Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая реконструкция ядра и циоплазмы Brasslca oleracea L. с помощью слияния протопластов.

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая реконструкция ядра и циоплазмы Brasslca oleracea L. с помощью слияния протопластов."

Oto 01 НАЦІОНАЛЬНА АКАДШІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

На правах рукопису УДК 575.222.75+573.6+582.63.2

Нітовська Ірина Олександрівна

ГЕНЕТИЧНА РЕКОНСТРУКЦІЯ ЯДРА ТА ЦИТОПЛАЗМИ BRASSTCA OLERACEA L. ЗА ДОПОМОГОЮ ЗЛИТТЯ ПРОТОПЛАСТІВ.

03.00.25 - "клітинна біологія" .

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

Киї б 1997

Роботу виконано у відділі клітинної селекції Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Науковий керівник - член-кореспондент НАН України та

УААН, доктор біологічних наук

■ В.А. Сидоров

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук Б.О. Левенко '

кандидат біологічних наук

С.І. Копнова

Провідна організація - Інститут молекулярної біології та

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.19.01 Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за = адресою: £52143, Київ-143, вул. Заболотного, 148.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України.

Автореферат розіслано р

Виконуючий обов’язки вченого секретаря

спеціалізованої ради, . ^

генетики НАН України, Київ

Захист відбудеться

.1997 р. 0 ____________________________________________________ГОД.

доктор біологічних наук

Л.Ф.Горовий

Актуальність теми. Впровадження в сільське господарство нетрадиційних технологій, які дозволили 0 підняти на новий рівень виробництво необхідних для людини продуктів харчування, є нагальною проблемою. Селекційний процес - це використання Існуючої генетичної мінливості у культурних видів рослин з метою покращення їх характеристик. В результаті зменшення генетичної різноманітності, стає малоефективним подальше якісне покращення сортів рослин методами традиційної селекції. Використання біотехнологічних методів, таких як соматична гібридизація, генетична трансформація, могло б привести до збаїачення генофонду культурних рослин

і, як наслідок, значного розширення можливостей традиційної селекції. '

Соматична гібридизація дозволяє-долати бар’єри статевої несумісності при міжвидових схрещуваннях та залучати до селекційного процесу філогенетично віддалені види. Як правило, для покрз щення існуючих сортіЕ, ВаМЛІІЕІІМ є перенесення від одного виду до Іншого тільки небагатьох корисних для селекційного процесу генів (ознак). Тому, найбільш привабливим є отримання асиметричних гібридів, які мають тільки частину генів іншого виду.

За допомогою соматичної гібридизації, на відміну від статевої, можливе поєднання не тільки ядерних, але й цитоплазматичних геномів. Відомо, що геном органел може код'/Еати ряд важливих в практичному відношенні ознак, таких як стійкість до патотоксинів та гербіцидів, температурна толерантність, чоловіча стерильність та ін. (Месіеуегу. 1990). Також встановлено, що цитолазматичний геном впливає на широкий спектр морфофізіологічних ознак рослини

(Давыденко. 1989, Medgyesy, 1990, Зиноватная и др.. 1996), в тому числі на господарсько цінні. Отже, розширення плазмофонду культурних рослин може мати значення для практичної селекції. Створення цитоплазматичних гібридів (цибридів), які поєднують геном культурного виду та цитоплазму інших видів, дозволяє не тільки перенести плазмогени інших видів, але і зберігти в таких рослинах пов’язані з ядерним геномом сортоспецифічні ознаки культурного пилу.

Капуста білокачанна (Brassica oleracea L. var. capitata L.) є однією із головних овочевих культур в Україні. Сорти ранньостиглої капусти білокачанної, які використовували в дослідженнях, мають високу продуктивність, але характеризуються слабкою холодостійкістю та схильністю до різних захворювань (кила капусти, судинний бактеріоз, фузаріоз). Розробка нових нетрадиційних технологій капусти дозволить, розширюючи генофонд В.oleracea L., отримати принципово новйй рослинний матеріал, який можна буде використати при створенні сортів капусти з високою продуктивністю та стійкістю до несприятливих факторів навколишнього середовища.

Мета та завдання роботи. Метою роботи було отримати асиметричні соматичні гібриди і цибриди між капустою та спорідненими і віддаленими видами родини Brasslcacea та дослідити їх генетичну конституцію. 1 •

Згідно з поставленою метою, в завдання дослідження входило:

1. Підібрати умови виділення, культивування протопластів та регенерації з них рослин Brassica oleracea L. var. capitata L. '

2. Отримати пластомні хлорофілдефектні мутанти капусти для

подальшого використання в експериментах по соматичній гібридизації. '

3. Створити асиметричні соматичні гібриди та цибриди капусти

. - з - .

з різними представниками родини Brasslcacea. ■

4. Провести аналіз ядерного та цитоплазматичного геномів отриманих гібридів. •

Наукова новизна. Вперше отримано хлорофілдефектні мутанти капусти.

