Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов

Никитин, Владимир Афанасьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов"

На правах рукописи

НИКИТИН

ВЛАДИМИР АФАНАСЬЕВИЧ

ООЗ16БЗОЭ

БИОФИЗИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ МИКРОХИРУРГИЧЕСКОЙ РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТКИ РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПОДХОДОВ И МЕТОДОВ

03 00 02 - «биофизика»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 3 ЬНР 2008

ПУЩИНО - 2008

Работа выполнена в лаборатории механизмов рецепции Института биофизики клетки РАН и лаборатории биофизики нервной клетки Института биологической физики АН СССР

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Соболев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Пермяков Евгений Анатольевич

доктор физико-математических наук, профессор

Акатов Владимир Семенович

Ведущая организация: Филиал Института биоорганический химии им

акад М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН, г Пущино

Защита состоится «27» марта 2008 г в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д 002 038.01 в Институте биофизики клетки РАН по адресу 142290, г Пущино, Московской области, ул Институтская, д 3, Институт биофизики клетки РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по адресу 142290, Московская область, г Пущино, ул Институтская, д 3

Автореферат разослан марта 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук,

I ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время исследования, посвященные получению жизнеспособных клеточных фрагментов и созданию на их основе новой клетки, выделились в самостоятельную область, получившую название клеточной инженерии, или реконструкции клеток Проблема реконструкции клетки и связанная с ней возможность клонирования живых организмов — одна из центральных в биологии, так как позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биофизики клетки, молекулярной биологии, биологии развития, биотехнологии Наибольший интерес вызывают задачи реконструкции эмбриональных клеток, позволяющие, по существу, приблизиться к пониманию механизмов реализации генетической информации, обеспечивая эффективный стратегический подход к получению животных с заданными свойствами и консервации генетических ресурсов (Гердон, 1977, Зеленин и др, 1982, Oguraet а), 2000)

Это направление исследований в наше время стало основным для более чем 130 лабораторий 20 стран мира, имея своим истоком классические работы лауреата Нобелевской премии Ганса Шпеманна (Spemann, 1938) поставив вопрос о целостности и идентичности генома в течение всей жизни организма, он предложил идею эксперимента по пересадке ядер дифференцированных эмбрионов в энуклеированные, активированные ооциты Появление в руках экспериментатора микроманипуляционных инструментальных средств для работы с единичной клеткой с возможностью активно вмешиваться в ее функционирование, не нанося ей значительных повреждений, — было одним из самых важных условий экспериментального развития этих исследований (Barber, 1914, Di Berardino et al, 2003) Продолжающееся совершенствование методов и новое их применение кардинально изменили экспериментальную эмбриологию и цитологию, привели к появлению нового знания о связи биофизических характеристик клетки и ее способности к развитию, внесли огромный вклад в развитие молекулярной биологии и дали импульс возникновению новых областей биотехнологии, включая терапевтическое (lllmensee, 2002, Hochedlmger, Jaenisch, 2003), фармацевтическое (Wolf et al, 2000) и репродуктивное клонирование животных (Wolf et al, 1998, Kuhholzer, Prather, 2000) Большие перспективы имеет использование методов реконструкции клетки для изучения и сохранения генофонда исчезающих видов животных, поскольку эмбриональное и соматическое клонирование является технологией, которая создает эффективный потенциал для длительного использования генетического материала, что особенно важно для решения проблемы сохранения природного биоразнообразия (Wolf et al, 2001)

Клеточная инженерия наиболее широко использует в настоящее время микрохирургические методы и подходы, к которым относится и микроинъекция в клетку и ее органеллы, — для пересадки ядер, разделения ранних предимплантационных эмбрионов, трансгенеза Однако эффективность общепринятых методов по-прежнему остается крайне низкой (1-3%), и в большинстве случаев не удается получить жизнеспособное потомство, не имеющее аномалий развития При этом характерной особенностью литературы по

реконструкции клетки, особенно с целью ее клонирования, является тот факт, что вопросам проведения самой микрооперации, как правило, вообще не уделяется внимания Только в самое последнее время появились работы, в которых авторы, в том числе Дэвид Солтер (Бо^ег, 2000) — один из создателей метода клонирования млекопитающих с помощью пересадки ядер (МсСга1Ь, БоИег, 1983), по которому работают большинство лабораторий мира, — видят причину исключительно низкой эффективности клонирования, наряду с другими факторами, в несовершенстве методологии операций По мнению (ДОакауэта, 2007), первым получившего клонированных мышей при пересадке ядер дифференцированных клеток в яйцеклетки мыши, механизмы репрограммирования станут яснее, если эффективность клонирования увеличится в результате совершенствования технологии клонирования Пока ье будут описаны и устранены незамеченные ранее недостатки методов клонирования, неудачи клонирования будут приписываться другим причинам (Реггу, УУакауата, 2002)

Таким образом, становится очевидным, что для лучшего понимания процессов, влияющих на получение полноценного потомства животных и на реализацию генетической информации, необходима экспертная оценка всех возможных факторов, от которых зависит успех этих весьма трудоемких, многоэтапных и дорогостоящих технологий Однако представляется важным рассматривать каждый из факторов в отдельности, насколько это возможно, начиная, несомненно, с весьма тонкой и сложной микрооперации на клетке с целью ее реконструкции Данная работа, начатая в 1975 году, выполнена в русле решения этих проблем

Цель и задачи исследования На основе изучения и анализа в эксперименте известных методов микрохирургии клетки, руководствуясь представлениями цитологии и биофизики клетки, выработать комплекс критериев и требований к методологии операций для того, чтобы реконструкция клеш с помощью пересадки ядер, разделения ранних предимплантационных эмбрионов, микроинъекции была успешной На этом основании разработать новые и усовершенствовать общепринятые подходы и методы, которые могут позволить сохранить или восстановить целостность клетки и ее органелл после микрохирургии, получить жизнеспособное, в том числе клонированное, потомство животных Создать также обеспечение этих методов приборами и микроинструментами для работы не только с клетками, но и с органеллами, в том числе с теми, которые по размерам являются наноструктурами, что вписывается в общее направление современных исследований, и внедрить эти подходы и методы как в практику научно-исследовательских работ, так и в практику работ, решающих проблемы биотехнологии

Для достижения этой цели были поставлены задачи

1 выявить и оценить в эксперименте возможные источники повреждения клетки при проведении микрохирургии,

2 на основании этих исследований разработать новые эффективные подходы к проведению основных этапов микрохирургии и микрсинъекции клетки и создать

базовый набор приборов и инструментальных средств специального и универсального назначений и методов работы с ними, который позволил бы проводить микрохирургическую реконструкцию клетки, сводя к минимуму риск нанесения ей нерепарируемых повреждений,

3 провести с помощью разработанных в рамках предыдущей задачи подходов и методов исследования по пересадке ядер эмбриональных клеток на мышах для получения эмбрионов, способных к полному развитию,

4 применить новые подходы, методы и инструментальные средства для репродуктивного клонирования животных разделением ранних предимплантационных эмбрионов

Научная новизна и практическая значимость. Выдвинута научно-обоснованная концепция необходимости сохранения целостности клетки как единого организма при проведении ее микрохирургической реконструкции Предложены некоторые пути решения этой научной проблемы с помощью представленных в работе научно-обоснованных технических и технологических решений комплексного подхода к проведению основных этапов микрохирургической реконструкции клетки и микроинъекции веществ и органелл в клетку, нашедшие практическое воплощение в создании эргономичного операционного блока в составе комплекса Приборов для Микрохирургии Яйцеклетки (ПМЯ-1) совместно е коллективом инженеров Института биологического приборостроения (ИБП РАН) Большинство методов, микроинструментов и приборов, представленных в работе, являются новыми, ряд методов усовершенствован, есть «пионерское» изобретение (не имеет аналогов в ограничительной части формулы изобретения) Многие из этих методов и приборов внедрены в лаборатории Институтов РАН (Институт теоретической и экспериментальной биофизики, Институт биофизики клетки, Институт молекулярной генетики, Институт биоорганической химии), в работу Института животноводства Украинской академии аграрных наук (ИЖ УААН), используются в опытном хозяйстве Всероссийского института животноводства (ВИЖ РАСХН) Применение данного подхода для микрохирургии клетки может решить проблему комплексного обеспечения научно-исследовательских лабораторий, а также Центров по биотехнологии методами, средствами и микроинструментами для микроманипуляций с клетками животных, внести значительный вклад в развитие исследований по биофизике клетки, молекулярной и клеточной биологии и биотехнологии в нашей стране, в том числе при выполнении программ по репродуктивному и терапевтическому клонированию, получению трансгенных животных с полезными свойствами, сохранению исчезающих видов животных Результаты представленной работы вошли в учебник по микроинъекции, в практические руководства по изготовлению и применению микроинструментов для микроманипуляции с эмбрионами млекопитающих, по микроманипуляционным методам экспериментальной микробиологии и используются автором в лекционном курсе "Клеточная инженерия" в Пущинском государственном университете и в

курсе лекций "Методы клеточной инженерии" в Филиале МГУ в Пущине, а также в практикумах кафедры биофизики биологического факультета МГУ и Филиала МГУ в Пущине

Применение автором микроинструментов, созданных для микрохирургии единичной клетки, в цикле работ по изучению морфогенеза маутнеровских нейронов земноводных для одностороннего удаления глаза головастиков показало возможность использования этих инструментов в микрооперациях на уровне органов С помощью созданных в работе методов удалось реализовать рецептор-опосредованный транспорт молекулярных конструкций т vivo непосредственно через половые пути (для получения трансгенных животных) и через протоки молочной железы мыши и овцы (для генетического изменения состава молока) В свою очередь опыт работы с органами привел нас к созданию принципиально новых способов и микроинструментов для фиксирования клетки при микроманипуляциях, в том числе без использования отрицательного давления, а также способа проведения быстрорепарируемой перфорации zona pellucida эмбрионов Впервые в России получена жизнеспособная особь лабораторной мыши методом пересадки ядер при сочетании микрохирургии и электрослияния В совместной работе с ВИЖ РАСХН впервые получены близнецы кроликов разделением ранних предимплантационных эмбрионов с помощью метода наложения микролигатуры, ранее не применявшимся на млекопитающих С использованием созданного в работе метода и микроманипулятора с вращающимся микроинструментом для осуществления этого метода получено жизнеспособное потомство близнецов крупного рогатого скота элитной Лебединской породы коров в результате микрохирургической реконструкции ранних эмбрионов в совместной работе с ИЖ УААН

Структура работы Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит 44 рисунка, одну таблицу и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных результатов и их обсуждения, заключения и выводов, а также Приложения «Микроинструменты для микроманипуляционных работ с единичной клеткой» В Списке цитированной литературы 369 ссылок

Апробация работы Основные результаты работы доложены на 14 отечественных и 7 международных конференциях и симпозиумах и воспроизведены в нескольких лабораториях нашей страны и в Институте зообиологии и исследования диких животных (г Берлин, Германия)

Публикации по теме работы Результаты работы отражены в 18 статьях, 8 из них в ведущих рецензируемых отечественных журналах, 3 в рецензируемых иностранных журналах, 7 в издательстве Пущинского научного центра РАН, в 27 авторских свидетельствах и патентах на изобретения, в 2 монографиях и главе в книге

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы яйцеклетки ранних эмбрионов кроликов породы шиншилла, шампань и русский горностаевый, яйцеклетки коров Лебединской

породы крупного рогатого скота и яйцеклетки лабораторных мышей — CBWA-тетрагибриды (albino), СВАхС57 (agouti) и C57BL/6 Получение эмбрионов, определение их жизнеспособности, подготовку для микрохирургии и культивирование т vitro проводили по стандартным методикам (Whitten, 1971, Дыбан, 1974, Hoppe, lllmensee, 1977, Березовская и др, 1986) Микроманипуляции на клетках проводили, в основном, по разработанным в процессе исследования методам, с помощью специальных оригинальных микроинструментов и приборов Приборы изготавливались совместно с ИБП РАН, г Пущино, микрокузница упрощенного типа разработана и изготовлена автором Методика электрослияния кариопласта донора и цитопласта реципиента также была разработана в экспериментах Трансплантацию зигот мышей в яйцеводы проводили по методу, описанному в работе (Tarkowski, 1959) Трансплантацию перевязанных пополам эмбрионов кролика в половые пути суррогатных самок кролика осуществляли совместно с сотрудниками отдела генетики ВИЖ РАСХН, перенос полуэмбрионов коров в яйцеводы суррогатных самок коров проводили совместно с сотрудниками Института животноводства УААН (Украина)

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I Общие подходы для всех видов микрургии единичной клетки

Разработан и применен принцип комплексного подхода к проведению работ по реконструкции клеток млекопитающих животных — лабораторных мышей, коров, кроликов Мы проводили поэтапный предоперационный анализ возможных источников повреадения клетки и, руководствуясь полученными данными, разрабатывали подходы и создавали методы и средства для снижения возможности таких повреждений, сочетая специальные подходы и методы для разных видов микрохирургии со стандартизацией основных способов, в том числе имея в виду уменьшение продолжительности операции Предложен и создан на базе ИБП РАН комплекс Приборов для Микрохирургии Яйцеклетки (ПМЯ-1), представляющий собой эргономичный операционный блок, разделенный на функциональные зоны, оснащенный арсеналом приборов и инструментальных средств для реализации комплексного подхода к реконструкции клетки Проведение всех этапов операции с использованием ПМЯ-1 позволило учесть и человеческий фактор — необходимость при проведении микрохирургии сохранить точность и эффективность действий экспериментатора — одного из главных условий успешной микроманипуляции

1.1 Комплекс приборов для микрохирургии яйцеклетки (ПМЯ-1)

Функциональная схема ПМЯ-1 представлена на рисунке 1 Слева и справа в первую и вторую зону комплекса могут подключаться помощники экспериментатора, что бывает необходимо для проведения сложных и серийных микроопераций ПМЯ-1 обеспечил возможность проведения всего цикла реконструкции клетки в едином пространстве, в т ч с тем, чтобы каждую операцию проводил отдельный экспериментатор Циклы, таким образом,

могут многократно повторяться и занимают меньше времени. Кроме того, такой комплекс позволил подойти к стандартизации протоколов микроопераций на клетках, что очень важно для того, чтобы сопоставлять собственные результаты с результатами, полученными разными экспериментаторами.

Приборы и методы, составившие основу ПМЯ-1, — антивибрационная установка для прецизионных работ с микрообъектом; микроманипуляторы специального назначения — пневматический микроманипулятор с вращающимся микроинструментом и возможностью микроинъекции и микроманипулятор для пересадки ядер; многодозовый микроинъектор; устройство и способ для заточки микроинструментов; прибор для вытяжки стеклянных капилляров; микрокузница. На них были получены авторские свидетельства на изобретения, а на один прибор, микроманипулятор для пересадки ядер, патент на изобретение, подтвержденный в 7 странах. Эти приборы и методы рассматриваются в соответствующих главах диссертации при описании конкретного применения их для решения различных задач микрохирургии клетки. В данном разделе описаны только те из них, которые используются для

некоторых задач микрохирургической реконструкции клетки. 1.1.1. Микрокузницы. Были разработаны два варианта микрокузниц; микрокузница упрощенного типа, доступная для изготовления в любой лаборатории (отмечена на выставке ВДНХ бронзовой медалью), и оригинальная микрокузница МК-2 (А. с. № 1183469). Микрокузница МК-2 имеет свое собственное устройство для вытягивания микропипеток; на ней можно использовать нити накаливания различных форм и заменять их в процессе работы простым поворотом головки держателя нитей. На МК-2 впервые заготовка может вращаться вокруг своей оси, что значительно расширило виды работ, которые можно производить на микрокузнице. Есть также специальное поворотное устройство, благодаря которому можно обрабатывать микроинструмент со всех сторон, в том числе с торца, под контролем микроскопа. Кроме того, на МК-2 можно устанавливать созданную нами пневматическую головку микроманипулятора, имеющую своё поворотное устройство, и микроинструмент изготавливать непосредственно на ней, а затем, не вынимая его из держателя, переносить головку с микроинструментом с микрокузницы на микроманипулятор для проведения операций. Коаксиальное устройство ручек управления нитью накаливания позволило одной рукой

Рис. 1. Схема зон ПМЯ-1 (слева.): I — зона приготовления объекта исследования: II — зона изготовления микроинструментов; III — зона микоохиоуогии клетки, Обший вил ПМЯ-1 Iciwaea).

перемещать ее по двум координатам. Этих возможностей не предоставляет ни одна из известных микрокузниц.

1.1.2. Заточка микроинструментов. Общепринятые устройства для заточки оставляют на микроинструменте микроскопические продукты шлифовки, которые могут попасть как на поверхность клетки во время операции, так и внутрь ее, и не позволяют контролировать весь процесс заточки, шлифовки и очистки микроинструментов от отходов.

Было разработано и изготовлено заводским способом устройство для заточки микроинструментов, в котором эти факторы учтены (Рис. 2). Потоком воды (3) можно регулировать величину мениска (4), который является показателем степени прижима затачиваемого микроинструмента силой поверхностного натяжения к абразивному диску (1): чем меньше мениск, тем интенсивней происходит заточка. Большой мениск создает режим шлифовки кончика микроинструмента.

1.2. Специализированные приборы и методы, не вошедшие в ПМЯ-1

1.2.1. Микроманипулятор, снижающий поперечные колебания микроинструмента. При прокалывании клеточной мембраны легко нарушить ее целостность из-за возможных поперечных колебаний микроинструмента. Для того чтобы устранить эти колебания, был разработан микроманипулятор с жидкостным демпфером поперечных колебаний микроинструмента (А. с. № 1261789). Демпфером служит магнитострикционная жидкость, находящаяся в поле соленоида. Кончик микроинструмента помещен в магнитострикционную жидкость, которая сжимается под действием электромагнитного поля и тем самым фиксирует микроинструмент, устраняя его поперечные колебания при скачкообразном (резком) перемещении. Это расширило диапазон микроманипуляционных операций: можно, фиксируя микроинструмент, перемещать его по продольной оси, вырезать отверстия в клеточных структурах вибрационным способом, можно проводить дезинтеграцию клеток, внутриклеточных органелл и др. Возможность жесткой фиксации микроинструмента в одном положении, кроме устранения его поперечных колебаний, очень важна при долговременных микрооперациях.

1.2.2. Магнитострикционный микроинъектор. Прецизионный магнитострикционный микроинъектор (А. с. № 1 136810) обеспечил получение малых доз инъецируемой жидкости (до долей пиколитра) за счет использования магнитострикционного материала вместо обычного поршня. Ступенчатое изменение напряженности постоянного поля, воздействующего

Рис. 2. Схема заточки микропипетки на микрокузнице под контролем микроскопа (А. с. № 1315248). 1 -абразивный диск; 2 - микропипетка; 3 - поток воды; 4 - мениск воды: чем он меньше, тем сильнее степень прижима микропипетки к диску.

