Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая реконструкция растительной клетки с помощью микроманипуляций

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая реконструкция растительной клетки с помощью микроманипуляций"

>ГБ ОЙ

I г:;! 5 < {Г*' г

_ 'о НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ

1НСТИТУТ КЛ1ТИНН01 БТОЛОГП ТА ГЕНЕТИЧН01 1НЖЕНЕР1!

на правах рукопису КИРИЧЕНКО 1гор Володинирович

УДК 575.082.261:575.032.263:576.' 085.2

ГЕНЕТИЧНА РЕК0НСТРУКЦ1Я Р0СЛИНН01 КЛ1ТИЯИ ЗА ДОПОМОГОЮ М1КР0МАН1ПУЛЯЦШ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ дисертацП на здобуття вченого ступени кандидата б!олог1чних наук

Ки1в - 1994

Дисертац1ею е рукопиС.

Робота виконана у в!дд1л1 цитоф1з1ологП 1 кл!тинно! НшенерП 1нституту KniTHHHp'i б1ологП та' генетично! 1нже-нерП HAH Укра1ни. '

Науковий кер!вник - академ1к HAH Укра1ни, доктор б!олог1чних наук, професор ГЛ6БА Ю.Ю.

0ф1ц1йн1 опонэнти - доктор б!олог1чних наук Б. А. ЛЕВЕНКО

кандидат б!олог1чних наук Г.П.ПЁТЮХ

Пров1дна орган!зац1я - 1нститут молекулярно! б1ологП 1 генетики НАН Украпш

Захист вхдбудеться 1994 р. о "¿0.

год. на зас1дакн1 спец1ал1зовано1 ради Д.01.19.01 1нституту кл!тинно1 61ологП та генетично! 1нженерП НАН Укра1ни за адресою: 252143, Ки1в-143, вул. акад.Заболотного, 148.

3 дисертац1сю можна ознайомитися в б1бл1отец! 1нституту кл1тинно! б1олог11 та генетично! 1нженерП НА11 Укранш за адресою: 252143, КИ1В-143, вул. акад. Заболотного, 148.

Автореферат роз!слано "^"■^и&Тир/ЪЯЗЗ.1994 г.

Вчений секретар спец!ал1зовано1 ради кандидат б1олог!чних наук ¡1 л ¡-^ Л. В.Малишева

/Млгу,

- 3 -

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть теми. Методи експериментапьних ман!пуляц!й з рослинними кл!тинами розраховаш головним чином на роботу з кгитинними популяц!ями. Робота ■ з великими к!лькостями кл!тин дозволяе спод1ватися на усп!х нав1ть при низьк!й !мов!рност! бажано1 генетично! под!!, але вносить невизна-чен!сть в початков! умови досл!ду. Наприклад, при отриманн! соматичних г!брид1в шляхом масового злиття протопластов, при якому визначення складу продуктгв злиття в!дбуваеться 1моа!рн!сно. нев!дома напевне початкова генетична консти-туц1я продукт!в злиття 1, зокрема, ск!льки 1 яких батыавсь-ких протопласт!в приймало в ньому участь. Тому так! "масовГ' п!дходи дозволяють отримати в1домоет! лише про к1нцевий стан експериментального об'екту при неповн!й чи недостатн!й 1нформацП про його початковий стан. На в!дм!ну в!д них, м!кроман!пуляцП з одиничними клхтинами та 1х фрагментами дають можлив1сть точно задавати склад кл!тинно! системн, що реконструюеться, стежити за П розвитком, отримувати точнШ дан! 1 правильнее 1х 1нтерпретувати.

Спостереження за 1ндиБ!дуальними кл!тинами дозволяють краще оц!нювати реакц1ю кл!тин на експериментальн! впливи. Це дае змогу створювати досконал!ш! ! ефективн!цц експериментальн! методи.

Таким чином, ман!пулювання з !ндив!дуальними протопластами 1 кл!тинами рослин - це вельми перспективна область кл!тинно1 1нженер!1, що може знайти застосування як у фунда-ментальних, так ! в прикладних галузях генетично! 1нженерП ! б!отехнолог!1 рослин, доповнюючи !снуюч! методичн! п1дхо-ди.

Мета .1. задач! досМдження. Мета дано! робота полягала у проведент направлено! генетично! реконструкцП рослинно! кл1тинн за допомого» м!кроматпуляц1й. Для досягнення ц1е! мети було необх!дно вир!шити так1 задачi:

1. Розробити методи 1ндив1дуального культивування про-топласт!в шдельних вид!в (Nicotiana).

2. Адаптувати процедуру для ряду immx вид!в рослин.

3. Розробити методи електричного i х!м!чного злиття 1ндив!дуальних преселектозаних протопласт!в ыодельних вид!в рослин та отримання рослин з одиничних продукт!в злиття.

4. Адалтувати процедуру для ряду 1ндшх вид1в рослин.

5. Провести норфолог1чний, цитолог!чний та бшх1(.йчний аналхз отриманих рослин.