Вперше для селекції соматичних гібридів в родині Brasslcacea застосовано ефективну клітинну технологію, яка базуєтьться на використанні хлорофілдефектних мутантіЕ; використання цієї технології дозволило спрямовано отримувати гібридні рослини калусти з пластомом Brassica napus L., Arabldopsls thallana L.., Capselia bursa-pastorls L. '

Запропоновано систему селекції соматичних гібридів між видами родини Brasslcacea, яка не потребуе присутності селективних генетичних маркерів у вихідному рослинному матеріалі та базується на подвійній Інактивації протопластів донора перед злиттям.

. Вперше отримано міжтрибні - соматичні гібриди Brasslaі

оіегасеа L. + Arabldopsls thallana та Brassica oleracea L. + Capselia bursa-pastorls L, а також цибриди, що містять ядерний геном В. oleracea та хлоропласти A. thallana. ■ '

' За допомого» рестриктного аналізу мітохондріальної ДНК показано, що всі отримані гібриди мали перебудований мітохондріальний геном. Зміни хондріому всіх гібридів В. oleracea + A. thallana мали однаковий характер.

Практична цінність роботи. Запропонована схема селекції соматичних гібридів з використанням хлорофілдефектних мутантів дозволяє отримувати гібриди капусти з цитоплазматичними генами інших видів, що робить можливим залучення до селекційного процесу плаз-мофондів споріднених 1 віддалених видів родини Brasslcacea. Розроблені підходи отримання гібридів за допомогою злиття прото-

- 4 - .

пластів дозволяють значно збагачувати генофонд капусти білокачанної та створювати унікальний в генетичному відношенні рослинний матеріал.

Одержані асиметричні соматичні гібриди кгШусти з Brassica нарив L., Arabldopsis thallaría L. та Capsella bursa-pastopís L. можуть бути використані в клітинній технології для отримання нових форм рослин. Іертпльні гібриди Brassica oleracea L. var. capitata L. + Brassica napus L. var. oleífera DC. можуть бути безпосередньо використані в селекційно-генетичних дослідженнях по капусті та ріпаку.

Гібридні рослини передані е інститут овочівництва та баштанництва УААН і Український державний аграрний університет для вивчення можливості їх екліочєння у селекційно-генетичні дослідження.

На захист виносяться положення.

1. Запропоновано клітинні технології в родині Brasslcacea для отримання унікального рослинного матеріалу, що може бути корисним в селекції капусти.

2. Експериментально доказано, що використання розроблених технологій дозволяє поєднувати генетичний матеріал споріднених і віддалених видів рослин родини Brasslcacea та отримувати гібридні рослини з реконструйованими ядерним і цитоплазматичним геномами.

3. Створено асиметричні соматичні гібриди капусти; Brassica

oleracea L. + Brassica napus L., Brassica oleracea L. + Arabldopsis thaliana L., Brassica oleracea L. ' + Capsella bursa-pastorls L. '

Апробація роботи. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на 7-й Міжнародній школі по вивченню онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії (Львів, 1994), Міжнародному симпозіумі по біотехнології

- 5 - .

та генетичній Інженерії рослин (Київ, 1994), III Російському симпозіумі "Новые методы биотехнологии растений" (Путино, 1995), 8-ій Міжнародній конференції по вивченню онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії (Київ, 1995), Міжнародній конференції Plant Genome IV (San Diego, 1996), 10 Міжнародному конгресі Федерації Европейських Товариств

Фізіологів Рослин (Florence, 1996), а також на наукових семінарах відділів клітинної селекції та цитофізіології 1 клітинної інженерії Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України. • .

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 робіт, список яких наведено в кінці автореферату.

Структура іа обсяг роботи. Дисертація складається Із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення, висновків та списку цитованої ■літератури, який містить 255 бібліографічних посилань. Робота викладена на 181 сторінках машинопису, включає 5 таблиць, 44 малюнка. ' .

ЦАТЕРІАЛИ ТА ІІЕТОЕИ

У дослідах використовували види родини Brasslcacea.

1. Капуста білокачанна, Brassica oleracea L. var. capitata

L. (2n-18), ранньостиглі культурні сорти Димерська, Зорінка та сорт німецької селекції Dithmarscher Früher (Каталог мировой коллекции, вып. 221, 1978). Насіння отримане на Сквирській се-

лекційній станції Інституту овочівництва та баштанництва УААН.

2. Пластомний хлорофілдефектішй мутант Brassica oleracea L. var. capitata L., отриманий на основі сорту Dithmarscher Früher.

і- 1-Î2

3. Ріпак, Brassica париs L. var. oleífera DC. (2n-38), сорти Клітинний 1 та Forte. Насіння люб’язно надане академіком УААН В.Ф. Пересипкіним (Українській державний аграрний університет).

4. Дикий вид арабідопсис, Arabldopsls thallaría L. cv.

Columbia (2n-10). ,

5. Дикий вид грицики, Capselia bursa-pastorls L. (2n-l6).

Рослини вирощували в асептичних умовах на модіфікованому

Т'езгормональному середовищі М3 (Murashige and Skoog, 1962) при 16-годинному світловому фотоперіоді, освітленні 3000-4000 лк та температурі 23-25°С. Розмножували живцюванням.

В дослідах по мутагенезу використовували насіння трьох сортів капусти, яке обробляли водним розчином N-нітрого'И-метилсечо-вини (НМС) протягом 18 годин. Строкаті форми рослин розхимерювали живцюванням або через культуру протопластів.