на магнитострикционный материал, обеспечивало многократное дозирование, а установка величины ступени, управляющей полем воздействия, задавала величину дозируемого объема, 1.2.3. Микроинструменты. Разработано 74 оригинальных микроинструмента для различных микрохирургических манипуляций по реконструкции единичной клетки (см. Приложение). Из них 10 микроинструментов (Рис. 3) сделаны специально для использования их с новым микроманипулятором для пересадки ядер: характерной их особенностью является то, что они полые, и в них можно вставлять дополнительный микроинструмент для микрохирургии клетки.

Рис. 3. Специализированные микроинструменты для пересадки ядер. Все представленные в Приложении микроинструменты можно изготавливать на микрокузнице МК-2 и использовать для самых различных задач эксперимента: прижима клетки ко дну камеры

с возможностью смены сред, разделения клеток, наложения микролигатуры петлей с изменяющимся диаметром, микроинъекции и др. Данный арсенал микроинструментов обеспечил решение многих задач реконструкции клетки,

1.2.4. Микрокамера (открытого типа). (Рис. 4). В микрокамере обеспечен открытый доступ для введения клеток в процессе работы и отбора прооперированных клеток при помощи капиллярной микропипетки: в ней можно работать микроинструментами прямого типа, что удобнее и требует меньше времени при их изготовлении и установке по сравнению с изогнутыми в общепринятых камерах. Микроинструменты вводят в микрокамеру за считанные секунды без риска их повредить. Для этого необходимо сначала сфокусировать микроскоп на исследуемой клетке в камере, затем отвести ее препаратозодителем в сторону. Не меняя положения объектива, поместить кончики микроинструментов з поле зрения микроскопа и с помощью микроманипуляторов навести на

Рис. 4. Микрок.амера открытого типа. А - 1 - предметное стекло; 2 - корпус; 3 — гайка; 4 - контргайка; 5 каретка, 6-7 — микроинструменты. Микрокамеру можно свободно передвигать по предметному стеклу вместе со средой и эмбрионами для смены эмбрионов и среды. Б - вид сбоку. (A.c. № 1461758).

резкость Одним движением препаратоводителя возвратить камеру с клеткой в прежнее положение до появления клетки в поле зрения Можно работать одновременно несколькими микроинструментами, установленными вокруг микроскопа любого типа в секторе до 300 градусов Число манипуляций, необходимых при подготовке к проведению микрохирургии в этой камере, по крайней мере, в 2-3 раза меньше, чем в общепринятых камерах I 2 5 Способ удерживания клетки микропипеткой-держателем Ставший уже классическим способ фиксации (удерживания) клетки для проведения микрохирургии или микроинъекции при помощи микроприсоски-держателя имеет один весьма существенный недостаток - в процессе удерживания клетки из нее сравнительно легко может выходить содержимое в полость микроприсоски-держателя под действием отрицательного давления, что видно непосредственно под микроскопом Это давление, в зависимости от конфигурации микроприсоски-держателя, равно от 0,05 до 0,1 кг/см5, тогда как для фиксации клетки достаточно давления на порядок или даже на два порядка ниже (Lin, 1967)

По новому способу (А с № 1616680), за счет капиллярных сил самой микропипетки-держателя в полости ее создавалось минимальное давление, достаточное для закрепления клеток (0,002-0,05 кг/см2, по нашим расчетам) Определяли положительное давление Р, сжатого воздуха, подаваемое в микропипетку, из условия (-Рз) < Рг < Ркр, где Рз - давление, создаваемое капиллярными силами, удерживающими клетку на кончике микроприсоски, Р«р -критическое давление начала выхода пузырьков воздуха их кончика микропипетки Для того чтобы действие капиллярных сил мениска обеспечивало необходимое давление Рз закрепления клетки на кончике микропипетки, объем Vi области всасывания выбирали из условия Vi - V«, = V2 => Vi = Уг + V№, где Vm - объем клетки, Уг - объем вытесненного из микропипетки водного раствора при изменении давления от Рз до Р, Регулировать степень присасывания клетки следует положением мениска среда-воздух внутри полости микроприсоски Это важно при микрохирургии, так как излишнее присасывание части клетки во время операции приводит к возникновению внутриклеточного давления, и при проколе клетки через перфорацию мембраны возможна утечка цитоплазмы Способ позволял сохранить жизнеспособность не менее 92% клеток при микрохирургических операциях, когда удерживание клетки (фиксацию) проводили с помощью микроприсоски-держателя

II. Пересадка ядер II1. Пересадка ядер с помощью сочетания методов микрохирургии и электрослияния

Особое внимание уделялось анализу источников возможных повреждений клеток при микрохирургии и созданию методов и приборов, снижающих риск нанесения клеткам нерепарируемых повреждений

Микроинструменты для пересадки ядер или пронуклеусов изготавливали из капилляров, приготовленных на приборе для вытяжки капилляров из трубок молибденового стекла

Микропипетки оттягивали на разработанной в настоящей работе микрокузнице (см 111) Для успеха операции пересадки ядер важен был правильный выбор места прокола мембраны яйцеклетки Это место в экспериментах было одним и тем же во всех операциях' на противоположном (вегетативном) полюсе от направительного тельца энуклеированной зиготы, что в какой-то мере обеспечивало стандартизацию метода пересадки ядер Применение цитохалазина Б в концентрации 5 мкг/мл и разбавление среды на 20% дистиллированной водой облегчало проникновение микроинструмента под zona peliucida и последующее извлечение ядер яйцеклеток Число удачных операций по энуклеации у одно- и двухклеточных эмбрионов возрастало до 70-90% по сравнению с 20-30% при проведении микрохирургии этих эмбрионов в неразбавленной среде Операции проводили на клетках с интактной zona peliucida Чувствительность яйцеклеток мыши к микрохирургическим манипуляциям изменялась в течение времени, предшествующего первому делению Было установлено, что оптимальное время проведения операций — непосредственно перед делением, как для клеток-реципиентов, так и для клеток-доноров

Микрохирургия яйцеклеток — была самым ответственным этапом пересадки ядер (или пронуклеусов), так как проникновение микропипетки в клетку, как правило, сопровождается значительными ее деформациями и повреждениями Благодаря новому устройству для заточки микроинструментов (см 112, Рис 2), была сделана специальная микропипетка для пересадки ядер с особой заточкой кончика с четырех сторон и цилиндрической внутренней полостью благодаря чему ядро внутри микропипетки не деформировалось Такой кончик легко проходил через zona peliucida, делая в ней щелевую перфорацию, а в момент извлечения его из zona peliucida происходил отрыв кариопласта от цитопласта (Рис 5) Обычная микропипетка делает перфорацию круглой, и тяж, соединяющий цитопласт с кариопластом, при удалении последнего из зародыша часто получается толстым и остается очень длинным после удаления микропипетки вплоть до окончательного отрыва При этом происходят потери содержимого клетки, что нежелательно, особенно если цитопласт предполагается использовать в дальнейшем Новая микропипетка для пересадки ядер производила перфорацию не расклинивая zona peliucida, а разрезая ее по профилю полукруглого сечения кончика При удалении кариопласта полукруглый разрез от кончика этой микропипетки легко смыкался, т е перфорация получалась быстрорепарируемой (см рис 5, в, 1,2, 3, 4)

Обычно удерживание эмбриона осуществляется с помощью микроприсоски-держателя за счет применения отрицательного давления При изучении процессов, происходящих при такой фиксации, нами было показано, что происходит утечка содержимого перивителлинового пространства и цитоплазмы бластомера (Рис 6) через несколько минут после помещения на микроприсоску-держатель клетка заметно уменьшается в объеме Процесс этот нелинейный он зависит от величины отрицательного давления, создаваемого микроприсоской-держателем, от времени удерживания клетки на ней, от начального положения бластомера в zona peliucida относительно выходного отверстия и прямо пропорционален размеру выходного отверстия

Рис. 5. Схемы формы и заточки кончика микропипетки для пересадки ядер, образования перфорации в процессе проникновения кончика полученной микропипетки через zona pellucida и фото пересадки ядер с помощью этой микропипетки, а, 1,2, 3 - профили кончика; б — схема заточки; е, 1, 2,3,4 — этапы образования перфорации в zona pellucida клетки; г — энуклеация эмбриона мыши, виден короткий тяж цитоплазмы в момент выхода микропипетки из zona pellucida. Кончик делает щелевую перфорацию в zona pellucida, и при извлечении микропипетки за ней не тянется тяж содержимого эмбриона, как это происходит у (McGrath, Solter, 1983).

микроприсоски-держателя. Сначала вытекает содержимое перивителлинового пространства, а затем, с меньшей скоростью, уменьшается размер бластомера. В связи с приведенными данными был разработан и использовался новый метод удерживания клетки, оптимизирующий этот процесс за счет использования капиллярных сил микроприсоски-держателя.

Рис. 6. Изменения эмбриона во времени при удерживании его на микроприсоске-держателе. А - эмбрион в начале фиксации на микроприсоске-держателе; Б - тот же эмбрион через 4 минуты фиксации;

внизу — график изменений размеров эмбриона.

—•— эмбрион —|з—бластомер

перивителлиноеое пространство

i 2 3 4 5 6 7 э 9 10 11 время (мин)

Рис. 7. Капсула-держатель для ранних эмбрионов. Слева - эмбрион помещают в капсулу без применения отрицательного давления. Справа - после операции эмбрион удаляется из капсулы небольшим положительным давлением

В дальнейшем была разработана капсула-держатель (Рис. 7), с помощью которой фиксировали эмбрион, вообще не используя отрицательное давление.

Необходимым завершающим этапом получения реконструированных клеток является процесс слияния кариопласта донора и цитопласта (оопласта) реципиента. Слияние кариопласта и цитопласта проводили методом электропробоя мембран. Метод локального электрослияния для введения кариопласта в цитопласт мышиных зигот с использованием электродов со специальным изолирующим покрытием был впервые применен в настоящей работе (Рис. 8, справа).

Рис. 8. Общая схема пересадки ядер сочетанием микрохирургии и электрослияния и фотографии этого

процесса.

После микрохирургии жизнеспособными оказались 90% прооперированных зигот. Количество удачных электрослияний от числа эмбрионов, выживших после микрохирургии, составило 76,4%. Эти результаты были независимо подтверждены Тсунода с соавт. (Tsunoda etal., 1987).

Н.2. Микроманипулятор (для пересадки ядер)

Общепринято проводить микрооперации на клетке по следующей схеме: клетку закрепляют с помощью микроприсоски-держателя и раздельно вводят внутрь клетки различные микроинструменты, необходимые для оперирования. Был создан, запатентован и сдан в серийное производство специальный микроманипулятср для пересадки ядер и других органелл и разработан новый способ операций на клетке (Patent 2 553 432, France). На рисунке 9 представлена схема операции пересадки ядер с помощью нового микроманипулятора по этому новому способу. Микроинструмент представляет собой две помещенные друг в друга микропипетки: наружная является микропипеткой-держателем, а внутренняя — микроинструментом для микрохирургии с одним или двумя каналами. В результате для проведения пересадки ядер было достаточно одного микроманипулятора, а не двух и более, как обычно.

Благодаря тому, что данный микроманипулятор позволял проводить все этапы пересадки ядер микроинструментами, проходящими в клетку через полость

микропипетки-держателя, можно было фиксировать клетку капсулой-

держателем, не используя отрицательное давление, придерживая клетку за счет упора 5. Все микрохирургические манипуляции проводили через один прокол. Такой способ микрооперации практически не приводил к потере содержимого перивителлинового пространства. Известные манипуляторы не позволяют осуществлять операции по нашему способу, так как каждый управляет только одним микроинструментом, Это усложняет микрооперацию, и процесс

III. Микроинъекция 111.1. Микрокамера для многодозоеых микроинъекций.

Для проведения серийных микроинъекций был предложен новый принцип устройства микрокамеры, в которой среда с клетками и инъецируемый раствор, например, раствор ДНК, разделены гидрофобным покрытием и воздушной прослойкой (Рис. 10). Благодаря этому не происходит их взаимного разбавления и снижается загрязнение кончика микроинструмента при микроинъекции. Кроме того, так как в этой микрокамере многодозовые микроинъекции проводились без изъятия микропипетки из камеры, не происходило соприкосновения микроинструмента с маслом и проникновения масла в клетки.

II 1.2. Изготовление и заполнение микропипеток

Для микроинъекции ДНК в ядра клеток был разработан способ изготовления микропипеток из капилляров с неравномерной толщиной стенок (А. с. № 966043). Благодаря

Рис. 9. Схема пересадки ядер {слева) и микроманипулятор для пересадки ядер (справа). 1 - капсула-держатель; 2 - бластомер; 3 -ядро для энуклеации; 4 - ядро для пересадки; 5 - стеклянная пластинка для упора; 6 - изотонический раствор; 7 - давление для удаления эмбриона из капсулы-держателя; 8 - упор, после пересадки ядоа снимается.

микроманипулирования замедляется.

Рис, 10. Микрокамера для многодозовых микроинъекций (А, с, № 1595899). 1 -микроприсоска-держатель, 2 - среда с клетками, 3 - клетка, 4 - гидрофобное покрытие, 5 - раствор для микроинъекции, 6 - микроинъекционная микропипетка, 7 - масляный затвор.

утолщению стенки капилляра при вытягивании микропипетки обрые происходил таким образом, что образовывался скошенный колющий кончик (Рис. 11), который уже не нужно

затачивать. Капилляры получали, используя различные приемы: неравномерный нагрев стенок, предварительное стачивание трубки, из которой изготавливают капилляры, вплавление внутрь него стеклянных вставок (филаментов). Капилляры делали с 3 и больше вставками, плотно прилегающими друг к другу вместо одной, как у коммерческих (Агаогде, 1982). Плотная упаковка филаментов в микропипетке позволяла ускорить процесс заполнения растворами ДНК. Предложен также способ заполнения таких микропипеток растворами ДНК. Раствор ДНК набирали в тонкий капилляр и помещали внутрь микропипетки, затем, при создании положительного давления жидкость заполняла конусную часть микропипетки, после чего по вставкам стекала в оттянутую часть и проходила через кончик микропипетки. Этот способ заполнения давал возможность непрерывно инъецировать до 1000 клеток, а положительное давление, создаваемое микроинъектором, предохраняло от засорения кончика микропипетки частицами культуральной среды и цитоплазмы. Мы использовали этот метод для проведения микроинъекций в эпителиальные клетки молочной железы мышей линии НС-11 со скоростью от 700 до 1400 микроинъекций/час без применения автомата, вручную, для введения ДНК-переносящей конструкции.

111.3. Микроинъектор (многодозовый)

Для многодозовых микроинъекций был разработан специальный микроинъектор (А. с, № 1223917). Для того чтобы не зависеть от возможного воздействия паразитной деформации шланга, в этом микроинъекторе плунжер механически связан с микроманипулятором. На рисунке 12 показана схема инъецирующей части многодозового микроинъектора и его общий вид, Внутрь конусной части микроинъекционной пипетки введен тонкий металлический микростержень (плунжер) 4 диаметром до нескольких десятых миллиметра, фактически служащий поршнем. Микроманипулятор, приводящий в движение плунжер, имеет редукцию усилий порядка 1:40000 за счет деформации мембраны и не имеет механических приспособлений. Благодаря этой уникальной величине редукции усилия микроинъектор обеспечил получение микродоз до фемтолитров (1 фемтолитр = 1 куб. микрометр) при очевидной простоте управления.

оттягивание

Рис. 11. Схема изготовления микропипеток со скошенными кончиками. А - сечение исходного капилляра с впаянными внутрь стеклянными филаментами, Б -сечение капилляра со смещенным внутреннем просветом, В сечение капилляра со шлифованной стороной, Г -сечение капилляра с напаянной накладкой из стекла.

Рис. 12. Слева — схема микропипетки многодозового микроинъектора с плунжером в конической части. 1 -кончик микропипетки, 2 - инъецируемый раствор, 3 - уплотнитель для плунжера, 4 -плунжер, 5 - ствол микропипетки, 6 - капилляр, удерживающий уплотнитель с разной степенью прижима к конусной части микропипетки. Справа—общий вид многодозового микроинъектора.

Во всех фирменных микроинъекторах лимитирующим фактором точности доз до сих пор остается деформация шлангов в процессе инъекции, проблема, которой нет в нашем микроинъекторе. Таким образом, впервые предлагается весьма простой способ инъецировать такие сверхмалые объемы как фемтолитры через стеклянные микропипетки.

IV. Получение генетически идентичных монозиготных близнецов IV. 1. Разделение эмбрионов методом наложения микролигатуры

--Репродуктивная характеристика

кроликов, включая простоту контролирования времени овуляции, сделало их удобной моделью для исследований в эмбриологии, биологии развития, генетической инженерии.

Рис. 13. Перевязка двубластомерного эмбриона °«HaK0 попь,тки получить кролика методом наложения лигатуры с однояйцовых близнецов у кроликов использованием капсул-держателей._ практически не имели успеха: методы

разделения эмбрионов, которые были разработаны для эмбрионов коров, не подходили для эмбрионов кролика (Brochart, 1954; Ogawa et al., 1983; Hahn, 1984).

Тот факт, что эмбрионы кролика имеют плотный, липкий слой муцина, затрудняющий использование инвазивных методов микрохирургии, привел к необходимости разработки альтернативного способа разделения эмбрионов. Таким стал новый метод разделения эмбрионов наложением лигатуры, ранее не применявшийся на млекопитающих. Для перевязки ранних эмбрионов кролика использовали специально разработанные микроинструменты: капсулы-держатели и петлю с изменяющимся диаметром в качестве микролигатуры.

На рисунке 13 представлены фотографии этапов перевязки 2-х клеточного эмбриона кролика. Под эмбрион подводили капсулу-держатель и помещали в нее один из двух

Рис. 13. Перевязка двубластомерного эмбриона кролика методом наложения лигатуры с использованием капсул-держателей.

бластомеров (фото А) (или половину бластомеров в случае перевязки эмбриона на более поздних стадиях). Второй бластомер двубластомерного эмбриона помещали во вторую капсулу-держатель (фото Б), между бластомерами подводили микролигатуру и затягивали петлю. Эмбрионы с наложенной лигатурой (фото В) помещали в яйцеводы суррогатных самок. Было выполнено 35 операций трансплантации перевязанных пополам двубластомерных эмбрионов кролика. Получено 5 фенотипически нормальных крольчат от трех самок-реципиентов из половинок эмбрионов, перевязанных пополам на стадии 2-х бластомеров

В последующих экспериментах проводилось разделение эмбрионов на более поздних стадиях развития, от 4-х до 64-х бластомеров, по той же методике.