Наукова новизна роботи. Створено методи 1нднв1дуального культивування протопластов рослин. Протопласти тютюну (Nicotiana tabacum), pina«y "(Brassica napus), напусти (В.chinensis), col (Glycine шах), лвцерни (Medicago sativa), гороху (Pisum sativum), картоога. (Solanum tuberosum), коню-шини (Trifolium pratense) були 1ндив!дуапьно культивоват до' стадП мшроколонп, з них uiicvb останн!х - вперше. Було створено методи електричного i вперсе - ;им1чного злиття 1ндиз1дуальних преселектованих протопласт!в в м1крокраплях п1д шаром олП. Вперше були проведен! xiniMHi злиття 1ндив!дуальних преселектованих протопластов В.napus X . В. carapestris, В. napus X В. napus, . Lycium barbaium X Lycopersicon peruvianum, N. tabacum X N.tabacum, N.tabacum X Rauwolfia serpentina, . N.tabacum X S.tuberosum, R. serpentina X Vinca minor, S.tuberosum X S. pinnatisectum. Вперше було проведене високоефективне xiMiMHe злиття одночасно трьох вид!в !ндив!дуальних преселектованих рослинних- протопласт!в

(N.tabacum X R. serpentina X Rhazya stricta). Вперше (за вик-люченням N. tabacum X N. tabacum i B.napus X B. napus) були проведен i електричн! злиття 1ндив1дуальних преселектованих протопласт1в B.napus X B.napus, B.napus X Solanum nlgrum, B.napus X B.nigra, Lycopersicon esculentum X L.esculentum, N. tabacum X N. tabacum. N. tabacum X N. plumbaginifolia, N.tabacum X N.plumbaginifolia (цитопласти),

N.plumbaglnifolla X N. plumbaginifolia, N. sylvestris X N.plumbaginifolia, N.tabacum X Antirrhinum majus, N.tabacum X Atropa belladonna, N. tabacum X R. serpentina, R. serpentina X Catharanthus roseus, (N.tabacum X Scopolia carniolica) X N.tabacum (цитопласти), (N.tabacum X Scopolia carniolica) X N. tabacum. Вперше були отриман1 рослини з продукт!в внутр!клонового електрозлиття 1ндив!дуа/1ьних преселектованих протопласт1в N.tabacum, а також комб!нац!й N.tabacum X N.plumbaginifolia, N.plumbaginifolia X N.plumbaginifolia, N.plumbaglnifolla X N.langsdorffii. Показана значна як м!жклонова, так i внутр!клонова м1нлив1сть отриманих рослин по морфологИ 1 числу хромосом. При цьому б!льша р!зниця в морфолог!! рослин в загальному випадку в!дпов!дала б1льш!й в1дм1нност1 в числ1 хромосом. Показано також м1нлив1сть отриманих рослин по 1зоферментних маркерах.

Практична ц!нн1сть. Показано можлив1сть 1ндив1дуального культивування протопласт!в ряду с!льськогосподарськи важли-вих вид1в рослин (тютюну, р!паку, капусти, сох, люцерни, гороху, картопл!, конюшини), високоефективного (до 95%) х1м1чного 1 електричного злиття 1ндив1дуальних преселектованих протопласт!в 1 цитопласт!в ряду с!льськогосподарськи важливих i л!карських вид1в рослин. Створен! методи 1ндив1дуального культивування протопластов i кл1тин рослин.

- б -

xiMlHHoro i електричного злиття 1ндив!дуальних преселектова-них протопласт!в, а такой отримат докази значнох хромосомно! i морфологiчно1 м1нливост! вослин, отриманих з продуктiс м!ЖВИДОЗОГО, ВНуТр!ВИД0В0Г'0 и BHyTpiклопового злиття можуть мати значения як для фундаментальних, так i прикладних галу-зей suiíthhhoi 1нженерП рослин.

Апробац!я роботи. Деяк! положения дисертацП було вик-ладоно на М!ннародн!й конференцП з кл!тиннох !нженерП рослин (Паланга, 1S09 р.). Основн! положения дисертгац! i було' представлено на Шжнародному симпоз!уш "Б1отехнолог!я рослин та генетична !нженер!я" (Ки!в, 1994 р.).

ПублжацП. По матер 1алах дисертацП опубл1ковано 13 друкованих pooiT.

Структура 1 об'ем роботи. Диссертацш викладено на 152 стор!нках машинописного тексту. Бона складаеться !з вступу, 4 роздШв, заключения, висновк1в i списку цитовано! л1тера-тури, включас 13 таблиць та 13 малюнк!в. Список л!тератури м1стить 226 б!бл!ограф1чних посилань, з як'их 215 - 1ноземн1.

МАТЕР1АЛИ I МЕТОДИ

Рослини тютюну Nicotiana tabacum (L.) i N. plumbaginifol'ia (Viv.) та !нших вид!в, що використовували-ся як досл1дн! об'екти, аселтично вирощували за стандартними методиками на агаризованиму середовищ! МС (MurasMge and Skoog, 1962). Протопласта вид1ляли за стандартними методиками, при цьому користувалися двома видами ферментних сум!шей: Фк-2 .! ФС-2К, котр! були створен! на основ! композицП Chupeau et al., 1974. Склад ферментно! сум!ш! Фк-2: Macerozyme R 10 (Serva, ФРН) - 20 мг, Onozuka R 10 (Serva,

ФРН) - 100 мг, Driselase (Sigma, США) - 50 мг, сахароза х. ч. - 17.100 мг СаС12*2Н20 х.ч. 100 мг. M{;S04»7H20 х.ч.- 1С0 мг, вода (б!дистильована чи де!он1зована) - до 100 мл, pH не доводити, стерил1зац1я ф1льтруванням, зберхгати при 4°С не б1льше м!сяця чи довший час при -20°С. ФС-2К являс собою Фк-2 з гйдвищеним у чотири рази bmíctom фермент!в, очищену на Sephadex-G25 (coarse, Pharmacia, Швещя).

