість клітин у бластоцистах, культивованих in vitro зі стадії зиготи, не відрізнялася за генотипічною (стосовно популяційної належності) ознакою. Число клітинних ПОДІЛІВ у всіх досліджуваних груп ембріонів виявилось подібним. Отже, зупинки дроблення на одно-та двоклітинній стадіях, які ми спостерігали, не можуть пояснюватися загальним неспецифічним пригніченням процесів поділу клітин ембріонів під впливом хронічного опромінювання батьків.’ Однією з можливих причин дефектів процесів дроблення ембріонів можуть бути різноманітні цитогенетичні пошкодження,

- 17 - .

Таблиця Б, Цитологічний аналіз бластоцист, які розвивалися в культурі зі стадіІзиготи протягом 96-102 годин.

Типи гамет за популяційною приналежністю донорів £ х <У Всього бластоцист в аналізі Кількість на один зародок

клітин М1Т03ІВ ПІКНОЗІВ

К К БО 45,3+2,5 1,9+0,2 0,2+0,1

К Ч 77 48,0+2,1 2,5+0,3 0,5+0,1

Ч К 54 БО,1+2,9 2,5+0,4 0,4+0,1

Ч Ч 60 48,0+2,5 2,0+0,2 0,5+0,1

К - київська експериментальна популяція мишей лінії СС5гЛ//Му

Ч - чорнобильська експериментальна популяція мишей лінії ССБТО/Му

які здатні призводити до дестабілізації геному генеративних та соматичних клітин.

5. Аналіз каріотипічної стабільності соматичних клітин мишей 0С57И/Му з чорнобильської та київської експериментальних популяцій. Для з'ясування впливу хронічного Іонізуючого опромінювання в малих дозах на каріотипічну стабільність геному мишей лінії СС57У/Ш нами було здійснено порівняльний аналіз параметрів цитогенетичноІ мінливості в клітинах кістковоггі мозку тварин з (К) та (Ч) популяцій. Отримані дані наведені в табл.6 1 свідчать про те, що хронічне Іонізуюче опромінювання в малих дозах призводить до глибокої дестабілізації генетичного матеріалу. Так, в групі (Ч) достовірно менша, ніж в контрольній, частка метафазних пластинок з диплоідним числом Хр 2п=40 (при розрахунках з урахуванням різних варіантів анеуп-лоїдії). Статистично достовірно вросла поява поліплоідних клітин у кістковому мозку тварин дослідної групи. В цих клітинах спостерігається також підвищена частота міжхромосомного злиття за типом робертсонівських транслокацій, різко зросли відносно контрольної групи частоти метафаз з хромосомними абераціями (хроматидні розвиви, делеції, фрагменти, кільцеві Хр) і з порушеною синхронністю розщеплення центромірних районів

Таблиця 6.

Характеристики карістипічноі мінливості в клітинах кісткового мозку мишей лінії СС57У/Му з чорнобильської (Ч) та київської (К) експериментальних популяцій.

Каріоти- Число Число Число Число метафаз (7.) Всього

пічні метафаз метафаз полі- ------------------------------------------ метафаз

характе- 2п-40 з плоідів з асоці- з АРЦХ з аберра-

ристики А-1 А-2 А-1 А-2 А-1 А-2 аціями ціями

(2) (X) (X) Хр Хр

1 50 . 65 36 17 14 18 13 9 4 103

2 62 76 25 11 11 13 10 6 5 100

3 59 71 ЗО 15 11 13 12 13 7 104

4 44 54 40 27 16 19 19 16 '5 37

(Ч) 5 60 73 25 8 15 19 17 19 5 84

6 60 65 27 20 13 14 11 11 8 75

7 51 51 36 24 14 16 9 6 7 101

8 56 61 24 15 20 23 10 7 3 72

9 51 66 37 18 12 16 16 14 8 49

середня 55+2 65+3 31+2 17+2 14+1 17+1 13+1 • 11+1,6 5,8+0,7

1 64 77 27 12 9 11 6 2 2 100

2 72 78 15 8 13 14 13 0 0 39

3 65 76 27 14 9 10 11 1 0 84

(К) 4 72 82 20 9 8 9 10 0 0 51

5 72 83 22 9 7 8 7 0 2 134

6 74 89 24 8 2 2 11 - 0 0 100

7 • 67 81 28 12 5 6 13 2. 2 130

середне 69+1 81+2 23+1 10+1 8+1 9+1 10+1 0,7 0,9

хроматид (АРЦХ).

Феномен АРЦХ в клітинах кісткового мовку мишей з (К) зустрічався в середньому не більше, Ніж у 1% метафазних пластинок. В клітинах кісткоеого мозку тварин (Ч) частота стрічання метафаз з АРЦХ істотно вища. Варто очікувати, що саме ця характеристика цитогенетичкої нестабільності піддається менш жорстокому добору на передмейотичних і мейотичних стадіях поділу генеративних клітин і вносить більший внесок в патологію клітинного поділу ембріонів на ранніх стадіях розвитку, ніж такі параметри, як анеуплоідія і міжхромосомні асоціації. Очевидно, що збільшення частоти поліплоідізаціІ клітин за будь-яким механізмом також може призводити до появи дефектних гамет та порушеннь проходження ранніх етапів ембріогенезу.