Разделенные эмбрионы вместе с микролигатурой помещали в среду для культивирования. 19 змещали в рог матки

крольчих-реципиентов, которых спаривали перед этим с вазектомированными самцами. От четырех крольчих-реципиентов получено 6 крольчат-трансплантантов, в том числе пара однояйцовых близнецов-самцов (31,6%).

С целью стандартизовать методику наложения микролигатуры на эмбрион был создан прибор и метод для разделения яйцеклеток наложением микролигатуры (Рис. 14). Случаев неудачных перевязок с помощью описываемого прибора и метода с применением капсул-держателей, фиксированных в микроманипуляторе, не наблюдалось, в отличие от наложения микролигатуры вручную (20-30% неудачных перевязок двубластомерных эмбрионов).

(14,3%).

Рис. 14. Схема наложения микролигатуры на двубластомерный эмбрион с помощью микроманипулятора для наложения лигатуры (слева) и общий вид микраманипулятора (справа) (А. с. № 1327333).. 1 - микродержатель; 2 - эмбрион; 3 — среда; 4 - покровные стекла микрокамеры; 5 - втулка для петли; 6 - микропетля; 7 - съемник микропетли; 8 - капроновая нить с петлей; Э - магнитные держатели нити; 10 - металлические платформы для перемещения магнита (показано стрелками). Микропетлю затягивают перемещением металлических платформ 10.

перевязанных пополам эмбрионов после культивирования /л vitгo пс

1 2 з

Рис.15. Микроигла для разделения эмбрионов (А. с. № 1727821). А - вид сбоку, Б - вид сверху. 1 - конусовидное утолщение; 2 - цилиндрическая часть; 3 -кончик микроиглы; 4 - эмбрион

IV.2. Разделение ранних эмбрионов мыши с помощью минроиглы

За счет особых приемов микрооперации с помощью микроиглы можно свести к минимуму (по сравнению с разрезанием скальпелем или бритвой) травмирование клетки: не разрезая эмбрион, а раздвигая бластомеры или группы бластомеров. Стандартные микроиглы, предлагаемые фирмами, — это весьма длинный и тонкий микроинструмент. Управлять движением такой микроиглы во время операции, с применением микроманипулятора или без него очень сложно. В настоящей работе использовали специально изготовленную микроиглу для клонирования доимплантационных эмбрионов животных (Рис. 15), Она выполнена из стекла и имеет острие и цилиндрическую часть, переходящую в конусовидное утолщение, которое сопряжено с держателем для закрепления в микроманипуляторе.

Разрезание эмбрионов цилиндрическим участком микроиглы проводили на предимплантационных эмбрионах тетрагибридных мышей СБ\Л/А всех стадий развития, от двубластомерных до бластоцисты. Микроманипулятором подводили цилиндрическую часть микроиглы 2 к середине эмбриона 4. Опираясь на острие 3, опускали ее на эмбрион 4 точно по его диаметру. Конусовидное утолщение 1, расположенное выше рабочей цилиндрической части 2, не позволяло эмбриону выскальзывать из-под рабочей части 2 а момент надавливания и разделения, и в результате происходило разделение эмбриона на две равные половинки под визуальным контролем микроскопа. В таком виде половинки эмбриона можно культивировать, а при разделении бластоцисты — трансплантировать с половые пути суррогатной самки.

Оказалось полезным использовать для исследовательских целей разрезание эмбрионов широким участком микроиглы, чтобы при разделении эмбрионз сразу понять, какой из бластомеров материнский, а какой — дочерний. При надавливании на эмбрион на стадии 2-х или 4-х бластомеров с помощью широкой части микроиглы, можно было непосредственно под микроскопом наблюдать начало разделения бластомеров: дочерний бластомер, обладая меньшей вязкостью, начинал первым отходить от материнского, Это дает возможность получения генетически идентичных особей, о которых точно известно, происходят они из

материнского бластомера или из дочернего, а при разделении 4-х клеточного эмбриона — от одного материнского и одного дочернего или от двух дочерних.

IV.3, Разделение предимплантац ионных эмбрионов скальпелем

Этот метод характерен тем, что экспериментатор видит режущий инструмент только сверху и

Рис. 16. Схема оптического адаптера для контроля за ходом операции. I вид сбоку, II вид снизу. А: 1 — бинокуляр микроскопа; 2 - микроскальпель; 3 - эмбрион; 4 - прозрачная кювета с раствором; 5, 6 - оптические призмы. Б: 1 - отражение эмбриона; 2 - эмбрион; 3 -микроскальпель; 4 — основание кюветы; 5 -микоог.кальпвпь. вип снизу: й - амбпипн пил снизу

ограничен в возможности контроля процесса разрезания Для успешного разделения эмбрионов с помощью скальпеля или бритвы необходимо контролировать как положение плоскости разреза эмбриона и положение бластомеров, так и положение микроинструмента относительно эмбриона в процессе разрезания Это было достигнуто нами с помощью специально сконструированного оптического адаптера, позволившего видеть сбоку и эмбрион, и его отражение, что дало возможность наблюдать движение микроинструмента вплоть до основания микрокамеры (А с № 1804807) (Рис 16) Благодаря этому устройству удалось обеспечить полный визуальный контроль за микрооперацией разделения эмбрионов с целью свести к минимуму повреждение и эмбриона, и микроинструмента Такой контроль не обеспечивает ни один из известных приборов для микрохирургии клетки

IV 4 Репродуктивное клонирование коров

(Новый способ разделения эмбрионов) Нами был создан новый, оригинальный микроманипулятор с дистанционным управлением, который позволяет передвигать микроинструмент не только по трем координатам, но и совершать поворот вокруг его оси Этот микроманипулятор может эффективно использоваться для микроинъекций, для пересадки ядер и других органелл, а также для разделения эмбрионов

Микроманипулятор апробировали на ферме НИИ животноводства Лесостепи и Полесья Украины (г Харьков) на эмбрионах коров элитной Лебединской породы Использовали 7-8 дневные криоконсервированные эмбрионы на стадии ранней бластоцисты, у которых проназой удаляли zona pellucida Разделение эмбрионов проводили в капле среды для микрохирургии стеклянной микроиглой без фиксации зародыша микроприсоской Микрохирургическое разделение эмбрионов после криоконсервации имеет свои особенности, связанные с тем, что такие эмбрионы хуже дезагрегируются, а бластомеры легче повреждаются С помощью нового микроманипулятора разделение бластоцист проводили особым приемом микроманипулятор продвигал микроиглу одновременно вниз, перпендикулярно плоскости эмбриона, и вправо-влево, по часовой стрелке и против часовой стрелки, не раздавливая бластомеры, а как бы раздвигая их Таким способом удавалось осуществить разделение эмбрионов без видимых повреиздений бластомеров Из 12 разделенных пополам криоконсервированных зародышей получили 24 морфологически полноценные половинки зародышей При культивировании 4-х половинок в течение 12 часов из трех сформировались эмбрионы (75%) уменьшенных размеров Этот выход довольно высокий, с учетом того факта, что использовались криоконсервированные эмбрионы Остальные половинки эмбрионов пересадили 10 синхронизированным коровам-реципиентам, по одной паре полуэмбрионов каждой корове По данным ректального исследования на 90 день после пересадки 3 реципиентные коровы были стельными (30%) Было роздено 3 жизнеспособных теленка (15% от числа пересаженных коровам полуэмбрионов)

Заключение

Понадобилось почти 40 лет, чтобы начались первые работы по реконструкции клеток млекопитающих, более известные как клонирование, идея которых была предложена в 1938 году Шпеманном Для ее осуществления не было приборов, методов и микроинструментов, с помощью которых можно было бы манипулировать клетками млекопитающих В нашей стране ко времени начала настоящих исследований микроманипуляционная техника была представлена несколькими видами отечественных микроманипуляторов, в основном для статических задач электрофизиологии — их весьма сложно использовать для микрохирургии клетки, и одним французским микроманипулятором Фонбрюна, работа с помощью которого также встретилась с рядом трудностей В то же время наметившиеся успехи в клонировании клеток млекопитающих продемонстрировали большие перспективы этого направления исследований В целом складывалось такое положение, что для решения этих задач в наших условиях неудовлетворительное соотношение цены и качества зарубежных приборов и микроинструментов при практически полном отсутствии отечественного оборудования для микрохирургии клетки, приводило к необходимости создания фактически заново всего комплекса методов и средств для реконструкции единичной клетки животных, а также изучения влияния различных факторов на жизнеспособность реконструированной клетки и потенциал ее развития

В представленной работе выдвинута идея комплексного подхода к проведению всех этапов микрохирургической реконструкции клетки для того, чтобы преодолеть ряд факторов, оказывающих вредное влияние на реконструируемые эмбрионы Таких, например, как потери содержимого клетки при ее удерживании с применением отрицательного давления в держателе, продолжительность микрооперации, связанная с ее многокомпонентностью, важность сохранения точности и эффективности действий рук экспериментатора при проведении многоэтапной и трудоемкой микрохирургической реконструкции клетки Качество операций во многом является производной этих факторов, и это уже невозможно игнорировать Нами разработан, а затем изготовлен на базе ИБП ран комплекс Приборов для Микрохирургии Яйцеклеток (ПМЯ-1) Комплексный подход в нем обеспечивается наличием эргономичного операционного блока, разделенного на функциональные зоны, что сделало возможным проведение всего цикла реконструкции клетки в едином пространстве, причем каждую операцию может проводить отдельный экспериментатор, в координации с другими, что позволяет достигнуть высокой степени профессионализма и стандартизовать методы Впервые предложен метод фиксации клетки при микрохирургии без использования отрицательного давления, с помощью капсулы-держателя, принципиально изменивший условия проведения операций Создана специальная микропипетка для пересадки ядер возникшие после проникновения ее отверстия в zona pellucida эмбрионов быстро репарируемы Разработанный и изготовленный микроинъектор впервые обеспечил возможность микроинъецирования в клетку и ее органеллы сверхмалых доз вплоть до фемтолитров и аттолитров Новый способ разделения эмбрионов на половинки наложением лигатуры позволил впервые получить близнецов кролика Предложенный в работе новый метод разделения эмбрионов с помощью мироманипулятора с вращающимся вокоуг собственной оси микроинструментом, позволил впервые получить живое потомство близнецов крупного рогатого скота Лебединской породы коров Предложенные в работе подходы, методы и приборы для их осуществления успешно внедрены в работу ряда Институтов и Биотехнологических центров

Выводы

1 Впервые разработан и применен на практике принцип комплексного подхода к проведению всех этапов микрохирургической реконструкции и микроинъекции единичной клетки, включающий создание эргономичного операционного блока, разделенного на функциональные зоны

2 Изготовленный на основании этого подхода комплекс Приборов для Микрохирургии Яйцеклетки (ПМЯ-1) позволил проводить практически все методы микрохирургии клетки в едином пространстве, а также обеспечил возможность проведения каждого этапа отдельным экспериментатором, что значительно снизило время операций

3 В дополнение к ПМЯ-1 созданы методы и устройства, являющиеся естественным развитием принципа комплексного подхода к микрохирургии клетки метод и прибор для наложения микролигатур, многодозовый магнитострикционный микроинъектор, микрокамеры - открытого типа и для многодозовых микроинъекций, метод и устройство для контроля проведения микрохирургического разделения эмбрионов

4 Разработан принципиально новый способ фиксирования клетки для микроманипуляций без использования отрицательного давления с целью сохранения ее целостности и созданы микроинструменты для его осуществления

5 Создан арсенал микроинструментов, 74 вида, снижающих риск нанесения нерепарируемых повреждений клеткам, с помощью которого можно проводить большинство видов известных операций на клетке

6 Впервые получена жизнеспособная особь лабораторной мыши реконструкцией зигот при сочетании микрохирургии и электрослияния с применением новых методов и микроинструментов для пересадки ядер

7 Методом наложения микролигатуры, не применявшимся ранее для разделения предимплантационных эмбрионов млекопитающих, с использованием новых микроинструментов, капсулы-держателя и петли с переменным диаметром, получено жизнеспособное плодовитое потомство кроликов-близнецов

8 Впервые в экспериментах на криоконсервированных эмбрионах коров получено живое потомство близнецов крупного рогатого скота Лебединской породы коров с помощью нового метода разделения предимплантационных эмбрионов и специального микроманипулятора с вращающимся микроинструментом для его осуществления Продемонстрирована пригодность разработанных методов не только для лабораторных исследований, но также и для работы в условиях фермы, опытного хозяйства и экспедиции

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1 Никитин В А (2007) Методы введения веществ и органелл в клетку в технологиях клеточной инженерии Цитология, 49(8), 631-641

2 Никитин В А, Соболев А С (2007) Использование технологий эмбрионального и соматического клонирования для сохранения и воспроизводства исчезающих видов животных, Ветеринарная патология, №1, с 3941

3 Никитин В А, Фесенко ЕЕ (2006) Биофизические аспекты реконструкции единичной клетки методами клеточной инженерии Биофизика, 51(4), 673-678

4 Мельникова Е В , Каурова С А, Утешев В К, Никитин В А, Гахова Э H (2003) Оценка качества криоконсервирсванных клеток диссоциированных зародышей амфибий Биофизика живой клетки, 7, «Консервация генетических ресурсов», с 70-73

5 Утешев В К, Мельникова Е В , Каурова С А, Никитин В А, Гахоаа Э H , Карнаухов В H (2002) Флуоресцентный анализ криоконсервированных тотипогентных клеток зародышей амфибий Биофизика, 47(3), 539-545

6 Безгина Е H Мошков Д А, Савельева Л H , Никитин В А, Утешев В К, Леднева В H (2000) Реакция эндоплазматического ретикулума на частичную денервацию маутнеровских нейронов головастиков шпорцевой лягушки Цитология, 42(5), 508-515

7 Bezgina Е N, Moshkov О А, Nikitm V А, Savel'eva L N , Uteshev V К (2000) The morphogenesis of mauthner neurons in tadpoles of the common frog after early unilateral enucleation of the eye Neurosci Behav Physiol, 30(5), 521-524.

8 Ivanova M M , Rosenkranz A A, Smirnova О A, Nikitin V A, Sobolev A S, Landa V, Naroditsky В S, Ernst L К (1999) Receptor-mediated transport of foreign DNA into preimplantation mammalian embryos Mol Reprod Dev,54(2), 112-120

9 Безгина EH, Мошков ДА, Никитин В А, Савельева ЛН, Утешев В К (1999) Морфогенез маутнеровских нейронов головастиков шпорцевой лягушки в условиях ранней односторонней энуклеации глаза, Морфология, 3,49-52

10 Sobolev A S, Rosenkranz А А, Smirnova О А, Nikitin V А, Neugodova G L, Naroditsky В S , Shilov I N, Shatski IN , Ernst LK (1998) Receptor-mediated transfection of murine and ovine mammary glands in vivo J Biol Chem, 273(14), 7928-7933

11 Чайлахян ЛМ, Вепринцев БН, Свиридова ТА, Никитин В А (1987) Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии, Биофизика, 32(5), 874-887

12 Свиридова ТА, Чайлахян ЛМ, Никитин В А, Вепринцев Б H (1987) Метод локального электрослияния пронуклеусов с энуклеированной зиготой, ДАН СССР, 295(1), 241-244

13 Никитин В А (1994) Технология генетически идентичных близнецов Возможности и пеоспективы Биофизика живой клетки, 6, «Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия», с 56-61

14 Хохлоз A M , Попов Ю А, Бондарев В А, Шишков M И, Никитин В А (1990) Комплекс приборов для проведения микрохирургических работ с клетками, яйцеклетками и ранними зародышами В сб «Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с 54-71

15 Никитин В А, Березовская ОП , Вепринцев Б H (1987) Применение метода микрохирургии для получения монозиготных близнецов мышей В сб «Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с 93-100

16 Попов Ю А, Бондарев В А, Хохлов A M , Никитин В А, Земскова M Ю (1987) Микроинъекторы и микроинъекция генетического материала в клетку и эмбрионы В сб «Приборы и лабораторное оборудование для научных исследований по новым направлениям биологии и биотехнологии», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с 14-21

17 Свиридова Т А, Никитин В А (1986) Техника пересадки ядер и пронуклеусов в яйцеклетки мышей В сб «Приборное оснащение и автоматизация экспериментальных исследований в области биотехнологии», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с 7-12,

18 ЛаринВТ,НикитинВА,ПоповЮА,ХохловАМ (1983) Методика изготовления микропипеток со скошенными кончиками В сб «Описание научных принципов устройства новых приборов и

методики пользования ими Аппаратура для исследования биологических молекул и клеток», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с 26-28

Изобретения и патенты

19 Соболев А С, Розенкранц А А, Иванова M M , Смирнова О А, Никитин В А, Народицкий Б С, Эрнст Л К (1996) «Способ получения трансгенных животных», Патент РФ № 2108714

20 Соболев АС, Розенкранц А А, Никитин В.А (1994) «Способ направленной генетической трансформации молочной железы животного и устройство для введения генетического материала в молочный проток молочной железы животного», Патент РФ № 20252487

21 Бондарев В А, Попов Ю А, Хохлов A M, Хохлов А А, Никитин В А, Иванов Е Г, Безуглый H Д, Осташко Ф И, Медведовский А В (1992) «Установка для разрезания бластоцист», А с № 1804807

22 Каноненко В Л, Никитин В А, Абраскова С В, Леткевич В И (1992) «Микроигла для клонирования доимплантационных эмбрионов животных», А с №1727821

23 Бондарев В А, Иванов ЕГ, Никитин В А, Попов ЮА, Хохлов AM (1989) «Устройство для исследования клеток и тканей, культивируемых под давлением», А с № 1514762

24 Бондарев ВА, Иванов ЕГ, Никитин В А, Попов ЮА, Хохлов AM (1989) «Микрооперационная камера», А с № 1461758

25 Кононенко В Л, Никитин В А, Абраскова С В , Леткевич В И (1988) «Камера для внутриклеточных инъекций», А с № 1595899

26 Никитин В А, Chochlov AM, Larin VT, Fichte В А (1988) Verfahren zur Durchfuhrung von Mikrooperationen an Zellen und Einrichtung zu dessen Verwirklichung CH 666 850 A5 Patentanwälte Schaad, Balass & Partner, Zurich

27 Бондарев В А, Иванов Е Г, Никитин В А, Попов Ю А, Хохлов A M (1987) «Способ закрепления клеток на микропипетке», А с № 1616680

28 Nikitm VA, Chochlov AM, L arm VT, Fichte В A (1987) Vorrichtung zur Durchfuhrung von Mikrooperationen in Zellen und Verfahren zur Durchfuhrung von Mikrooperation in Zeilen Patentschnft DDR 242 525 A3 DDR