Для нанесения м!крокрапель на дно пластикових чаигак Петр! 1х поверхню обробляли, а властивост! культурачьних се-редовищ модиф!кували. Обробку nosepxHi чашки Петр1 най-част1ше проводили водяною парою, для чого пЮля внесення е чашку крапель середовища для культивування i/чи розчин!в для х1м!чного чи електричного злиття. чайку.на 3-5 хвилин гакри-вали кришкою. Властивост! культуральних середовищ модифшу-вали додаванням до них бичачого сироваткового альбум1ну (БСА) (V Фракц1я, Serva, ФРН) в концентрацП 0,005-1% в за-лежност!в1д середовища 1 виду протопласт!в.

Вазел1нову ол!ю для 1ндив1дуального культивування промивали б!дистильованою водою, п1сля чого насичували куль-туральним середовищем.

1ндив1дуальне культивування. МшромашлуляцП над протопластами проводили за допомогою м1кроп!петок з внутр!шн!м д1аметром к1нчика.б!ля 100 мкм, виготовлених на мшрокузн! МЭ-4 (п/о Черноголовка) з кап!ляр1в мол1бденового скла д!аметром 1,5 мм. Шкротпетку закр!плювапи на гол!вц! ман1пулятора фон Брюнна з комплекту м i кроманi пулятор i в КМ-2 (п/о Черноголовка). Г'з'еднували тефлоновим шлангом д!амет-ром 2 мм з м1крошприцем на 50 мкл. Шприц 1 шланг були запов-нен! аптечною вазел1новою ол1ею. Гол1вка ман!пулятора прикр1плювалася до столика 1нвертованого м!кроскопа

- 8 -

ЛеЮЬеП-Оигщ кисгс^а^' (США).

1ндив1дуальне культивування проводили в пластикових чашках Петр! д!аметром 40 мм. Спочатку в чашку вносили 2 крапл! середовища для ¡ндив!дуального культивування об'емом 100-200 мкл, пот1м чашку1' накривали кришкою на 2-3 хв, п!сля чого заповнювали ол!ею доти, поки п!д шаром ол!1 не эникапи верх!вки крапель. В одну з крапель вносили суспенз!» протоп-ласт!в, а !нша служила джерелсм чистого середовища для нанесения м1крог.ралель. Крапл! середовищ для зм1ни в ход! культивування вм!щували в ш ж чашку.

М1крокрапл1 наносили за допомогою м!кроп!петки ! м1крошприца на дно чашки Петр!. Нанесення 40-50 м!крокрапель .тривало 15-20 хв. П1сля цього по м!крокраплях з велико! краши з суспенз1ею розсаджували протопласти, що тривало ще 15-20 хв. П!сля розсаджування протопласт1в чашку Петр! вм1щували у вологу камеру 1 1нкубували в термостат! в темряв!. Отриман! м1кроколон!1 регенерували за стандартними методиками.

Додавання середовища м!кроколотям. Розрахунок додаван-ня середовища ' проводили за формулою (з Шмальгаузен, 1932, модиф1коване): V = У0есТ, де V - об'ем м1крокрапл!, У0 - по-чатковий об'ем м!крокрапл!, с - постШна швидкост1 росту, Т - час.

Як \!0 був прийнятий об'ем 46,23 нл - середне значения початкового об'ему мшрокрапель найусп1шнших досл!д!-в.

При додаванн! середовища для культивування синхронно з ростом ! под!лом шитин V - 2У0 за час подвоення об'ему кл1тини I. Тод! справедливе 2У0 = У0е°1, зв!дки Шсля прос-тих перетворень отримуемо с = (1п2)Л.

Для об'ект!в, що використовувалися в досл1дах, Ь прий-

мали р1вним 3 добам. Середовище до м1крокрапель додавали за допомогою мшроп!петки 1 м!кроапл1катора (Microapplicator М, ISC0, США) кожн1 три-п'ять дн!в.

Для xiMiHHoro злиття використовували так1 розчини. Спо-лучення 1. Розчин ПЕГ (псл1етиленгл1колю): глюкоза - 200,0 мг. СаС12 *2Н20 - 15,0 мг. КН2Р04 - 1.0 мг. ПЕГ 6000 - 5000.0 мг, вода до 10-мл. рН не доводили. Стерил!зупали автоклаву-ванням. Натр1й-гл1циновий буфер: гл1цин - 760,0 мг. вода -100,0 мл, 0,1 N NaOH - до рН 10,5 чи 12,5, вода до 200 мл. Збер1гали в пластиковому посуд! при 4°С. стерши зузали в пластиковому посуд! безпосередньо перед досл!дом. Розчпн ДМС0: диметилсульфоксид (ДМС0) - 2,0 мл, СаС12*2Н20 - 266,0 мг, глюкоза - 1200,0 мг, вода до 20 мл, рН не доводили. Стерил!зували автоклавуванням. Перед застосузанням розчини натрШ-глхцинового буферу i ДМС0 змшували в сп1вв1дно:иенн! 1:1. Середовище W-5A, мг/л: NaCl - 9000. СаС12*2Н20 - 18400, КС1 - 800, глюкоза - 1000, БСА - 100, рН 5,6, стерил!зували ф!льтруванням. W-5 - те ж, без БСА.