Мезофільні протопласти виділяли за вдосконаленою методикою (Сидоров и др., 1985).‘ Перед злиттям протопласти донора (B.napus,

A.thallana, чи С.bursa-pastor Is) ї-опромінювали дозою 1000 Гр (Со60, 83 Гр/хв). . '

Злится протопластів проводили за методикою Менцеля (Menczel et al., 1981), модифікованою стосовно умов експерименту.

Протопласти культивували у рідкому поливному середовищі SW (Sidorov et al., 1987) з використанням методу імобілізації клітин у алгінат кальцію. Для регенерації рослин із клітинних колоній використовували тверде поживне середовище MS зі зниженим рівнем цукрози (1%), яке містило 0,5 мг/л БАЛ та 0,1 мг/л НОК. ;

Селекцію гібридних колоній проводили за ДБома схемами (мал. 1, 2). Згідно з першою схемою, як реципієнт чужинних генів використовували мезофільні протопласти отриманих пластомних хлорофіл-дефектних мутантів капусти (мал. 1). Селекція гібридних колоній

РЕЦИТОСНТ ДОНОР

ЯДРО О О

ХЛОРОПЛАСТИ о о

РШПЮНТ МУТАНТНИЙ ТИП

ДОНОР

дикий тип

АСИМЕТРИЧНИЙ ПБРИД МУТАНТНОГО ТИПУ .

АСИМЕТРИЧНИЙ

ПБРИД

ДИКОГО

ТИПУ

ЦИБРИД

ДИКОГО

ТИПУ

“*я 1- СХЕМА СЕЛЕКЦІІ АСИМЕТРИЧНИХ ГІБРИДІВ

ТА ЦИБРИДІВ З ВИКОРИСТАННЯМ ПЛАСТОМНИХ ХЛОРОФІЛДЕФЕКТНИХ НУТАНТІВ РОСЛИН.

РЕЦИПІЄНТ ДОНОР

ЯДРО 0 о

ХЛОРОПЛАСТИ • о *бо51г

формування зелених копомй НА СЕЛЕКТИВНОМУ СЕРЕДОВИЩІ

МАа 2. СХЕМА СЕЛЕКЦІЇ ІІИБРИДШ ПРИ ВИКОРИСТАННІ ПОДВІЙНОЇ ІНАКТИВАЦІЇ ПРОТОПЛАСТІВ ДОНОРА.

базувалась на відновленні у них фотосинтетичної здатності, за рахунок перенесення хлоропластів донора.

Згідно з другою схемою (мал. 2), використовували подвійну інактивацію протопластів донора Sidorov et al. (1994). flit реципієнт було взято вихідні зелені рослини капусти сорту Dithmarscher Früher. Для підвищення частоти пластомних мутацій, протопласти донора після т-опромінення обробляли летальними дозами мутагену НМС (5мМ водний розчин, 1 година). Селекцію гібридних протоклонів проводили за здатністю зеленіти та/чи рости на регенераційному середовищі, ' що містило 1 г/л стрептоміцинсульфату.

■ Рослини-регенеранти укорінювали на безгормональному середо-

вищі М3, висаджували у грунт.

Цитогенетичний та біохімічний аналізи гібридних рослин проводили за загально прийнятими методиками (Биохимический анализ в клеточной биологии растений - Киев. - 1988. - Препринт/АН УССР,

Институт ботаники; 88.1).

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

1. Культивування протопластів Brassica oleracea var. сарі tata.

Для успішного проведення експриментів по соматичній гібридизації, необхідною умовою є наявність ефективної методики культивування протопластів та регенерації рослин із протоклонів. ;

У представників роду Brassica регенерація рослин із протопластів залежить від генотипу та умов культивування (Bidney et al. 1983, Glimelius 1984, Barsby et al. 1986, Choung et al. 1987b, Pelletier 1990). Таким чином, першочерговим завданням було

розробити умови культивування протопластів для конкретних сортів капусти білокачанної.

Для виділення протопластів використовували листя 3-4-тижне-вих рослин. Використання рідкого середовища SW, що містило 2 мг/л НОК, 0,5 мг/л БАЛ та 0,2 мг/л 2,4-Д виявилось найбільш оптимальним для поділу протопластів та утворення клітинних колоній.

Застосування фіксації протопластів в алгінатну плівку підв.и- , щувало ефективність їх висіву приблизно у три рази порівняно з культивуванням протопластів безпосередньо у рідкому поживному середовищі. Ефективність висіву протопластів капусти була найбільш високою для сорту Dithmarscher Früher (35-40%), 25-30% для сорту

Дилерська та близько 10% для сорту Зсрінка.

Приблизно через ЗО днів після початку культивування, колонії, які до цього часу досягали близько 0,5-1,5 мм у діаметрі, звільняли від алгінатної плівки та переносили на тверді поживні середовища з різними емістом та концетрацією фітогормонів для індукції органогенезу. Серед близько 50 середовищ, що використовували, регенерацію рослин спостерігали на б (мал. 3). Найбільша частота регенерації для всіх сортів капусти була на середовищі М3, що вміщувало 0,5 мг/л БАЛ та 0,1 мг/л НОК. На цьому середовищі калус не втрачав регенераційної здатності протягом року і довше. • .

Рослини-регенеранти мали морфологію та набір хромосом, характерні для вихідних рослин капусти.

Таким чином, розроблена ефективна методика культивування протоплатів, яка дозволила отримувати нормальні рослини капусти.

• 1КЖ • 1ш ]*• )ЫЛ*)м 1МСЖЧЫЛ 01НСЖ«0»ЬАП

Вв^ит и»1»»шм

М*л.Э. Частот« регенерації рослин капусти Ь ггротоклонів на еарадовищІ МЭ Ь різними концентраціями

фітогормонів (мгУл)

МАЛ 4 ФІЛОГЕНЕТИЧНІ ЗВ'ЯЗКИ МІЖ ВИДАМИ, ЯКІ ВИКОРИСТОВУВАЛИСЬ ' ' в ДОСЛІДЖЕННІ. СТРІЛКИ ВКАЗУЮТЬ НА НАПРЯМОК, В ЯКОМУ

БУЛО ЗДІЙСНЕНО ПЕРЕНЕСЕННЯ ЧАСТИНИ ГЕНЕТИЧНОЇ ІНФОРМАЦІЇ.

- и -

S. Отримання хлорофілдефектних мутантів капусти та їх характеристика.

Використання пластомних хлорофілдефектних мутантів як реципієнтів в експериментах по злиттю протопластів полегшує селекцію гібридів, які мають хлоропласти донора.

Для отримання пластомних хлорофілдефектних мутантів капусти проводили експерименти по мутагенезу насіння. НМС є ефективним індуктором пластомних мутацій (Hagemann et al., 1982). Обробка насіння БмМ розчином НМС практично не впливала на його схожість і життєздатність та індукувала появу мутантних рослин з досить високою частотою (18% для сорту Dithmarscher Früher та 12% для сорту Димерська).

Рослини, які мали переважно мутантне листя з чіткими зонами хлорофілдефектності, розхимерювали живцюванням або через культуру протопластів. Було отримано 4 гсмопластидні хлорофілдєфектні лінії капусти сорту Dithmarscher Früher. Цитогенетичний аналіз показав, що мутантні рослини мали 18 хромосом, що відповідає дипло-їднсму набору хромосом капусти.

Проведення генетичного аналізу мутантів було неможливим через їх нежиттєздатність. Характер дії мутагену (Hagemann, 1982, Hostiska and Hanson, 1984, Fluhr et al., 1985, Сидоров и др., 1990), що використовували, а також поява в першому мутантному поколінні строкатих рослин (фенотип, характерний для пластидних мутацій) вказують на пластомну локалізацію мутації хлорофілдефектності. Крім того, в експериментах по соматичній гібридизації між В.оіегасеа та A. thaliana були регенеровані із зеленого калусу строкаті рослини, які в результаті живцювання дали початок білим

І *

та зеленим рослинам. Рестриктний аналіз хлДНК з використанням рестриктази Ват НІ показав, ідо білі рослини мали хлоропласти капусти, а зелені - арабідопсиса. Це також свідчить про пластомну локалізацію мутації хлорофілдефектності та сегрегацію хлоропласт-тів двох видів після злиття протопластів (Medgyesy, 1990).

Таї™ чином, використовуючи обробку насіння мутагеном;. було вперше отримано та охарактеризовано хлорофілдефектиі мутанти капусти. •

3. Отримання соматичних гібридів з використанням хлорофілдефектних мутантів капусти.

Хлорофілдефектні мутанти були вперше застосовані нами для селекції соматичних гібридів між видами родини Brassicacea.

Використовуючи хлорофілдефектні мутанти капусти, було отримано соматичні асиметричні гібриди в трьох комбінаціях видів, що відрізняються рівнем філогенетичної віддаленості: Brassica oleracea L. + В. napus L., В. oleracea L. + Arabldopsls thallana L., B. oleracea L. + Capselia bursa-pastorls L. (мал. 4). Вибір видів-донорів зумовлювався в першу чергу їх стійкістю до захворювань та несприятливих факторів навколишнього середовища. По-друге, ми вважали важливим оцінити ефективність використання хлорофілдефектних мутантів капусти для перенесення генетичного матеріалу від споріднених і віддалених видів шляхом злиття протопластів та отримання надалі гібридних рослин капусти. ;

З метою Інактивації та перенесення лише частини ядерного геному, протопласти донора опромінювали ї-променями. Гібридні колонії з ядром капусти та-пластомом донорних видів (В.napus,

A. thallana, С.bursa-pastor Is) відбирали за здатністю зеленіти в

умовах освітлення.

Ефективність висіву протопластів після злиття складала £5-40%. Частота утворення зелених колоній була 2-8 %. Проте, в кожному експерименті кількість зелених колоній зменшувалась при подальшому культивуванні протягом місяця. Це може бути пов’язано із загибеллю зелених колоній через незбалансованість геному гібридних клітин або з впливом опромінення на хлоропластний геном донора, що узгоджується з попередніми результатами (Menczel et al., 1987, Bonnema et al., 1992, Bauer-Weston et al., 1993, Skarzhinskaya et al., 1997). Зменшення кількості фотосинтезуючих колоній протягом культивування ln vitro можна пояснити спрямованою сегрегацією пластид на користь хлорофілдефектних хлоропластів В. оіегасеа. Спрямовану сегрегацію хлоропластів після злиття протопластів часто спостерігали в гібридах Brasslcacea (Morgan and Maliga, 1987, Landgren and Gllmelius, 1990, Sundberg and Gllmelius, 1991a, Walters and Earle, 1993, Fahleson et al., 1994a, Bauer-Weston et al., 1994, Forsberg et al.1994). Спрямованість сегрегації хлоропластів може.відображати ядерно-пластидну несумісність (Thanh et al., 1988, Perl et al., 1991, Walters and Earle, 1993). Інші дослідники зазначають, що в клітинах зберігаються хлоропласті! того виду, геном якого переважає у гібридному ядрі (Sundberg and Gllmelius, 1991а, Wolters et al., 199І, 1993), або виду, для якого розроблялись умови культивування протопластів (Forsberg et al. 1994).

В кожній комбінації видів було відібрано від 17 до 89 фотосинтезуючих колоній. Рослини-регенеранти були отримані протягом 2-11 місяців культивування калусів на. регенераційному середовищі.

Для біохімічного аналізу використовували: 1) 2 лінії рослин

В. оіегасеа + В. rtapus (одна лінія отримана на основі ріпака сор-

ту Клітинний 1 - ГКЗ, а друга - при використанні ріпака сорту Forte - TFl); 2) 25 ліній рослин В. оіегасеа + A. thallana-, 3) рослини однієї лінії В. oleracea + C. bursa-pastorls.

Аналіз регенерованих рослин було в першу чергу зосереджено на характеристиці генетичного матеріалу органел, що пов’язано із застосованою схемою селекції гібридів. Геном органел вивчали за допомогою аналізу поліморфізму довжин фрагментів рестрикції, використовуючи головним чином рестриктази Ват НІ і Hind III, а також Eco RI, Eco RV, Sma I, Xba I.

Було показано, що рестриктні спектри хлДНК регенерованих рослин відповідали рестриктному спектру виду-донора, тобто, отримані рослини мали хлоропласти донора. Виключенням був гібрид ГКЗ, у якого було виявлено змінений Eco RI-рестриктний спектр хлДНК.

Таким чином, використання отриманих хлорофілдефектних мутантів капусти виявилось надзвичайно ефективним для спрямованого відбору гібридів з пластомом донора. Особливо це актуально при отриманні гібридів у родині Brasslcacea, оскільки в багатьох опублікованих працях повідомляється про спрямовану сегрегацію хлоропластів на користь хлоропластів Brassica (Landgren and Gllmelius, 1990, Walters and Earle, 1993).

Рестриктний аналіз мтДНК показав, що всі проаналізовані рос- ■ лини мали змінену мтДНК, не характерну для батьківських форм. В рестриктних спектрах мтДНК гібридів було виявлено більшу частину фрагментів, специфічних для В. oleracea, частину фрагментів ви-ду-донора, а також гібрид-специфічні фрагменти. Малоймовірно, щ<3 перебудована мтДНК отриманих рослин могла виникнути в' результаті культивування їл vitro, оскільки в змінених рестриктних спектрах мтДНК були присутні фрагменти, характерні для обох батьківських видів. До того ж, жодного разу не було виявлено змін мтДНК у рос-

- 15 - • •

лин капусти після тривалого культивування ln vitro, а також у хлорофілдефєктних мутантів, отриманих при використанні НМС -сильного Індуктора цитоплазматичних мутацій. Ймовірним поясненням появи у регенерованих рослин перебудованої мтДНК є міжгеномна рекомбінація після утворення гетероплазматичної гібридної клітини (Medgyesy, 1990)*. Відомо також, що віддалені соматичні гібриди Brasslcacea характеризуються високою частотою рекомбінаційних процесів мтДНК (Landgren and Glimelius, 1990, Lelivelt and Krens, 1992, Walters and Earle, 1993, Landgren and Glimelius, 1994).

Всі проаналізовані рослини В. oleracea + A. thallana мали однотипні зміни мтДНК. Рестриктний аналіз мтДНК за допомогою рестриктази Ват НІ еиявив однакові гібрид-специфічні фрагменти у рослин 24 проаналізованих ліній, отриманих в результаті різних експериментів по злиттю протопластів. Гібриди, які мали однакові зміни мтДНК, були ЕИЯЕЛЄНІ в деяких Інших дослідженнях (Kemble et al., 1936, Primard et al., 1983, Landgren and Glimelius, 1994). Поява гібридних рослин з однотипними перебудовами хондріому говорить на користь сайт-специфічної міжгеномної рекомбінації мтДНК (Landgren and Glimelius, 1994). .

Ядерний геном рослин-регенерантів досліджували за допомогою аналізу множинних молекулярних форм ферментів (ММІФ) естерази та пероксидази. Було показано, що всі проаналізовані рослини, окрім двох (В. oleracea + A. thallana, лінії 1А та 1C), мали ізозими естерази та/або пероксидази виду-донора поряд з основними ізозимами В. oleracea. У рослин ліній 1А та 1C були виявлені тільки ізозими В. oleracea. Аналіз ЬШФ гібридів В. oleracea + А. thallana показав, присутність різної кількості Ізозимів Arabldopsls в електрофоретичних спектрах естерази різних гібридних ліній. Таким чином, нами були отримані гібридні рослини ка-

пусти з генетичним матеріалом Brassica napus L., Arabldopsls thallana L., Capselia bursa-pastorls L. s різним ступенем асиметрії гібридного ядерного геному.

Цитогенетичний аналіз отриманих рослин показав, що більшість гібридів мали кількість хромосом, яка перевищувала диплоїдний набір хромосом капусти (2п-18) та була менша за суму диплоїдних наборів хромосом батьків. Гібриди з C. bursa-pastorls не вивчались, оскільки отримані рослини не укорінювались. Серед різноманіття гібридів В. оіегасеа + A. thallana були виявлені рослини, які мали 36 хромосом (лінії 1А, 4А) та 32 хромосоми (лінії 1C, 5С), що

більше за суму диплоїдних наборів хромосом капусти (2п-18) та арабідопсиса (2п-10). Морфологічно хромосоми рослин лінії 1А відповідали хромосомам капусти. Рослини 1А, ймовірно, є цитоплазматичними гібридами (цибридами) з хлоропластами Arabldopsls, перебудованим хондріомом та геномом капусти," що має тетраплоїдний набір хромосом. У міжтрибній комбінації видів родини Brasslcacea цибриди отримані вперше.

Гібридні рослини В. oleracea + A. thallana ліній 1C, 2С, 4С і 5С та В. oleracea + C. bursa-pastorls були аномальної морфології, погано укорінювались. Гібриди, що добре укорінювались, висаджували у грунт. В теплиці всі гібриди росли набагато повільні-• ше, ніж вихідні батьківські форми. Більшість гібридів морфологічно були проміжними між батьками. Гібриди з ріпаком ( лінія ГКЗ) та з арабідопсисом (лінії 1Ä та 4А) були більше схожі на капусту.

У отриманих гібридів спостерігали фенотипічне різноманіття за формою та розміром листків. Деякі гібриди В. oleracea + А. thallana мали на'поверхні листка прості, нерозгалужені трихоми (ознака арабідопсиса). Після висадки в поле гібриди з ріпаком ГКЗ утворили фертильні квітки, морфологічно подібні до капустяних. ' В

результаті самозапилення було отримане насіння. Решта гібридів не дішли до стадії цвітіння, що, можливо, пов’язано з тим, що капуста є дворічною рослиною.

При проведенні експериментів по соматичній гібридизації в комбінації видів В. oleracea + A. thallana було отримано набагато більше гібридних рослин, ніж в комбінаціях видів В. oleracea + В. napus та В. oleracea + С. bursa-pastor Is. Це може бути пов’язано, по-перше, з філогенетичною віддаленістю видів, а по-друге, з розміром ядерного геному виду-донора. Наші спостереження узгоджуються з гіпотезою, яку висунули Samoylov and Sink (1996), відносно впливу відношення кількості ДНК донор:реципієнт на рівень елімінації хромосом донора у гібридах. Чим більше це відношення, тим менш ефектибно відбувається елімінація хромосом. В результаті злиття протопластів між В. oleracea та A. thallana було отримано багато гібридних колоній, з яких спостерігали регенерацію пагонів з високою частотою. Тобто поєднання геномів цих видів проходило значно легше порівняно з Іншими, незважаючи на те, що ці види належать до різних триб родини Brasslcacea. Теж ж саме спостерігали Forsberg et al (1994) у комбінації видів.В. napus +4. thallana. Більш високий ріЕвнь гомології в унікальних послідовностях ядерної ДНК Brassica та Arabldopsls (Lagercrantz et al., 1994) може бути причиною більш високого рівня сумісності між двома геномами. Крім того, висока частота регенерації гібридних рослин у цій комбінації може бути пов’язана з малими розмірами геному A. thallana, що полегшує його об’єднання з геномом В. oleracea. ■

Таким чином, при використанні методу "гамма-злиття" протопластів нами був отриманий різноманітний в генетичному відношенні матеріал. Використання отриманих хлорофілдефектних мутантів вия-' билось надзвичайно ефективним для селекції гібридів капусти з ци-

топлазматичним геномом Інших видів Brasslcacea. За допомогою роз-робленної технології можливе залучення до генофонду капусти корисній для селекційного процесу генів від споріднених та віддалених видів родини Brasslcacea.

4. Отримання гібридів "Brassicapsella" з використанням подвійної інактивації протопластів донора.

Для селекції цитоплазматичних гібридів (цибридів) між партнерами, що не несуть генетичних селективних маркерів, був запропонований метод (Sidorov et al. 1994) з використанням подвійної інактивації протопластів донора (r-променів для інактивації ядра та НМС для індукції пластомних мутацій). Суть процедури полягає в індукції пластомних мутацій стійкості до стрептоміцину кожний раз безпосередньо перед злиттям протопластів та подальшій селекції мутантних пластид в продуктах злиття.

В результаті проведених експериментів по злиттю протопластів Brassica oleracea var. capitata та Capsella bursa-pastor Is було ізольовано 11 стійких до стрептоміцину колоній, серед них 3 колонії були здатні до фотосинтезу, а решта були знебарвлені, але активно росли на середовищі із стрептоміцином. Через два місяці після перенесення стійких до стрептоміцину колоній на регенераційне середовище без антибіотика, спостерігали морфогенез пагонів із двох зелених протоклонів (Cl, С2) та одного знебарвленого (Сб). Рослини отримані Із клонів Сі та С2 мали морфологічні ознаки проміжні між капустою та грициками. Рослини, які регенерували із протоклону Сб, були морфологічно подібні до капусти. Гібридні рослини Сі та С2 зберігали стійкість до антибіотику та утворювали корені на середовищі із стрептоміцином (0,2 мг/мл), в той час як

рослини клону Сб, як і вихідні рослини капусти, знебарвлювались.

Ядерну конституцію отриманих рослин вивчали за допомогою ци-тогенетичного аналізу та аналізу МММ естерази. Онтогенетичний аналіз рослин-регєнерантів показав, що рослини клону Сі мали ЗО хромосом, а рослини клону С2 - 23, що менше суми диплоідних наборів хромосом батьків. Рослини Сі та С2 мали хромосоми, морфологічно відмінні бід капустяних, які, ймовірно, належать

С. bursa-pas tor is. Рослини C6 мали 54 хромосоми, що відповідає гексаплоїдному набору хромосом капусти.

Аналіз ШЕФ виявив в естеразних спектрах рослин-регенерантів Сі та СС всі ізозими, характерні для В. оіегасєа, та частину ізозимів, специфічних для С. bursa-pastor Is. Отже, аналіз МММ естерази показав, що рослини Сі та С2 є асиметричними гібридами. В зимограмі естерази регенеранта Сб були присутні тільки характерні для Brassica ізозими.

Цитоплазматичний геном отриманих гібріщів вивчали за допомогою рестриктного аналізу хлЛНК та мтДНК, використовуючи рестрик-тази Ват Ні та Wind III. рестриктні.спектри хлДНК отриманих рослин були поеністю ідентичні рестриктному спектру капусти, тобто регенеранти мали хлоропласти В. оіегасєа.

Рестриктні спектри мтДНК гібридів Сі та С2 були відмінні від батьківських: було виявлено більшість видоспешфічних фрагментів

капусти і частину Еидоспешіфічних фрагментів С. bursa-pastor is, а також нові фрагменти, не характерні для рестриктних спектрів батьків, що може свідчити про рекомбінацію мтДНК у гібридних рослин (Landgren and Qlimelius,’ 1994). Рестриктний аналіз мтДНК регенерантів, отриманих із протоклону Сб, виявив, що рослини мали мітохондрії капусти.

Таким чином, за результатами морфологічного, цитогенетичного

- 20 - ■

- * ■

та біохімічного аналізів, регенеранти, отримані із протоклону С6 є рослинами капусти з гексаплоїдним набором хромосом. Калус С6 на середовищі із стрептоміцином ріс краще порівняно з іншими калуса-ми, можливо, завдяки поліплоїдії. Рослини клонів СІ та С2 є асиметричними гібридами В. oleracea + С. bursa-pastorIs з хлоропластами капусти та реконструйованою мтДНК.

Таким чином, схема селекції з використанням подвійної інактивації протопластів донора при відсутності селективних маркерів у вихідних форм рослин може бути застосована для отримання соматичних гібридів між видами рослин родини Brasslcaceа при наявності ефективної методики культивування протопластів.

Проведене дослідження очевидно показало можливість поєднання геномів капусти та грициків шляхом злиття протопластів. Вперше наші були отримані асиметричні міжтрибні соматичні гібриди "Brasslcapsella" між В. оіегасеа L. var. capitata L. (триба ßrasslcea) та С. bursa-pastoris L. (триба Lepldleae), які мали гібридне ядро, хлоропласти капусти та перебудовану мтДНК. Віддалена гібридизація в родині ßrassicacea - це можливість розширення генетичного різноманіття видів Brassica, перенесення багатьох господарсько цінних ознак, в тому числі і тих, що не зустрічаються у представників роду. Отримані гібриди є унікальними за своєю ядерною та цитоплазматичною генетичною конституцією.

ВИСНОВКИ.

1. Запропонована ефективна методика культивування протопластів Brassica oleracea L. var. capitata L. з використанням їх Імо-білізації в алгінатну плівку та розроблені умови регенерації рослин.

• C. Вперше ллл Brasslcacea застосована ефективна система селекції гібридів капусти з цитоплазматичними генами іншого виду, яка базується на використанні отриманих хлорофілдефектних мутантів капусти.

_ ?. Показано можливість отримання гібридів між віддаленими

видами родини Brasslcacea без наявності селективних генетичних маркер іЕ у вихідному матеріалі за допомогою клітинної технології, яка базується на використанні подвійної інактивації протопластів-донора. •

4. Показано, що метод "гаша-злиття" протопластів є ефективним для перенесення частини ядерного та цитоплазматичного генетичного матеріалу та створення асиметричних гібридів між спорідненими і Філогенетично віддаленими видами рослин родини Eiassl с ítc r 'Si.

5. Отримано міжвидові (Brassica oleracea L.+ Brassica napus і.) та мі,грибні (Brassica oleracea L. + Arabldopsls thallana L., Brassica о1с-га.:ез L. + Capselia bursa-pastorls L.) асиметричні соматичні гібриди капусти, а також цибриди з ядерним геномом капусти та цитоплазматичними генами A. thallana.

6. Показано, що отримані асиметричні гібриди капусти були різними за ядерною генетичною конституцією,' мали хлДНК донорного еиду або капусти та реконструйовану мтДНК.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації. ’

1. Нитовская И.А., Сидоров в.А. Соматический эмбриогенез как один из путей органогенеза растений ln vitro на примере Brassica' oleracea var. capí tata./Матеріали 7-ї міжнародної школи по вив-

ченню онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії., Львів, 1994.

2. Нитовская И.А., Сидоров В.А. Получение генетически маркированных растений для использования в клеточной инженерии Brassica oleracea var. capitata./ Материалы симпозиума по биотехнологии и генетической инженерии растений, Киев, 1994.

3. Нитовская И.А., Околот A.H., ,Сидоров В.А. Регенерация растений из мезофильных протопластов Brassica oleracea var. capitata.//Цитология и генетика. - 1994. - том 28, N 6. - С. 3-6.

4. Нитовская И.А. Органогенез 1л vitro у некоторых видоб Brassica. /Матеріали 8-ї Міжнародні конференції по вивченню онтогенезу рослин природних та культурних флор у ботанічних закладах Євразії, Київ,1995.

5. Нитовская И.А., Околот А.Н., Сидоров В.А. Получение ln vitro хлорофиллдефектных растений капусты.//Цитология и генетика.

- 1996. - том 30, N 1. - С. 72-76.

6. Nitovskaya I., Sidorov V. .Isolation of chlrophyll-defl-c I ent mutants of ‘Brassica oleracea var. capitata and their capability for cybrid production within Brasslcacea./ Abstracts Plant Genome IV, San Diego, 1996.

7. Nitovskaya I.A., Shakhovsky A.M., Sidorov V.A. Asymmetric somatic hybrids between Brassica oleracea and Arabldopsls thallana.//Plant Physiology and Biochemistry. Spesial issue, 10th FESPP Congress, Florence, Italy. - 1996, September 9-13. - p. 40.

Nltovska 1.0. Genetic reconstruction of nucleus and cytoplasm of Brassica oleracea L. by protoplast fusion.

Thesis for a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.25. - Cell Biology, Institute of

Cell-. Biology and Genetic Engineering, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1997. .

The results of 7 scientific publications are defended.

The effective method of protoplast culturing and plant regeneration of cabbage (Brasslea oleracea L. var. capitata L.) using protoplast immobilization In calcium-alginate has been developed. Chlorophyll-deficient mutants of cabbage were isolated using the treatment of seeds with N-nitroso-N-methylurea. Two approaches for somatic hybrid selection within Brasslcacea have been proposed. One approach is based on using of protoplast of cabbage chlorophyll-deficient mutants as recipients, and r-irradiation of donor protoplasts. Another Is based on using double inactivation of donor protoplast before fusion. Interspecific (В. oleracea L. + B. rapus L. ) and intertribal (B. oleracea L.+ Arabldopsls thallana L.,

B. oleracea + Capsella bursa-pas tor Is L.) asymmetric somatic hybrids and cybrlds with nuclear genome of cabbage and Arabldcpsls plastcme were obtained. Using chromosome counting, isozyme analysis and restriction analysis of organelle DNA, obtained asymmetric hybrids were shown to have different nuclear genome, plastome of the donor species or cabbage and rearrangement of mitochondrial DMA.

Нитовская И.Л. Генетическая реконструкция ядра и цитоплазмы Brasslca oleracea L. с помощью слияния протопластов.

. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.25. - клеточная биология, Ийс-титут клеточной ' биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1997.

Защищается 7 научных работ по теме диссертации.

Предложена еффективная методика культивироЕания протопластов и регенерации растений капусты Селокачанной ÍBrassica oleracea'L. var. capitata L.) с использованием иммобилизации протопластов е алгинат кальция. В результате обработки семян ti-нитрого-И-метил-мочевиной получены хлорофиллдефектные мутанты В. oleracea war. capitata. Предложены две клеточных технологии селекции асимметричных соматических гибридов в семейстье Brassi cacea: одна осно-

вывается на использовании протопластов хлорсфиллдефектных i-гутан-тов капусты как реципиентоЕ и r-облучения протопластов донора, а другая - на использовании двойной инактивации протопластов донора перед слиянием. Получены межЕВДОвые (В. oleracea L. +.В. napus L.) и межтрибные (В. oleracea L.+ Arabidopsis thaliana L., В. oleracea + Capselia bursa-pastor is L.) асимметричные соматические гибриды капусты, а также цибрэды с лдерным геномом капусты и пластомом Arabidopsis thaliana. С помощью цитогенетического анализа, анализа множественных молекулярных форм ферментов и рестрикционного анализа ДНК органелл показано, - что полученные асимметричные гибриды капусты были различны по своей ядерной генетической' конституции, имели хлоропласты донорного вида или капусты и реконструированую митохондриальную ДНК.

Ключевые слова: Brassica oleracea; хлорофиллдефектные мутанты; слияние протопластов; Brasslcacea; межвидовые и межтрибные соматические гибриды.