29 Nikitin VA, Khokhlov AM, Larin VT, Fikhte В A (1987) Method and device for performmg microoperation on cells UK Patent GB 2 154 608 В UK Patent London

30 Nikitin VA, Chochlov AM, Larin VT, Fichte В А (1987) Zpusob provadeni mikrooperaci bunek а zarizem kjeho provadeni Cislo 258410

31 Гришин А Ф, Иванов Е Г, Никитин В А, Попов ЮЛ, Хохлов A M , Цалкович А Э (1987) «Способ заточки стеклянных микропипеток и устройство для его осуществления», А с № 1315248

32 Ларин В Т, Никитин В А, Хохлов A M (1986) «Микроманипулятор», А с № 1229030

33 Бондарев В А, Иванов Е Г, Ларин В Т, Никитин В А, Попов Ю А, Хохлов A M , Цалкович А Э (1986) «Многодозовый микроинъектор», А с №1223917

34 Межбурд ЕВ, Горячев ВИ, Никитин В А, Утешев В К (1986) «Микроманипупятор», А с № 1261789

35 Nikitm V А, Khokhlov A M, Larin V Т, Fikhte В А (1986) Proc'ed'e d'intervention microchirurgicale sur les cellules et dispositif pour sa mise en oeuvre N de publication 2 553 432 REPUBLIQUE FRANÇAISE, Cabinet Lavoix

36 Nikitin VA, Khokhlov AM, Lann VT, Fikhte В A (1986) Method and device for performmg microoperation on cells Patent Number 4,619,899 United States Patent

37 Nikitin VA, Chochlov AM, Lann VT, Fichte В A (1986) Verfahren zur Durchfuhrung von Mikrooperationen an Zellen und Einrichtung zu dessen Verwirklichung Patentschrift DE 3390499 C2 BRD München

38 Бондарев В А, Иванов Е Г, Нихитин В А, Попов Ю А, Хохлов A M , Цалкович А Э (1986) «Способ микроинъекции пневматическим давлением», А с № 1334081

39 Иванов Е Г, Ларин В Т, Попов Ю А, Никитин В А, Хохлов A M , Шишков M И , Комаров В П (1985) «Прибор для вытяжки стеклянных капилляров», А с №1172891

40 Иванов Е Г , Ларин В Т, Никитин В.А, Попов Ю А, Хохлов A M , Шишков M И , Комаров В П (1985) «Устройство для изготовления стеклянных микроинструментов», А с № 1183469

41 Межбурд ЕВ, Горячев ВИ, Никитин В А, Утешев В К (1985) «Устройство для микроинъекции жидкости», А с № 1136810

42 Бондарев В А , Иванов Е Г, Никитин В А, Попов Ю А , Хохлов A M , Цалкович А Э , Газарян К Г (1984) «Способ разделения яйцеклетки и устройство для его осуществления», А с № 1327333

43 Никитин В А, Попов ЮА, Ларин ВТ, Хохлов AM, Фихте Б А (1983) «Установка для прецизионных работ с микрообъектами», А с № 1008688

44 Ларин ВТ, Никитин В А, Хохлов AM, Вызов АЛ, Пигарев ИН (1982) «Способ изготовления микропипеток», А с № 966043

45 Никитин В А, Хохлов AM, Ларин ВТ, Фихте Б А (1980) «Устройство для проведения микроопераций на клетках и способ проведения микроопераций на клетках», А с № 1088171

Монографии и глава в книге

46 Никитин В А (1986) "Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом", Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР (под ред проф БН Вепринцева), 122с

47 Никитин В А, Гольдман И Л, Клецко Н Г, Волынчук В Ф (1980) "Методические рекомендации по изготовлению и применению микроинструментов для микроманипуляции с эмбрионами млекопитающих" М , Изд-во ВИЖ ВАСХНИЛ, 25с

48 Фихте БФ, Никитин В А Ратнер ЕН (1977) В кн "Микроманипупяционные методы экспериментальной микробиологии", гп 5, "Организация уикроманипуляционных исследований и некоторые приемы их практического применения", М , Изд-во МГУ, с 140-169

Материалы и тезисы конференций

49 Никитин В А (2007) Совершенствование подходов и методов клеточной инженерии для повышения эффективности репродуктивного клонирования животных Материалы Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных» (Дуброзицы-Быково, 25-26 октября 2007 г), Дубровицы-быково, с 457-461

50 Никитин В А (2007) Микрохирургические методы клеточной инженерии в эмбриональном клонировании животных Доклады IV Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве", посвященной 100-летию со дня рождения академика РАСХН НА Шманенкова (Боровск, 5-7 сент 2006 г), Боровск, ВНИИФБиП, с 356-368

51 Никитин В А, Фесенко Е Е (2006) Методы микроинъекции и микрохирургии в клеточной инженерии и биотехнологии Материалы Четвертого съезда Общества биотехнологов России им ЮА Овчинникова (Пущино, 5-7 декабря 2006 г), М , Макс-Пресс, с 176-177

52 Никитин В А (2006) Микрохирургические методы клеточной инженерии в эмбриональном клонировании животных Материалы IV Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 5-7 сент 2006 г), Боровск, с 257-258

53 Никитин В А, (2006) Новые подходы и приборное обеспечение для решения задач клеточной инженерии Биофизика живой клетки, 8, «Консервация генетических ресурсов» Материалы ХН рабочего совещания, посвященного 50-летию организации Института биологической физики в Академии наук 1952-2002 (Пушино, 19-21 ноября 2002 г), с 352-357

54 Никитин В А, Антипов С С (2006) Возможности и перспективы реализации генетического материала криобанков с использованием близнецовых технологий Биофизика живой клетки, 8, «Консервация генетических ресурсов» Материалы XII рабочего совещания, посвященного 50-летию организации Института биологической физики в Академии наук 1952-2002 (Пущино, 19-21 ноября 2002г), с 358-367

55 Никитин В А, Фесенко Е Е (2001) Современная техника клонирования клеток и организмов млекопитающих, Цитология, 43,371-372

56 Утешев В К, Каурова С А, Никитина Л А, Никитин В А, Г ахова Э Н (2000) Криоконсераация тотипотентных эмбриональных клеток для трансплантации ядер в энуклеированные клетки, Тезисы 1 Международного симпозиума "Генетический криобанк для аквакультуры редких и исчезающих видов рыб и других гидробионтов" (Пущино, 20-23 ноября 2000 г), с 63

57 Nikitin V А, Fesenko Е Е (2000) Ways to increase reproduction and restoration of small endangered populations with the help of embryonic and somatic cloning In Advances in Ethology, 35, Contributions to the 3rd International Symposium on Physiology and Ethology of Wild and Zoo Animals (Berlin, Germany, 4-7 October 2000) Berlin, Blackwell Science, (eds M Lechner-Doll, H Hofer), p 146

58 Никитин В А, Фесенко EE (2000) Современная техника клонирования клеток и организмов Тезисы семинара-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнологии-2000" (Пущино, 26-28 сентября 2000 г), Пущино, с 50

59 Никитин В А, Фесенко Е Е (1998) Трансплантация ядер и других внутриклеточных органелл для клонирования эмбрионов млекопитающих В сб «Консервация генетических ресурсов», Пущино, с 193-197

60 Иванова М М, Соболев А С, Смирнова О А, Розенкранц А А, Никитин В А, Народицкий Б С (1997) Введение чужеродного генетического материала методом рецептор-опосредуемого эндоцитоза в эмбрионы млекопитающих Международная конференция «ДНК технологии в животноводстве и ветеринарии» (Киев, 20-21, ноября 1997), с 26

61 Смирнова О А, Розенкранц А А, Никитин В А, Шатский И Н, Народицкий Б С, Соболев А С (1996) Трансформация клеток молочной железы ДНК-переносящими конструкциями in vitro и in vivo Международная конференция, посвященная памяти акад А А Баева (Москва, 20-22 мая 1996 г), М, Cobiotech-PAH, с 62

62 Смирнова О А, Розенкранц А А, Никитин В А., Шатский И Н, Соболев А С (1996) Секреция светлячковой люциферазы в молоко мышей после трансформации молочной железы in vivo Международная конференция, посвященная памяти акад А А Баева (Москва, 20-22 мая 1996 г), М, Cobiotech-PAH, с 63

63 Никитин В А, Соболев А С (1992) Методы микроинъекции (переноса) генного материала в клетку, Цитология, 34, с 87-88

64 Соболев А С, Розенкранц А А, Никитин В А, Ячменев С 8 , Серебрякова Н В, Гулак П 8, Ахлынина ТВ, Киселева ТГ, Бубчиков ВИ, Васильева АП (1991) Создание молекулярных конструкций для направленной доставки генетического материала в клетки Тезисы докладов 1 Всесоюзной планово отчетной конференции по направлению "Генная и клеточная инженерия", Государственная научно-техническая программа "Новейшие методы биоинженерии" (Пущино-на-Оке,ноябрь-дек 1990г) М,с 56-58

65 Осташко Ф И, Никитин В.А, Гордиенко Н А, Безуглый Н Д, Кот В В (1987) Микрохирургическое разделение деконсервированных эмбрионов крупного рогатого скота Республиканская научно-практическая конференция "О широком использовании метода трансплантации эмбрионов в ускорении качественного совершенствования сельскохозяйственных животных" (Львов, 22-23 дек 1987 г), Львов, Госагропром УССР, с 57-58

66 Вепринцев Б Н, Никитин В А, Свиридова Т А Физико-химические условия культивирования яйцеклеток и методы пересадки ядер из одной клетки в другую (1986) Отчет за 1984-1985 г г по программе сотрудничества стран-членов СЭВ и СФРЮ по проблеме "Исследования в области биологической физики", Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР, с 304

67 Земскова МЮ , Никитин В А, Бендукидзе К А (1983) Микроинъекция ДНК в ядра соматических клеток В кн "2-е Всесоюзное совещание по генетике соматических клеток в культуре", М, Изд-во атомной энергии АН СССР, с 95

68 Никитин В А, Земскова М Ю, Бендукидзе К А (1982) Метод микроинъекций для введения ДНК в ядра клеток животных Материалы конференции "Рекомбинантная ДНК" (Пущино, 20-22 дек 1982 г), Пущино, с 22

69 Клецко НГ, Гольдман ИЛ, Волынчук ВФ, Никитин В А, (1980) Техника микроманипуляций с эмбрионами млекопитающих Материалы 2-го Всесоюзного симпозиума по иммунологии воспроизведения (Москва, 16-18 дек 1980 г), М , ВАСХНИЛ, с 147

Подписано в печать 20 02 2008 г Печать трафаретная

Заказ № 103 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш , 36 (495) 975-78-56, (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитин, Владимир Афанасьевич

ВВЕДЕНИЕ.

I ч , ' '

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. О РЕКОНСТРУКЦИИ КЛЕТКИ КАК ОДНОМ ИЗ ВАЖНЕЙШИХ ПОДХОДОВ В ВОПРОСАХ КЛЕТОЧНОЙ

ИНЖЕНЕРИИ.

Исторический экскурс.

Проблемы и методы реконструкции клетки млекопитающих.

Микрохирургия клетки.

Пересадка ядер.

Механические способы энуклеации.

Энуклеа1{ия "вслепую".

Инъекция — энуклеация.

Энуклеация с помощью выталкивания РЫ и прилегающей к нему цитоплазмы через zona pellucida.

Разделение ооцитов пополам.

Неинвазивные методы энуклеации.

Технология микрохирургии клетки.

Слияние кариопласта и энуклеированного ооцита.

Методы слияния.

Микроинъекция.

Методы прямой микроинъекции.

Микроинъекция под давлением.

Разделение ранних предимплантационных эмбрионов (близнецы)

Приборы и оборудование.

Микроманипуляторы.

Изготовление микроинструментов.

Микроинъекторы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов"

Почти все главные проблемы биологии приводят к необходимости изучения процессов, происходящих в отдельной клетке. Это позволяет подойти к решению ряда принципиальных вопросов биологии развития, молекулярной биологии, биофизики клетки. В настоящее время исследования, связанные с активным изменением клетки в эксперименте введением чужеродных генов или разделением клетки на жизнеспособные клеточные фрагменты — ядро и цитоплазму — и созданием на их основе новой клетки — выделились в самостоятельную область, получившую название клеточная инженерия, или реконструкция клеток.Наибольший интерес вызывают проблемы, связанные с реконструкцией эмбриональных клеток млекопитающих. Реконструкция эмбриональных клеток, по существу, включает в себя задачу изучения механизмов реализации генетической информации, обеспечивает эффективный стратегический подход к получению животных с заданными свойствами, консервации генетических ресурсов (Гёрдон, 1977; Зеленин и др., 1982; Ogura et al., 2000). Это направление исследований призвано решить такие важные задачи, как выяснение реальной тотипотентности генома клеток разного уровня дифференцировки; способности геномов к репрограммированию; получение гибридных животных и межвидовых химер путем искусственного слияния геномов и создания реконструированных зигот и ранних эмбрионов; исследование подходов к получению отцовских и материнских копий, или клонированию (Мак-Ларен, 1979; Шкуматов, 2001).В конце 1960-х — начале 1970-х годов технологии микрохирургии клетки стали интенсивно развиваться в мире (Graham, 1969; Lin, 1971).Появление в руках экспериментатора микроманипуляционных инструментальных средств для работы с единичной клеткой с возможностью активно вмешиваться в ее функционирование, не нанося ей значительных повреждений, — было одним из самых важных условий экспериментального развития этих исследований (Di Berardino et al., 2003; Gurdon, Byrne, 2003). Клеточная инженерия наиболее широко использует микрохирургические методы и подходы, к которым относится и микроинъекция в клетку и ее органеллы, — для пересадки ядер, разделения ранних предимплантационных эмбрионов, трансгенеза.Большие перспективы имеет применение методов реконструкции клетки для сохранения генофонда исчезающих видов животных, поскольку эмбриональное и соматическое клонирование является технологией, которая создает эффективный потенциал для длительного использования генетического материала, что особенно важно для решении проблемы сохранения природного биоразнообразия (Вепринцев, Ротт, 1991; Wolf et al., 2001; Holt et al, 2004). Благодаря этим методам реконструкции единичной клетки получили развитие такие биотехнологии, как фармацевтическое (Wolf et al., 2000), терапевтическое (Illmensee, 2001, 2002; Hochedlinger, Jaenisch, 2003) и репродуктивное клонирование животных (Wolf et al., 1998; Kuhholzer, Prather, 2000).В настоящее время реконструкция эмбриональных клеток с помощью переноса ядер или разделения ранних эмбрионов, известная как клонирование, проводится в более чем 130 лабораториях 20 стран мира. В России в последние десятилетия также ведутся работы по изучению факторов, влияющих на выживаемость реконструированных эмбрионов, на пролиферативную активность стволовых клеток (Chailakhyan ТА. et al., 2005; Selezneva et al., 2005; Осипенко и др., 2007). Однако эффективность общепринятых методов клонирования животных остается крайне низкой, составляя для млекопитающих 1-3% (Wilmut et al., 1997; Wakayama et al., 1998; Gurdon, Byrne, 2003), и в большинстве случаев потомство имеет серьезные аномалии развития (Tsunoda, Kato, 2002; Tamashiro et al., 2002; Palmieri et al., 2007). По свидетельству (Oback, Wells, 2003), до последнего времени практически не было ни одного одинакового протокола проведения экспериментов во всех этих исследовательских центрах.Характерно и то, что, как правило, экспериментаторы либо вообще не приводят описания деталей столь сложной и тонкой технологии микроопераций на клетке, либо — во всяком случае— не видят причины низкой эффективности клонирования в погрешностях самой операции, и представляется, что удачи носят как бы случайный характер. Только в самое последнее время появились работы, в которых авторы, в том числе Д. Солтер— один из создателей метода клонирования млекопитающих с помощью пересадки ядер (McGrath, Solter, 1983), по которому работают большинство лабораторий мира, — охарактеризовал пересадку ядер как «технологию, работающую вслепую», так как по-прежнему неясно, какие методические или биологические причины лежат в основе ее неуспеха.Так как непреложным фактом является огромные научные и практические перспективы, которые сулит это направление науки, по мнению Солтера, пора решить, что должно быть сделано для решения этой проблемы (Solter, 2000). Как отмечают исследователи из Научного центра акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН в Москве, несмотря на интенсивные исследования и насущные потребности медицины, биологический и информационный потенциал эмбриональной и плодной тканей не реализован ни на теоретическом, ни на прикладном уровнях (Repin et al., 2007). По мнению (Wakayama, 2007), первым получившего клонированных мышей при пересадке ядер дифференцированных клеток в яйцеклетки мыши, механизмы репрограммирования станут яснее, если эффективность клонирования увеличится в результате совершенствования методов клонирования. Пока не будут описаны и устранены незамеченные ранее недостатки этих методов, неудачи клонирования будут приписываться другим причинам (Perry, Wakayama, 2002).В нашей стране ко времени начала настоящих исследований микроманипуляционная техника была представлена несколькими видами отечественных микроманипуляторов, в основном для статических задач электрофизиологии — их весьма сложно использовать для микрохирургии клетки, и одним французским микроманипулятором Фонбрюна, работа с помощью которого также встретилась с рядом трудностей. В то же время наметившиеся успехи в клонировании клеток млекопитающих продемонстрировали большие перспективы этого направления исследований. Для решения этих задач в наших условиях возникла необходимость создания практически всего комплекса методов и средств для микрохирургии и микроинъекции клетки, нацеленных на изучение влияния различных факторов микрохирургического вмешательства на жизнеспособность реконструированной клетки и потенциал ее развития, которые бы позволили создать предпосылки для развития в нашей стране столь широко представленного в мире направления по реконструкции клетки как для фундаментальных исследований биофизики клетки, общей биологии клетки, процессов реализации генетической информации, так и для решения прикладных задач биотехнологии, привлекая и развивая нанометоды и нанотехнологии в работе с единичной клеткой.Представляемая работа, начатая в 1975 году, выполнена в русле решения этих проблем.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Никитин, Владимир Афанасьевич

выводы

1. Впервые разработан и применен на практике принцип комплексного подхода к проведению всех этапов микрохирургической реконструкции и микроинъекции единичной клетки, включающий создание эргономичного операционного блока, разделенного на функциональные зоны.

2. Изготовленный на основании этого подхода комплекс Приборов для Микрохирургии Яйцеклетки (ПМЯ-1) позволил проводить практически все методы микрохирургии- клетки в едином пространстве, а также обеспечил возможность проведения каждого этапа отдельным экспериментатором; что значительно снизило время операций.

3. В дополнение к ПМЯ-1 созданы методы и устройства, являющиеся естественным развитием принципа комплексного подхода к микрохирургии клетки: метод и прибор для наложения, микролигатур, многодозовый магнитострикционный микроинъектор, микрокамеры — открытого типа и для многодозовых микроинъекций, метод и устройство для. контроля проведения микрохирургического разделения эмбрионов.