Сполучення 2. Розчин ПЕГ: ПЕГ 6000 - 3000 мг. глюкоза -594 мг. СаС12*2Н20 - 100 мг, вода до 10 мл, рН не доводили, стерил1зували автоклавуванням. Розчин А: глюкоза - 9,9 г, СаС12 *2Н20 - 1,0 г, ДМСО -. 10,0 мл, вода до 100 мл, рН не доводили, стерил!зувапи автоклавуванням. Розчин В: 0,1 N КОН -8,0 мл, гл!цин - 225,0 мг, вода до 10 мл. доводили рН до 10,5 св!жим 1N КОН. стерил1зували ф!льтруванням. До викорис-тання розчини A i В збер1гапи заморожсними, перед вживанням зм1шували в сп!вв!днош'енн! А: В=9:1.

Крапл1 вказаних розчин!в í середовища для культивування об'вмом б!ля 100 мкл наносили на дно 40-мм пластиково! чашки Петр! ближче до кра!в. ÍIotím в чашку наливали очищену олш

доти. доки П шар не покривав верх!вки крапель. Власне злит-тя проводили в (Лкрокраплях. розташованих у в1льн!й центральна частин1 чашки. Перед додаванням розчину ПЕГ протоп-ласти приводили в контакт, котрйй тдтримугали 1 п1д час до-давання, налеяним чином направлянчи струмшь розчину з м!кроп1петки. Крапл1 розчин1в ДМСО 1 натрхй-гтицинового буферу зм!иували в окрем1й крапл! безпосередньо перед додаванням до мшрокрапель 1з протопластами, що 1х зливали. Для збирання використаних п1сля в1дмивки розчин1в використовува-ли окрему краплю. Шсля дослхду вс! краши, кр1м крапель 1з середовищем для культивування 1 мШрокрапель з продуктами злиття, з чашки забирали за допомогою м!кроп1петки.

Процедура злиття полягала в посл!довних зм!нах за допомогою м!кроп!петки розчин1в в м1крокраплях з протопластами. Були досл1джен! так1 схеми, чи посл!довност! злиття:

1. У-5 - ПЕГ (5-10%, 10-30 хв) - в1дб!р розчину (ВР) -Буфер 9А:1В (сполучення 2) (15-20 хв) - ВР - середовище для культивування (СЮ - ВР - СК.

2. СК - ПЕГ (5-25 хв) ^ На-гл!циновий буфер рН 10,5 + розчин ДМСО 1:1 (тут 1 дал! сполучення 1) (5-25 хв) г• ВР -СК - ВР - СК - ВР - СК.

3. И-5- ПЕГ (5-25 хв) - Ма-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1:1 (5-25 хв) - ВР - СК - ВР г СК - ВР - СК.

4. У-5 - ПЕГ (5-25 хв) - Ка-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1;1 (5-25 хв) - ВР - На-гл1Циновий буфер рН 12,5 .+ розчин ДМСО 1:1 (5-25 хв) - ВРСК.

5. И-5 - ПЕГ (5-25 хв) - СК - ВР - И-5 - ВР - СК..

6. №-5 - Иа-гл!циновий буфер рН 10,5 + розчин ДМСО 1:1 (5-25 хв) - ПЕГ (5-25 хв)- СК - ВР - N-5 - ВР - СК.

7. И-5 - ПЕГ (5-25 хв) - Иа-глщиновий буфер рН 12,5 +

розчин ДМСО 1:1 - СК - ВР - СК - ВР - ПЕГ (якщо протопласти роз1йшлися) - СК - ВР - СК - ВР - СК - ВР.

8. М—5 - ПЕГ (5-25 хв) - 0,25 М розчин н!трату натр!ю -СК - ВР - СК - ВР - СК - ВР.

9. №-5 - ПЕГ (5-25 хв) - 0,25 М розчин н1трату натр!» -ПЕГ - СК - ВР - СК - ВР - СК - ВР.

10. \У-5 - 0,25 М розчин н!трату натр!ю г ПЕГ (5-25 хв)

- СК - ВР - СК - ВР - СК - ВР.

11. №-5А - ПЕГ - (10 хв) - .На-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1:1 (5 хв) - ВР - \Ь5А - ВР - ПЕГ, 5 хв (якщо протопласти роз!йилися)'- ВР - И-5А - ВР - №-5А - ВР - W-5A

- ВР - СК (+1 мг/мл БСА) - ВР - СК - ВР - СК.

12. Ш-5А *+ СК - ПЕГ (10 хв) - йа-глщиновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1:1 (5 хв) - ВР - ПЕГ - На-гл1циновий буфер рК 12,5 + розчин ДМСО 1:1 (5 хв) - ВР - ПЕГ - ВР - \1-5A

- ВР - №-5А - ВР - У-5А - ВР - СК - ВР - СК - ВР - СК.

