Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая дифференциация хантавирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Генетическая дифференциация хантавирусов"

?Т6 ОЛ

, б № №5

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им. М.П.Чумакова

На правах рукописи УДК 616.98:578.833.1- 078.33

ДЕКОНЕНКО Александр Евгеньевич

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ХАНТАВИРУСОВ

03.00.06 - вирусология

Автореферат .диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Научные руководители:

Кандидат биологических науж, ГЛО. ЛИПСКА5!

Профессор, доктор медицинских наук Е.А. ТКАЧЕНКО

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент РАМН, профессор, доктор медицинских наук В.А. ЛАШКЕВИЧ

Доктор биологических наук A.A. АГРАНОВСКИЙ

Ведущая организация: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Защита диссертации состоится " <^ 1996 г. в 1022 часов на

заседании Диссертационного совета Д. 1)01.2/.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

О.А.Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хантавирусные лихорадки - инфекционные заболевания людей, возбудители которых относятся к роду Хаитавирус семейства Буньявириде современной классификации вирусов. Природным резервуаром хантавирусов и источником заражения людей являются дикие грызуны, спонтанно инфицированные этими вирусами.

Термин "геморрагическая лихорадка с почечным синдромом" (ГЛПС) употребляется в настоящее время для обозначения заболевания, возбудителем которого может быть, в зависимости от географического региона, один из 4-х хантавирусов: Хантаан (Hantaan), Пуумала (Puumala), Сеул (Seoul) и Добрава/Белград (Dobrava/Belgrade). В клинической картине ГЛПС ведущим является своеобразное поражение почек, сопровождающееся у части больных симптомами геморрагического диатеза. ГЛПС распространена, главным образом, в странах Евразии, из которых Китай и Россия лидируют по показателям заболеваемости на 100 тысяч населения. В Российской Федерации ГЛПС занимает ведущее место среди зоонозных вирусных инфекций и одно из первых мест среди всех природно-очаговых болезней человека.

___Название "хантявирусный_пульмональный_синдром!1—(ХПС) было—

принято для обозначения недавно обнаруженного в США заболевания, ' вызываемого хантавирусами Син Номбре (Sin Nombre), Блок Крик Канал (Black Creek Canal) и Байо (Bayou). В отличии от ГЛПС в клинической картине ХПС ведущим является поражение легких, сопровождающееся интерстициальной пневмонией и респираторным дистресс-синдромом, приводящим в 50-60% к летальному исходу.

Широкое распространение, высокие показатели заболеваемости людей, значительная частота тяжелых форм течения болезни, отсутствие специфических средств лечения и профилактики обусловливают высокую

социальную и медицинскую значимость проблемы хантавирусных лихорадок.

С момента выделения в 1976 г. в Южной Корее от полевой мыши первого хантавируса до настоящего времени в различных регионах мира было выделено от больных тодей, мелких млекопитающих, птиц и клещей более 500 хантавирусных штаммов, в том числе на территории Российской Федерации и Республик бывшего СССР - более 100 штаммов.

Еще на первом этапе изучения штаммов вируса-возбудителя ГЛПС с помощью серологических методов с использованием сывороток крови больных и переболевших ГЛПС людей из разных географических регионов мира была установлена антигенная неоднородность вируса ГЛПС, так называвшегося в то время и считавшегося единственным циркулирующим в природе и инфицирующим людей хантавирусом. Немного позднее было показано также, что антигенные различия возбудителя ГЛПС, которые прежде связывали с территориальным размещением природных очагов, коррелируют, в основном, с видовой принадлежностью мелких млекопитающих - природного резервуара вируса ГЛПС. По мере совершенствования лабораторных методов выявления вирусного антигена и специфических антител, а также в результате разработай и применения моноклональных антител удалось изучить более тонкие антигенные взаимоотношения между вирусными штаммами, что позволило распределить исследованные штаммы по группам, которые было решено рассматривать, как антигенные варианты или серотипы вируса ГЛПС, а позже, как хантавирусные типы. К началу наших исследований в мире было серологически типировано 8 хантавирусных типов: Хантаан, Пуумала, Сеул. Проспект Хилл, Добрава/Белград, Таиланд, Тоттапалаям и Син Номбре, в том числе на территории бывшего СССР - четыре типа. Однако, вопрос с реальном количестве существующих в природе хантавирусов остается открытым, как и вопрос об эпидемиологической значимости и пагогенност}

еще не открытых хантавирусных типов, их природных резервуарах и носителях.

Наглядным примером, подтверждающим актуальность этой проблемы, было обнаружение в 1993 г. в США нового хантавирусного типа и установление его этнологической связи с тяжелым инфекционным заболеванием людей. Вместе с тем, было вполне очевидным, что для решения этих важных вопросов необходимы новые, современные и более эффективные методические подходы, позволяющие в короткие сроки обнаруживать и идентифицировать хантавирусы, при этом не только в клетках; предварительно инфицированных вирусными штаммами, но и непосредственно в полевых материалах от животных и людей.

В этом плане применение молекулярно-биологических методов, позволяющих выявлять вирусную РНК и анализировать геном вируса, является, на наш взгляд, наиболее перспективным направлением.

Цель работы: Исходя из вышеизложенного, мы предприняли исследования, направленные на оптимизацию, применительно к хантавирусам, методов генетической индикации и идентификации, а также выявления с помощью этих методов новых хантавирусов и изучения генетических взаимосвязей между хантавирусными типами.

Задачи работы:

1. Определить оптимальные условия применения полимеразной ценной реакции (ПЦР) и метода частичного секвенирования генома для индикации и идентификации хантавирусов.

2. Разработать новый метод ПЦР-ИФА, базирующийся на комбинированном использовании полимеразной цепной реакции и иммуноферментного анализа, для детекции и идентификации хантавирусов.

3. Изучить генетическую структуру хантавирусов различного происхождения с помощью ПЦР и частичного секвенирования генома.

4. Установить эволюционное родство между хантавирусными типами и определить генотипы, циркулирующие на территории Российской Федерации и республик бывшего СССР.

Научная новизна. Обнаружение новых хантавирусных типов, циркулирующих в России (Хабаровск и Таймыр); первое выявление хантавирусного типа Тула в Крыму и установление их эволюционного родства с известными хантавирусными типами.

Были оптимизированы молекулярно- биологические методы применительно к хантавирусам, позволившие существенно повысит! эффективность выявления и идентификации хантавирусов и получить новьк данные, имеющие приоритетное значение в изучении хантавирусов I хантавирусных лихорадок в нашей стране и за рубежом. К ним относятся определение генетических характеристик хантавирусных штаммов выделенных ранее в России республиках бывшего СССР, и их систематизацге по принадлежности к конкретным хантавирусным типам.

Практическая значимость работы. Разработка нового метода ПЦР-ИФ/ и оптимизация применительно к хантавирусам ПЦР и секвенировани: позволяют более эффективно по сравнению с ранее применявшимися методам! обнаруживать и идентифицировать хантавирусы непосредственно в полезы; материалах от животных и человека, что открывает перспективу для оценю активности природных очагов и своевременного проведения соответствующн противоэпидемических мероприятий.

Основные положения, выносимые на защиту.

I. Для индикации и идентификации хантавирусов оптимизирован! условия применения полимеразной цепной реакции и секвенирования геномг

а также разработан новый метод ПЦР-ИФЛ, основанный на комбинированном использовании ПЦР и иммуноферментного анализа.

2. Установлены степень генетического родства исследованных хантавирусных штаммов и эволюционные взаимосвязи между хантавирусными типами.

3. Доказано существование новых хантавирусных типов на территории России (Хабаровск и Таймыр) и выявлен впервые в Крыму хантавирусный тип Тула.

4. Определены эволюционные взаимосвязи между хантавирусными типами.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на Междунар. симпозиуме по ГЛПС (Ленинград, 1991), 2-й Междунар. конференции по ГЛПС (Пекин, Китай, 1992), 3-й Междунар. конференции по ГЛПС (Хельсинки, Финляндия, 1995), а также на заседании межлабораторного Ученого совета по проблемам частной вирусологии Института полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН.

Публикация. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена- на 120 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (7 глав), заключения с обсуждением, выводов и списка литературы, состоящего из 104 источников (из них 14 -отечественных авторов). Работа иллюстрирована 29 рисунками и 12 таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе было использовано 34 хантавирусных штамма, из содержащихся в коллекции Института полиомиелита, образцы биологического материала, включая 10% суспензии легочной ткани мышевидных грызунов, а также кровь и сыворотки больных и-переболевших ГЛПС людей. Выделение тотальной (клеточной и вирусной) РНК без очистки вируса проводили либо методом фенольной депротеинизации, либо с использованием коммерческих реактивов для экстракции РНК.

Праймеры и пробы, фланкирующие фрагменты М- и S-сегментов хантавирусов, были сконструированы с помощью компьютерной программы. Пробы-зонды синтезировали с прикреплением молекулы биотина на 5'-конце.

Методической основой для проведения обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции служили методы, описанные в Сборнике лабораторных методик иод ред. Maniatis Т. (1989). Были использованы несколько модификаций ПЦР в зависимости от системы термоциклера и использовавшихся реагентов: классическая ПЦР, гнездовая ПЦР (nested PCR) и РНК-ПЦР.

Реакционные смеси подвергали термоциклированию с последующим контрольным электрофорезом (10 В/см) в 1,5% агарозном геде. Для синтеза дигоксигенин (0Ю)-меченных амплифицированных кДНК фрагментов использовали обычную методику постановки ПЦР, за исключением того, что использовали смесь dNTP, содержащую DIG-1 l-dUTP:dTTP в соотношении 1:9 (Boehringer Mannheim, Германия). Контроль включения дигоксигенина проводили с помощью Саузерн- блотгинга по стандартной методике.

Амплифицированные фрагменты части образцов были клонированы с использованием коммерческого набора ТА Cloning kit (Invitrogen, США) по методике, предложенной фирмой изготовителем. Очищенные плазмиды проверяли на наличие вставки с помощью ПЦР, используя вирус-

:пецифические праймеры, после чего секвенировали. Секвенированию тодвергали как амплифицированные фрагменты, очищенные из агарозного ~еля, так и клонированные ПЦР-фрагменты.

Секвенирование амплифицированных фрагментов проводили согласно ;тандартному протоколу с некоторыми модификациями с использованием эадиоактивно-меченной dATP ([a- PJdATP, fa- PJdATP или [a- SJdATP) и 5НК- полимеразы (Sequenase version 2.0). Электрофорез в юлиакриламидном геле, содержащем мочевину проводили при 50° С в течение 5 часов со стабилизацией по напряжению 1400 В. Гель фиксировали Ю мин в растворе содержащем 10% этиловый спирт и 10% уксусную кислоту, госле чего высушивали при комнатной температуре. Затем гель жспонировали на пленке Hyperfflm (Amersham, США) в течение 24 часов. Все эеагенты были от United States Biochemical, США. Амплифицированные фрагменты части образцов были мечены флуоресцентными метками и этсеквенированы на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 377 (Perkin-Elmer, CILIA). Секвенирование проводилЬ в обоих направлениях трех независимо амплифицированных кДНК фрагментов каждого из образцов.

ПЦР-ИФА (PCR-ELISA) с использованием биотинилированных проб-юндов проводили следующим образом. К DIG-меченному ПЦР-продукту добавляли денатурирующий раствор, после чего проводили гибридизацию с Зиотин-меченными пробами. Смесь, содержащую ДНК-проба гибриды тереносили в панели со стрептавидиновым покрытием и инкубировали 1 час три 37° С. Панели промывали 3 раза промывочным буфером, 3 раза дистиллированной водой и в лунки добавляли раствор анти-DIG хонъюгата, леченного пероксидазой хрена. Панели инкубировали 30 мин при 37° С, после iero повторно промывали описанным способом и в лунки добавляли ;убстрат- индикаторный раствор (ABTS). Заключительную инкубацию зроводили в темноте при 37° С от 15 мин до 1 часа. Все реагенты для ПЦР-ЯФА были от Boehringer Mannheim, Германия. Оптическую плотность

измеряли при длине волны 410/490 нм после 15, 30 и 60 мин инкубации

Результат считали положительным, если значения оптической плои гост:

превышали величину, исчисляемую по формуле:

(ОРх +ОРг+ОРз)

ОР=1-— + Зет

3

где , ООг , ООз - величины оптической плотности трех, не содержащи ДНК контролен (отрицательный контроль); ст - стандартное отклонение.

Выравнивание полученных нуклеотидных и аминокислотны последовательностей проводили с помощью пакета компьютерных програм РСОЕНЕ или СепеЬее (Бродский и соавт., 1992, МГУ, Москва Филогенетический анализ был сделан с использованием пакетов програм РНУ1ЛР, версия 3.5 и РАЪ'Р, версия 2.4.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящем исследовании было доказано, что на тсрриторг Российской Федерации циркулирует по крайней мере 5 хантавирусных типо Кроме известных ранее типов Хантаан, Сеул и Пуумала были выявлены еи два - Хабаровск и Тула. Остается открытым вопрос о циркуляции I территории Крыма хантавирусов типа Проспект Хилл, к которому I результатам исследования в МФА с моноклональными антителами были отнесены штаммы МА-24, МА-40, МА-34, МА-36, выделенные в этс географическом регионе из обыкновенной полевки {Мкгош апаИ. Результаты секвенирования генома вирусов некоторых из перечисленш штаммов показали 100%-ную гомологию с геномом вируса штамма Ргохрс НШ-1, выделенным от пенсильванской полевки (Мктош реппзукатсиз) \ территории США. Учитывая данные других исследований, свидетель и вую щ о прямой корреляции степени гомологии геномов различных хантавирусо! расстоянием между ареалами их циркуляции, а также скорость и часто

мутаций генома хантавирусов, можно предположить, что факт выделения на территории Крыма вируса, практически идентичного вирусу, циркулирующему в другом полушарии, скорее всего сопряжен с лабораторной контаминацией. В данной работе было выявлено, что на территории Крыма циркулируют, по крайней мерс, три хантавирусных типа - Пуумала, Тула и, вероятно, Проспект Хилл (Рис. 1).

Рисунок 1. Филогенетическое дерево, сконструированное на основании фрагмента нуклеотидной последовательности М-сегмента хантавирусов. Показано взаимоотношения штамма МА-1009/Крым-96, отнесенного к типу Тула с другими хантавирусами.

антител или молекуяярно- биологических методов, в наших лабораториях еще не применялось, поэтому выделенный вирус был отнесен в группу Пуумала-Проспект Хилл. Позднее, эти штаммы были тестированы с применением моноклональных антител, в результате чего выяснилось, что исследуемые вирусы отличаются от всех прототипных хантавирусных штаммов. Заключительное слово по данному вопросу было сказано после

и

серии экспериментов, в результате которых были частично отсеквенированы М и Б сегменты генома хантавирусных штаммов МР-43 и МР-113, а также проведена реакция нейтрализации. Результаты этих исследований однозначно свидетельствуют о том, что на территории России циркулирует еще один хантавирусный тип, названный Хабаровск (КНАВ), по месту выделения (Рис. 2). Основным носителем данного вируса была признана

гА- MF-43

Я7ЧА

75% rMF-231

MF-113

• CG-1820 --— Sotkamo

-Prospect Hill —1-М. Canyon

- Hantaan -Seoul

Рисунок 2. Филогенетическое дерево, сконструированное на основании фрагмента нуклеотидной последовательности М-сегмента хантавирусов. Показано взаимоотношения штаммов, выделенных от МкгоШ /опк и отнесенных к типу Хабаровск, с другими хантавирусами.

большая полевка (М¡сгогих /огт-). Позднее (в 1994 г.) в том же регионе были выделены еще несколько штаммов, среда которых два (СШ'-416, СЯР-418) -от красно-серой полевки (<СлеЛпопогпуз ги/осапш). Секвенирование части генома вирусов выделенных штаммов показало, что они также принадлежат ж хантавирусному типу Хабаровск.

В результате проведенных исследований помимо хантавируса Хабаровск :акже впервые был выявлен новый хантавирусный тип, циркулирующий на территории России в популяции сибирских леммингов (Ьеттш МЫг1сш) на юлуострове Таймыр. Хотя генетические исследования этого вируса с юследующим филогенетическим анализом были проведены не в полном >бьеме, тем не менее, на основании полученных результатов можно говорить )б отдельном хантавирусном типе, названном нами "Таймыр" (Рис.3). В юльзу этого свидетельствует степень гомологии

■ CG-1820

21

75% 20

100К>

22

Khabarovsk

Sotkamo -Tula

-Prospect Hill

Hantaan Seoul

Taimyr

3исунок 3. Филогенетическое дерево, сконструированное на основании [>рагмента нуклеотидной последовательности М-сегмента хантавирусов. "Токазано взаимоотношения вируса, обнаруженного в популяции сибирских геммингов и отнесенного к типу Таймыр, с другими хантавирусами.

гуклеотидных последовательностей хантавирусов Таймыр и Хабаровск штамм МР-252) - 79%. Для сравнения - степень гомологии вирусов Хантаан и

Сеул , либо Проспект Хилл и Тула, принадлежащих различны хантавирусным типам составляет 78% на том же участке генома.

В настоящем исследовании было показано, что некоторь хангавирусы, до настоящего времени ассоциируемые с определенным видо грызунов-носителей, могут быть изолированы от грызунов тех видо. которые, как считается, более свойствены хантавирусам другого типа. Та; хантавирусные штаммы CRF- 110, CRF-355, CRF-367, выделенные с красно-серой полевки Clethrionomys rufocanus, оказались генетическ близкородственными хантавирусному типу Хантаан, а не Пуумала, как этог следовало бы ожидать согласно сложившемуся на сегодняшний день мнет» При этом, обращает на себя внимание тот факт, что эти штаммы был выделены в разные годы (CRF-110 - в 1990 г.; CRF-355 и CRF-367 - в 1993 г. что позволяет усомниться в случайности этого феномена. Кроме тог< сравнение нуклеотидных последовательностей вышеуказанных штаммов другими штаммами вируса Hantaan позволило выявить их близкс генетическое родство с двумя хаптавирусными штаммами, выделенными с больных ГЛПС в Китае (штаммы НЗ и Н5) (Рис. 4). Полученные нами даннь с учетом географической близости природно-очаговых территорий, где был изолированы штаммы (Хабаровский край и пограничная с ним провинщ Китая), свидетельствуют о возможной эпидемиологической значимое] выделенных от красно-серой полевки штаммов, а также о вероятно носительстве хантавирусных типов "несвойственными" им видами грызунов.

Следует отметить также, что помимо штаммов от красно- серс полевки, генетически близким к китайским штаммам НЗ и Н5 оказался штам АР-111, выделенный от восточно- азиатской лесной мыши A.peninsulae Хабаровском крае. Поскольку на Дальнем Востоке России ареал грызунов различных видов (включая роды Apodemus и Clethrionorny перекрываются, вплоть до совместного обитания в одних стациях, нель; исключить вероятность того, что виды рода Clethrionomys являются лни случайными носителями хантавирусов, "свойственных" для видов ро;

Аросктия, и представляют, в конечном итоге, "биологический тупик". Подтверждением этому является тот факт, что от красно-серых полевок были выделены также штаммы СкР-416 и СРН-4] 8, оказавшиеся генетически близкородственными хантавирусному типу Хабаровск, ассоциированному ранее с большой полевкой (М./оШх).

5исунок 4. Филогенетическое дерево, сконструированное на основании фрагмента нуклеотидпой последовательности М-сегмента хантавирусов. Токазаны взаимоотношения штаммов СЯР-110 (Дальний Восток России) и 43, Н5 (Китай), относящихся к типу Хантаан, с другими хантавирусами.

В результате проведенных исследований нами генетически щентифицировано 34 хангавирусных штамма, выделенных за период с 1983 ю 1996 гг. в различных географических регионах Российской Федерации и >еспублик бывшего СССР. Без учета штаммов, относящихся к хантавирусным ипам Тула и Хабаровск, большинство генетически исследованных штаммов

лишь незначительно отличались от штаммов ранее серологически идентифицированных хантавирусных типов. Так, практически все штаммы, относящиеся к типам Пуумала и Сеул , оказались идентичными штаммам СО-1820 и Н1180-39, соответственно. По всей вероятности это связано с тем, что все они были отсеквенированы лишь частично, на участках генома, которые являются относительно консервативными. Так, например, огсеквенированные на участке Б-сегмента длиной 718 нт. РНК из образцов крови людей и легочной ткани животных, собранные во время вспышки ГЛПС в Егорьевском районе (Московская обл.), довольно значительно отличались от таковой штамма СО - 1820 (различия на нуклеотидном уровне - 9,8%; на аминокислотном уровне - 4,3%). Результаты анализа последовательностей этих образцов хорошо совпадают с опубликованными ранее данными исследований, проведенных с другими штаммами хантавирусного типа Пуумала, свидетельствующие о том, что вирусы, различающиеся "микрогеографически", т.е. циркулирующие в различных, хотя и хотя и граничащих друг с другом популяциях грызунов, различаются между собой на 6-8% и 1-3% на нуклеотидном и аминокислотном уровнях (для Б-сегмента генома), соответственно.

В процессе работы нами был разработан принципиально новый метод, базирующийся на комбинированном использовании ПЦР и ИФА, с применением биотинилированных олигонуклеотидных проб-зондов. Схема метода представлена на Рисунке 5. Метод ПЦР-ИФА позволяет обследовать большое количество образцов биологических материалов для обнаружения и одновременной идентификации хантавирусов. Сравнение данного метода с классическим ИФА, основанном на детекции антигена, показало что ПЦР-ИФА намного превосходит его по чувствительности. Так, если первый метод позволяет определять антиген с чувствительностью до 10 БОЕ/мл, то ПЦР-ИФА имеет чувствительность 1,5 БОЕ/мл, т.е. на два порядка выше. Следует, однако, отметить, что подобное сравнение чувствительности обоих методов достаточно условно, поскольку ПЦР-ИФА основан на детекции

вирусной нуклеиновой кислоты (т.е. вирионов), тогда как классический ИФА регистрирует антиген, который может содержаться в образцах и при отсутствии в них вируса.

ABTS

колориметрический субстрат

Лнти-DIG пероксидазный конъю гат

•'^N ^ -^N ^S «я* '^N т» ^^

Стрептавидин - покрытая панель

Рисунок 5. Схема метода, основанного на комбинированном использовании полимеразноп цепной реакции и иммуно-ферментного анализа (ПЦР-ИФА).

Специфичность ПЦР-ИФА зависит в первую очередь от специфичности троб-зондов, используемых в эксперименте. В нашей работе все пробы были зыбраны эмпирическим путем, при этом длина олигонуклеотидов составляла эт 21 до 24 нт., что исключает вероятность неспецифической гибридизации; минимальное отличие соответствующих участков нуклеотидных юследовательностей различных '{антивирусов от последовательностей проб ¡оставляло не менее 4 оснований на весь олигонуклеотид. Оказалось, что

17

подобное отличие достаточно для, практически, 100%-ной специфичности методики. Так, например, штаммы HoJo и Lee, отличающиеся oí прототипного HTN 76-118 на участке, соответствующем пробе, на 3 основания, дают при тестировании положительный результат, хотя оптическая плотность исследуемого образца (после коныогации и добавления субстрат- индикаторной смеси) значительно ниже, чем таковая положительного контроля (штамм HTN 76-118).

ВЫВОДЫ

1. В процессе работы выявлены и генетически идентифицированы новые хантавирусы: Хабаровск, выделенный от большой полевки (Microtus fortis' н красно-серой полевки (Clethrionomys rufocanus) в Хабаровском крае i Таймыр, обнаруженный в образцах ткани сибирских леммингов (Lemmw sibiricus), отловленных на полуострове Таймыр.

2. С помощью молекулярно-биологических методов ПЦР i секвенирования обследованы 34 хантавирусных штамма, культивируемые i клетках Vero Е6, а также большое количество образцов полевых материалов собранных от мелких млекопитающих и больных ГЛПС людей. Изучен; ген еттежая-шруктура-хантавиру сов. различного происхождения._

3. Впервые на территории Крыма установлена циркуляция сред! обыкновенных полевок (Microtus arvalis) хантавирусного типа Тула, рана выявленного в животных, принадлежащих тому жевнду в Тульской области i в Словакии.

4. Для детекции и идентификации хантавирусов разработан новый мето? ПЦР-ИФА на основе полимеразной цепной реакции и иммуноферментноп анализа с использованием биотинилированных олигонуклеотидных проб зондов. Показано, что чувствительность метода ПЦР-ИФА в 600 ра превосходит таковую классических иммуносорбентных методов и обладав специфичностью близкой 100%.

5. Применительно к хантавирусам были оптимизированы молекулярно-иологические методы ПЦР и секвенирование генома, позволившие ущественно повысить эффективность выявления и идентификации антавирусов по сравнению с ранее применявшимися вирусологическими -и урологически ми методами.

6. Изучены эволюционные взаимосвязи между хантавирусными типами определены генотипы, циркулирующие на территории Российской

Федерации и Республик бывшего СССР. На сегодняшний день существует, по райней мере, 7 типов: Хантаан, Пуумала, Сеул, Хабаровск, Тула, Проспект 'илл, Таймыр.

Список опубликованных работ по теме диссертации

. Leschinskaya Е., Gavrilovskaya I., Dzagurova Т., Tkachenko Е., Dekonenko А. t al. (1991). Uniform evaluation of clinical severity of HFRS. Abstracts of ntemational Symposium on HFRS, Leningrad, USSR. p. 20.

. Tkachenko E., Drozdov S., Dzagurova Т., Ivanov A., Myasnikov Yu., Slonova I., Ivanov L., Malkin A., Dekonenko A. (1992). Epidemiological studies of HFRS ti Russia. 2nd Internationa! Conference on HFRS, Beijing, China, p.78.

I. J.Horling, A.Lundkvist, K.Persson, M.Mullaart, T.Dzagurova, A.Dekonenko, Tkachenko and B.Niklasson. (1995) Detection and subsequent sequencing of 'uumala virus from human specimens by PCR. Journal of Clinical Microbiology, Vol.33(2), pp 277 - 282.

i. T.Dzagurova, E.Tkachenko, R.SIonova, L.Ivanov, E.Ivanidze, S.Markeshin, ^..Dekonenko, B.Niklasson, A.Lundkvist. Antigenic relationships of 83 hantavirus trains analysed by monoclonal antibodies. Archives of Virology, Vol.140, pp 763-1773.

5. A.Dekonenko, T.Dzagurova, G.Lipskaya, R.Slonova, L.Ivanov, S.Markeshin I.Lukashevich and E.Tkachenko. (1995) Study of hantaviruses by polymerase chair reaction. 3rd International Conference on HFRS and Hantaviruses, Helsinki Finland.p 35.

6. T.Dzagurova, Yu.Myasnikov, A.Dekonenko and E.Tkachenko. (1995). Seoul type hantavirus isolated from HFRS patient in european Russia. 3rd Internationa Conference on HFRS and Hantaviruses, Helsinki, Finland.p 42.

7. J.Horling, V. Chizhikov, A.Lundkvist, M.Jonsson, L.Ivanov, A.Dekonenko B.Niklasson, T.Dzagurova, C.J.Peters, E.Tkachenko and S.Nichol. (1996 Khabarovsk, a phylogenetically and serologically distinct hantavirus isolated fron Microtus fortis trapped in Far East Russia. Journal of General Virology, Vol. 77, pj 687-694.

8. А.Деконенко, Е.Тжаченко, Г.Липская, Т.Дзагурова, А.Иванов, Л.Иванов Р.Слонова, С.Маркешин, Э.Иванидзе, Т.Шухкова, В.Якименко, В.Чижиков (1996) Генетическая дифференциация хантавирусов с помощью полимер азно! цепной реакции и секвенирования. Вопросы вирусологии I, стр. 24-27.

9. А.Иванов, А.Деконенко, Т.Шуткова, Т.Дзагурова, Е.Ткаченхо. (1996 Поликлональная иммуноферментная система для определения антигено] хантавирусов: оценка специфичности с помощью моноклональных антител i полимеразной цепной реакции. Вопросы вирусологии 3, стр. 110-117.

10. Дзагурова Т., Ткаченко Е., Слонова Р., Иванов Л., Иванидзе Э. Маркешин С., Деконенко А., Никлассон Б.; Лундквист О. (1996) Антигенна: дифференциация хантавирусов с помощью моноклональных антител Медицинская паразитология и паразитарные болезни 3, стр. 47-52.