4. Разработан принципиально новый способ фиксирования клетки для микроманипуляций без использования отрицательного давления с целью сохранения, ее целостности .и созданы микроинструменты для его осуществления. ■ • /

5. Создан арсенал микроинструментов, 74 вида, снюкающих риск нанесения нерепарируемых повреждений клеткам, с помощью которого можно проводить большинство видов известных операций* на клетке.

6. Впервые получена жизнеспособная особь лабораторной мыши реконструкцией зигот при сочетании микрохирургии и электрослияния с применением новых методов и микроинструментов для пересадки ядер.

7. Методом наложения микролигатуры, не применявшимся ранее для разделения предим плантационных эмбрионов млекопитающих, с использованием новых микроинструментов, капсулы-держателя и петли с переменным диаметром, получено жизнеспособное плодовитое потомство кроликов-близнецов.

8. Впервые в экспериментах на криоконсервированных эмбрионах коров получено живое потомство близнецов крупного рогатого скота Лебединской породы коров с помощью нового метода разделения предимплантационных эмбрионов и специального микроманипулятора с вращающимся микроинструментом для его осуществления. Продемонстрирована пригодность разработанных методов не только для лабораторных исследований, но также и для работы в условиях фермы, опытного хозяйства и экспедиции.

БЛАГОДАРНОСТИ

Прежде всего, я хочу с самой сердечной благодарностью обратиться к памяти профессора Бориса Николаевича Вепринцева, инициатора и вдохновителя настоящей работы, без энтузиазма и авторитета которого нельзя было бы заинтересовать целые научные коллективы в ее осуществлении.

Огромное спасибо моему научному руководителю, профессору Соболеву Александру Сергеевичу, за терпение, понимание, за огромную помощь в развитии работы и подготовке диссертации к защите - и особенно - за большую научную требовательность - и за дружбу.

Мои слова большой благодарности — коллективу Института биофизики клетки и лично заведующему Лабораторией механизмов рецепции, где я работаю, моему соавтору, профессору Фесенко Евгению Евгеньевичу — за предоставленную возможность продолжить и развивать исследования в столь привлекательной для меня области науки.

Спасибо моей семье, моей жене, Маргарите, и моему сыну Георгию - за огромную помощь в подготовке диссертации к защите, поддержку, понимание и терпение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Идея комплексного подхода к микрохирургии клетки в значительной степени нашла свое воплощение в разработанном нами, а затем и изготовленном реально комплексе Приборов для Микрохирургии Яйцеклеток (ПМЯ-1). Комплексный подход в ПМЯ-1 обеспечивается созданием эргономичного операционного блока, разделенного на функциональные зоны для проведения микрохирургии: — зоны приготовления объекта исследования, зоны изготовления микроинструментов (микрокузница, прибор для вытягивания капилляров (пуллер), газовая горелка), зоны расположения микроскопа с микроманипуляторами для исследований, системы жизнеобеспечения клетки и приборов для измерений различных физико-химических параметров. Создание эргономичного операционного блока сделало возможным проведение всего цикла реконструкции клетки в едином пространстве, причем каждую операцию может проводить отдельный экспериментатор, в координации с другими, что позволяет достигнуть высокой степени профессионализма и стандартизовать методы. Циклы таким образом, могут многократно повторяться, а каждая операция занимает значительно меньше времени, что очень важно для сохранения жизнеспособности клетки.

Облегчается также задача и тем самым стоимость обучения команды для проведения микрохирургии и снижается острота проблемы наличия особых способностей у микрохирурга, что, наряду с высокой стоимостью микроманипуляционной системы, препятствует успешному использованию этих методов для многих практических задач:

В состав ПМЯ-1 вошли созданными нами и запатентованные в России и за рубежом новые методы и приборы, что позволило проводить реконструкцию клеток млекопитающих с применением практически всех микрохирургических технологий, в том числе с использованием предложенных в работе новых методов. ПМЯ-1 был изготовлен совместно с ИБП РАН, и в него вошли в качестве основных 7 приборов, на которые получены авторские свидетельства, а на один из приборов, микроманипулятор для. пересадки ядер, получены 7 зарубежных патентов на изобретение. В создании некоторых микроинструментов для разделения1 предимплантационных эмбрионов принимали участие сотрудники ВИЖ РАСХН.

Технологии и приборы комплекса ПМЯ-1 внедрены и используются в работе ряда Институтов РАН и в работе Харьковского биотехнологического центра и Института животноводства Украинской академии аграрных наук.

Вошедший в состав комплекса ПМЯ-1 новый механический многодозовый микроинъектор увеличил точность микродозирования до* фемтолитров, и при этом он исключительно прост в управлении. Таких доз не обеспечивает ни один из известных микроинъекторов. С помощью нового микроманипулятора для пересадки ядер единичных клеток с дистанционным управлением по новому способу фиксацию клетки и проведение микрооперации осуществляли за счет введения операционного микроинструмента из полости микропипетки-держателя. Благодаря этому для операции достаточно было одного микроманипулятора, а не двух и более, как обычно. При работе с помощью этого микроманипулятора можно фиксировать клетку капсулой-держателем, не используя отрицательного давления. Использование этого нового способа фиксации клетки при проведении операций на ней позволило преодолеть утечку содержимого клетки при удерживании ее общепринятым способом, с помощью микроприсоски и тем самым сохранять целостность клетки, сводя к минимуму ее повреждения. Известные микроманипуляторы не позволяют проводить внутриклеточные операции по этому способу, так как каждый из них управляет только одним микроинструментом. Это усложняет микрооперацию, и процесс микроманипулирования замедляется. Новый микроманипулятор можно использовать не только для пересадки- ядер, но и для управления микроинструментами, при проведении других микроопераций. Десять оригинальных микроинструментов, представленных в работе, сделаны специально для работы с этим микроманипулятором.

В состав комплекса ПМЯ-1 вошел также новый микроманипулятор с вращающимся микроинструментом, позволяющий локально перфорировать zona pellucida яйцеклетки в заданном месте, не деформируя всю клетку. Его. использовали в работе для разделения ранних эмбрионов коров, но можно его использовать и для микроинъекций, для перфорации zona pellucida (может использоваться вместо лазерных перфораторов), для пересадки ядер и других органелл.

Микроинструменты для микроманипуляций на клетках, как правило, изготавливает сам исследователь. Для этой цели используют микрокузницу — специальный прибор для изготовления микроинструментов для работы под микроскопом. В данной работе представлена новая микрокузница МК-2, новый прибор для вытяжки капилляров и разработан комплекс микроинструментов (74 вида) для микрохирургии единичной клетки с целью ее реконструкции, которые можно изготавливать, наряду с известными, на этой микрокузнице. В отличие от известных микрокузниц, в которых стеклянная заготовка для изготовления микроинструментов закреплена в тисках и имеет фиксированное положение по отношению к нити накаливания, мы впервые применили другой способ изготовления микроинструментов, добавив еще одну степень свободы: заготовка может вращаться вокруг своей оси. Это позволило значительно расширить виды работ, которые можно было производить на микрокузнице. Она имеет свое собственное устройство для вытягивания микропипеток, на ней, можно использовать широкий набор сменных нитей накаливания различных форм, можно обрабатывать микроинструмент с торца и контролировать его размеры. Этих возможностей.в настоящий момент не предоставляет ни одна из известных зарубежных микрокузниц.

Главные достоинства разработанного и изготовленного по нашему проекту заводским способом устройства для заточки и шлифовки микроинструментов и предложенного способа осуществления этих операций в том, что процесс заточки можно регулировать, поток воды из полости микропипетки предотвращает засорение ее кончика, микроинструмент можно шлифовать.и, самое главное, заточку можно проводить под контролем микроскопа. Ни одно известное устройство не позволяет проводить микроскопический контроль всех манипуляций, связанных с затачиванием микроинструментов.

Устройство для прецизионных работ с клеткой, антивибрационный стол, амортизировало, вертикальную и горизонтальную вибрации, и тем самым обеспечило стабильные условия работы.

Создан также ряд методов и устройств, в том числе защищенных авторскими свидетельствами и патентами на изобретения, не вошедших в ПМЯ-1, являющихся естественным продолжением и развитием комплексного подхода к микрохирургической реконструкции клетки, обеспечивая проведение практически всех методов микрохирургии единичной клетки.

В числе их — специализированный микроманипулятор для наложения микролигатуры и метод разделения ранних эмбрионов с его помощью для получения генетически идентичных клеток и организмов, изобретение, признанное Государственным комитетом Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий пионерским как не имеющее аналогов в ограничительной части формулы изобретения.

Работа с клеткой под микроскопом при проведении микрохирургии требует постоянного контроля за перемещением микроинструментов и положением клетки и клеточных органелл. Например, для разделения эмбрионов необходимо было контролировать взаимное расположение плоскости разреза эмбриона, бластомеров и скальпеля относительно эмбриона в процессе разрезания. Эти экспериментальные трудности были преодолены разработкой специального оптического адаптера, позволяющего наблюдать клетку и микроинструменты одновременно с двух сторон в поле зрения стереомикроскопа: снизу и сбоку. С помощью оптического адаптера у экспериментатора появилась возможность оперировать клетку под микроскопом, наблюдая ее одновременно — «сбоку» и «снизу».

Операции на клетке, к которым относится! и микроинъекция, требуют, чтобы был возможен доступ различных микроинструментов к ней, и при этом среда для микрохирургии была защищена от испарения, так как это нарушает осмотические параметры и может привести к травмированию клетки. Для этого используют специальные микрокамеры. В работе представлены три новых микрокамеры: специальная микрокамера для многодозовых микроинъекций, в которой микроинструменты не контактируют с маслом; микрокамера открытого типа, позволяющая работать с прямыми микроинструментами, в отличие от известных нам микрокамер, в которых работают только с изогнутыми микроинструментами. Такие микроинструменты сложнее изготовить, труднее установить в камере, не поломав при установке. При подготовке к проведению микрохирургии в микрокамере открытого типа уменьшается число манипуляций и укорачивается время микрооперации в 2-3 раза. Кроме того, в этой камере можно одновременно работать несколькими микроинструментами и забирать прооперированные клетки сразу после окончания микрооперации. Была также разработана специальная камера для работы с клеткой под давлением, позволяющая следить за морфологией развития клетки в условиях высокого давления, отрицательного давления и нормального атмосферного давления, обеспечивающая возможность длительного культивирования клеток и, что самое важное, при регулируемом ламинарном протоке питательной среды без пульсаций.

Представлен новый прецизионный многодозовый микроинъектор, обеспечивающий точность вводимого в клетку или органеллу объема до долей пиколитра за счет замены механического поршня магнитострикционным материалом, изменяющим свой объем под действием электромагнитного поля. Ступенчатое изменение напряженности постоянного поля, воздействующего на магнитострикционный материал, обеспечивает многократное дозирование (до 500-1000 и более доз); установка величины, ступени, управляющей полем воздействия, задает величину дозируемого объема.

Для микроинъекции растворов в клетку был разработан способ изготовления микропипеток с 3-4-мя вплавленными в них филаментами (Ларин и; др., 1983). Утолщение стенки капилляра и плотная упаковка вплавленных филаментов дали возможность изготовить пипетку со скошенным колющим кончиком и значительно ускорить процесс заполнения микропипеток растворами, в том числе, вязкими, например, ДНК.

Предлагаемые методы и микроинструменты были использованы в экспериментах по пересадке ядер и разделению ранних предимплантационных эмбрионов (Никитин, Фесенко, 1998, 2000, 2001).

Методом микрохирургического удаления пронуклеусов и электрослияния кариопласта донора и энуклеированной зиготы реципиента было получено жизнеспособное потомство мышей. В совместной работе с ВИЖ РАСХН были проведены эксперименты по репродуктивному клонированию методом разделения эмбрионов на кроликах пород шиншилла, шампань и русский горностаевый с использованием описанной в работе микрокузницы упрощенного типа и изготовленного на ней микроинструментария. В этих опытах впервые было получены жизнеспособное потомство кроликов из половин эмбрионов методом наложения лигатуры по разработанному нами методу, в том числе, однояйцовые близнецы.

В опытах на ферме Харьковского Биотехнологического центра УААН было получено живое потомство близнецов крупного рогатого скота Лебединской породы коров методом разделения ранних эмбрионов при помощи микроманипулятора с вращающимся микроинструментом (Рис. 4), входящего в представленный в работе комплекс ПМЯ-1.

Успешное проведение репродуктивного клонирования кроликов и Лебединской породы коров продемонстрировало пригодность разработанных методов, оборудования и микроинструментария не только для лабораторных исследований (Утешев, и др., 2000), но также и для работы в условиях фермы (Никитин, 20066), опытного хозяйства (Никитин, Антипов, 2006в) и экспедиции (Nikitin, Fesenko, 2000).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитин, Владимир Афанасьевич, Пущино

1. Амстиславский С.Я. (2006). Межвидовая трансплантация эмбрионов и клеточных ядер как подход к сохранению исчезающих видов млекопитающих. Онтогенез, 37(1), 3-11.

2. Андреева Л.Е., Серова И.А. (1992). Повреждающее действие микроманипуляционной техники, применяемой для трансгенеза, на развитие мышей. Онтогенез, 23(6), 637-643.

3. Безгина E.H. Мошков Д.А., Савельева Л.Н., Никитин В.А., Утешев В.К., Леднева В.Н. (2000). Реакция эндоплазматического ретикулума на частичную денервацию маутнеровских нейронов головастиков шпорцевой лягушки. Цитология, .42(5), 508-515.

4. Безгина E.H., Мошков Д.А., Никитин В.А., Савельева Л.Н., Утешев В.К. (1999). Морфогенез маутнеровских нейронов головастиков шпорцевой лягушки в условиях ранней односторонней энуклеации глаза, Морфология, 3, 49-52.

5. Березовская О.П., Межевикина Л.М., Вепринцев Б.Н. Метод культивирования доимплантационных зародышей мыши. (1986). Онтогенез, 17(5), 553-555.

6. Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Ларин В.Т., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Цалкович А.Э. (1986). «Многодозовый микроинъектор», А. с. № 1223917.

7. Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M. (1989). «Устройство для исследования клеток и тканей, культивируемых под давлением», А. с. № 1514762.

8. Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M. (1989). «Микрооперационная камера», А. с. № 1461758.

9. Ю.Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M. (1988). «Камера для внутриклеточных инъекций», А. с. № 1595899.

10. И.Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M. (1987). «Способ закрепления клеток на микропипетке», А. с. № 1616680.

11. Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Цалкович А.Э. (1986). «Способ микроинъекции пневматическим давлением», А. с. № 1334081.

12. Бондарев В.А., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Цалкович А.Э., Газарян К.Г. (1984). «Способ разделения яйцеклетки и устройство для его осуществления», А. с. № 1327333.

13. М.Бондарев В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Хохлов A.A., Никитин В.А., Иванов Е.Г., Безуглый Н.Д., Осташко Ф.И., Медведовский A.B. (1992), «Установка для разрезания бластоцист», А. с. № 1804807.

14. Вагонис 3., Тарвидас А. (1975). К вопросу о частоте моно- и дизогных двоен у скота и методы их определения. Бюлл. Научно-технич. информации Лит. НИИЖ, 32, №2, 5-10.

15. Васецкий С.Г. (1986а). Пересадка ядер в яйцеклетки млекопитающих. Онтогенез, 1986, 17, №3, 229-233.

16. Васецкий С.Г., Бетина М.И. (19866). Экспериментальное воздействие на мейоз как способ управления онтогенезом. В кн.: Биология развития и управление наследственностью. М., Наука, с. 122-138.

17. Вепринцев Б.Н., Ротт H.H. (1991). Стратегия сохранения животного и растительного мира Земли. В сб.: Консервация генетических ресурсов. Методы, проблемы, перспективы. Пущино, с. 5-18.

18. Гексли Дж., де Берг Г. (1936). Экспериментальная эмбриология. М.-Л. Биомедгиз.

19. Гёрдон Дж. (1977). Регуляция функции генов в развитии животных. М., Мир.

20. Гинзбург A.C. (1968). Оплодотворение у рыб и проблемы полиспермии. М., Наука.

21. Грессман А., Грессман М. (1985). Микроинъекция превращает культуральную клетку в исследовательскую пробирку. В кн.: Методы генетики соматических клеток. Т. 2, М., Мир, с. 520-534.

22. Гришин А.Ф., Иванов Е.Г., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Цалкович А.Э. (1987). «Способ заточки стеклянных микропипеток и устройство для его осуществления», А. с. № 1315248.

23. Дыбан А.П. (1974). Опыты на зародышах млекопитающих. В кн.: Методы биологии развития. М., с. 217-245.

24. Егорова Е.М., Черномордик Л.В., Абидор И.Г., Чизмаджев Ю.А. (1981). Фотодинамический метод исследования взаимодействия липосом с бислоями. Докл. АН СССР, 256(2), 476-479.

25. Иванов Е.Г., Ларин В.Т., Никитин В.А., Попов Ю.А., Хохлов A.M., Шишков М.И., Комаров В.П. (1985). «Устройство для изготовления стеклянных микроинструментов», А. с. № 1183469.

26. Иванов Е.Г., Ларин В.Т., Попов Ю. А., Никитин В.А., Хохлов A.M., Шишков М.И., Комаров В.П. (1985). «Прибор для вытяжки стеклянных капилляров», А. с. №1172891.

27. Квасницкий A.B. (1951). Опыт межпородной пересадки яйцеклеток. Советская зоотехния, №1, 36-42.

28. Клецко Н.Г., Гольдман И.Л., Волынчук В.Ф., Никитин В.А., (1980).Техника микроманипуляций с эмбрионами млекопитающих. Материалы 2-го Всесоюзного симпозиума по иммунологии воспроизведения (Москва, 1618 дек. 1980 г.), М., ВАСХНИЛ, с. 147. ( '

29. Кононенко В.Л., Никитин В.А., Абраскова C.B., Леткевич В.И. (1992). «Микроигла для клонирования доимплантационных эмбрионов» животных», А. с. № 1727821.

30. Ларин В.Т., Никитин В.А., Хохлов A.M. (1986). «Микроманипулятор», А. с. № 1229030.

31. Ларин В.Т., Никитин В.А., Хохлов A.M., Вызов A.JL, Пигарев И.Н. (1982). «Способ изготовления микропипеток», А. с. № 966043.

32. Лопашов Г.В. (1945). In: Ref. Rab. Biol. Otd. Akad. Nauk SSSR, 88-89 (цит. no McKinnel R.G. (1978). Cloning. Nuclear transplantation in Amphibia. Univ. Minneesota Press, Minneapolis).