13. И-5А + СК - ПЕГ (10 хв) - На-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1:1' (8 хв) - ВР - ПЕГ - СК - ВР - СК - ВР

- СК - ВР - ск:

14. \f-5A Ш:1)/чи СК - ПЕГ (10 хв) - Ма-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО 1:Т (5-25 хв) - ВР - ПЕГ (якщо протопласти роз1йшлися) - УЬ5А 1(1:1) /чи СК - ВР - У/-5Л 1(1:1)/чи СК - ВР - \1-5A Н1:1)/чи СК - ВР - СК - ВР - СК -ВР - СК. Тут 1 дал1 СК 1 W5-A м!стили 0,03 мг/мл БСА проти звичайно! концентрацП- 1 мг/мл.

15. №-5А - ПЕГ (10 хв) - ВР - Ыа-гл1циновий буфер рН 12,5 + розчин ДМСО + 0, 25 М н!трат натр!ю 1:1:1 (Буфер Б-4) (7-10 хв) - ВР - СК - ВР - СК '- ВР - СК.

16. М-5А - ВР - ПЕГ (10 хв) - ВР - Б-4 (7-10 хв) - ВР -ПЕГ (якщо протопласти роз1йшлися) - ВР - И-5А - ВР - СК.

- 12 -

17. \V-5A - ВР - ПЕГ (10 хз) - (ВР - Ка-гл1циновий буфер рН 12,5 + роэчин ДМСО 2:1 (5-25 хв) - ВР - И-5А) 1-2 рази .-ВР - СК - ВР - СК - ВР - СК.

Для електричного злиття використовували так! розчини (мг/100 мл): РЕЗ-1 (манн!т 6000, БСА 13, л!зоцим 10), РЕЗ-2 (манн!т 9109, БСА 3-10),' РЕЗ-З (манн!т 10931, БСА 5-10), РС-22 (БСА 5, сахароза 3000, мантт 10930), Р3-23 (гл!цин 225С, БСА 5. манн!т 5460), РЕЗ-21 (гл!цин 3750, БСА' 5). РЕЗ-24 (манШт 9000, БСА 5. СаС12*2Н,0 5), РЕЗ-Й5 (макн!т 9200, БСА 5, СаС12*2Н20 5, Ме804 * 7Н20 5), РЕЗ-26 (манн!т 8000, БСА 5, СаС12 *2Н20 5, !^804 * 7Н20 5)-, РЕЗ-27 (гл!цин 3750, БСА 5, СаС1г*2Н20 5, Ме304*7Н20 5), РЕЗ-28 (арабшоза 7510, БСА 5, СаС12 *2Н20 5. Мз804 »7Н20 5), РЕЗ-29 (ксил!т 7530, БСА 5, СаС12 *2Н20 5, МеБ04*7Н20 5), РЕЗ-ЗО (ыагопт 4500, БСА 5, .СаС12*2Н20 5, Мй304 *7Нг0 5, ксилоза 3750). РЕЗ-З1 (гл!цин 6005, БСА 5-10), РЕЗ-32 (мани!т 4500, БСА 5, СаС12*2Н20 5, Ме804*7Н20 5, ксилоза 4000), РЕЗ-ЗЗ.О (БСА 5, СаС12*2Н20 5, Мс804 * 7К20 5, ксилоза 8250) РЕЗ-ЗЗ (манн1т 4500, БСА 5, СаС12*2Н20 5. Мв804*7Н20 5, ксилоза 3800), РЕЗ-34 (маншт 4500, БСА 5, СаС12*2Н20 14,4, Ме804 * 7Н20 6,8, ксилоза 3800), РЕЗ-35 (БСА 5, СаС12»2Н20 14,4, ИgS04*7H:0 6,8. ксил!т 7610), РЕЗ-41 (БСА 5, СаС12*2Н20 5, Мд304 * 7Н20 5, гл1церин 7360).

Електрозлиття проводили за доломогою платинових мшрое-лектрод1в д!аметро.м 50 мкм. Об'ем м!крокрапель для електрозлиття складав 1 мкл. В1дстань м!ж м1кроелектродами сягала в1д 200 до 400 мкм, напруга: д!електрофорезу - 5-10 Вольт (частота 1 Мгц). прямокутного !мпульсу - 14-20 Вольт (тривал!сть 80 мкс). Швидк1сть злиття сягала 50-100 пар/год. П1сля завершения електрозлиття роэчин для електрозлиття

- 13 -

зам1!дували 100 нл поживного середовища 1 вели 1ндив!дуальну культуру продукт1в злиття, як описано вище.

Отримання рослик з 1ндив1дуалъких продуктов злиття ЛЦсоИапа 1аЬасаш (N1) 1 N.р1ииЬай'1пНоПг ДО). Шсля рого--нерацп отримували вих1дн1 колонП, 1сотр1 ?озр1зали на приб-лизно р!вш частини, як/ переносили на св1же середовице. По тому, як рослини тдросталм, процедуру переносу повторввал::. •Було розроблоно систему пезначень, залдяни котр!й назва рос -лики в1добрачсалэ м1сце П розтааування у сих!дн1й колонП.

Препарата хромосом готували за стандартнпм методом при-готування чавлених препаратов к1нчик1в корхнщв. Готов! пво-парати переглядали на ьикроскоп: игиуаг (Чо1сЬ.ег'»Р Австрия). 1зоферментний анализ отриманих рослин проводили за стандартами методами.