ВИСНОВКИ

1. Запропоновано нову модельну систему для виечєння ге-ном-дестабілізуючого впливу хронічного низькодозового опромінення на ряд поколінь ссавців. II основу складають миші трьох інбредних ліній' - CC57W/Mv, C5VBL/6, BALB/c. Оскільки генотип мишей CC57W/MV є похдним від батьківських - BALB/c та С57В]/б - стає можливим виділення з феноменологічних ефектів генотиксичної дії мутагенів генотипічних та епігенетичних аспектів на організменому, клітинному та молекулярно-генетичному рівнях. ■ ■

2. Показано достовірно знижену плідність трьох послідовних поколінь фертильних самиць лінії CC57W/MV з чорнобильської експериментальної популяції за Показниками "кількість погонів протягом життя" та "кількість народжених в погоні".

3. Встановлено, що зниження плідності мишей CC57W/MV з чорнобильської експериментальної популяції Пов’язано в значній мірі Із зростанням в 2-3 рази рівня доімплантаційних втрат.

4. При хронічному низькодозовому опроміненні в умовах зап-

ропонованої модельної системи критичним періодом при формуванні та визріванні ооцитів мишей лінії CC57W/MV є ембріональний період розвитку організму, а при формуванні статевих клітин самців - стадії стовбурових сперматогоніїв А1 - А4 в сперматогенному епітеліІ. •

5. В експериментах in vitro показано, що опромінення мишей інбредної лінії CC57W/MV протягом неонатального розвитку

призводить до порушень доімплантаційних стадій ембріогенезу нащадків. Для ембріонів, отриманих від схрещування обох оп-роміненеих батьків, зафіксовано найвищій рівень доімплан-таиійної загибелі на всіх контрольованих стадіях.

6. В клітинах кісткового мозку мишей генотипу CC57W/MV під впливом хронічного Іонізуючого опромінювання в малих дозах спостерігаються зміни каріотипічних характеристик , які можуть лежати в основі порушень раннього ембріонального розвитку.

7. Показано, що зниження плідності хронічно опромінюваних мишей лінії CC57W/MV за рівними показниками в системах in vivo та in vitro співпадає з міжлінійними відмінами таких характеристик у батьківських ліній BALB/c і С57В1/6. Це свідчить про можливість реалізації генотсксичної дії хронічного Іонізуючого опромінення в малих дозах на епігенетичному рівні.

Список роб 1т.опубл1кованих за темою дисертаціІ

1. Столина М.Р., Морозова Л.М., Соломко А.П. Оптимизация системы для проведения генетико-эмбриологических исследований на инбредных линиях мышей. 1. . Сравнительная оценка сезонной плодовитости самок мышей линий BALB/cLac, С57В1/6j и ICR // Биополимеры и клетка. -1992. -8. -N2. -С.49-52.

2. Морозова Л.М., Столина М.Р., Соломко А.П. Оптимизация системы для проведения генетико-эмбриологических исследований на инбредных линиях мышей. 2. Сравнение способности к оплодотворению in vitro у инбредных линий мышей C57Bl/6j и BALB/cLac // Биополимеры и клетка. -1992. -8. -N3. -С.33-36.

3. Соломко А.П., Столина М.Р. Генетические эффекты у самцов чернобыльской популяции лабораторных мышей CC57W/MV, индуцированные малыми дозами сочетанного облучения // Тез.докл. конференции СНГ "Актуальные проблемы влияния ионизирующих излучений на репродуктивную функцию. -Обнинск. -1992. -С.67.

4. Столина М.Р., Соломко А.П. Анализ репродуктивной функции

самок лабораторных мышей CC57W/MV из чернобыльской и киевской популяций // Тез.докл. конференции СНГ "Актуальные проблемы елияния ионизирующих излучений на репродуктивную функцию. -Обнинск. -1992. -С.69-70. .

5. Solomko А.Р., Stolina M.R. Effect of low doses of radiation on fertility of CC57V mice // 1-th Conf."Medical consequences of the Chernobyl accident" (Kiev,1992). Proc. K0L1SKA Found. -1993. -Nl. -P.19.

6. Столина М.Р. Влияние хронического действия низких доз сочетанного внешнего и внутреннего излучения на репродуктивную функцию >самцов и самок мышей линии СС57У/Му // Биополимеры и клетка. -1993. -9. -N3. -С.49-52.

7. Столица М.Р., Соломко А.П., Глазко Т.Т. и др. Влияние

малых доз хронического ионизирующего излучения на ранние этапы эмбриогенеза у мышей // Докл.АН Украины. -1993. -N6.

-С.171-176.

3.Столина М.Р., Соломко А.П. Влияние малых доз сочетанного ионизирующего излучения на доимплантационную гибель зародышей мьпаей СС57У //Тез.докл.Радиобиологического съезда (Киев, 1993). -Пущино. -1593. -Ч.З. -С.964-965. -

9. Глазко Т.Т., Столина М.Р., Соломко А.П. и др. Кариологические изменения в клетках костного мозга мышей линии СС57У, индуцируемые низкими дозами ионизирующего излучения // Тез.докл. Радиобиологического съезда (Киев, 1993). -Пущино. -1993. -4.1. -С.233-234.

Підписано до друку Об.О^.^р Формат 60x64/16 .. Папір друк.Умов, друк, л. І.О. Тираж .100 примірник. Заказ К*598

Надруковано ЦУОП ДНПП "Плодвинконсерв" и. Київ, Саксаганського , І