33. Лопашов Г.В. (1946). "Comptes Rendus (Doklady) de Г Academie des Sciences de l'URSS" 1946, v. VII, №4 (цит. по Корочкин Л.И. (2002). Биология индивидуального развития, с. 28. М., МГУ).

34. Лютиков K.M. (1935). Многоплодие крупного рогатого скота. Проблемы животноводства, №7, 63-69.

35. Мак-Ларен А. (1979). Химеры млекопитающих. М., Мир.

36. Максимовский Л.Ф., Микичур Н.И. (1989). Методы микроманипуляции и ултрамикроанализа в биологии и медицине. Новосибирск, Наука, 237с.

37. Межбурд Е.В., Горячев В.И., Никитин В.А., Утешев В.К. (1985). «Устройство для микроинъекции жидкости», А. с. № 1136810.

38. Межбурд Е.В., Горячев В.И., Никитин В.А., Утешев В.К. (1986). «Микроманипулятор», А. с. № 1261789.

39. Мельникова Е.В., Каурова С.А., Утешев В.К., Никитин В.А., Гахова Э.Н. (2003). Оценка качества криоконсервированных клеток диссоциированных зародышей амфибий. Биофизика живой клетки, 7, «Консервация генетических ресурсов», с. 70-73.

40. Мерфи Д., Хэнсон Дж. (1989). В кн.: Новое в клонировании ДНК. Методы, глава 10. М., Мир, с. 308-353.

41. Никитин В.А. (1986). "Техника изготовления микроинструментов для исследования клеток под микроскопом", Пущино, ОНТИ НЦБИ АН СССР (под ред. проф. Б.Н. Вепринцева),. 122с.

42. Никитин В.А. (1994). Технология генетически идентичных близнецов. Возможности и перспективы. Биофизика живой клетки, 6, «Криоконсервация генетических ресурсов в проблеме сохранения биоразнообразия», с. 56-61.

43. Никитин В.А. (2006а). Микрохирургические методы клеточной инженерии в эмбриональном клонировании животных. Материалы IV Международной конференции "Актуальные проблемы биологии в животноводстве" (Боровск, 5-7 сент. 2006 г.), Боровск, с. 257-258.

44. Никитин В.А. (2007а). Методы введения веществ и органелл в клетку в технологиях клеточной инженерии Цитология, 49(8), 631-641.

45. Никитин В.А., Гольдман И.Л., Клецко Н.Г., Волынчук В.Ф. (1980). "Методические рекомендации по изготовлению и применению микроинструментов для микроманипуляции с эмбрионами млекопитающих". М., Изд-во ВИЖ ВАСХНИЛ, 25с.

46. Никитин В.А., Земскова М.Ю., Бендукидзе К.А. (1982). Метод микроинъекций для введения ДНК в ядра клеток животных. Материалыконференции "Рекомбинантная ДНК" (Пущино, 20-22 дек. 1982 г.), Пущино, с. 22.

47. Никитин В.А., Попов Ю.А., Ларин В.Т., Хохлов A.M., Фихте Б.А. (1983). «Установка для прецизионных работ с микрообъектами», А. с. № 1008688.

48. Никитин В.А., Соболев A.C. (1992). Методы микроинъекции (переноса) генного материала в клетку, Цитология, 34, с. 87-88.

49. Никитин В.А., Соболев A.C. (2007). Использование технологий эмбрионального и соматического клонирования для сохранения и воспроизводства исчезающих видов животных, Ветеринарная патология, №1, с. 39-41.

50. Никитин В.А., Фесенко Е.Е. (1998), Трансплантация ядер и других внутриклеточных органелл для клонирования эмбрионов млекопитающих. В сб. «Консервация генетических ресурсов», Пущино, с. 193-197.

51. Никитин В.А., Фесенко Е.Е. (2000). Современная техника клонирования клеток и организмов. Тезисы семинара-презентации инновационных научно-технических проектов "Биотехнологии-2000" (Пущино, 26-28 сентября-2000 г.), Пущино, с. 50:

52. Никитин В.А., Фесенко Е.Е. (2001). Современная техника клонирования клеток и организмов млекопитающих, Цитология, 43, 371-372.

53. Никитин В.А., Хохлов A.M., Ларин В.Т., Фихте Б.А. (1980). «Устройство для проведения микроопераций на клетках и способ проведения% микроопераций на клетках», А. с. № 1088171.

54. Осипенко М.А., Жерелова О.М., Петрова П.П., Межевикина Л.М., Фесенко Е.Е. (2007). Влияние ионов свободного кальция на пролиферативную активность и жизнеспосбность эмбриональных стволовых клеток, Доклады Академии наук, 412(1), 123-125.

55. Пастушенко В.Ф., Чизмаджев Ю.А. (1985). Биол. мембраны, 2(11), 11161129.

56. Риджуэй Э.А.Дж. (1991). Векторы экспрессии млекопитающих. В кн.: Сельскохозяйственная биотехнология: векторные системы молекулярного клонирования. М., ВО, Агропромиздат, с. 438-464.

57. Свиридова Т.А., Никитин В.А. (1986). Техника пересадки ядер и пронуклеусов в яйцеклетки мышей. В сб.: «Приборное оснащение и автоматизация экспериментальных исследований в области биотехнологии», ОНТИ НЦБИ АН СССР, Пущино, с. 7-12;

58. Свиридова Т.А., Чайлахян Л.М., Никитин В.А., Вепринцев Б.Н. (1987). Метод локального электрослияния пронуклеусов с энуклеированной зиготой, ДАН СССР, 295(1), 241-244.

59. Серова И.А., Андреева Л.Е., Семенова Л.А. (1998). Повреждающее действие микроманипуляционной техники, применяемой для трансгенеза, на развитие мышей. Материалы XV рабочего совещания «Консервация генетических ресурсов», Пущино, с. 200-202.

60. Смирнова O.A., Розенкранц A.A., Никитин В.А., Шатский И.Н., Соболев

61. A.C. (1996). Секреция светлячковой люциферазы в молоко мышей после трансформации молочной железы in vivo. Международная конференция, посвященная памяти акад. А.А.Баева (Москва, 20-22 мая 1996- г.), М., Cobiotech-PAH, с. 63.

62. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Иванова М.М., Смирнова O.A., Никитин

63. B.А., Народицкий Б.С., Эрнст Л.К. (1996). «Способ получения трансгенных животных», Патент РФ № 2108714.

64. Соболев A.C., Розенкранц A.A., Никитин В.А. (1994). «Способ направленной генетической трансформации молочной железы животного и устройство для введения генетического материала в молочный проток молочной железы животного», Патент РФ № 20252487.

65. Утешев В.К., Мельникова Е.В., Каурова С.А., Никитин В.А., Гахова Э.Н., Карнаухов В.Н. (2002). Флуоресцентный анализ криоконсервированных тотипотентных клеток зародышей амфибий. Биофизика, 47(3), 539-545.

66. Фихте Б.Ф., Никитин В.А. Ратнер E.H. (1977). В кн.: "Микроманипуляционные методы экспериментальной микробиологии", гл. 5, "Организация микроманипуляционных исследований и некоторые приемы их практического применения", М., Изд-во МГУ, с. 140-169.

67. Фонбрюн П. (1951). Методы микроманипуляции, М.

68. Хохлов A.M., Решетников В.И., Ячин В.М. (1971). Принцип построения и описания комплекта микроманипуляторов KM-I. Цитология, 13(4), 540-545.

69. Чайлахян Л.М., Вепринцев Б.Н., Свиридова Т.А., Никитин В.А. (1987). Электростимулируемое слияние клеток в клеточной инженерии, Биофизика, 32(5), 874-887.

70. Чайлахян Л.М., Свиридова Т.А., Вепринцев Б.Н. (1989). Эффективность микрохирургического удаления ядер у ранних зародышей мышей, в зависимости от времени до деления дробления. Онтогенез, 20(1), 33-39.

71. Чахотин С.С. (1959). Изучение локализованных воздействий ультрафиолетовых лучей на живую клетку методом микроукола. Цитология, 1(6), 614-626.

72. Шелаев Н.Т. Новая советская оптическая аппаратура для морфологических исследований. Современные методы и техника морфологических исследований. М., Машгиз, 1955.

73. Шкуматов A.A. (2001). Клонирование: прошлое, настоящее. будущее? Проблемы репродукции, №6, 1-16.

74. Эрнст Л., Гольдман И., Зиновьева Н. (1995). Доклады РАН, 345(4), 555-558.

75. Abramczuk J., Solter D., Koprowski H. (1977). The beneficial effect of EDTA on development of mouse one-cell embryos, in chemically defined medium. Dev. Biol., 61, 378-383.

76. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2004). Molecular biology of the cell. 4-th ed., Garland Publishing, Inc., New York London. 3786p.

77. Allen R.D. (1954). Fertilization and activation of sea urchin eggs in glass capillaries. I. Membrane elevation and nuclear movements in totally and partially fertilized eggs. Exp. Cell Res. 6(2), 403-424.

78. Anderegg C., Markert C.L. (1986). Successful rescue of microsurgically produced homozygous uniparental mouse embryos via production of aggregation chimeras. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 83(17), 6509-6513.

79. Ansorge W. (1982). Improved system for capillary microinjection into living cells. Exp. Cell Res., 140(1), 31-37.

80. Arave C.W., Bunch T.D., Mickelson C.H., Warnick K. (1987). Factors affecting survivability of transferred whole and demi-embiyos in a commercial dairy herd. Theriogenology, 28, 373-382.

81. Baguisi A., Overstrom E.W. (2000). Induced enucleation in nuclear transfer procedures to produce cloned animals. Theriogenology, 54, 209 (abstract).

82. Baker R.D., Shea B.F. (1985). Commercial splitting of bovine embryos. Theriogenology, 23(1), 3-12.

83. Barber M.A. (1904). A new method of isolating microorganisms. Journ. Kans. Med. Soc., 4.

84. Barber M.A. (1911). The effect of the protoplasm ofNitelle of various chemical substances and of microorganisms introduced into the cavity of the living cell. J. Infect. Dis., 9, 117-129.

85. Barber M.A. (1914). A pipette method in the isolation of single microorganisms and in the inoculation of substances-into living cells. Philippine Journ. Sci.,'9.

86. Barton C., Surani M.A. (1993). Manipulation of genetic constitution by nuclear transplantation, Methods of Enzymology, 225, 732-744.

87. Barton S.C., Surani M.A., Norris M.L. (1984). Role of paternal and maternal genomes in mouse development. Nature, 311(5984), 374-376.

88. Beaujean N., Taylor J., Gardner J., Wilmut I., Meehan R*., Young L. (2004). Effect of limited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on somatic cell nuclear transfer. Biol. Reprod., 71(1), 185-193.

89. Beettshen J.-C., Fischer J.-L. (2004). Yves Delage (1854-1920) as a forerunner of modern nuclear transfer experiments. Int. J. Dev. Biol., 48, 607-612.

90. Bernstein R.M., Mukherjee B.B. (1972). Control of nuclear RNA synthesis in 2-cell and 4-cell mouse embryos. Nature, 238, 457-459.

91. Bezgina E.N., Moshkov D.A., Nikitin V.A., Savel'eva L.N., Uteshev V.K. (2000). The morphogenesis of mauthner neurons in tadpoles of the common frog after early unilateral enucleation of the eye. Neurosci. Behav. Physiol., 30(5), 521-524.

92. Blangero C., Teissie J. (1985). Ionic modulation of electrically induced fusion of mammalian cells. J. Membr. Biol., 86(3), 247-253.

93. Bordignon V., Smith L.C. (1998). Telophase enucleation: an improved method to prepare recipient cytoplasts for use in bovine nuclear transfer. Mol. Reprod. Dev., 49(1), 29-36.

94. Brem G., Kruff B., Szilvassy B. (1984). Identical simmental twins through microsurgery of embryos. Theriogenology, 21(1), 215.

95. Briggs R., King T.J. (1952). Transplantation of living cell nuclei from blastula cells into enucleated froggs' eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 38,455-463.

96. Briggs R., King T.J. (1957). Changes in the nuclei of differentiating endoderm cells as revealed by nuclear transplantation. J. Morphol., 100, 269-311.

97. Brochart M. (1954). Attempted experimental production of identical twins in rabbits. Nature, 173, 160-162.

98. Bromhall J.D. (1975). Nuclear transplantation in the rabbit egg. Nature, 258(5537), 719-722.

99. Buryanov Y., Shevchuk T. (2005). The use of prokaryotic DNA methyltransferases as experimental and analytical tools in modern biology. Anal. Biochem., 338(1), 1-11.

100. Campbell K.H. (1999b). Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning, 1, 3-15.

101. Campbell K.H. Nuclear transfer in farm animal species. (1999a). Semin. Cell Dev. Biol. Jun; 10(3), 245-252.

102. Campbell K.H., Loi P., Otaegui P., Wilmut I. (1996). Cell cycle coordination in embryo cloning by nuclear transfer. Rev. Reprod., 1, 40—46.

103. Capecchi M.R. (1980). High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells. Cell, 22(2 Pt 2), 479-488.

104. Celis J.E. (1977). Injection of tRNAs into somatic cells: search for in vivo systems to assay potential nonsense mutations in somatic cells. Brookhaven Symp. Biol., May 12-20; (29), 178-196.

105. Celis J.E. (1984). Microinjection of somatic cells with micropipettes: comparison with other transfer techniques. Biochem. J., 223(2), 281-291.

106. Chailakhyan T.A., Davydova G.A., Kovaleva M.A., Selezneva I.I., Chailakhyan L.M., Gavrilyuk B.K. (2005). Factors affecting survival of reconstructed mouse embryos after nuclear transfer. Bull. Exp. Biol. Med., 139(1), 145-149.

107. Chambers R. (1922). New apparatus and methods for the dissection and injection of living cells. Anat. Rec. 24, 1-19.

108. Chan A.W., Dominko T., Luetjens C.M., Neuber E., Martinovich C., Hewitson L., Simerly C.R., Schatten G.P. (2000). Clonal propagation of primate offspring by embryo splitting. Science, 287(5451), 317-319.

109. Cheong H.-T., Takahashi Y., Kanagawa H. (1993). Birth of mice after transplantation of early cell-cycle-stage embryonic nuclei into enucleated oocytes. Biol. Reprod., 48(5), 958-963.

110. Chernomordik L.V., Sukharev S.I., Popov S.V., Pastushenko V.F., Sokirko A.V., Abidor I.G., Chizmadzhev Y.A. (1987). The electrical breakdown of cell and lipid membranes: the similarity of phenomenologies. Biochim. Biophys. Acta, 902(3), 360-373.

111. Chesne P., Adenot P.G., Viglietta C., Baratte M., Boulanger L., Renard J.P. (2002). Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol., 20(4), 366-369.

112. Cotten M. (1995). Adenovirus-augment, receptor mediated gene delivery and some solution to the common toxity problems. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 199(Pt3), 283-295.

113. Dalcq A. Arch. d'Anat. Micr. XXVIII (1932). P. 223 (цит. по Гексли Дж.С., де Бер Г.Р. (1936). Основы экспериментальной эмбриологии. M.-JL, Биомедгиз).

114. Dasgupta S. (1962). Induction of triploidy by hydrostatic pressure in leopard frog Rana pipiens. J. Exp. Zool., 151, 105-116.

115. Delage Y. (1895, 1903, 2nd edition). La Structure du Protoplasma, les théories de l'Hérédité et lesgrands problèmes de la Biologie gènerale. Schleicher, Paris.

116. Di Berardino M.A. (1980). Genetic stability and modulation of metazoan nuclei transplanted into eggs and oocytes. Differentiation. 17, 17-30.

117. Di Berardino M.A. (1988). Genomic multipotentiality of differentiated somatic cells. Cell Differ. Dev., Suppl., pp. 129-136.

118. Di Berardino M.A., Hoffner N.J. (1975). Nucleo-cytoplasmic exchange of nonhistone proteins in amphibian embryos. Exp. Cell Res., 94(2), 235-252.

119. Di Berardino M.A., Hoffner N.J. (1983). Gene reactivation in erythrocytes: nuclear transplantation in oocytes and eggs of Rana. Science, 219(4586), 862-864.

120. Di Berardino M.A., Hoffner N.J., Etkin L.D. (1984). Activation of dormant genes in specialized cells. Science, 224(4652), 946-952.

121. Di Berardino M.A., McKinnell R:G., Wolf D.P. (2003). The golden anniversary of cloning: a celebratory essay. Differentiation, 71(7), 398-401.

122. Diacumakos E.G. (1973). Methods for micromanipulation of human somatic cells in culture. Methods Cell Biol., 7, 287-311.

123. Dinnyes A., Dai Y., Jiang S., Yang X. (2000). High developmental rates of vitrified bovine oocytes following parthenogenetic activation, in vitro fertilization, and somatic cell'nuclear transfer. Biol. Reprod., 63(2), 513-518.

124. Donahue S. (1986). A technique for bisection of embryos to produce identical twins. In: Genetic Engineering of Animals. J. Evans, A. Hollaender (eds). Plenum Press, New York, pp. 163-173.

125. Dubois D. (1931). A mashine for pulling glass micropipettes and needles. Science, 73.

126. Echelard Y. (1996). Recombinant protein production in transgenic animals. Curr. Opin. Biotechnol., 7(5), 536-540. Review.

127. Elsheikh A.S., Takahashi Y., Hishinuma M., Kanagawa H. (1997). Developmental ability of mouse late 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. J. Vet. Med. Sci., 59(2), 107-113.

128. Elsheikh A.S., Takahashi Y., Katagiri S., Kanagawa H. (1998). Functional enucleation of mouse metaphase II oocytes with etoposide. Jpn. J. Vet. Res., 45(4), 217-220.

129. Fehilly C.B., Willadsen S.M. (1986). Embryo manipulation in farm animals. Oxf. Rev. Reprod. Biol., 8, 379-413.

130. Ferrier V., Jaylet A. (1978). Induction of triploidy in the newt Pleurodeles waltlii by heat shock or hydrostatic pressure: interpretation of the different types of ploidy using a chromosomal marker. Chromosoma, 69(1), 47-63.

131. Fischer J.L. (1990). Experimantal biology in France (1887-1936). Int. J. Dev. Biol., 34, 11-23.

132. Fonbrune P. (1949). Technique de micromanipulation. Monografies de L'lnstitute Pasteur. Masson et Cie, eds., Paris. 203p.

133. Freifelder D. (1976). Physical chemistry. Applications to Biochemistry and Molecular Biology. W.H. Freeman & Co., eds., San Francisco.

134. Fulka J. Jr., First N.L., Moor R.M. (1996). Nuclear transplantation in mammals: remodelling of transplanted nuclei under the influence of maturation promoting factor. Bioessays, 18, 835-840.