РЕЗУЛЬТАТИ I 0БГ0В0РЕННЯ

Культивування !ндиз!дуальних преселсктованих рослинних протопласт1в ! продукт1в 1х злиття. Дан! наведено в Таблицях 1 та-2, вядпсв/дно. Ефектиен1сть виелву 1ндив1дуальни.х протопласт/в тютюну та р!паку та ефектиБНлсть елеятрозлиття протошпст1п ГЛсоМапа ! регенераци рослин з продуктов злиття узгоднуються з в!домимн л!торатурнимм дани! т.

Х1м1чне злиття /ндшидуалоних преселектованих протопласт 1в. Ноли для злиття застосовували стандартн1 методики, ,що добре зарекомендували себе при масовому злитт! протоп-ласт!в (див., напр., посл^довност! х!м1чного злиття 1,2,5,6 1 10), продуктов злиття отримати не вдавалосл. Це стало мож-ливим (див. Мал.1) лише п1сля п!двищення рН буферу для злиття до 12,5, застосування розчинлв з БСА 1 розробки спсц1зль-

- и -

них посл!довностей злиття, деяк1 з котрих виявилися особливо ефективними (Таблиця 3).

Ефективн1сть електрозлиття 1ндив1дуальних преселектова-них протопластов сягала 95%. Найефективн1шими виявилися роз-чини РЕЗ-34 та РЕЗ-35 (див. Мал.2, Табл.4).

Морфолог1чний 1 цитолог1чний анал1з отриманих рослин б комб1нац1ях ГЛ+ПТ, КТ+ИР и виявив 1х значну м1нлив1сть

нав!ть в то!лу випадку, якщо рослини було отримано з одного 1 того ж продукту злиття. У 296 рослин ощнювали ряд морфо-лог!чних показник1в. У 60 рослин через р1к був проведений повторнин ыорФологХчний анализ 1 визначене число хромосом. Найстаб1льн1шими ознаками виявилися форма коретв, листя та кол!р рослини, найнест1йк!шими - швидк1сть росту рослин та корен!в. Рослини з близькими числами хромосом звичайно вияв-лялися морфолопчно под!бними, 1 навпаки.

Соред рослин-регенерант1в було знайдено 5 химер по числу хромосом; у однШ рослини листки були плямист!. Хромо-сомн 1 числа рослин ГШМР розпод1лялись по двох трупах: нав-коло значень для № (27-32) 1 оч!куваних для МТ+№ (72-82). Б1ох1м1чний анал!з показав, що в рослинах першо! групп на-явн! 1зоферменти лише № (Мал.4), а друго! - обох батьк!в (Мал, 3). У проанал!зованих рослин 1\1Р+№ 1 !\1Т+НТ число хромосом було близьке до батьк!вського (в1дпов!дно 27-30 1 42-54); . деяк! рослини булк химерами по хромосомних числах. Отриман! дан! можча пояснити, якщо припустити, що при роз-витку одиничних продукт!в злиття сумщалися два процеси (со-маклонально!?) м!нливост1: 1) втрата невеликих к1лькостей хромосом (що приводило до виникнення анеуплоШП, : 2) втрата великих груп хромосом, що в1дбувалася, мокливо, при сегрегацП чи незлитт! ядер.

Малюнок 1. Посл1довн1 стадП хш!чного злиття 1ндио1ду-альних преселектованих протопласт!в в м!крокраплях (11-а посл!довн1сть злиття, каллюсний протопласт Rauwolfía serpentina (б!льшого розм1ру) X мезоф1льний протопласт Vinca minor): а) вих!дна пара протопласт1в в мшрокрапл! (100Х); б) те ж, при 400Х. Видно, що протопласт Rauwolfía мае тяж! цитоплазми i не 'м!стить хлоропласт!в, тод! як протопласт Vinca, навпаки, не мае розвинутих тяж!в, але (Лстить чи-сленн! хлоропласти; в) додавання ПЕГ (100Х); г) додавання буферу для злиття (100Х); д) друге додавання ПЕГ (100Х); е) продукт злиття утворюеться при в1дмивц1 (100Х); ж) продукт злиття м1стить хлоропласти Vinca i мае характерну структуру протопласта Rauwolfía. Частина протопласта Vinca залишилася зовн!. не зливаючись (400Х).

Малшок 2. Посл1довн1 стадп електрозлиття преселекто-ваних протопластов тютюну в ткрокрашй: а) дЮлектрофорез; б) подача пршокутного ¿мпульсу; в) - д) подальаи етапи злиття.

Таблиця 1.

ЕфективнЮть !ндив!дуального культивуванкя протопласт1в ряду вид!в рослин.

Вид Кл1ти- К!ль- Процент кл1- Час

ни (кл) к!сть, тин. що по- куль-чи про- ' шт д1лилися, тиву-топлзс- М + т вання,

ти (пп) д1б

Р1пак (Brassica napus) Р!пак (В.napus) Капуста (В. chinensis) Соя (Glycine гаах) Тютюн (Nicotiana tabacum) Тютюн (N.plumbaginifolia) Люцерна (Medicago sativa) Горох (Pisum sativum) Горох (Р.sativum) Картопля (Solanum tuberosum) Конюшина (Trifoliura pratense)

кл 60 30,00 + 5,97 3

пп 251 11,55 + 2,02 • 6

пп 50 18,00 + 5,49 .7

пп 39 46,15 4- 8,09 6

пп 45 75,56 + 6,48 7

пп 25 2.0,00 + 8.16 10

пп 90 12,22 + 3,47 4

кл 9 44,44 + 17,57 7

пп 51 9, 80 + 4,21 8

кл 40 55,00 + 7,97 7

пп 40 2,50 + 2,50 7

Таблиця 2.

ЕфективнЮть електрозлиття !ндив1дуальних преселектова-них протопласт!в. Nicotiana tabacum (NTM N.plumbaginifolia (NP) та культивування одиничних продукт!в ix злиття в м1крокраплях.

Партнери Вих!дне Злилося, М!кроколон1й, рогенерувало число пар (%,. М+т) (%, М+т) (-6, Мни)

tJT+NP 32 12 (37,5+8.7) 4 (12,5+5,9) 3 (9.4+5.2)

NT+NT 41 35 (85.4+5,6) 9 (21,9+6,5) 5 (12,2+5,2)

NP+NP 27 17 (63,0+9,5) 5 (29,4+11,4) 5 (29,4+11,4)

l

i»

Mi

Малюнок 3. 1зоферментний (естерази) анал1з регенеранта 3D2-2, що розвинувся з продукту злиття 1ндив1дуальннх пресе-лектованих протопласт1в Nicotiana tabacum (N. t.) i N.plumbaginifolia (N.p.)

Таблиця 3.

НайефективнШ посл1довност! х!м!чного злиття 1ндив1ду-альних преселектованих протопласт1в рослин (N0 - номер посл1довност1 злиття, див. Матер1али 1 методи)

Батьк!вськ! вкди Мп Вих1д- Зли- Ефективн1сть

них пар лося злиття (%, М + т)

И. БегрепШа+У. т1пог И 15 4 26,7 + 11.8

N. tabacu¡n+N.1аЬасит 11 51 13 25,5 + 6,2

N. 1аЬасит+Р. йОгрепНпа 11- 10 1 10,0 + 10.0

N. 1аЬасит+.М. tabacum 14 35 15 42,9 + 8.5'

В. париз+В. париэ 14 12 6 50.0 + 35,1

N. 1аЬасит+Н. 1аЬасит 15 54 18 33,3 + 6,5

N.1аЬасит+8.tuberosum 15 10 2 20,0 + 13.3

N. tabacum+^J. 1аЬасит 16 52 31 59,6 + 6.9

N. tabacura + 17 10 4 40,0 + 16.3

Я. зегрепипа+И. stricta

В. парив+В. сатреБШз 17 7 4 57.1 + 20.2

Таблиця 4.

Ефективн1сть електрозлиття деяких комб1нац!й рослинних протопласт!в (розчин РЕЗ-34).

Батьки Число вШ- Злилося Ефективн1сть

браних пар (%, М + т)

А.ЬеПайоппа+И. 1аЬасит 36 27 75,0 + 7,3

N.1аЬасит +

(Б. сагп1о11са+Ы. tabacum) 37 35 94,6 + 3,8

Малюнок 4. 1зофер-ментний (естерази) анал1з регенерант!в 1А8-19.6, 1А8-24.8, 1А8-21.7, 1А8-24.2, ЭЕ43-8, 1А8-4.3,

1А8-11.1. ЗД24-2, що розвинулися з продукт1в злиття 1ндив1дуальних преселектованих протопласт^ Nlcotiana 1аЬасит (N.) 1 N.р1ишЬае1п1Го11а(М.р.)

ь:

о

<ф

О

'0

д ъ

(Ф Чз»

Vй «а

чйа/

| ЩГ

|Г О ^

Ф,

о

О

О о

ч

№

о

(''

. * 'в

<Р О я.

Зд?

Малюнок 5. Препарата хромосом рослин, отрнманих з продуктов злиття 1ндив1дугльних преселектованих протопластов: 1Д9-13.2 (а). 1А8-21.2 (б), 1А2-3 (в), 3.10 (е) (комб1нац!я ШсоМала 1аЬасит + N. р1итЬав1л1Го11а). 2ТЬг2-Д (г) (комб!нац1я М.р1игаЬай1п1Го11а + ^р1шг,Ьа£1пПо11а), VI7' Р-2 Чд) (комб1нац!я N. 1аЬасшп + N. 1аЬасиш).

- 20 -висновки

1. Створен! методи 1ндив!дуального культивування дозво-ляють з високою ефективн!стю проводити !ндив!дуальне культивування кл!тин, протопласт1в та продукт!в злиття протопласт! в ряду вид!в рослин.

2. Створен! методи х1м!чного та електричного злиття доз-воляють з високою частотою отримувати !ндив!дуальн! продукти злиття преселектованих протопласт!в ряду вид!в рослин.

3. За допомогою створених метод!в !ндив!дуального культивування 1 злиття отримано одиничн! продукти злиття, а з них - рослини в таких видових комб1нац1ях преселектованих протопласт!в: М!соИапа tabacum + N. 1аЬасит, N. 1аЬасит + М.р1ииЬаа!п!Го11а, N.р1итЬае!п1Го11а + N.р1итЬа§1п!Го11а.

4. Проведений анал!з показав м1нлив1сть отриманих рослин щодо морфолог!1, чисел хромосом та 1зоферыентних картин. Серед рослин. отриманих з одиничних продукт1в злиття 1ндив!дуальних преселектованих протопласт!в N. 1аЬасига + М. р1ип^^!п!ГоГ1а, зустр1чалися як рослини, близьк1 за числом хромосом та !зоферментною картиною до оч!куваних г!брид1в, так 1 рослини, близьк! лише до одного'з батьк!в Ш. р11шЬае1п!Го1!а).

Список основних роб!т, опубл1кованих за матер!алами ди-сертацП:

1. Кириченко И. В., П. В.Мельников, Ю.Ю.Глеба. Регенерация растений из индивидуально культивируемых протопластов табака. // Доклады АН УССР, сер. Б. Геол., хим., и биол. науки. - 1989. - N7. - С. 63-65.

2.. Кириченко И.В., Н. В.Кучук, Л.А.Сахно, Ю.Ю.Глеба. Ин-

дивидуальное культивирование растительных протопластов и клеток. // Доклады АН УССР. сер. Б. Геол.. хим., и биол. науки. - 1990. - N3. - С. 63-65

3. Кириченко И. В. Слияние индивидуальных пар преселек-тированных протопластов табака при помощи электрического поля. // Доклады АН УССР, сер.Б. Геол., хим., и биол. науки. -1990. - N6. - С. 71-74.

4. Кириченко И. В., Н. Упадхаи, 0. Ф. Любарец, И. А. Косте-нюк. Культивирование мезофильных протопластов Rauwolfia canesccns L. // Доклады АН Украинской ССР. - 1991. - N1. -С.131-134

5. Кириченко И. В., Ю. ¡0. Глеба. Индивидуальное культивирование преселектированных растительных протопластов и продуктов их слияния, в микрокаплях питательных сред. // Биополимеры и клетка. - 1991. - т. 7, N4. - С. 6-20

6. Kyrychenko I.V.. Sulimenko V.V:. Bondarcbuk L.V. et al. Analysis of plants obtained from single products of fusion of individual preselected Nicotiana protoplasts. /' International Symposium "Plant ' Biotechnology and Genetic Engineering". October 3-6, 1994, Kiev, Ukraine. Abstracts. -Kiev. - 1994. - p. 61

7. Кириченко И.В.. П.В.Мельников, Ю.Ю.Глеба. Способ индивидуального культивирования протопластов и клеток растений. АС СССР N1549225.

8. Кириченко И.В. Индивидуальное культивирование про-.топластоз в микрокаплях. // Методы клеточной биотехнологии растений. Препринт 87.1. - Киев. Институт ботаники им. Н. Г. Холодного. - 1987. - С. 14-17.

9. Кириченко И. В. Индивидуальное культивирование протопластов, в микрокаплях. // Методы культивирования расти-

тельных объектов In vitro. Препринт 88.3.- Киев, Институт ботаники иы.Н.Г.Холодного.- 1988. - С.24-28.

Кириченко И.В. Генетическая реконструкция растительной клетки при помощи микроманипуляций. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. Институт клеточной биологии и-' генетической инженерии HAH Украины, Киев, 1994.

Поскольку при массовом культивировании и слиянии протопластов растений невозможно точно определить исходный состав клеток, из которых получены растени5\-регенеранты. он задавался путем предварительной селекции родительских протопластов и их отбора из суспензии при помощи микропипетки и микроманипулятора. Были разработаны методы культивирования таких индивидуальных преселектированных протопластов, химического и электрического слияния их в желаемом сочетании и регенерации растений из полученных таким образом продуктов слияния. Полученные растения (Nicqtiana tabacum X N. tabacum, N.tabacum X \N.plumbaginifolia, N. piumbaginifolia X N.plumbaglnlfolia) показали вариабильность по морфологии, числу хромосом и изоферментным маркерам даже в том случае, когда происходили от одного и того же продукта слияния.

Ключов1 слова:

протопласта, соматична г!бридизац!я, Nicotiana.

Kyrychenko I.V. Genetic reconstruction of the plant cell by micromanipulations. ■ Ph.D. thesis. Speciality 03.00.15 - Genetics. Institute of Cell Biology.and Genetic Engineering, National Academy of. Sciences of the Ukraine. Kiev, 1994.

- 23 -

By using the procedures of mass culturing' and mass fusion of plant protoplasts, the initial composition of the cells could not be determined exactly. To be aware of this composition the parental protoplasts v/ere preselected and then picked up from-the suspension using a mlcropipette and a micromanipulator. Methods of culturlng of these individual preselected protoplasts, chemical and electrical fusion of that ones in desired combination and regenerating of the plants from the fusion products obtained In this way have been developed. The plants regenerated (Nicotiana tabacum X N.tabacum, N.tabacum X'N.plumbaginifolia, N.plumbaginifolia X N.plumbaginifolia) demonstrated 'variability in their morphology, chromosome numbers and isoenzyme patterns even when they have been grown from the same fusion product.

Шдяисано до друку I7.II.9^P Фориат 60x84/16 ■ Пяп1р дртк. Уиоа. лртк.л. 1,0. Тирах 100 пт>иц1рник. Заказ №1667

адруковано ЦУОП ДНПП " Плодвинконсврв " и. Ки1в , Ськсагйнського ,1