135. Fulka J. Jr., Moor R.M. (1993). Noninvasive chemical enucleation of mouse oocytes. Mol. Reprod. Dev., 34(4), 427-430.

136. Galli C, Lagutina I, Lazzari G. (2003). Introduction to cloning by nuclear transplantation. Cloning Stem Cells, 5(4), 223-232. Review.

137. Galli C., Lagutina I., Vassiliev I., Duchi R., Lazzari G. (2002). Comparison of microinjection (piezo-electric) and cell fusion for nuclear transfer success with different cell types in cattle. Cloning Stem Cells, 4(3), 189-196.

138. Gardner R.L. (1971). Manipulations on the blastocyst. Bioscience, 6,279-296.

139. Gopal T.V. (1985). Gene transfer method for transient gene expression, stable transformation, and cotransformation of suspension cell .cultures. Mol. Cell Biol., 5(5), 1188-1190.

140. Graessmann A., Graessmann M. (1988). DNA methylation, chromatin structure and regulation of Herpes simplex virus tk gene expression. Gene, 74(1), 135-137.

141. Graessmann A., Graessmann M., Mueller C. (1979). Fused cells are suited for microinjection. Biochem; Biophys. Res. Commun., 88(2), 428-432. :

142. Graessmann A., Graessmann<M., Mueller C. (1980). Microinjection'of early SV40 DNA fragments and T antigen. Methods Enzymol., 65(1), 816-825.

143. Graessmann-M., Graessmann A. (1983). Microinjection of tissue culture cells. Methods Enzymol., 101, 482-492.

144. Graham C.F. (1969). The fusion of cells with one- and »two-cell mouse embryos. Wistar Inst Symp Monogr., 9, 19-35.

145. Graham C.F. (1971). Virus assisted fusion'of embryonic cells. Acta-Endocrinol Suppl (Copenh), 153, 54-67. :.

146. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol., 36(1), 59-74.

147. Graham F.L., van der Eb A.J. (1973). A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology, 52(2), 456-467.

148. Gray D., Plusa B., Piotrowska K., Na J., Tom B., Glover D.M., Zernicka-Goetz M. (2004). First cleavage of the mouse embryo responds to change in egg shape at fertilization. Curr. Biol., 14(5), 397-405.

149. Greenwald G.S. (1962). The role of the mucin layer in development of the rabbit blastocyst. Anat Rec., 142, 407-415.

150. Greising T., Jonas L. (1999). The influence of enucleation on the ultrastructure of in vitro matured and enucleated cattle oocytes. Theriogenology, 52(2), 303-312.

151. Gurdon J.B. (1962). Adult frogs derived from the nuclei of single somatic cells. Dev. Biol., 4,256-273.

152. Gurdon J.B., Byrne J.A. (2003). The first half-century of nuclear transplantation. PNAS, 100(14), 8048-8052.

153. Gurdon J.B., Lane C.D., Woodland H.R., Marbaix G. (1971). Use of frog eggs and oocytes for the study of messenger RNA and its translation in living cells. Nature, 233(5316), 177-182.

154. Guy J, Drabek D, Antoniou M. (1995). Delivery of DNA into mammalian cells by receptor-mediated endocytosis and gene therapy. Mol. Biotechnol., 3,237-248.

155. Hahn J. (1984). The value of laboratory animals in embryo transfer research. Theriogenology, 21,45-59.

156. Hanahan D. (1985). Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature, 315(6015), 115-222.

157. Haskell R.E., Boven R.A. (1995). Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos. Mol Reprod Dev 40:386- 390.

158. Heyman J. (1985). Factors affecting the survival of whole and half-embryos, transferred in cattle. Theriogenology, 23(1), 63-75.

159. Hiramoto Y. (1970). Rheological properties of sea urchin eggs. Biorheology, 6(3), 201-234.

160. Hiroshi H., Ogawa S. (1981) Studies on the developmental potential and the survival after the deep freezing of microsurgically dichotomized morulae embryos in rats and rabbits. Japan J. Anim. Reprod., 27(11.), 12-17.

161. Hochedlinger K., Jaenisch R». (2003). Nuclear transplantation, embryonic stem cells, and the potential for cell therapy, N. Engl. J. Med:, 349(3), 275-286.

162. Holm P., Greve T., Bak A., Schmidt M. (1991). Bisection of bovine morulae and blastocysts from superovulated Danish dairy cows. Acta Vet. Scand., 32(1), 47-53.

163. Holt W.V.,. Pickard A.R., Prather R.S. (2004). Wildlife conservation and. reproductive cloning. Reproduction, 127(3), 317-324.

164. Hoodbhoy T, Talbot P. (1994). Mammalian cortical granules: contents, fate, and* function. Mol Reprod Dev. 39(4),"439-48. Review.

165. Hoppe P.C., Illmensee K. (1982). Full-term development after transplantation of parthenogenetic embryonic nuclei into fertilized mouse eggs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.; 79(6), 1912-1916.

166. Hoppe P.S., Illmensee K. (1977). Microsurgically produced homozygous-diploid uniparental mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74(12), 5657-5661.

167. Houdebine L.M., Chourrout D. (1991). Transgenesis in fish. Experientia, 47(9), 891-897.

168. Howlett S.K., Barton S.C., Surani M.A. (1987). Nuclear cytoplasmic interactions following nuclear transplantation in mouse embryos. Development, 101(4), 915923

169. Huther G., Andra J. (1980). Microelectrophoresis—experience and uses. Z'. Med. Lab. Diagn.; 21(2), 67-77.

170. Illmensee К. (2002). Biotechnology in reproductive medicine. Differentiation, 69,167-173.

171. Illmensee К., Hoppe P.C. Nuclear transplantation in Mus musculus: developmental potential of nuclei from preimplantation embryos. Cell, 1981, 23(1), 9-18.

172. Ivakhnenko V., Cieslak J., Verlinsky Y. (2000). A microsurgical technique for enucleation of multipronuclear human zygotes. Hum. Reprod., 15(4), 911-916.

173. Ivanova M.M., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Sobolev A.S., Landa V., Naroditsky B.S., Ernst L.K. (1999). Receptor-mediated transport* of foreign DNA into preimplantation mammalian embryos. Mol. Reprod. Dev., 54(2), 112-120.

174. Kaltoft K., Celis J.E. (1978). Ghost-mediated transfer of human hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase into deficient Chinese hamster ovary cells by means of polyethylene glycol-induced fusion. Exp. Cell Res., 115(2), 423-428!

175. Kang Y.K., Koo D.B., Park J.S., Choi Y.H., Chung A.S., Lee K.K., Han Y.M. (2001). Aberrant methylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nat. Genet., 28(2), 173-177.

176. Kapur R.P., Johnson L.V. (1988). Ultrastructural evidence that specialized regions of the murine oviduct contribute a glycoprotein to the extracellular matrix of mouse oocytes. Anat Rec., 221(3), 720-729.

177. KatoY., Tani T., Sotomaru Y., Kurokavva K., Kato J., Doguchi H., Yasue H., Tsunoda Y. (1998). Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, 282(5396), 2095-2098.

178. Kawase Y., Iwata T., Watanabe M., Kamada N., Ueda~0., Suzuki. H. (2001). Application of the piezo-micromanipulator for injection ¿of embryonic stem cells into mouse blastocysts. Contemp: Top Lab. Anim. Sci., 40(2), 31-34.

179. Keefer C.L. (2008). Lessons learned from nuclear transfer (cloning). Theriogenology, 69(1), 48-54.

180. Kikyo N., Wolffe A.P. (2000). Reprogramming nuclei: insights from cloning, nuclear transfer and heterokaryons. J. Cell Sci., 113 (Pt 1), 11-20.

181. Kopac M.J. (1956). Instrumentation for the Transplantation of Nucleoli. J. of the Franklin Institute, 262, 407-411.

182. Korzh V., Strahle U. (2002). Marshall Barber and the century of microinjection: from cloning of bacteria to cloning of everything. Differentiation., 70(6), 221-226.

183. Корж В. (1981). Онтогенез, 12, 187-192.

184. Kubiak J.Z., Tarkowski A.K. (1985). Electrofusion of mouse blastomeres. Exp. Cell. Res., 157(2), 561-566.

185. Kuhholzer В., Prather R.S. (2000). Advances in livestock nuclear transfer. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 224(4), 240-245.

186. Kurome M., Fujimura T., Murakami H., Takahagi Y., Wako N., Ochiai T., Miyazaki K., Nagashima H. (2003). Comparison of electro-fusion and intracytoplasmic nuclear injection methods in pig cloning. Cloning Stem Cells, 5(4), 367-378.

187. Laffafian I., Hallett M.B. (1998). Lipid-assisted microinjection: introducing material into the cytosol and membranes of small cells. Biophys J., 75(5), 25582563.

188. Lambeth V.A., Looney C.R., Voekel S.A., Jackson S.A., Hill K.G., Godke R.A. (1983). Micromanipulation of bovine embryos at the morula stage to produce monozygotic twin calves. Theriogenology, 20, 85-95.

189. Latham K.E., Solter D.(1993). Transplantation of nuclei to jocytes and embryos. Methods Enzymol., 225, 719-732.

190. Li G.-P, Chen D.Y., Lian L., Sun Q.Y., Wang M.K., Liu J.L., Li J.S., Han Z.M. (2001). Viable rabbits derived from reconstructed oocytes by germinal vesicle transfer after intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Mol. Reprod. Dev., 58(2), 180-185.

191. Li G.-P., White K.L, Bunch T.D. Review of enucleation methods and procedures Bunch used in animal cloning: state of the art. Cloning Stem Cells. 2004;6(1):5-13. Review.

192. Li X., Li Z., Jouneau A., Zhou Q., Renard J.-P. (2003). Nuclear transfer: Progress and quandaries. Reprod. Biol. Endocrinol., 1(1), 84-89.

193. Lin T.P. (1966). Microinjection of mouse eggs. Science, 151(3708), 353-357.

194. Lin T.P. (1967). Micropipetting cytoplasm from the mouse egg. Nature, 216, 8889.

195. Loi P., Boyazoglu S., Fulka J., Naitana S., Cappai P. (1999). Embryo cloning by nuclear transfer: experiences in sheep. Livestock Production Science, 60 (2-3), 281-294, Sp.lss. SI.

196. Loi P., Clinton M., Vackova I., Fulka J. Jr., Feil R., Palmieri C., Delia Salda L., Ptak G. (2006). Placental abnormalities associated with post-natal mortality in sheep somatic cell clones. Theriogenology, 65(6), 1110-1121.

197. Loskutoff N.M. (1990). Micromanipulation of embryos and gametes. Embryo Transfer Newslett., 8(2), 5-14.

198. Loyter A., Zakai N., Kulka R.G. (1975). "Ultramicroinjection'' of macromolecules or small particles into animal cells. A new technique based.on virus-induced cell fusion. J. Cell Biol., 66(2), 292-304.

199. Markert C.L., Petters R.M. (1977). Homozygous mouse embryos produced by microsurgery. J. Exp. Zool., 201(2), 295-302.

200. McCaman R.E., McKenna D.G., Ono J.K. (1977). A pressure system for intracellular and extracellular ejections of picoliter volumes. Brain Res., 136(1), 141-147.

201. McGrath J., Solter D. (1983). Nuclear transplantation in the mouse by microsurgery and cell fusion. Science, 220, 1300-1302.

202. McGrath J., Solter D. (1984b). Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell, 37(1), 179-183.

203. McGrath J., Solter D. (1984c). Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science, 226, 1317-1319.

204. McGrath J., Solter D. Maternal Thp lethality in the mouse is a nuclear, not cytoplasmic, defect. Nature. (1984a). 308(5959), 550-551.

205. McLaren A. (1984). Methods and success of nuclear transplantation. Nature, 309, 671-672.

206. Meech R. (1981). Microinjection. In: Techniques in cellular physiology, Part 1, PI 09/1-16, Elsevier.

207. Meng L., Rutledge J., Zhu Y., Kidder G.M., Khamsi F., Armstrong D.T. (1996). Role of germinal vesicle on protein synthesis in rat oocyte during in vitro maturation. Mol. Reprod. Dev., 43(2), 228-235.

208. Mitalipov S.M., White K.L., Farrar V.R., Morrey J, Reed W.A. (1999). Development of nuclear transfer and parthenogenetic rabbit emb.ryos activated with inositol 1,4,5-trisphosphate. Biol. Reprod., 60(4), 821-827.

209. Miyawaki F„ Arai Y., Morisaki T., Ahmed S., Omata S., Fukui Y. (2003). Development of a vibratory microinjection method. Int. J. Artif. Organs, 26(1), 80-85.

210. Modlinski J.A. (1970). The role of the zona pellucida in the development of mouse eggs in vivo. J. Embryol. Exp. Morphol., 23(3), 539-547.

211. Modlinski J.A. (1978). Transfer of embryonic nuclei to fertilised mouse eggs and development of tetraploid blastocysts. Nature, 273(5662), 466-467.

212. Modlinski J.A. (1980). Preimplantation development of microsurgically obtained haploid and homozygous diploid mouse embryos and effects of pretreatment with CytochalasinB on enucleated eggs. J. Embryol. Exp. Morphol., 60, 153-161.

213. Modlinski J.A. (1981). The fate of inner cell mass and trophectoderm nuclei transplanted to fertilized mouse eggs. Nature, 292(5821), 342-343.

214. Moore N.W., Adams C.E., Rowson L.E.A. (1968). Develpment" potential of single blastomeres of rabbit eggs. J. Reprod. Fertil., 17, 527-531.

215. Motlik J., Fulka J. (1986). Factors affecting meiotic competence in pig oocytes. Theriogenology, 25, 87-96.

216. Moustafa L.A., Hahn J. (1978). Experimental production of identical twins in the mouse. Dtsch. Tierarztl. Wochenschr., 85(6), 242-244.

217. Mouton C., Reynolds H, Genco R'.J. (1977). Combined micromanipulation, culture and immunofluorescent techniques for isolation of the coccal organisms comprising the "corn cob" configuration of human dental plaque. J. Biol. Buccale, 5(4), 321-332.

218. Muggleton-Harris A., Whittingham D.G., Wilson L. (1982). Cytoplasmic control of preimplantation development in vitro in the mouse. Nature, 299(5882), 460462.

219. Mullen R.J., Whitten W.K., Carter S.C. (1970). In: Annual Report of the Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, pp. 67-68.

220. Nagashima H., Kato Y., Ogawa S. (1989). Microsurgical bisection of porcine morulae and blastocysts to produce monozygotic twin pregnancy. Gamete Res., 23(1), 1-9.

221. Nagashima H., Matsui K., Sawasaki T., Kano Y. (1984). Production of monozygotic mouse twins from microsurgically bisected morulae. J. Reprod. Fertil., 70(1), 357-362.

222. Nakagawa A., Takahashi Y.} Kanagawa H. (1985). Studies on developmental potentials of bisected mouse embryos in vitro and in vivo. Jap. J. Vet. Res., 33, №3-4, 121-133.

223. Neumann E., Schaefer-Ridder M., Wang Y., Hofschneider P.H. (1982). Gene transfer into Mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J., 1(7), 841-845.

224. Nicaise G., Meech R.W. (1980). The effect of microinjection on the ultrastructure of an identified molluscan neurone. Brain Res. 193(2), 549-553.

225. Nikitin V.A., Chochlov A.M., Larin V.T., Fichte B.A. (1986). Verfahren zur Durchfuhrung von Mikrooperationen an Zellen und Einrichtung zu dessen Verwirklichung Patentschrift DE 3390499 C2 BRD München.

226. Nikitin V.A., Chochlov A.M., Larin V.T., Fichte B.A. (1987). Vorrichtung zur Durchfuhrung von Mikrooperationen in Zellen und Verfahren zur Durchführung von Mikrooperation in Zellen Patentschrift DDR 242 525 A3 DDR.

227. Nikitin V.A., Chochlov A.M., Larin V.T., Fichte B.A. (1987). Zpusob provadeni mikrooperaci bunek a zarizeni k jeho provadeni'Cislo 258410.

228. Nikitin V.A., Chochlov A.M., Larin V.T., Fichte B.A. (1988). Verfahren zur Durchführung von Mikrooperationen an Zellen und Einrichtung zu dessen Verwirklichung CH 666 850 A5 Patentanwälte Schaad, Balass & Partner, Zurich.

229. Nikitin V.A., Khokhlov A.M., Larin V.T., Fikhte B.A. (1986). Method and1 device for performing microoperation' on cells Patent Number: 4,619,899 United States Patent.

230. Nikitin V.A., Khokhlov A.M., Larin V.T., Fikhte B.A. (1986). Proc'ed'e d'intervention microchirurgicale sur les cellules et dispositif pour sa mise en oeuvre N de publication: 2 553 432 REPUBLIQUE FRANÇAISE, Cabinet Lavoix.

231. Nikitin V.A., Khokhlov A.M., Larin V.T., Fikhte B.A. (1987). Method and device for performing microoperation.on cells UK Patent GB^ 154 608-B-UK Patent London.

232. Oback B., Wells D. (2002). Donor cells for nuclear cloning: many are called, but few are chosen. Cloning Stem Cells, 4(2), 147-168»

233. Oback B., Wells D. (2003). Cloning cattle. Cloning Stem Cells, 5(4), 243-256.

234. Ocho M., Nakai S., Tasaka K., Watanabe S., Oda T. (1981). Microinjection of nucleic acids into cultured mammalian cells by electrophoresis. Acta Med. Okayama, 35(5), 381-384.

235. Ogawa S., Miyake K., Seike N., Kanagwa H. (1983). Microsurgical technique-for the bisection of early embryos in the mouse, rabbit and cow. Jpn. J. Anim. Reprod., 29, 198-208.

236. Ogonuki N., Inoue K., Yamamoto Y., Noguchi Y., Tanemura K., Suzuki O., Nakayama H., Doi K., Ohtomo Y., Satoh M., Nishida A., Ogura A. (2002). Early death of mice cloned from somatic cells. Nat. Genet., 30(3), 253-254.

237. Ogura A., Inoue K., Takano K., Wakayama T., Yanagimachi R. (2000). Birth of mice after nuclear transfer by electro fusion using tail tip cells. Mol. Reprod. Dev., 57, 55-59.

238. Ornitz D.M., Palmiter R.D., Hammer R.E., Brinster R.L., Swift G.H., MacDonald R.J. (1985). Specific expression of an elastase-human growthhormone fusion gene in pancreatic acinar cells of transgenic mice. Nature, 13(6003), 600-602.

239. Otani H., Yokoyama M., Nozawa-kimura S., Tanaka O., Katsuki M. (1987). Pluripotency of homozygous-diploid mouse embryos in chimeras. Dev. Growth Differ., 29, 373-380.

240. Otto L. (1954). Der Mikromanipulator und seine Hiflsgerate. Veb Verlag Technik. Berlin.

241. Ozil J.P. (1983). Production of identical twins by bisection of blastocysts in the cow. J. Reprod. Fertil, 69, 463-468.

242. Ozil J.P., Heyman Y., Renard J.P. (1982). Production of monozygotic twins by micromanipulation and cervical transfer in the cow. Vet. Res., 110, 126-127.

243. Ozil J.P., Modlinski J.A. (1986). Effects of electric field on fusion rate and survival of 2-cell rabbit embryos. J. Embryol. Exp. Morphol., 96, 211-228.

244. Palmieri C., Loi P., Reynolds L.P., Ptak G., Delia Salda L. (2007). Placental abnormalities in ovine somatic cell clones at term: a light and electron microscopic investigation. Placenta, 28(5-6), 577-584.

245. Papaioannou V.E. (1981). Microsurgery and micromanipulation of early mouse embryos. In: Techniques in cellular physiology, Part I, PI 16/1-27. Elsevier.

246. Papaioannou V.E., Mkandawire J., Biggers J.D: (1989). Development and phenotypic variability of genetically identical half mouse embryos. Development. 106(4), 817-827.

247. Pastushenko V.F., Chizmadzhev Iu.A. (1982). Theory of electric clamp of lipid bilayer membranes. Splitting of the energy barrier. Biofizika, 27(3), 475-479.

248. Pedersen R.A. (2001). Sperm and mammalian polarity. Nature, 409, 473-474.

249. Pellicer A., Robins D., Wold B., Sweet R., Jackson J., Lowy I., Roberts J.M., Sim G.K., Silverstein S., Axel R. (1980). Altering genotype and phenotype by DNA-mediated-gene transfer. Science, 209(4463), 1414-1422.

250. Pendleton R.J., Youngs C.R., Rorie R.W., Mernon M.A., Godke R.A. (1987). The birth of split-embryo goat offspring in Louisiana. Dairy Goat J., 65, 58-59.

251. Pepperkok R., Schneider C., Philipson L., Ansorge W. (1991). Single cell assay with'an automated capillary microinjection system. Cytotechnology, 5 Suppl 1, 93-98.

252. Perez-Mongiovi D., Beckhelling C., Chang P., Ford C.C., Houliston E. (2000). Nuclei and microtubule asters stimulate maturation/M phase promoting factor (MPF) activation in Xenopus eggs and egg cytoplasmic extracts. J. Cell Biol., 150(5), 963-974.

253. Perry A.C., Wakayama T. (2002). Untimely ends and new beginnings in mouse cloning. Nat. Genet., 30(3), 243-244.

254. Peterfi T. (1923). Die mikrurgische Methodik. Handb. Microbiol. Technik. Kraus und Uhlenhut. Urban and Schwarzenberg, Berlin.

255. Peura T.T., Lewis I.M., Trounson A.O. (1998). The effect of recipient oocyte volume on nuclear transfer in cattle. Mol Reprod. Dev., 50(2), 185-191.

256. Peura T.T., Tolvanen M., Hyttinen J.M., Janne J. (1995). Effects of membrane piercing and the type of pronuclear injection fluid on development of in vitro-produced bovine embryos. Theriogenology. 43(6), 1087-1096.

257. Picard L., Betteridge K. (1989). The micromanipulation of farm animal embryos. In: Animal Biotechnology, Comprehensive Biotechnology (First Suppl). M. Moo-Yong, L. Babiuk, J. Phillips (Eds). Pergamon Press, Oxford, pp. 141-178.

258. Picard L., Greve T., King W.A., Betteridge K.J., Jorgensen P.H. (1986). Bisection of post-compaction bovine embryos: the difference in viability between the two monozygotic halves. Acta Vet. Scand., 27(1), 33-48.

259. Piotrowska K., Zernicka-Goetz M. (2001). Role for sperm in spatial patterning of the early mouse embryo. Nature, 409, 517-521.

260. Piotrowska K., Zernicka-Goetz M. (2002). Early patterning of the mouse embryo—contributions of sperm and egg. Development, 129(24), 5803-5813.

261. Polejaeva I.A., Chen S.H., Vaught T.D., Page R.L., Mullins J., Ball S., Dai Y., Boone J., Walker S., Ayares D.L., Colman A., Campbell K.H. (2000). Cloned pigs produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 407(6800), 86-90.

262. Prathe. R.S., Barnes F.L., Sims M.M., Robl J.M., Eyestone W.H., First N.L. (1987). Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte. Biol Reprod., 37(4), 859-866.

263. Prather R.S. (1991). Nuclear Transplantation and Embryo Cloning in Mammals. ILAR Journal Online, Volume 33(4).

264. Prather R.S. (2007). Nuclear remodeling and nuclear reprogramming for making transgenic pigs by nuclear transfer. Adv. Exp. Med. Biol., 591, 1-13.

265. Prather R.S., Sims M.M., First N.L. (1989). Nuclear transplantation in early pig embryos. Biol Reprod., 41 (3), 414-418.

266. Pursel V.G., Rexroad C.E. Jr. (1993). Status of research with transgenic farm animals. J Anim Sci., 71 Suppl 3, 10-19. Review.

267. Raz T., Shalgi R. (1998). Early events in mammalian egg activation. Hum: Reprod., 13 Suppl 4, 133-145.

268. Reik W., Dean W., Walter J. (2001). Epigenetic reprogramming in mammalian development. Science, 293(5532), 1089-1093.

269. Reinert G.G. (1939). Forschritte in der Technik des Micromnipulators. Zeiss.-Nachr., 3 Folge, H. 1-5.

270. Renard J.P., Zhou Q., LeBourhis D:, Chavatte-Palmer P., Hue I., Heyman Y., Vignon X. (2002). Nuclear transfer technologies: between successes and doubts. Theriogenoly, 57, 203-222.

271. Repin V.S., Saburina I.N., Sukhikh G.T. (2007). Cell biology of fetal tissues and fundamental medicine. Bull. Exp. Biol. Med., 144(1), 108-117.

272. Reyniers J. A. (1933). Studies in micrurgical technique. The adaptation of single-cell technique to routine use. J. Bact., 26 (цит. по Перфильев, Габбе, 1961).

273. Reyniers J.A. (1943). Introduction to the general problem of isolation and limination of contamination. Symp. "Microsurgical and germ-free methods", (цит. по Перфильев, Габбе, 1961).

274. Rideout W.M., III, Eggan K., Jaenisch R. (2001). Nuclear cloning and epigenetic reprogramming of the genome. Science, 293, 1093-1098.

275. Rorie R.W., McFarland C.W., Overskei T.L., Voetkel S.A., Godke R.A. (1987). A new method of splittimg embryos without the use of a commercial micromanipulator unit. Theriogenology, 23, 224.

276. Rottmann O.J., Lampeter W.W. (1981). Development of early mouse and rabbit embryos without zona pellucida. J. Reprod. Fertil., 61(2), 303-306.

277. Sathananthan A.H. (1997). Mitosis in the human embryo: the vital role of the sperm centrosome (centriole). Histol. Histopathol., 12(3), 827-856.

278. Schouten S.L. (1935). Untersuchung mit dem Mikromanipulator. Arch. Exp. Zellf., 17. (цит. по Перфильев, Габбе, 1961).

279. Seidel F. (1952). Die entwicklungspotenzen einer isolierten blastomere es zweizellenen stadium. Saugetierei Naturwissenschafter, 39, 306.

280. Selezneva I.I., Savintseva I.V., Vikhlyantseva E.F., Davydova G.A., Gavrilyuk B.K. (2006). Immobilization and long-term culturing of mouse embryonic stem cells in collagen-chitosan gel matrix. Bull. Exp. Biol. Med., 142(1), 119-122.

281. Shaefer-Ridder M., Wang Y, Hofschneider P.H. (1982). Science, 215, 166-168.

282. Shen Y.M., Hirschhorn R.R., Mercer W.E., Surmacz E., Tsutsui Y., Soprano K.J., Baserga R. (1982). Gene transfer: DNA microinjection compared with DNA transfection with a very high efficiency. Mol. Cell Biol., 2(9), 1145-1154.

283. Shephard K.L. (1987). The influence of water pH on the perivitelline fluid of perch (Perca fluviatilis) eggs. Comp. Biochem. Physiol. C., 86(2), 383-386.

284. Shi W., Zakhartchenko V., Wolf E. (2003). Epigenetic reprogramming in mammalian nuclear transfer. Differentiation, 71(2), 91-113.

285. Simerly C., Dominko T., Navara C., Payne C., Capuano S., Gosman G., Chong K.Y., Takahashi D., Chace C., Compton D., Hewitson L., Schatten G. (2003). Molecular correlates of primate nuclear transfer.failures. Science, 300(5617), 297.

286. Sobolev A.S., Rosenkranz A.A., Smirnova O.A., Nikitin V.A., Neugodova G.L., Naroditsky B.S., Shilov I.N., Shatski I.N., Ernst L.K. (1998). Receptor-mediated transfection of murine and ovine mammary glands in vivo. J. Biol. Chem., 273(14), 7928-7933.

287. Solter D. (1998). Dolly is a clone-and no longer alone. Nature, 394(6691), 315316.

288. Spemann* H. (1928). Die entwicklung seitlicher und dorso-ventraler. Keimhälften bei verzögerter Kernversorgung. Ztschr. f. wiss. Zool. 132, 105-134.

289. SpemannrH. (1938). Embiyonic Development and Induction. New York: Hafner Publishing Co., pp. 210-211.

290. Stewart C. (1997). Nuclear transplantation. An udder way of making lambs. Nature, 385(6619), 769; 771.

291. Sukharev S.I.,' Bandrina N., Barbul A.I. et al. (1987). Studia Biophys., 120(1), 91.

292. Sun Q.Y., Schatten H. (2007). Centrosome inheritance after fertilization and nuclear transfer in mammals. Adv. Exp. Med. Biol., 591, 58-71.

293. Surani M.A., Barton S.C., Norris M.L. (1984). Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature, 308(5959), 548-550.

294. Surani'M.A., Barton S.C., Norris M.L. (1987). Experimental reconstruction of mouse eggs and embryos: an analysis of mammalian development. Biol. Reprod., 36(1), 1-16. Review.

295. Sussman D.J., Milman G. (1984). Short-term, high-efficiency expression of transfected DNA. Mol. Cell Biol., 4(8), 1641-1643.

296. TabaraN. (1998). In vitro and in vivo survival of frozen-thawed bovine oocytes after I VF, nuclear transfer, and parthenogenetic activation. Mol. Reprod., 51(3), 281-286.

297. Talbot P., Dandekar P. (2003). Perivitelline space: does it play a role in blocking polyspermy in mammals? Microsc. Res. Tech., 61(4), 349-357.

298. Tamashiro K.L., Wakayama T., Akutsu H., Yamazaki Y., Lachey J.L., Wortman M.D., Seeley R.J., DAlessio D.A., Woods S.C., Yanagimachi R., Sakai R.R.2002). Cloned mice have an obese phenotype not transmitted to their offspring. Nat. Med., 8(3), 262-267.

299. Tarkowski A.K. (1959). Experiments on the development of isolated blastomeres of mouse egg. Nature, 184, 1286-1287.

300. Terreros D.A., Grantham J.J. (1982) Marshall Barber and the origins of micropipette methods. Am J. Physiol., 242, F293-F296.

301. Tschachotin S. (1912). Eine Microoperationsvorrichtung. Zs. Wiss Microskop., 29, 188.

302. Tschachotin S. (1935). Die Mikrosrahlstichmethode und andere Methoden des zytologischen Mikroexperimentes. Handb. Biol. Arbeitsmeth. Abderhalden, Abt. V. 10, 877.

303. Tsunoda Y, Yasui T, Nakamura K, Uchida T, Sugie T. (1986). Effect of cutting the zona pellucida on the pronuclear transplantation in the mouse. J. Exp. Zool., 240(1), 119-125.

304. Tsunoda Y. (1986). Gastrin induces intracellular Ca2+ release and acid secretion regulation by the microtubular-microfilamentous system. Biochim. Biophys. Acta., 855(1), 186-188.

305. Tsunoda Y., Kato Y., Shioda Y. (1987). Electrofusion for the pronuclear transplantation of mouse eggs. Gamete Res., 17, 15-20.

306. Tsunoda Y., KatoY. (2002). Recent progress and problems in animal cloning. Differentiation, 69(4-5), 158-161.

307. Tsunoda, Y., McLaren A. (1983). Effect of various procedures on viability of mouse embryos containing half the normal number of blastomeres. J. Reprod. Fertil., 69(l),315-322.

308. Tsunoda^ Y., Tokunaga' T., Sugie T., Katsumata< M. (1985). Production of monozygotic twins following the transfer of bisected embryos in the goat. Theriogenology, 24, 337-345.

309. Van der Putten H., Botteri F.M., Miller A.D., Rosenfeld M.G., Fan H., Evans R.M., Verma I.M. (1985). Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors. Proc. Nat.l Acad. Sci. U.S.A., 82, 148-152.

310. Van Hoof J:, Harrisson F., Vakaet L. (1984). Microinjection in the chick blastoderm. An improved method-to study the extracellular matrix in the living organism. Exp. Cell Res., 155(1), 278-282.

311. Wakayama T. Production of cloned mice and ES cells from adult somatic cells by nuclear transfer: how to improve cloning efficiency? (2007). J. Reprod. Dev., 53(1), 13-26. Review.

312. Wakayama T., Perry A.C., Zuccotti M., Johnson K.R., Yanagimachi R. (1998). Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 394(6691), 369-374.

313. Walton J.R., Murray J.D., Marshall J.T., Nancarrow C.D. (1987). Zygote viability in gene transfer experiments. Biol. Reprod., 37, 957-967.

314. Warfield S.J., Seidel G.E. Jr, Elsden R.P. (1987). Transfer of bovine demiembryos with and without the zona pellucida. J. Anim. Sci., 65(3), 756-761.

315. Wee G., Koo D.B., Song B.S., Kim J.S., Kang M.J., Moon S.J., Kang Y.K., Lee K.K., Han Y.M. (2006). Inheritable histone H4 acetylation of somatic chromatins in cloned embryos. J. Biol. Chem., 281(9), 6048-6057.

316. Westhusin M.E., Levanduski M.J., Scarborough R., Looney C.R., Bondioli K.R. (1992). Viable embryos and normal calves after nuclear transfer into Hoechst stained enucleated demi-oocytes of cows. J. Reprod. Fertil., 95(2), 475-480.

317. Whithingham A.G. (1974). Composition of phophate buffered medium for mouse embryos storage. Embryo banks in the future of developmental genetics. Genetics, 78,395-402.

318. Whitten W.K., (1971). Nutrient requirements for culture of preimplantation embryos in vitro. Adv. Biosci., 6, 129-141.

319. Wighton D.C. (1966). A plexiglas isolation-transfer chamber for use with the Fonbrune micromanipulator. Stain Technol., 41(2), 139-140.

320. Wigler M., Pellicer A., Silverstein S., Axel R. (1978). Biochemical transfer of single-copy eucaryotic genes using total cellular DNA as donor. Cell, 14(3), 725731.

321. Willadsen S.M. (1983). Micromanipulation of embryos of the large domestic species. In: Mammalian egg transfer. Ed. Adams C. E., CRC Press. Inc. Boca Raton, Florida, pp. 185-210.

322. Willadsen S.M. (1986). Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, 320(6057), 63-65.

323. Willadsen S.M. (1985). Towards cloning of domestic animals. In: Future Aspects in Human In Vitro Fertilization, ed. W. Feichtinger, P. Kemeter, SpringerVerlag, Berlin, pp. 232-237.

324. Willadsen S.M., Godke R.A. (1984). A simple procedure for the production of identical sheep twins. Vet Rec., 114(10), 240-243.

325. Willadsen S.M., Lehn-Jensen H., Fehilly C.B, Newcomb R. (1981). The production of monozygotic twins of preselected parentage by micromanipulation of non-surgically collected cow embryos. Theriogenology, 15(1), 23-29.

326. Williams T.J., Elsden R.P., Seidel G.E. (1982). Identical twin bovine pregnancies derived from bisected embryos. Theriogenology, 47, 114.

327. Williams T.J., Elsden R.P., Seidel G.E. (1984). Pregnancy rates with bisected bovine embryos. Theriogenology, 22, 521-531.

328. Wilmut I., Schnieke A.E., McWhir J., Kind A.J., Campbell K.H.S. (1997). Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 385, 810— 813.

329. Woods G.L., White K.L., Vanderwall D.K., Li G.-P., Aston K.I., Bunch T.D., Meerdo L.N., Pate B.J. (2003). A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science, 301(5636), 1063.

330. Wrenzycki C., Wells D., Herrmann D., Miller A., Oliver J., Tervit R., Niemann H. (2001). Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned bovine blastocysts. Biol. Reprod., 65(1), 309-317.

331. Yang F., Hao R., Kessler B. Brem G„ Wolf E„ Zakhartchenko V. (2007). Rabbit somatic cell cloning: effects of donor cell type, histone acetylation status and chimeric embryo complementation. Reproduction, 133( 1), 219-230.

332. Yang X., Foote R.H. (1987). Production of identical twin rabbits by micromanipulation of embryos. Biol. Reprod., 37, 1007-1014.

333. Yang X., Jiang S., Farrell P., Foote R.H., McGrath A.B. (1993). Nuclear transfer in cattle; effect of nuclear donor cells, cytoplast age, co-culture, and embryo transfer. Mol. Reprod. Dev., 35(1), 29-36.

334. Yu Y., Ding C., Wang E„ Chen X., Li X., Zhao C„ Fan Y., Wang L., Beaujean N., Zhou Q., Jouneau A., Ji W. (2007). Piezo-assisted nuclear transfer affects cloning efficiency and may cause apoptosis. Reproduction, 133(5), 947-954.

335. Zakhartchenko V., Stojkovic M., Brem G., Wolf E. (1997). Karyoplast-cytoplast volume ratio in bovine nuclear transfer embryos: effect on developmental potential. Mol. Reprod. Dev., 48(3), 332-338.

336. Zalokar M. (1981). A method for injection and transplantation of nuclei and cells in Drosophilla eggs. Experientia, 37(12), 1354-1356.

337. Zimmermann U, (1982). Electric field-mediated fusion and related electrical phenomena. Biochim. Biophys. Acta, 694(3), 227-277. Review.

338. Zimmermann U., Scheurich P. (1981). Fusion of Avena sativa mesophyll cell protoplasts by electrical breakdown. Biochim. Biophys. Acta, 641(1), 160-165.

Информация о работе

Никитин, Владимир Афанасьевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2008
ВАК 03.00.02

Диссертация

Биофизические аспекты микрохирургической реконструкции клетки. Разработка новых подходов и методов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы