Гемостаз и эстеразная активность крови крыс при интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами

Войтенко, Наталья Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гемостаз и эстеразная активность крови крыс при интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Гемостаз и эстеразная активность крови крыс при интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами"

На правах рукописи

ВОЙТЕНКО Наталья Геннадьевна

ГЕМОСТАЗ И ЭСТЕРАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ КРОВИ КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ФОСфОРОРГАНИЧЕСКИМИ ОТРАВЛЯЮЩИМИ ВЕЩЕСТВАМИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино, 2010 г.

004603495

Работа выполнена в лаборатории молекулярной токсикологии ФГУП НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека Федерального медико-биологического агентства

Научный руководитель: доктор биологических наук

Гончаров Николай Васильевич

НИИ гигиены, профпатологии и экологии человека ФМБА России, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Маевский Евгений Ильич

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино

доктор биологических наук, профессор Авдонин Павел Владимирович Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, Москва

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург

Защита состоится 27 мая 2010 г. в 16 ч. 00 мил. на заседании Диссертационного совета Д 002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, Московская обл., г.Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН

Автореферат разослан 27 апреля 2010 г.

И.о. Ученого секретаря Диссертационного совета

доктор биологических наук, ГУ, Е.Г. Новоселова

профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболевания, этиологически связанные с воздействием химических факторов, приобрели широкое распространение вследствие интенсивного развития химической промышленности. Фосфорорганические соединения (ФОС) - особая составляющая этих факторов, они широко используются в сельском хозяйстве и промышленности в качестве пестицидов, пластификаторов, компонентов в синтезе лекарственных веществ, полимерных материалов. Примерно 80 различных ФОС используются в качестве инсектицидов, другие ФОС нашли свое применение в фармакологии [Pope et al., 2005], а также в военной токсикологии [Lotti, 2000, 2001] - это так называемые фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ).

В соответствии с Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации», одной из задач является обеспечение безопасности этого процесса для персонала объектов по хранению и уничтожению химического оружия, а также граждан, проживающих и работающих в зоне защитных мероприятий. В случае острого отравления антидоты позволяют сохранить жизнь людей, но при этом существует вероятность развития последствий отравления. Имеющиеся средства лабораторной и клинической диагностики рассчитаны главным образом на оценку степени токсического поражения в ранние сроки интоксикации, тогда как оценка риска развития заболеваний на более поздних сроках остается актуальной задачей. Неясен патогенез развития отдаленных последствий, отсутствует единая система физиолого-биохимических, цитологических и иммунологических маркеров для своевременной диагностики.

Наблюдения за пострадавшими в результате острого и хронического воздействия ФОВ выявили среди основных отставленных симптомов вегетативные изменения сердечнососудистой системы и «микроорганические расстройства» ЦНС неясной этиологии [Мусийчук, Янно, 1988]. Были основания предполагать, что сосудистая патология играет значимую роль в формировании отставленных последствий острого отравления [De Groot et al., 1993]. Результаты экспериментальных исследований при субхроническом действии различных ФОС свидетельствовали о ведущей роли несинаптических механизмов в возникновении оставленных функциональных эффектов [Гончаров и др., 2001, 2002; Goncharov et al., 2003, 2004; Mindukshev et al., 2005]. Эти эффекты проявлялись при восстановлении активности и даже при отсутствии ингибирования холинэстераз, были связаны с нарушением эндотелий-зависимой релаксации сосудов, нарушением нервно-мышечной проводимости, изменением кинетических параметров агрегации тромбоцитов.

Эксперименты показали, что тромбоцитарное звено гемостаза может служить индикатором состояния сосудистого русла при интоксикации ФОС. Другой группой исследователей были получены морфологические доказательства поражения эндотелия на разных сроках после острого отравления [Прозоровский, Чепур, 2001; Чепур и др., 2006].

Однако проблема разработки и обоснования комплекса физиолого-биохимических методов диагностики далека от решения. Биомаркеры интоксикации ФОС (ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза) специфичны лишь в ранние сроки интоксикации. Более или менее полный анализ клеточного и плазменного гемостаза на дальних сроках после острого отравления не проводился, а имеющиеся данные о состоянии плазменного гемостаза на ранних сроках весьма скупы и недостаточны для оценки роли гемостаза в развитии патологии. Исследования многих биохимиков, работающих в области токсикологии, сосредоточены главным образом на поиске продуктов деструкции ФОС или их аддуктов с белками, сохраняющихся в организме в течение более или менее длительного периода, с целью доказательства факта интоксикации [\Vorek е1 а1., 2005; ЯасШоу с! а1., 2009]. Гораздо меньше внимания уделяется биохимическим и функциональным методам диагностики, которые могли бы пролить свет на механизмы патогенеза, дать ответ на вопрос о тяжести поражения и критических сроках в развитии интоксикации.

Цель II задачи. Цель настоящей работы - исследовать состояние системы гемостаза, активность основных эстераз крови и ряд биохимических показателей на разных сроках после острого отравления фосфорорганическими отравляющими веществами (ФОБ) на примере зомана и вещества типа УХ (Г<УХ), определить критические сроки в развитии интоксикации и диагностическую значимость применяемых методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Исследовать активность эстераз и другие биохимические показатели крови крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и К УХ.

2) Определить кинетические параметры агрегации тромбоцитов в динамике при острой интоксикации крыс зоманом и К УХ.

3) Исследовать гемолитическую устойчивость эритроцитов при острой интоксикации крыс зоманом и ЯУХ.

4) Исследовать состояние плазменного гемостаза крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и ЯУХ.

5) Определить критические сроки в развитии последствий острой интоксикации с точки зрения состояния системы гемостаза.

Научная новизна. С использованием высокотоксичных ФОВ - зомана и RVX -впервые проведено комплексное изучение гуморального и клеточного звеньев гемостаза в динамике в ходе продолжительного эксперимента. Проведен анализ биохимической активности холинэстераз эритроцитов и плазмы с точки зрения надежности этих показателей для оценки степени и тяжести поражения на разных сроках интоксикации. Методология малоуглового светорассеяния впервые использована для комплексного исследования кинетических параметров агрегации тромбоцитов и гемолитической устойчивости эритроцитов, что позволило по-новому охарактеризовать степень интоксикации ФОВ, понять особенности патогенеза и характер токсикодинамики, выявить критические периоды патогенеза. Впервые в токсикологических исследованиях показана динамика активности металлопротеиназы ADAMTS13 при интоксикации ФОВ, наряду с активностью ее субстрата - протромбогенного фактора Виллебранда. С целью поиска новых маркеров интоксикации впервые проведен анализ низкомолекулярных пептидов плазмы, в результате чего был выявлен ряд пептидов - продуктов ограниченного протеолиза фибринопептида А, образующихся в результате активности экзопептидаз. Полученные данные проанализированы с точки зрения состояния системы гемостаза и сосудистого русла, что позволило получить дополнительные доказательства важной роли эндотелия сосудов в развитии последствий интоксикации.

Практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют представления о механизмах токсикодинамики при острой интоксикации ФОВ, позволяют лучше понять взаимосвязь специфических и неспецифических проявлений интоксикации. Данные, полученные в настоящей работе, помогут в определении новых критериев диагностики отравлений ФОВ, в понимании механизмов патогенеза отдаленных последствий интоксикации, формулировке новых принципов терапии на разных сроках интоксикации ФОВ. Исследованные вещества фосфорорганической природы обладают различными токсикокинетическими характеристиками, а потому имеют различный спектр молекулярных и клеточных мишеней. Это имеет большое значение для «гражданских» областей человеческой деятельности, поскольку аналогичные проблемы, связанные с диагностикой и терапией отравлений ФОС, существуют в сельском хозяйстве и промышленности. Использование методологии малоуглового светорассеяния вносит вклад в развитие физиолого-биохимических исследований. Данные об активности металлопротеиназы ADAMTS13, полученные в экспериментах in vivo и in vitro, важны для понимания механизмов токсикокинетики и токсикодинамики, для разработки новых рецептур фармакологической коррекции.

Публикации и апробация работы. Основные материалы опубликованы в 15 печатных работах, из них 7 статей в реферируемых журналах, 3 статьи в сборниках, 4 тезисов докладов. Результаты исследований представлены на международном семинаре «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями» (Санкт-Петербург, 2007), 3-м съезде токсикологов России (Москва, 2008), международной конференции «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (Пущино, 2009), Токсикологическом Обществе США (Солт-Лейк-Сити, 2010), Питтсбургской конференции (Орландо, 2010).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 72 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 8 экспериментальных разделов, обсуждения, заключения и выводов. Библиография включает 39 отечественных и 255 зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Лабораторные животные и общие токсикологические методы. Для экспериментальных исследований использовали самцов белых беспородных крыс. Содержание экспериментальных животных соответствовало «Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев)», утвержденных МЗ СССР 06.07.73 г. и Приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77г. Токсичность оценивали методом пробит-анализа [Беленький, 1959; Finney, 1980]. Показатель ЛД50 при подкожном введении крысам зомана составил 90 мкг/кг, при введении RVX - 18 мкг/кг. Острое отравление моделировали двукратным подкожным введением зомана и RVX в дозе 0,4ЛД5о с интервалом в 1 час. Эксперименты проводили через 3 часа после первого введения токсиканта, 1 сутки, 1,2,4 и 6 недель.

Методы определения активности эстераз. Активность ацетилхолинэстеразьг (АХЭ) в цельной крови проводили по методу Эллмана [Ellman et al., 1961]. Определение активности бутирилхолинэстеразы (БХЭ) производилось с помощью планшетного варианта метода Эллмана. Определение активности карбоксилэстеразы было произведено планшетным методом, основанном на расщеплении р-нитрофенилацетата (НФА) с образованием окрашенного продукта - п-нитрофенола. Эстеразную активность альбумина по отношению к ацетилтиохолину (АТХ) и бутирилтиохолину (БТХ) определяли также планшетным вариантом метода Эллмана на спектрофотометрическом планшетном ридере Thermo Multiscan Ascent на длине волны 405 нм. Активность альбумина относительно фенилвалерата

-6-

(ФВ) определяли по методу Джонсона (492 нм) [Johnson, 1977]. Активность альбумина относительно НФА определяли спектрофотометрически (405 нм) по накоплению п-нитрофенола, образующегося в результате гидролиза НФА.

Методы клинической биохимии. Определение биохимических показателей сыворотки крови проводили на автоматическом биохимическом анализаторе Lisa 300 Plus с использованием готовых наборов реагентов производства Elitech и Biocon.

Метод оценки функциональной активности тромбоцитов. Функциональную активность тромбоцитов исследовали методом малоуглового светорассеяния, позволяющим оценить все стадии трансформации тромбоцитов [Деркачев и др., 1998; Mindukshev et al., 2005а, 2005b]. Регистрацию проводили на приборе «ЛаСка-2К» (НПФ «Люмекс», Санкт-Петербург).

Метод оиенкн состояния эритроцитов. Исследования проводили с помощью метода малоуглового светорассеяния [Mindukshev et al., 2007] на приборе «ЛаСка-2К». Забор крови у крыс осуществляли из сонной артерии. Эксперименты проводили при 20ПС. При помещении 30-50 мкл рабочей суспензии эритроцитов в изотоническую среду, в которой ионы натрия заменены ионами аммония, наблюдается набухание клеток с последующим полным гемолизом клеток. Оценка эритроцитарной устойчивости, полученные при осмотической нагрузке, лучше коррелируют с данными по гемолизу в NILiCl-cpefle, чем при кислотном гемолизе. Эритрограмма позволяет количественно характеризовать гемолиз по времени достижения максимальной скорости гемолиза (Tgern) и по максимальной скорости гемолиза (Vgem). Кроме того, рассчитывали процент гемолиза (%gem).

Исследование гуморального гемостаза. Для исследования гуморального гемостаза забор крови (2 мл) осуществляли из сонной артерии крыс, предварительно наркотизированных уретаном в дозе 1 г/кг. В качестве антикоагулянта использовали 3,2% раствор цитрата натрия (pH 6,0) в соотношении 9:1. Для оценки плазменного звена гемостаза использовали основные скрининговые тесты: АЧТВ (активированное частичное тромбопластиновое время), ПВ (протромбиновое время), ТВ (тромбиновое время) и концентрацию фибриногена в плазме крови. Для постановки тестов использовали наборы реактивов «Dade Behring» (Германия). Исследования проводили на коагулометре «TS 1000» (США).

Определение активности аптнтромбипа (AT III) в плазме крови. Исследование активности AT III проводили на полуавтоматическом коагулометре ACL2000. Использовали стандартный набор реактивов фирмы Instrumentation Laboratory согласно инструкции,

прилагаемой к прибору. Для построения калибровочной кривой использовали пул бедной тромбоцитами плазмы интактных животных (п=15).

Определение ристоцетин-кофакторной активности фактора Виллебранда (VWF:RCo).

Определение VWF:RCo в плазме крыс проводили с помощью агрегометра Solar, АР2110 (Минск, Беларусь). В реакции использовали реактив «Тромбоциты человека», («Технология-Стандарт», Россия), трис-солевой буфер (0,01M Tris, 0.15М NaCl, рН 7.4), ристомицин в конечной концентрации 1,35 мг/мл, образцы обедненной тромбоцитами плазмы крыс. В качестве калибровочного образца служил пул (и-15) обедненной тромбоцитами плазмы интактных крыс, из которого готовили последовательные разведения на трис-солевом буфере. По значениям оптической плотности, полученным для каждого разведения, строили калибровочную кривую, с помощью которой определяли VWF:RCo в исследуемых образцах. Результаты выражали в процентах от активности фактора Виллебранда в пуле.

Определение активности ADAMTS13 проводили на планшетном флуориметре FLx800 производства BioTek instruments (США) с использованием флуоресцентного субстрата FRETS-VWF73. Образцы плазмы и субстрат растворяли в буфере, следуя рекомендациям производителя. Измерение проводили при 30°С в режиме 340/450 нм. Полученные результаты выражали в процентах от активности ADAMTS13 в пуле плазм интактных животных (п=15). Для определения активности ADAMTS13 в кондиционных средах испльзовали тот же субстрат и модифицированный состав буфера. Активность фермента прямо пропорциональна наклону кривой.

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток. Эндотелиальные клетки выделяли из пупочной вены человека в соответствии с разработанным протоколом. Среда роста 199 с солями Эрла включала фетальную бычью сыворотку, гентамицин, гепарин, эндотелиальную ростовую добавку (Sigma). В экспериментах использовали клетки 1-2 пассажа.

Матрично-активированная лазерная десорбции/ионизации - MALD1 (Matrix-assisted laser Desorbtion/Ionization). Исследования проводили при техническом и научном содействии к.х.н. Подольской Е.П., ст.науч.сотр. Института аналитического приборостроения РАН. Масс-спектрометрический анализ пептидов проводили на времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Germany) с источником MALDI, оснащенном УФ-лазером (337 нм) в режиме детектирования положительных ионов с использованием рефлектрона. Ионы детектировали в диапазоне m/z от 700 до 2000. Обработку спектров проводили в программе FTDocViewer (Varian, США).

-8-

Поиск в базе SwisProt осуществляли с помощью программного комплекса MASCOT (Matrix Science, Великобритания), при этом использовали следующие параметры поиска: точность определения массы родительского иона - 50 рргп, точность определения масс фрагментных ионов - 1200 рргп, возможные модификации - окисление метионина. Точная моноизотопная масса и форма изотопного распределения для пептидов с нестандартными модификациями рассчитывались при помощи программы MassPro (ИАнП РАН). Дополнительная обработка масс-спектрометрических данных проводилась при помощи программы Sequence Viewer (ИАП РАН).

Статистическая обработка результатов проводилась при помощи электронных таблиц EXCEL 2000 for Windows (Microsoft, USA) и программы «GraphPad Prism 5». Результаты представлены как М (среднее значение) и SD (стандартное отклонение), Ме (5; 95 персентиль) или Ме (Ql; Q3). Перед началом анализа вариационные ряды проверяли на нормальность распределения. При нормальном распределении рассчитывался t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони, однако преимущественно распределение признака было асимметричным, поэтому применялись непараметрические методы статистики: вычисление критерия Крускала-Уоллиса и критерия Данна для множественных сравнений, а также критерий Манна-Уитни для сравнения двух выборок. Для всех видов анализа статистически значимыми считали значения р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Динамика относительного изменения массы животных. В течение первой недели после острого отравления зоманом наблюдали незначительное снижение относительного прироста массы тела. Однако в дальнейшем животные опытной группы не только компенсировали отставание в приросте массы, но и несколько превысили его относительно контроля. Показатели привеса за весь период эксперимента составили 92% и 107% для контрольной и опытной групп, соответственно. После острого отравления RVX, в течение первых двух недель эксперимента наблюдали относительное снижение привеса в опытной группе, и эта тенденция сохранялась до конца наблюдения. Показатели итогового привеса составили 132% и 114% для контрольной и опытной групп, соответственно. Выявленные различия были статистически значимы (р<0,01).

Биохимические показатели в динамике после острого отравления крыс зоманом и RVX. Через 3 и 24 часа после острого отравления зоманом снижена концентрация триглицсридов в сыворотке крови, что отражает снижение потребления животными корма в течение первых суток. На дальних точках уровень триглицеридов приближается к

контрольным значениям. Через 1 сутки после отравления в сыворотке крови повышается концентрация общего холестерина. Уровень альбумина не подвергается выраженным изменениям, однако его доля в составе общего белка несколько увеличивается через 3 часа после отравления. В течение первых суток наблюдается снижение концентрации креатинина. Постепенное повышение этого показателя достигает статистической значимости через 4 и 6 недель после отравления. Изменения концентрации мочевины в сыворотке крови носят фазовый характер - повышение через 3 часа и снижение среднего значения через 1 сутки. К шестой неделе наблюдается устойчивое повышение этого показателя. Также в течение первых суток повышается активность аминотрансфераз в сыворотке крови. Максимальные значения активности AJ1T наблюдаются через 3 часа и сутки, при этом у отдельных особей активность фермента увеличивается по сравнению с контролем в 2 раза. Активность ACT достигает максимальных значений через 1 сутки. Так как оба эти фермента присутствуют и в печени и в сердце, в клинической практике используют коэффициент де Ритиса, который представляет собой отношение активностей ACT и AJ1T. При повышении этого коэффициента принято говорить об инфаркте миокарда или ином процессе, связанным с разрушением кардиомиоцитов; уменьшение коэффициента в большей степени характерно для заболеваний печени. В наших экспериментах не удалось выявить статистически значимых изменений коэффициента де Ритиса, хотя после отравления зоманом через 3 часа и 1 неделю можно отметить незначительную тенденцию к снижению этого показателя, а через сутки повышение среднего значения коэффициента де Ритиса на 25% относительно контроля и на 40% относительно 3-часовой точки. Имеются убедительные свидетельства того, что значительное повышение уровня ACT при нормальном уровне AJIT (т.е. повышение коэффициента де Ритиса) связано не с поражением сердечной мышцы, а с поражением гемоксигеназы-1 гепатоцитов, гемолитической анемией, поражением почек и эндотелия сосудов [Yachie et al., 1999]. Повышение активности гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ, КФ 2.3.2.2) наблюдается на всех сроках после острого отравления зоманом, но наиболее выраженный характер эти изменения носят в первые сутки: уже через 3 часа активность ГГТ повышается на 25-30% (а у отдельных животных активность фермента повышается вдвое). В более поздние сроки активность фермента несколько снижается, претерпевая фазовые изменения, но остается при этом выше уровня контроля.

После острого отравления RVX уровень общего холестерина не претерпевает значительных изменений. Через 1 сутки наблюдается снижение концентрации триглицеридов в сыворотке крови. На сроках 1 сутки и 6 недель можно отметить незначительное снижение доли альбумина в составе общего белка. Через 3 часа после отравления RVX наблюдается снижение концентрации креатинина в сыворотке крови на

- 10-

30%, затем происходит восстановление показателя до уровня контроля и повышение в среднем на 20% через 4 недели после отравления. Отметим, что различия между этими точками статистически значимы. Наиболее заметный подъем концентрации мочевины в сыворотке крови наблюдается через 2 и 4 недели. В течение первых суток наблюдается умеренный подъем активности ЛЛТ и значительное повышение активности ACT. При оценке коэффициента де Ритиса можно отметить заметное его повышение через 1 сутки. После острого отравления RVX наблюдается повышение ГГТ, а на сроке 4 недели этот показатель статистически значимо повышается в среднем на 30%. Известно, что ГГТ экспресируется не только гепатоцитами, но и эндотелиальными клетками, играя важнейшую роль, особенно в мозге, в переносе аминокислот из кровеносного русла [Осадчая, 1999; Orlowski et al., 1974; Spater et al., 1982]. Повышение уровня ГГТ ассоциируется с патологией сердечно-сосудистой системы, риском геморрагического и ишемического инсульта [Ruttmann et al., 2005].

При интоксикации зоманом наблюдается незначительное повышение уровня мочевины на 15-25% через 3 часа, которое возвращается к норме через сутки (хотя у отдельных животных концентрация мочевины остается повышенной в 2,5 раза), затем более значительное повышение на 30-40% через 6 недель, что может быть связано с повышением интенсивности белкового обмена и развитием патологии почек. При интоксикации RVX уровень мочевины повышается сначала на 15-25% через 2 недели и на 40-60% через 4 недели. Однако это не связано с повышением веса животных. При интоксикации крыс RVX отмечено снижение уровня креатинина в сыворотке крови на 30% через 3 часа, затем происходит восстановление показателя до уровня контроля и повышение в среднем на 20% через 4 недели после отравления. При интоксикации зоманом повышение уровня креатинина на 20-30% наблюдается лишь через 4 и 6 недель после отравления. Повышенный уровень мочевины и креатинина в крови крыс через 6 недель после острого отравления зоманом, а также через 4 недели после отравления RVX может свидетельствовать об интенсификации белкового обмена и развитии почечной недостаточности на этих сроках.

Исследование эстеразной активности крови. Результаты измерения активности АХЭ после отравления зоманом представлены на рисунке 1. Обнаружено статистически значимое (р<0,05) снижение активности АХЭ на ранних сроках после отравления зоманом -через 3 часа активность составляла менее 10% от контроля, через сутки 22%, а через одну неделю активность АХЭ восстанавливалась лишь на 56%. В более поздние сроки активность АХЭ цельной крови остается несколько ниже контрольных значений, но статистической значимости эти изменения не имеют. Изменение активности АХЭ в цельной крови после острого отравления RVX представлено на рисунке 2. Статистически значимое снижение

- 11 -

активности фермента обнаружено через 3 часа (в среднем до 22%) и 1 сутки (до 54%) после отравления (р<0,05). Через 1 неделю активность АХЭ достигает контрольного уровня, а к двухнедельному сроку незначительно превышает его - на 14%. Далее активность фермента вновь возвращается к контрольным значениям, с некоторой тенденцией к снижению на 6 неделе эксперимента. Минимальное значение активности в этой группе 68%. Некоторое повышение активности АХЭ через 2 недели по сравнению с контролем может быть связано с обновлением популяции эритроцитов: известно, что активность АХЭ эритроцитов «молодого и среднего возраста» значительно выше, чем у «старых» эритроцитов [Prall et al., 1998]. Об этом также свидетельствует некоторое снижение количества эритроцитов через 2 недели, а также снижение процента гемолиза через 4 недели. При сравнении характера действия зомана и RVX на активность АХЭ в цельной крови обнаружено значительно более выраженное и продолжительное угнетение активности фермента после отравления зоманом. Очевидно, это связано с различным характером взаимодействия ФОВ с ферментом. Комплекс фермента с зоманом быстро подвергается «старению», поэтому восстановление активности АХЭ идет за счет вновь синтезированных молекул. С другой стороны, ингибированный RVX фермент подвергается в организме реактивации, что способствует более быстрому восстановлению активности АХЭ цельной крови.

Рисунок 1 - Динамика активности АХЭ в Рисунок 2 - Динамика активности АХЭ в цельной крови после отравления зоманом. цельной крови после отравления ЯУХ.

Здесь и на рис.3,4: По оси ординат - % активности фермента от среднего значения в контрольной группе. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль). * - р<0,05

Активность бутирилхолинэстеразы (БХЭ). Результаты измерения активности БХЭ представлены на рисунках 3 и 4. Обнаружено достоверное снижение активности БХЭ на ранних сроках после отравления зоманом - через 3 часа, сутки и 1 неделю (р<0,05). При отравлении ЛУХ изменения имеют характер тенденции и недостоверны. Значительный

разброс в значениях активности БХЭ может быть связан с тем, что существуют различные генетические формы БХЭ, фенотипически проявляющие разную активность. Однако решающее значение имеет, очевидно, чрезвычайно медленное «старение» фермента при связывании с веществом типа УХ [\Vorek е1 а!., 2005].

200

! 0>150

; X : ш

I 5 100

: О : X О

Рисунок 3 - Динамика активности БХЭ в Рисунок 4 - Динамика активности БХЭ в цельной крови после отравления зоманом. цельной крови после отравления RVX.

Активность карбоксилэстеразы (КЭ) и альбумина. Наличие КЭ в сыворотке крови мышей, крыс, других животных и отсутствие ее у человека показано ранее [Li et al., 2005]. Достоверных отличий в уровнях активности КЭ не обнаружено как при отравлении зоманом, так и при отравлении RVX. Оценка истинной активности КЭ в сыворотке крови затруднена отсутствием строгой субстратной специфичности этого фермента. Известно, что альбумин обладает неспецифической эстеразной активностью в отношении субстратов - производных п-нитрофенила, которые обычно используются для определения активности карбоксилэстеразы [Tildón, Ogilvie, 1972; Means, Bender, 1975; Sakurai et a!., 2004]. Для понимания возможного вклада альбумина в эстеразную активность сыворотки крови, а значит и его роли в возможном искажении данных, получении ложноотрицательных результатов при определении активности холинэстераз, нейротоксиэстеразы (НТЭ) и карбоксилэстеразы мы провели модельный эксперимент, в котором оценивали активность человеческого альбумина относительно субстратов, которые обычно используются для определения активности эстераз крови: нитрофенилацетат (НФА) - для определения активности КЭ, фенилвалерат (ФВ) - для определения активности НТЭ, ацетилтиохолин (АТХ) и бутирилтиохолин (БТХ) - для определения активности АХЭ и БХЭ, соответственно. Полученные значения активностей сравнивали с активностью сыворотки крови крыс относительно этих субстратов. Наибольшая эстеразная активность альбумина, а также условный вклад в ферментативную активность сыворотки наблюдается относительно

- 13 -

гидролиза НФА и ФВ при сравнении с человеческой сывороткой, и относительно НФА, ФВ и БТХ при сравнении с крысиной сывороткой. Более надежные данные с точки зрения статистики получены с бычим сывороточным альбумином (БСА). Их объединяет с вышеприведенными данными по альбумину человека то, что активность и условный вклад БСА максимален по отношению к НФА и БТХ, при сравнении с крысиной сывороткой. Активность относительно ФВ и АТХ невелика, но в условиях острого отравления, когда ферментативная активность эстераз крови подавляется, этот вклад может оказаться существенным, обусловливая искажение результатов измерения их активности, получение ложноотрицательного ответа. В особенности это утверждение справедливо при оценке активности БХЭ. Для более точной оценки вклада альбумина в активность сыворотки крови крыс требуются дальнейшие эксперименты с использованием крысиного альбумина.

Изменение параметров агрегации тромбоцитов. Через 3 часа после острого отравления зоманом наблюдается тенденция к снижению показателя ЕС50, однако на следующие сутки ЕС50 достоверно повышается относительно контроля более чем в 2 раза, что свидетельствует о снижении чувствительности тромбоцитов к действию АДФ. Далее изменения показателя носят обратный характер. Так, вернувшись через неделю к контрольному уровню, уже через 2 недели после отравления зоманом значения ECjo достоверно меньше контрольного значения. Через 4 недели значение показателя возвращаются к контрольному уровню, а через 6 недель вновь видна слабовыраженная тенденция к повышению чувствительности тромбоцитов (рис.5). Через 3 часа после воздействия зомана у крыс наблюдается достоверное повышение Umax. Через сутки отличие от контроля еще более выражено. В дальнейшем наблюдается снижение данного показателя и возвращение его к контрольному значению к 2-недельному сроку (рис.6).

В первые часы и сутки после воздействия RVX наблюдается повышение показателя ЕС50 относительно контроля. К недельному сроку значение ЕС50 несколько снижается, хотя в среднем остается выше контрольного уровня. Через 4 недели после интоксикации ЕС50 снова достоверно выше контрольного значения на 45%. К 6-недельному сроку значение показателя возвращается к уровню контроля (рис.7). Через 3 часа после острого отравления RVX у крыс наблюдается тенденция к повышению Umax. Через сутки отличие от контроля еще более выражено и достоверно. Через неделю после отравления RVX максимальная скорость агрегации резко снижается и, в среднем, меньше контрольного значения. Ещё через неделю Umax возвращается к контрольному уровню, но через 4 недели от начала эксперимента значение показателя вновь достоверно выше контрольного. К 6 неделям наблюдается тенденция к снижению Umax, хотя в среднем значение показателя остается несколько выше контрольного. Эти изменения агрегационной активности тромбоцитов нельзя объяснить

- 14-

прямым действием ФОБ, поскольку срок жизни тромбоцитов не превышает 10 суток, а значит, наблюдаемые к концу эксперимента изменения присущи неоднократно обновленной популяции клеток.

Kunrpu.ib 3 часа ¿4 часа I ш- il.hi 2 uew.iu 4 ut ri..ia 6 tii.uvii.

Рисунок 5 - ЕС5о после острого отравления зоманом. По оси Y - концентрация АДФ (нМ)

3» .

Рисунок 6 - Umax после острого отравления зоманом. По оси Y - усл.ед.

Рисунок 7 - ЕС50 после острого отравления Рисунок 8 - Umax после острого RVX. По оси Y - концентрация АДФ (нМ) отравления RVX. По оси Y - усл.ед.

Для более наглядного представления данных мы ввели понятие «агрегационный потенциал тромбоцитов» (АПТ), который можно выразить как отношение Umax к ЕС5о. Зоман оказывает более сильное влияние на АПТ, чем RVX в эквипотенциальной дозе. Отличительной особенностью является наличие ярко выраженного фазового характера изменений АПТ при воздействии зомана. У RVX фазовый характер изменений АПТ слабо выражен, наблюдается только одна «волна», которая выходит к 4-недельному сроку на уровень контроля. Данные экспериментов позволяют сделать вывод, что хотя и зоман и RVX оказывают влияние на параметры агрегации тромбоцитов, это влияние не имеет универсальный и однозначный характер. Следовательно, невозможно оценить роль изменений функционального состояния тромбоцитов на развитие отдаленных последствий острой интоксикации вне связи с другими физиолого-биохимическими показателями.

Исследование функционального статуса эритроцитов. Максимальная скорость гемолиза не претерпевает в течение эксперимента существенных изменений - лишь на сроках 1 и 2 недели наблюдается некоторая тенденция к ее увеличению. Время достижения

- 15-

максимальной скорости гемолиза увеличивается через 3 часа после воздействия зомана. Однако уже через 1 сутки начинается уменьшение Т gem, которое достигает минимальных значений на сроке 2 недели (р<0,05). Возможно, такие изменения связаны с гибелью части популяции клеток по некротическому пути. Возвращение Tgem к нормальным значениям на 4 неделе свидетельствует о значительном обновлении пула эритроцитов. Подтверждением этого предположения может служить статистически значимое снижение %gem (р<0,05) -молодые эритроциты обладают большей устойчивостью. После отравления RVX максимальная скорость гемолиза и время ее достижения подвергаются лишь незначительным колебаниям на протяжении всего эксперимента. На сроке 4 недели полнота гемолиза значимо (р<0,05) отличается от контроля и составляет 94%. Вероятно, это связано с возрастанием в популяции молодых эритроцитов, которые менее чувствительны к аммонийной нагрузке.

Изменение показателей гуморального гемостаза. Наиболее значительные отклонения от контрольных показателей наблюдали в течение первых суток после отравления зоманом (табл.1). Через 3 часа после воздействия значительно увеличивается протромбиновое отношение, что свидетельствует об удлинении протромбинового времени (ПВ). Прямое ингибирование факторов внешнего пути свертывания, например, проконвертина, являющегося сериновой протеазой, маловероятно, так как в крови этот фермент находится в неактивной форме. Изменения в системе «внутреннего пути» свертывания крови имеют фазовый характер. Удлинение АЧТВ в 1,5 раза у отдельных животных наблюдается через сутки, 4 и 6 недель. Через 1 неделю эти изменения наиболее выражены - скорость свертывания по «внутреннему пути» может замедляться в 2,5 раза (р<0,05). Удлинение АЧТВ может быть обусловлено дефицитом XII, XI, IX или VIII факторов или их функциональной неполноценностью. Через 1 сутки наблюдали увеличение концентрации фибриногена в 2,5 раза и укорочение тромбинового времени (ТВ). Начиная с недельной точки концентрация фибриногена возвращается к исходному уровню и до конца эксперимента не претерпевает значительных изменений.

Интоксикация RVX сопровождается выраженными изменениями протромбинового времени (табл.2). Через 3 часа и 1 неделю наблюдается увеличение протромбинового отношения в среднем на 20%, что свидетельствует о нарушении свертывания крови по «внутреннему пути». Через 2 недели ПВ уменьшается в среднем на 10% по отношению к контролю и эти изменения статистически значимы, еще более выражено это снижение по сравнению со сроками 3 часа и 1 неделя. Укорочение ПВ через 2 недели после отравления совпадает с резким падением активности антитромбина (AT). Средние значения скорости свертывания крови по «внутерннему пути» не претерпевают выраженных изменений на всем

- 16-

протяжении эксперимента, однако у отдельных животных отмечено значительное увеличение (в 1,3-1,5 раз) этого показателя через 3 часа и сутки. Эффект может быть обусловлен действием металлопротсиназы Л1)ЛМТ813, расщепляющей фактор Виллебранда (УУ/Р) - носитель РУШ. Количество фибриногена в плазме крови увеличивается в 1,7 раза через сутки. Вслед за подъемом следует уменьшение показателя ниже контрольного уровня. В более поздние сроки уровень фибриногена не меняется по отношению к контролю. Выраженное укорочение ТВ отмечено через 1 сутки и 2 недели после отравления, в остальные сроки показатель не отличается от контроля.

Таблица 1 - Показатели гуморального гемостаза крыс-самцов после 2-кратного введения зомана в дозе 0,4ЛД5о. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль).

Контроль 3 часа 24 часа 1 неделя 2 недели 4 недели 6 недель

АЧТВ 0,99 0,99 1,24 1,24* 0,97 1,08 1,33

(0,86; (0,84; (0,93; (0,92; (0,79; (0,88; (0,89;

1,19) 1,27) 1,48) 2,47) 1,05) 1,58) 1,59)

ПВ 1,07 1,28 * 1,03 1,00 1,10 1,10 0,98

(0,95; (1,10; (0,97; (0,94; (0,96; (0,91; (0,85;

1,19) 1,31) 1,08) 1,12) 1,11) 1,25) 1,06)

ТВ, с 38,6 39,8 31,2 37,5 40,9 40,7 34,1

(32,6; (31,3; (29,0; (31,3; (21,3; (32,2; (27,4;

45,1) 45,1) 36,0) 42,1) 47,5) 45,5) 38,1)

Фибрино- 0,87 1,04 2,23** 0,94 0,91 0,92 0,90

ген, г/л (0,75; (0,86; (2,05; (0,86; (0,83; (0,73; (0,81;

1,12) 1,12) 2,49) 1,95) 0,99) 1,14) 0,94)

* - р<0,05; **- р<0,01; АЧТВ и ПВ - в относительных единицах к пулу здоровых животных.

Таблица 2 - Показатели гуморального гемостаза крыс-самцов после 2-кратного введения ПУХ в дозе 0,4ЛД50. Данные представлены в виде Ме (5; 95 персентиль).

Контроль 3 часа 24 часа 1 неделя 2 недели 4 недели 6 недель

АЧТВ 0,99 1,05 1,02 1,04 1,00 1,15 1,09

(0,86; (1,02; (0,80; (1,00; (0,88; (0,86; (0,81;

1,19) 1,36) 1,47) 1,05) 1,37) 2,16) 1,36)

ПВ 1,07 1,23 * 0,95 1,25 * 0,91 * 1,05 0,99

(0,95; (1,И; (0,81; (1,14; (0,83; (0,94; (0,83;

1,19) 1,36) 1,17) 1,31) 1,05) 1,25) 1,09)

ТВ 38,6 39,3 34,8 40,4 33,4 40,5 35,9

(32,6; (35,3; (32,9; (38,4; (27,3; (26,7; (32,7;

45,1) 41,6) 38,2) 42,2) 42,3) 43,4) 41,1)

Фибрино- 0,87 0,85 1,50 ** 0,79 0,96 0,91 0,96

ген, г/л (0,75; (0,72; (1,07; (0,75; (0,91; (0,84; (0,85;

1,12) 0,98) 1,96) 0,81) 1,02) 1,10) 1,09)

Систему естественных антикоагулянтов оценивали по изменению активности АТ.

Через сутки после острого отравления зоманом активность АТ повышалась в среднем на 25% относительно контроля. В более поздние сроки активность антитромбина не отличалась от контрольных значений. У животных, отравленных ЯУХ, наблюдается более

продолжительный подъем активности AT - через 3 часа и сутки (р<0,05) показатель на 25% выше контрольных значений, через 1 неделю наблюдается снижение активности, хотя среднее значение остается повышенным по отношению к контролю. Максимальное падение активности наблюдается через 2 недели после отравления, что может быть связано со снижением функциональной активности эндотелия. С 4-й недели начинается повторный подъем активности AT, но значимых отличий от контроля не наблюдается.

VWF:RCo после отравления зоманом характеризуется высокой вариабельностью, при этом через 3 часа, 1, 2 и 6 недель отмечена тенденция к повышению активности, через сутки и 4 недели - тенденция к снижению активности, но эти изменения недостоверны. Через 1 неделю после отравления RVX отмечено выраженное повышение VWF:RCo. В остальные сроки наблюдалась тенденция к снижению активности. Через 3 часа после отравления зоманом отмечено двукратное увеличение активности ADAMTS13 в плазме крови крыс (р<0,05). После острого отравления RVX в плазме крыс наблюдается повышение активности AD AMTS 13 в 1,5 раза (р<0,05) через 3 часа. В дальнейшем активность фермента постепенно снижается, достигая минимального значения 70% (р<0,05) к двухнедельному сроку. В остальные сроки значимых изменений не выявлено. Активность фактора Виллебранда имеет фазовый характер и связана с активностью ADAMTS13 (рис.10,12). Разнонаправленные изменения показателя при интоксикации зоманом и RVX отмечены через 2 и 6 недель после отравления. Зоман вызывает повышение VWF:RCo, в то время как RVX, наоборот, снижает активность фактора в плазме крови. Особый интерес представляет повышения активности ADAMTS13 в ранние сроки после воздействия ФОБ. Большое число исследований посвящено изучению состояний, характеризующихся снижением активности AD AMTS 13 и связанных с ним рисках тромботических осложнений [Mannucci et а)., 2001; Zheng, Sadler, 2008]. Клиническое значение повышения активности этого фермента и механизмы, лежащие в основе этого явления, недостаточно освещены. Помимо эндотелиальных клеток, ADAMTS13 синтезируется в тромбоцитах, мегакариоцитах [Suzuki et al., 2004, Liu et al. 2005] и в звездчатых клетках печени [Uemura et al., 2005].

Интересным оказался анализ соотношения активности VWF к активности ADAMTS13 (рис.9,11). Повышение отношения свидетельствует об увеличении прокоагулянтных свойств плазмы, а снижение - о недостаточности свертывающей системы. Выраженная тенденция к усилению прокоагулянтной активности плазмы наблюдается через 6 недель после отравления зоманом, а через 2 недели эти изменения статистически значимы (р<0,05). После острого отравления RVX выраженное повышение прокоагулянтной активности наблюдается в первую неделю эксперимента. Через сутки отмечено снижение прокоа[улянтной активности (р<0,05).

Рисунок 9 - Динамика соотношения Рисунок 10 - Динамика активностей фактора

активности фактора Виллебранда и Виллебранда (пунктирная линия) и

АОЛМТ813 в плазме крови крыс после АВЛМТ813 (сплошная линия) в плазме отравления зоманом. На оси У - усл. ед.

i.eo

1.40 1.20 1.00 0 30 ' 0.60 0.40 0,20 0.00

i. J

П.':''1.!! 1ч.

24'lilf.J 1 мСД

i Л 2.«<

41 ид 6

крови крыс после отравления зоманом.

160% 140% 120% 100% ВОЯ 60% 40% 20% 0%

■...............L

\ I

.................................................................

; контроль 2 ) часл 2 не/icnr " недель Ч.И.Я 1 неделя 4 недели

Рисунок 11 - Динамика соотношения Рисунок 12 - Динамика активное"-, " фактора активности фактора Виллебранда и Виллебранда (пунктирная ли,;м.1) и АБАМТЭП в плазме крови крыс после ЛОАМТБ13 (сплошная линия) в плазме

отравления RVX. На оси Y - усл. ед.

крови крыс после отравления RVX.

Активность ADAMTS13 исследовали на культуре эндотелия в кондиционных средах и лизатах клеток через 24 часа после добавления в среду роста зомана, RVX, карбахола, азида натрия и перекиси водорода. Под действием перекиси водорода активность фермента в клеточных лизатах повышалась в 3 раза, причем это не было связано с цитолизом, что позволяет предположить стимуляцию эндотелия. Известно, что в эндотелиальных клетках основным источников перекиси является ксантин-оксидазная реакция, которая активируется при ишемии/реперфузии [Phan et al., 1989; Pohlman, Harlan, 2000]. Возможно, именно эта реакция является генератором относительно высоких концентраций перекиси при интоксикации ФОВ, опосредуя генерацию протеиназы ADAMTS13. Вопрос этот чрезвычайно важный и интересный и требует отдельных исследований.

Исследование сывороток крови крыс после отравления зоманом и RVX методом масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI), показало, что в масс-спектрах образцов, полученных от крыс через 1 сутки после отравления

- 19-

появляется пептид с МН+ 1452,69 Да (рис.13). Этот же сигнал, но гораздо более низкой интенсивности обнаруживается в образцах через 3 часа и 1 неделю после воздействия. Для идентификации данного пептида был проведен МС-МС анализ, показавший, что сигнал с МН+ 1452,69 Да соответствует пептиду с аминокислотной последовательностью GTTSEFIDEGAGIR, который является частью фибринопептида А (ФПА) (ADTGTTSEFIDEGAGIR). ФПА отщепляется от фибриногена под действием тромбина в процессе свертывания крови, поэтому его присутствие в образцах вполне объяснимо.

геспиаори

12Í14 67S

BHEA3GD1R

{iEFIEAGGDIR 119? €12

1211830

ÍFIEAGGCIR ■9V7 3t« 1161.322

TTSEF1£*.SGDJR t*J%5 54 7

ГЗТ J IE

155?.71.

«38? í )l 1SM.737

iurisos

MOO »00 WW УЖО UCW 1$0i)

u.'.LuJli

1С-.АЛ

DT ОТ T SE Fl E AGGW R

71 '5ГР.&

WS2»31 " I

t7 ОС 1й-;0 •),:

JlULU

AD7Ü7T;JEFIEMV>£4S

DTGTTSFFIgA^CtUR

EFIEAGGDIR FÍEAGGDIR

iEFIEAGGDIR it »3.6 32

TGT TSE FIE A?VG Г> IR

TSEflEAOGDlft

1294 565

rTSEFlEAGGDIR

..................V" "

15S1764

A J!

w.ij; as« '

нею 1 .:-:•) гид hop i^co шо поз igoo )j;/j

Рисунок 13. Масс-спектры пептидной фракции сыворотки крови контрольных крыс (а) и крыс через 1 сутки после острого отравления RVX (б). Показано (на врезке а) отсутствие пептида с МН+ 1452.77 Да в плазме крови контрольных животных (а)

Присутствие фрагмента GTTSEFIDEGAGIR означает, что ингибирована некая экзоаминопептидаза, расщепляющая связь TG (треонил-глицин). Следует отметить, что ранее было показано ковалентное взаимодействие некоторых ФОС с N-ацилпетидгидролазой (экзоаминопептидазой) мозга [Richards et al., 2000]. Применительно к объекту нашего исследования, особый интерес представляет аминопептидаза N (CD13/APN, ЕС 3.4.11.2), которая, не имея строгой субстратной специфичности, является мультифункциональным белком и основной аминопептидазой плазмы крови. Она присутствует в виде мембран-связанного фермента на миелоидных клетках, зрелых моноцитах и нейтрофилах, на эпителии, фибробластах, а также на эндотелиальных клетках, причем ангиогенные и ряд других сигнальных факторов индуцируют экспрессию CD13/APN [Favaloro et al., 1993; Pasqualini et al., 2000; Bhagwat et al., 2001; Bauvois, Dauzonne, 2006]. Значительная активность APN показана в плазме крови, лишенной клеточных элементов, причем инстинной APN

считалась именно растворимая плазменная форма [Favaloro et al., 1993]. Специфическими ингибиторами APN являются бестатин, 1,10-фенантролин, 2.2'-дипиридил [Ashmun, Look, 1990]. ФОВ, возможно, также ингибируют данную аминопептидазу, временно нарушая тем самым деградацию ФПА; отсутствие подобного эффекта при остром отравлении крыс фторацетатом свидетельствует в пользу такого предположения. С другой стороны, повышение уровня всех фрагментов ФПА, а не только пептида GTTSEF1DEGAGIR, может быть связано с повышенным уровнем фибриногена. Связь между активностью CD13/APN в плазме или сыворотке, воспалением, поражением эндотелия, сдвигами в лейкограмме/миелограмме представляется важной и интересной, однако требует проведения специальных исследований.

ВЫВОДЫ

1. Активность холинэстераз крови, уровень аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы являются биохимическими маркерами интоксикации в течение 1 недели после острого отравления ФОВ. Уровень креатинина и мочевины - неспецифические маркеры отравления на поздних сроках острой интоксикации крыс.

2. Совокупность кинетических параметров агрегации тромбоцитов (полуэффективная концентрация активатора, максимальная скорость агрегации, агрегационный потенциал тромбоцитов) - неспецифическая характеристика острого отравления ФОВ на всех сроках интоксикации (3 часа - 4 недели).

3. Совокупность показателей гемолитической устойчивости эритроцитов (максимальная скорость гемолиза, время достижения максимальной скорости гемолиза, процент гемолиза) является неспецифической характеристикой для оценки патогенеза на средних и поздних сроках (2 и 4 недели) интоксикации ФОВ.

4. Ряд показателей плазменного гемостаза (АЧТВ, ПВ, фибриноген, ADAMTS13, VWF, пептид 1452) характеризуют развитие острой интоксикации на ранних сроках (до 1 недели); некоторые из этих показателей (ПВ, ADAMTSI3, VWF) дают представление о развитии интоксикации ФОВ на средних сроках (2 недели).

5. Динамика изменений исследованных показателей системы гемостаза и биохимических показателей свидетельствует о том, что критическими сроками при острой интоксикации ФОВ являются первые 24 часа (риск развития геморрагии и ДВС-синдрома) и 2 недели (риск развития тромботических осложнений). При отравлении зоманом риск тромботических осложнений более выражен по сравнению с RVX.

-21 -

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

В реферируемых журналах

Краснов И.А., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Бабаков В.И., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко И.Г., Смолихина Т.Н., Поляков Н.Б., Радилов A.C., Краснов Н.В. Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии 0-изобутил-5'-(2-диэтиламиноэтил)метилтиофосфоната. // Научное приборостроение. - 2008.- т. 18,- №4.- с.29-36.]

Краснов И.А., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина JIM., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов A.C., Краснов Н.В. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии. // Научное приборостроение. - 2008.-г.18.-№4.- с.46-53.

Бабаков В.Н., Гончаров Н.В., Радилов A.C., Глашкина Л.М., Подольская Е.П., Ермолаева Е.Е., Шилов В.В., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Егоров H.A. Новые подходы к раннему выявлению хронической интоксикации фосфорорганическими веществами у работников объектов уничтожения химического оружия. // Медицина труда и промышленная экология.-2009-. № 4,- С 26-29.

Goncharov N., D. Prokofieva, N. Voitenko, L. Gustyleva, E. Savelieva, A. Radilov, V. Babakov, E. Ermolaeva, N. Khlebnikova, Y. Pechenevsky and V. Rembovsky Elaboration of microplate spectroscopic method for biomonitoring of warfare organophosphates soman and Russian VX. // The Toxicologist. - 2010. - V.99. - # 1. - P.397 (A 1866).

Прокофьева Д.С., Бабаков B.H., Войтенко Н.Г., Гончаров Н. В. Определение токсичности фосфорорганических соединений на клетках нейробластомы линии SH-SY5Y // Биологические мембраны. 2010. - Т.27. - №3. - С.252-255.

Гончаров Н.В., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М. Молекулярные механизмы холинергической регуляции и дисрегуляции // Токсикологический вестник.- 2010. - № 2. - С. 5-10.

Бабаков В.Н., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Краснов И.А., Поляков П.Б., Войтенко Н.Г., Прокофьева Д.С., Краснов Н.В., A.C. Радилов. Новые маркеры интоксикации фосфорорганическими соединениями в пептидной фракции плазмы крови крыс // Токсикологический вестник.- 2010. - № 2. - С. 31 -38.

Материалы научно-практических конференций

Goncharov N., L. Glashkina, Е. Senchenkov, Е. Savelieva, N. Koryagina, I. Dobrylko, N.Voitenko, Т. Kuznetsova, E. Ermolaeva, A. Radilov. Comparative assessment of biochemical express methods for RVX detection on technological surfaces // Материалы международного семинара «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями». Санкт-Петербург, 18-20 сентября 2007 г.

Войтенко Н.Г., Гарнюк В.В., Гончаров Н.В.. Поиск новых средств терапии острых отравлений суррогатами алкоголя. // Г.Г.Онищенко, Б.А.Курляндский (ред.). Материалы 3-го съезда токсикологов России 2-5 декабря 2008 г., Москва. С.487-488.

Goncharov N.V., Prokofieva D.S., Glashkina L.M., Savelieva E.I., Koryagina N.L., Voitenko N.G., Dobrylko LA., Ermolaeva E.E., Radilov A.S.. Biochemical and cytotoxicity studies for developing a methodology of combined express analysis and risk assessment at chemical weapon destruction facilities // 12th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference (CWD 2009). - 19-21th May 2009, Stratford-upon-Avon. - P.69.

Войтенко Н.Г., Глашкина Л.М., Прокофьева Д.С., Бабаков В.П., Гончаров Н.В. N-ацетилирование: новые возможности старых методов. // Сборник статей «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесников, А.В. Бережное). -Пущино, 2009. С.335-339.

Бабаков В.Н., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Подольская Е.П., Фатеенков В.Н., Ермолаева Е.Е., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Влияние отравляющих веществ на активность ключевых внутриклеточных сигнальных систем в клетках нейробластомы человека SK-N-МС. // Сборник статей «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесников, А.В. Бережнов). - Пущино, 2009. С.321-326.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Метод Эллмана в планшетном варианте с использованием нейробластомы линии SH-SY5Y как носителя ацетилхолинэстеразы. // Сборник статей «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (ред. В.П. Зинченко, С.С. Колесников, А.В. Бережнов). - Пущино, 2009. С.722-727.

Prokofieva D.S., Gustyleva L.K., Voitenko N.G., Babakov V.N., Goncharov N.V. Biochemical methods to estimating organophosphates in environmental objects // 61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 February-4 March 2010. - Orlando.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 21.04.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5934Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Войтенко, Наталья Геннадьевна

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ '

Глава 1. Токсикология фосфорорганических соединений и система гемостаза млекопитающих (Обзор литературы) 11 1.1. - Фосфорорганические соединения (ФОС) и механизм их токсического действия

1.2 — Структурно-функциональные аспекты гемостаза

• Структура и функции тромбоцитов

• Структура и функции эритроцитов

• Гуморальный (плазменный) гемостаз

1.3 — Гемостаз и возможные механизмы развития патогенеза при интоксикации ФОС

1.4 - Обзор литературы: Резюме

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 - Динамика относительного изменения массы животных после острого отравления

3.2 - Биохимические показатели в динамике после острого отравления крыс зоманом и RVX

3.3 - Исследование эстеразной активности крови

3.4 - Изменение параметров агрегации тромбоцитов после острого отравления ФОВ

3.5 — Исследование функционального статуса эритроцитов при интоксикации ФОВ

3.6 - Изменение показателей гуморального гемостаза после острого отравления зоманом и RVX

3.7 - Исследование активности ADAMTS13 в культуре эндотелиальных клеток

3.8 - Исследование сывороток крови крыс после отравления зоманом и RVX методом масс-спектрометрии с ионизацией лазерной десорбцией в присутствии матрицы (MALDI)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гемостаз и эстеразная активность крови крыс при интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами"

Актуальность проблемы

Заболевания, этиологически связанные с воздействием химических факторов, приобрели широкое распространение вследствие интенсивного развития химической промышленности, загрязнения производственной и окружающей среды. Фосфорорганические соединения (ФОС) - особая составляющая этих факторов, они широко используются в сельском хозяйстве и промышленности в качестве пестицидов, пластификаторов, компонентов в синтезе лекарственных веществ, полимерных материалов. Популярность и широта их использования обусловлена высокой эффективностью и быстрой деградацией в окружающей среде [Costa, 1997]. Примерно 80 различных ФОС используются в качестве инсектицидов, другие ФОС нашли свое применение в фармакологии [Pope et al., 2005], а также в военной токсикологии [Lotti, 2000, 2001] - это так называемые фосфорорганические отравляющие вещества (ФОВ).

В соответствии с Федеральной целевой программой «Уничтожение запасов химического оружия в Российской Федерации», одной из задач является обеспечение безопасности этого процесса для персонала объектов по хранению и уничтожению химического оружия, а также граждан, проживающих и работающих в зоне защитных мероприятий. В случае острого отравления антидоты позволяют сохранить жизнь людей, однако это не решает проблему медицинской реабилитации пострадавших, поскольку велика вероятность развития отдаленных последствий интоксикации. О развитии отставленной патологии можно судить по данным лабораторной и клинической диагностики, однако имеющиеся средства диагностики рассчитаны главным образом на оценку степени токсического поражения в ранние сроки интоксикации, тогда как оценка риска развития того или иного заболевания на более поздних сроках остается актуальной задачей. Неясен патогенез развития отдаленных последствий, отсутствует единая система физиолого-биохимических, цитологических и иммунологических маркеров для своевременной диагностики.

Наблюдения за пострадавшими в результате острого и хронического воздействия ФОВ выявили среди основных отставленных симптомов вегетативные изменения сердечнососудистой системы и «микроорганические расстройства» ЦНС неясной этиологии [Мусийчук, Янно, 1988]. Были основания предполагать, что сосудистая патология играет значимую роль в формировании отставленных последствий острого отравления [De Groot et al., 1993]. Результаты экспериментальных исследований при подостром и хроническом действии различных ФОС свидетельствовали о ведущей роли несинаптических механизмов в 6 возникновении оставленных функциональных эффектов [Гончаров и др., 2001, 2002; Goncharov et al., 2003, 2004; Mindukshev et al., 2005]. Эти эффекты проявлялись при восстановлении активности и даже при отсутствии ингибирования холинэстераз, имели характер микроангиопатий в компенсаторной фазе, были связаны с нарушением эндотелий-зависимой релаксации сосудов, нарушением нервно-мышечной проводимости, изменением кинетических параметров агрегации тромбоцитов. Эксперименты показали, что тромбоцитарное звено гемостаза может служить индикатором состояния сосудистого русла при интоксикации ФОС. Другой группой ученых были получены морфологические доказательства поражения эндотелия на разных сроках после острого отравления [Прозоровский, Чепур, 2001; Чепур и др., 2006].

Однако проблема разработки и обоснования комплекса физиолого-биохимических методов диагности далека от решения. Методы морфологии не являются распространенным средством клинической диагностики. Используемые в настоящее время биомаркеры интоксикации ФОС (ацетилхолинэстераза, бутирилхолинэстераза) специфичны лишь в ранние сроки интоксикации. Более или менее полный анализ клеточного и плазменного гемостаза на дальних сроках после острого отравления не проводился, а имеющиеся данные о состоянии плазменного гемостаза на ранних сроках весьма скупы и недостаточны для оценки роли гемостаза в развитии патологии. Так, нарушения в системе гемостаза были отмечены у людей и в экспериментах на животных в течение первых суток после острого отравления ФОС-пестицидами [Namba et al., 1971; Gupta et al., 1982; Ziemen, 1984], зарином [Von Kaulla, Holmes, 1961] и зоманом [Lee, Clement, 1990].

В настоящее время исследования многих биохимиков, работающих в области токсикологии, сосредоточены главным образом на поиске продуктов деструкции ФОС или их аддуктов с белками, сохраняющихся в организме в течение более или менее длительного периода, с целью доказательства факта интоксикации [Worek et al., 2005; Radilov et al., 2009]. Гораздо меньше внимания уделяется переоценке распространенных и внедрению новых биохимических и функциональных методов клинической диагностики, которые могли бы пролить свет на механизмы патогенеза, помочь в создании своеобразного «спектра» физиолого-биохимических показателей, каждый из которых сам по себе не способен дать ответ на вопрос о тяжести поражения, критических сроках интоксикации и направленности патогенеза, но их совокупность, наряду с осмысленной интерпретацией, может обладать таким свойством.

Цель и задачи

Цель настоящей работы — исследовать состояние системы гемостаза, активность основных эстераз крови и ряд биохимических показателей на разных сроках после острого отравления фосфорорганическими отравляющими веществами (ФОВ) на примере зомана и вещества типа VX (RVX), определить критические сроки в развитии интоксикации и диагностическую значимость применяемых методов.

Для достижения данной цели были поставлены и решены следующие задачи:

1) Исследовать активность эстераз и другие биохимические показатели крови крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX.

2) Определить кинетические параметры агрегации тромбоцитов в динамике при острой интоксикации крыс зоманом и RVX.

3) Исследовать гемолитическую устойчивость эритроцитов при острой интоксикации крыс зоманом и RVX.

4) Исследовать состояние плазменного гемостаза крыс в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX.

Положения диссертации, выносимые на защиту

1) Активность холинэстераз, аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы в крови крыс — биохимические маркеры острого отравления ФОВ исключительно на ранних сроках интоксикации.

2) Кинетические параметры агрегации тромбоцитов — неспецифические характеристики острого отравления ФОВ на всех исследованных сроках интоксикации.

3) Определение гемолитической устойчивости эритроцитов - новый функциональный тест для оценки характера патогенеза на средних и поздних сроках острой интоксикации ФОВ.

4) Определение динамики показателей плазменного гемостаза необходимо для выявления критических сроков и механизма развития последствий при острой интоксикации ФОВ.

Научная новизна

С использованием высокотоксичных ФОВ - зомана и RVX - впервые проведено комплексное изучение гуморального и клеточного звеньев гемостаза в динамике в ходе продолжительного эксперимента. При этом проведен анализ биохимической активности холинэстераз эритроцитов и плазмы с точки зрения надежности этих показателей для оценки степени и тяжести поражения на разных сроках интоксикации. Предложено теоретическое объяснение и экспериментальное обоснование динамики ряда биохимических показателей в крови животных при остром воздействии ФОВ. Методология малоуглового светорассеяния впервые использована для комплексного исследования кинетических параметров агрегации тромбоцитов и гемолитической устойчивости эритроцитов, что позволило по-новому охарактеризовать степень интоксикации ФОВ, понять особенности патогенеза и характер токсикодинамики, выявить критические периоды патогенеза. Также впервые в токсикологических исследованиях показана динамика активности металлопротеиназы ADAMTS-13 при интоксикации ФОВ, наряду с активностью ее субстрата -протромбогенного фактора Виллебранда. С целью поиска новых маркеров интоксикации впервые проведен анализ низкомолекулярных пептидов плазмы, в результате чего был выявлен ряд пептидов — продуктов ограниченного протеолиза фибринопептида А, образующихся в результате активности экзопептидаз. Полученные данные проанализированы с точки зрения состояния системы гемостаза и сосудистого русла, что позволило по-новому оценить ту роль, которую играют эндотелиальные клетки сосудов в выживаемости организма и развитии последствий интоксикации.

Теоретическое и практическое значение работы

Проведенные исследования расширяют представления о механизмах токсикодинамики при острой интоксикации ФОВ, позволяют лучше понять взаимосвязь специфических и неспецифических проявлений интоксикации. Особое значение имеет тот факт, что в работе не просто получены новые данные для токсического вещества фосфорорганической природы, но по сути проведен сравнительный анализ двух наиболее токсичных отравляющих веществ, являющихся компонентами химического оружия. Поэтому данные, полученные в настоящей работе, помогут в определении новых критериев диагностики отравлений ФОВ, в понимании механизмов патогенеза отдаленных последствий интоксикации, формулировке новых принципов терапии на разных сроках интоксикации ФОВ.

Исследованные вещества фосфорорганической природы обладают различными токсикокинетическими характеристиками, а потому имеют различный спектр молекулярных и клеточных мишеней. Данный факт имеет большое значение для других, «гражданских» областей человеческой деятельности, поскольку аналогичные проблемы, связанные с диагностикой и терапией отравлений фосфорорганическими соединениями, существуют в сельском хозяйстве и промышленном производстве ФОС.

Использование новой методологии малоуглового светорассеяния для изучения морфофункциональных характеристик клеток крови свидетельствует о ее высокой эффективности для определения характера интоксикации, что является несомненным вкладом в методическое обеспечение физиолого-биохимических и токсиколого-фармакологических исследований. Данные о динамике активности металлопротеиназы ADAMTS-13, полученные в экспериментах in vivo и in vitro с использованием культуры эндотелиальных клеток, имеют важное теоретическое значение и заставляют интенсифицировать исследования функциональной роли эндотелия для понимания механизмов токсикокинетики, токсикодинамики и фармакологической коррекции. Полученные в работе практические результаты и теоретические обобщения могут быть использованы в лекционных курсах по биохимии, физиологии и токсикологии.

Апробация работы

Результаты исследований представлены: на международном семинаре «Предупреждение и устранение последствий химически опасных чрезвычайных ситуаций, обусловленных терроризмом и промышленными авариями» (Санкт-Петербург, 2007), на 3-м съезде токсикологов России (Москва, 2008), на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная регуляция» (Пущино, 2009), на Токсикологическом Обществе США (Солт-Лейк-Сити, 2010), на Питтсбургской конференции (Орландо, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 72 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, 8 экспериментальных разделов, обсуждения, заключения и выводов. Библиография включает 39 отечественных и 255 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Войтенко, Наталья Геннадьевна

выводы

1. Активность холинэстераз крови, уровень аминотрансфераз и гамма-глутамилтрансферазы являются биохимическими маркерами интоксикации в течение 1 недели после острого отравления ФОВ. Уровень креатинина и мочевины — неспецифические маркеры отравления на поздних сроках острой интоксикации крыс.

4. Ряд показателей плазменного гемостаза (АЧТВ, ПВ, фибриноген, ADAMTS13, VWF, пептид 1452) характеризуют развитие острой интоксикации на ранних сроках (до 1 недели); некоторые из этих показателей (ПВ, ADAMTS13, VWF) дают представление о развитии интоксикации ФОВ на средних сроках (2 недели).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Наблюдение за динамикой относительного изменения массы животных после острого отравления двумя разными ФОВ - зоманом и RVX - показало более выраженное влияние RVX на этот интегральный показатель. За 6 недель наблюдения животные после воздействия RVX прибавили в весе на 18% меньше (р<0,01), чем животные контрольной группы. В то же время животные опытной группы после воздействия зомана не только компенсировали отставание в приросте массы, которое наблюдалось в ранние сроки интоксикации, но и несколько превысили его относительно контроля.

Из исследованных биохимических показателей крови животных наиболее значительно менялась активность ACT, АЛТ, ГГТ, уровень креатинина, мочевины, холестерина и триглицеридов. В ранние сроки после отравления зоманом наблюдаются статистически значимые изменения уровня аминотрансфераз и ГГТ, однако они носят значительно менее выраженный характер, чем при острых воспалительных и некротических процессах в печени и сердечной мышце. При интоксикации RVX значительно изменяется только активность ACT через 3 часа и сутки и ГГТ через 4 недели после отравления. Анализ количества мочевины и креатинина в сыворотке крови крыс выявил значительное повышение этих показателей в отдаленные сроки (при интоксикации зоманом — через 4 и 6 недель, при интоксикации RVX — через 4 недели).

В ранние сроки интоксикации зоманом и RVX активность эритроцитарной АХЭ была значительно снижена (до 10% от контрольного уровня), но ко второй неделе эксперимента практически полностью восстанавливалась. При этом зоман вызывал более выраженное и длительное ингибирование фермента. БХЭ сыворотки крыс при интоксикации зоманом также ингибируется (до 50%), восстановление активности фермента наблюдали лишь через 2 недели после отравления. Однако RVX не оказывал выраженного влияния на активность БХЭ. Исследование активности КЭ в сыворотке крови экспериментальных животных не выявили значительных отклонений от контроля.

Изучение кинетических параметров агрегации тромбоцитов выявило снижение чувствительности кровяных пластинок к индуктору агрегации АДФ через сутки и повышение чувствительности через 2 недели после отравления зоманом. При этом Umax повышается в течение первых суток после воздействия. При интоксикации RVX в ранние сроки наблюдается аналогичная картина — снижение чувствительности тромбоцитов к АДФ при повышении максимальной скорости агрегации. Такие же изменения кинетических параметров агрегации наблюдаются через 4 недели после воздействия.

При оценке функционального статуса эритроцитов через 2 недели после отравления зоманом было выявлено выраженное уменьшение времени достижения максимальной скорости гемолиза, что свидетельствует об увеличении пула «постаревших» или «пострадавших» клеток, вероятность гибели которых по некротическому пути возрастает. Восстановление Tgem к 4-недельному сроку с одновременным снижением полноты гемолиза (до 89%) свидетельствует о значительном обновлении популяции эритроцитов. Интоксикация RVX в меньшей степени отражается на исследованных показателях функционального статуса эритроцитов - максимальная скорость гемолиза и время достижения максимальной скорости гемолиза в течение эксперимента практически не менялись, хотя можно отметить тенденцию к снижению Tgem через 2 недели. Снижение полноты гемолиза на 4 неделе эксперимента также свидетельствует об обновлении популяции эритроцитов.

Подсчет форменных элементов крови после отравления зоманом выявил значительное снижение числа лейкоцитов через 3 часа и сутки, а также снижение числа эритроцитов через 2 и 4 недели, что согласуется с повышением гемолитической активности эритроцитов в эти

99 сроки. Число эритроцитов крови крыс после воздействия RVX подвергается незначительным колебаниям, с тенденцией к снижению на 2 неделе эксперимента, что, в совокупности с изменением Tgem, свидетельствует о возможности развития внутрисосудитстого гемолиза в этот период. Число лейкоцитов значительно снижается на ранних сроках интоксикации и через 6 недель после воздействия RVX.

Скрининговые тесты состояния гуморального гемостаза выявляют схожие результаты воздействия зомана и RVX в ранние сроки: увеличение ПВ (торможение внешнего пути свертывания крови) через 3 часа, значительное повышение количества фибриногена через 1 сутки. При интоксикации зоманом отмечено удлинение АЧТВ через 1 неделю, а через 2 недели после отравления RVX наблюдается активация внутреннего пути свертывания (уменьшение ПВ). Увеличение ПВ можно было бы связать с ингибированием сериновой эстеразы - фактора VII, но гораздо более вероятным представляется выброс TFPI из активированных эндотелиальных клеток и тромбоцитов. При действии следов тромбина TFPI выделяется из специфических гранул хранения и связывается с фактором Vila и его комплексом с ТФ, ограничивая тем самым активацию коагуляционного каскада [Зубаиров, 2000; Lwaleed, Bass, 2006].

Исследование антикоагулянтной активности плазмы крови выявило повышение активности антитромбина в ранние сроки интоксикации, причем после отравления RVX эти изменения были более продолжительными и выраженными.

Ристомицин-кофакторная активность фактора Виллебранда, известного как маркер дисфункции эндотелия, повышалась через 3 часа и 2 недели после острого отравления зоманом, при этом вторая волна была более выражена, чем первая. Изменение активности VWF при интоксикации RVX носило иной характер - максимальная активность фактора наблюдалась через 1 неделю после воздействия, в остальные сроки показатель был близок к контрольным значениям или значительно ниже - особенно через сутки. При этом на всех сроках отмечалась значительная вариабельность показателя.

Динамика активности ADAMTS-13 имеет значительное сходство при интоксикации зоманом и RVX - резкое повышение активности наблюдается через 3 часа после отравления. В дальнейшем наблюдалось возвращение показателя к контрольным значениям с незначительным повышением через 1 неделю после отравления зоманом и снижением через 2 недели после отравления RVX. Повышение активности ADAMTS13 при действии перекиси в экспериментах in vitro — не только еще одно свидетельство активации эндотелия, но и вероятный индикатор ишемии-реперфузии как одной из главных причин генерации перекиси в условиях in vivo.

Исследование пептидного состава сыворотки крови крыс при интоксикации ФОВ методом масс-спектрометрии выявило нарушение деградации фибринопептида А. Появление пептида GTTSEFIDEGAGIR с массой 1452 в сыворотке крови в ранние сроки может быть связано с ингибированием зоманом и RVX аминопептидазы N, а максимальная интенсивность пика этого маркерного пептида, выявленная через 1 сутки после воздействия ФОВ, соответствует максимальной концентрации фибриногена в плазме.

Исследование динамики ряда биохимических и гематологических показателей, наряду с показателями клеточного и плазменного гемостаза позволяет сформулировать следующую картину происходящих в организме животных изменений в динамике при острой интоксикации зоманом и RVX (табл. 4.1).

Через 3 часа после острого отравления ингибирование эритроцитарной АХЭ и сывороточной БХЭ вызывают повышение уровня ацетилхолина в кровеносном русле (на фоне выраженных холинергических симптомов). Действие АХ на эндотелий сопряжено со стимуляцией М-рецепторов, мобилизацией внутриклеточного кальция, генерацией окиси азота. Чрезмерная активация обусловливает повреждение эндотелия, нарушение микроциркуляции, ишемию. Возможными маркерами этого воздействия являются повышение активности AJIT, ACT, ГГТ, фактора Виллебранда (для зомана) и менее выраженные признаки этого процесса при отравлении RVX. Клеточное звено гемостаза быстрее реагирует на активацию: при отравлении зоманом уже через 3 часа достоверно повышается Umax и АПТ. С другой стороны, активируются факторы, препятствующие свертыванию крови: значительно повышается активность ADAMTS13 и есть признаки активации AT при интоксикации RVX. При интоксикации зоманом на этом сроке активность AT еще не повысилась, возможно отчасти с этим связан более выраженный прокоагуляционный эффект зомана на данном этапе.

Через сутки процесс интоксикации затрагивает уже и плазменный гемостаз. В плазме значительно повышается уровень фибриногена. С большой долей вероятности можно утверждать, что этот факт связан с активацией системы гемостаза: по-прежнему высоким остается уровень аминотрансфераз с преобладанием ACT, а повышение активности фактора Виллебранда может быть замаскировано в этот срок воздействием ADAMTS13. Остается повышенным показатель Umax, хотя чувствительность тромбоцитов к АДФ снижена (увеличение ЕС50). На этом сроке есть все предпосылки для развития острого ДВС-синдрома, при котором активируется не только свертывающая система, но и фибринолитическая, килликреин-кининовая и система комплемента. Активация последних двух приводит к агрегации и лизису лейкоцитов, о чем может свидетельствовать снижение их количества в ранние сроки интоксикации. Мембраны разрушенных лейкоцитов служат

101 дополнительным источником тканевого фактора, вызывающего дальнейшую активацию системы гемостаза. В такой ситуации исход процесса зависит от компенсаторных возможностей организма, в частности, от генерации ADAMTS13 в более ранние сроки. Тенденция к снижению активности фактора Виллебранда и достоверное снижение соотношения VWF/ADAMTS13 через сутки после отравления RVX позволяет предположить более благоприятный исход по сравнению с зоманом. В пользу такого вывода свидетельствует более выраженное повышение активности AT при интоксикации RVX. Однако истощение антитромботических факторов (снижение AT и ADAMTS13) через две недели после отравления RVX создает угрозу развития тромботических осложнений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Войтенко, Наталья Геннадьевна, Санкт-Петербург

1. Авдонин П.В., Ткачук В.А. Рецепторы и внутриклеточный кальций. // М.: Наука, 1994. -288с.

2. Балуда В.П., Балуда М.В., Деянов И.И., Тлепшуков И.К. Физиология системы гемостаза. // Москва, 1995.

3. Баркаган З.С. Геморрагические заболевания и синдромы. // М.: Медицина, 1988. -528с.

4. Баркаган З.С., Бишевский К.М. Физиологические антикоагулянты. Современное представление о составе, функции и клиническое значение // Лабораторное дело. -1978. — №10. С.579-586.

5. Беленький М.Л. Элементы количественной оценки армакологического эффекта. // Рига, 1959.- 114с.

6. Вестрайт М., Вермилен Дж. Тромбозы. // М.: Медицина, 1986.

7. Гаврилов O.K., Козинец Г.Н., Черняк Н.Б. Клетки костного мозга и периферической крови. // М.: Медицина, 1985. 288с.

8. Дарбре А. Практическая химия белка. // М.: Мир, 1985. 456 с.

9. П.Деркачев Э.Ф., Миндукшев И.В., Кривченко А.И., Крашенниников А.А. Способ исследования активации и агрегации тромбоцитов. // Патент RU 2108579 С1 6 G01 N 33/49. 1998. Б.И. №10 (II). С. 98.

10. Долгов В.В., Свирин П.В. Лабораторная диагностика нарушений гемостаза. // М. -Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2005. 227с.

11. Зубаиров Д.М. Молекулярные основы свертывания крови и тромбообразования. // Казань: Из-во «ФЭН», 2000.

12. Иванов Е.П. Руководство по гемостазиологии. // Минск, 1991.

13. Козинец Г.И., Макарова В.А. (ред.). Исследование системы крови в клинической практике. // М., 1998. 480с.

14. Костюк П.Г. Кальций и клеточная возбудимость. // М.: Наука, 1986. — 255с.

15. Ложкина А.Н. //Автореферат дис. . канд.биол.наук. Иркутск, 1988.

16. Мазур Э.М. Патофизиология крови. // М. СПб.: БИНОМ - Невский Диалект, 2000. -С. 54-156

17. Маршалл Дж.В. Клиническая биохимия. // М.-СПб.: БИНОМ Невский Диалект, 2000. -368с.

18. Музыкантов В.Р., Сахаров Д.В., Домогатский С.П., Гончаров Н.В., Данилов С.М., Смирнов В.Н. Защита эндотелиальных клеток от цитотоксического действия перекиси водорода посредством иммуноэритроцитов. // Доклады АН СССР 1986. - Т.288 -№3 - С.748-750.

19. Мусийчук Ю.И., Янно Л.В. О состоянии исследования отдаленных последствий действия химических веществ у людей. // Гигиена труда и профессиональные заболевания. 1988. - № 9. - С. 4-7.

20. Осадчая Л.М. Свободные аминокислоты нервной системы. // В кн. «Биохимия мозга». (Ред. Ашмарин И.П. и др.) Изд. СпбГУ. - 1999. - С.29-56.

21. Папаян Л.П. Новое представление о процессе свертывания крови // Папаян Л.П. (ред) Система гемостаза. — СПб.-2003.

22. Плужников Н.Н., С.В. Чепур, А.В. Лешневский и др. Профилактика отдаленных нейропатий при отравлениях ФОС. // Медико-гигиенические аспекты обеспечения работ с особо опасными химическими веществами. СПб, 2002. — С.407-408.

23. Прозоровский В.Б., Чепур С.В. Новые данные о несинаптических (дистантных) эффектах фосфорорганических ингибиторов холинэстеразы (обзор литературы). // Токсикологический вестник. 2001. - №4. - С.2-7.

24. Ройтберг Г.Е., Струтынский А.В. Лабораторная и инструментальная диагностика заболеваний внутренних органов Электрон, ресурс. 2003. - Режим доступа: http://rnedbook.medicina.ru/index.php7id level=337

25. Самаль А.Б., Черенкевич С.Н., Хмара Н.Ф. Агрегация тромбоцитов: методы изучения и механизмы. // Мн.: Университетское изд., 1990. 104с.

26. Соколовская Л.Г., Сиголаева Л.В., Еременко А.В. и др. Семейство биосенсорных анализаторов для оценки «эстеразного статуса» организма. // Химическая и биологическая безопасность. 2004. - №1-2. — С.21-33.

27. Теппермен Дж., Теппермен X. Физиология обмена веществ и эндокринной системы. Вводный курс. // М.: Мир, 1989. 656с.

28. Терсков Г.В., Гительзон И.И. Метод химических (кислотных) эритрограмм. // Биофизика. 1957. - Т.2. - №2. - С.259-263.

29. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э., Хилл Р., Леман И. Основы биохимии: В 3-х томах. // Т.1., М.: Мир, 1981.-534с.

30. Фултон А. Цитоскелет. Архитектура и хореография клетки. // М.: Мир, 1987. С.120.

31. Хашен Р., Шейх Д. Очерки по патологической биохимии. // М.: Медицина, 1981. -253с.

32. Хримель X., Брок И. Основы иммунологии. // М., 1986. — 254с.

33. Хухо Ф. Нейрохимия: Основы и принципы. // М.: Мир, 1990. 384с.

34. Чепур С.В., В.Б. Василюк, Л.В. Павлова. Применение карбаматов для экстренной профилактики отсроченных нейропатий при отравлении органофосфатами. // Актуальные вопросы военно-полевой терапии: мат. II всеарм. конф. — СПб., 1999. -С.285-286

35. Чепур С.В., Юдин М.А., Быков В.Н. Изменение структуры и функциональных свойств эндотелия сосудов гемомикроциркуляторного русла при токсическом холинопозитивном синдроме. // Морфология. 2006. - Т.129. - № 2. — С. 106.

36. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови. // М.-Спб.: БИНОМ — Невский Диалект, 2000. С.149-283.

37. Abou-Donia М.В. Organophosphorus ester-induced delayed neurotoxicity. // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 1981. -V.21. - P.511-548.

38. Ahmad S.S., London F.S., Walsh P.N. The assembly of the factor X-activating complex on activated human platelets. // J. Thromb. Haemost. -2003. V.l. - P.48-59.

39. Anderson R.J., Dunham C.B. Electrophysiologic changes in peripheral nerve following repeated exposure to organophosphorus agents. // Arch. Toxicol. 1985. - V.58. - P.97-101.

40. Ashmun R.A., Look A.T. Metalloprotease activity of CD13/aminopeptidase N on the surface of human myeloid cells. // Blood. 1990. - V.75. - №2. -P.462-469.

41. Auman J.T., Seidler F.J., Slotkin T.A. Neonatal chlorpyrifos exposure targets multiple proteins governing the hepatic adenylyl cyclase signaling cascade: implications for neurotoxicity. // Dev. Brain Res. 2000. - V. 121. - P. 19-27.

42. Authi K.S. Ca2+ homeostasis and intracellular pools in human platelets. // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - V.344. - P.83-104.

43. Barbosa M., Rios O., Velasquez M., Villalobos J., Ehrmanns J. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase histochemical activities and tumor cell growth in several brain tumors. // Surg. Neurol. 2001. - V.55. - №2. - P.106-112.

44. Bartels C.F., Zelinski Т., Lockridge O. Mutation at codon 322 in the human acetylcholinesterase (ACHE) gene accounts for YT blood group polymorphism. // Am. J. Hum. Genet. 1993,-V.52.-№ 5.-P.928-936.

45. Bauvois В., Dauzonne D. Aminopeptidase-N/CD13 (EC 3.4.11.2) inhibitors: chemistry, biological evaluations, and therapeutic prospects. // Med. Res. Rev. 2006. - V.26. - №1. -P.88-130.

46. Berk M., Plein H., Csizmadia T. Supersensitive platelet glutamate receptors as a possible peripheral marker in schizophrenia. // Int. Clin. Psychopharmacol. — 1999. — V.14. — №2. — P.l 19-122.

47. Berk M., Plein H., Ferreira D. Platelet glutamate receptor supersensitivity in major depressive disorder. // Clin. Neuropharmacol. 2001. - V.24. -№3. - P.l29-132.

48. Bertoncin D., Russolo A., Caroldi S., Lotti M. Neuropathy target esterase in human lymphocytes. // Arch. Environ. Health. 1985. - V.40. - P.l39-144.

49. Bessis. M., Weed. R.I., Leblond P. F. (Eds.) Red Cell Shape: Physiology, Pathology, Ultrastructure. // Springer Verlag, Heidelberg, 1973. P. 1-23.

50. Bhagwat S.V., Lahdenranta J., Giordano R., Arap W., Pasqualini R, Shapiro L.H. CD13/APN is activated by angiogenic signals and is essential for capillary tube formation. // Blood. 2001. - V.97. - №3. - P.652-659.

51. Bhagwat S.V., Petrovic N., Okamoto Y., Shapiro L.H. The angiogenic regulator CD13/APN is a transcriptional target of Ras signaling pathways in endothelial morphogenesis. // Blood. 2003. - V. 101. - №5. - P. 1818-1826.

52. Black R.M., Harrison J.M., Read R.W. The interaction of sarin and soman with plasma proteins: the identification of a novel phosphonylation site. // Arch. Toxicol. 1999. - V.73. -№2. -P. 123-126.

53. Blann A.D. von Willebrand and atherosclerosis. // J. Intern. Med. 1995. - V.237. - P.432-433.

54. Blomback B. Fibrinogen to fibrin transformation. // In Blood Clotting Enzymology. (Ed. Seegers W.H.). Academic Press, Inc., New York, 1967. P. 143-215.

55. Boas F.E., Forman L., Beutler E. Phosphatidylserine exposureand red cell viability in red cell aging and in hemolyticanemia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95. - P.3077-3081.

56. Bratosin D., Mazurier J., Tissier J.P., Estaquier J., Huart J.J., Ameisen J.C., Aminoff D., Montreuil J. Cellular and molecular mechanisms of senescent erythrocyte phagocytosis by macrophages. A review. // Biochimie. 1998. - Y.80. - №2. - P. 173-195.

57. Brenner В., Zwang E., Bronshtein M., Seligsohn U. von Willebrand factor multimer patterns in pregnancy-induced hypertension. // Thromb. Haemost. 1989. -V.62. -P.715-717.

58. Browne R.W., Koury S.T., Marion S., Wilding G., Muti P., Trevisan M. Accuracy and Biological Variation of Human Serum Paraoxonase 1 Activity and Polymorphism (Q192R) by Kinetic Enzyme Assay // Clin Chem. 2007. - V.53 - №2. - P.310-317.

59. Buonassisi V., Venter J.C. Hormone and neurotransmitter receptors in an established vascular endothelial cell line. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1976. - V.73. -№ 5. -P.1612-1616

60. Carvalho F.A., Gra?a L.M., Martins-Silva J., Saldanha C. Biochemical characterization of human umbilical vein endothelial cell membrane bound acetylcholinesterase. // FEBS J. -2005. V.272. - № 21. - P.5584-5594.

61. Casida J.E., Quistad G.B. Serine hydrolase targets of organophosphorous toxicants. // Chem. Biol. Interact. 2005. - V. 157-158. - P.277-283.

62. Catalan R.E., Hernandez F. Temperature effects on cholinesterases from rat brain capillaries. // Biosci. Rep. 1986. - V.6. - № 6. - P.573-577.1.l

63. Chemnitius J.M., Zech R. Inhibition of brain carboxylesterases by neurotoxic and non-neurotoxic organophosphorous compounds. // Molec. Pharmacol. 1983. - V.23. - P.717-723.

64. Chiaroni J. Numeric terminology of erythrocyte blood group antigens. Article in French. // Transfus. Clin. Biol. 1998. - V. 5. - №5. - P.366-371.

65. Choudhary S., Gill K.D. Protective effect of nimodipine on dichlorvos-induced delayed neurotoxicity in rat brain(l). // Biochem. Pharmacol. 2001. - V.62. - №9. - P. 1265-1272.

66. Churchill L., Bausback H.H., Gerritsen M.E., Ward P.E. Metabolism of opioid peptides by cerebral microvascular aminopeptidase M. // Biochim. Biophys. Acta. 1987. - V.923. -№1. — P.35-41.

67. Cines D.B., Pollak E.S., Buck C.A., Loscalzo J., Zimmerman G.A. et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. // Blood. 1998. - V.91.I1. P.3527-3561.

68. Clark M.R. Senescence of red blood cells: progress and problems. // Physiol. Rev. 1988. — V.68. — P.503-554.

69. Cline J.K., Johnson R.B., Johnson W.H. Cholinesterase content of erythrocytes in various anemic states; preliminary report. // South. Med. J. 1948. - V.41. - № 4. - P.374-376.

70. Costa L.G. Biomarker research in neurotoxicology: The role of mechanistic studies to bridge the gap between the laboratory and epidemiological investigations // Envor. Health Persp. -1996.-V. 104.- Suppl.l.-P.55-67.

71. Costa L.G. Basic toxicology of pesticides. // Occup. Med. State. Art. Rev. 1997. - V.12. -P.251-268.

72. Costa L.G., Cole T.B., Vitalone A., Furlong C.E. Measurement of paraoxonase (PON1) status as a potential biomarker of susceptibility to organophosphate toxicity. // Clin. Chim. Acta. 2005. - V.352. - №1-2. - P.37-47.

73. Crott J.W., Fenech M. Effect of vitamin С supplementation on chromosome damage, apoptosis and necrosis ex vivo. // Carcinogenesis. 1999. - V.20. -№6. - P. 1035-1041.

74. Daleke D.L., Huestis W.H. Erythrocyte morphology reflects the transbilayer distribution of incorporatedphospholipids. // J. Cell. Biol. 1989. - V. 108. - №4. - P. 1375-1385.

75. Daniel J.L., Adelstein R.S. Isolation and properties of platelet myosin light chain kinase. // Biochemistry. 1976. - V.15. - P.2370-2377.

76. Davie E.W., Ratnoff O.D. Waterfall sequence for intrinsic blood clotting. // Science. 1964. - V.145. -P.1310-1312.

77. Davies D.R. Neurotoxicity of organophosphorus compounds. // In: Cholinesterase and Anticholinesterase Agent. Berlin: Springer, 1963. - P.860-882.

78. De Groot D.M., Bierman E.P., Van Huygevoort A.N. Involvement of NMDA-receptors in soman-induced neuropathology. // Proc. Med. Def. Biosci. Rev. 1993. - V.2. - P. 447-455.

79. Desi I., Nagymajtenyi L. Electrophysiological biomarkers of an organophosphorous pesticide, dichlorvos. // Toxicol. Lett. 1999. - V.107. -№1-3. - P.55-64.

80. Drachman D. Do we have brain to spare? // Neurology. 2005. - V.64. - № 12. - P.2004-2005.

81. Eber S., Lux S.E. Hereditary spherocytosis-defects in proteins that connect the membrane skeleton to the lipid bilayer. // Semin. Hematol. 2004. - V.41. - №2. - P. 118-141.

82. Ellman G., Courtney D., Andres V. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. // Biochem. Pharmacol. 1961. - V.7 - P.88-95.

83. Essler M., Amano M., Kruse H.-J., Kaibuchi K., Weber P.C. Aepfelbacher M. Thrombin Inactivates Myosin Light Chain Phosphatase via Rho and Its Target Rho Kinase in Human Endothelial Cells. // J. Biol. Chem. 1998. - V.273. - P.21867-21874.

84. Farkas E., de Jong G.I., de Vos R.A.I., Jansen Steur E.N.H., Luiten P.G.M. Pathological features of cerebral cortical capillaries are doubled in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. // Acta Neuropathol. (Berl). 2000. - V.100. - №4. - P.395-402.

85. Favaloro E.J., Browning Т., Facey D. CD13 (GP150; aminopeptidase-N): predominant functional activity in blood is localized to plasma and is not cell-surface associated. // Exp. Hematol. 1993. - V.21. - №13. - P.1695-1701.

86. Fenech M. The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. // Mutat. Res. 1997. - V.392. -№1-2. - P.l 1-18.

87. Ferrell J.E., Lee K.J., Huestis W.H. Membrane bilayer balance and erythrocyte shape: a quantitative assessment. // Biochemistry. 1985. - V.24. - №12. - P.2849-2857.113

88. Finney D.J. Probit analysis. // Cambridge: University Press, 1980. 333p.

89. Franconi F., Miceli M., De Montis M.G., Crisafi E.L., Bennardini F., Tagliamonte A. NMDA receptors play an anti-aggregating role in human platelets. // Thromb. Haemost. — 1996. V.76. - №1. - P.84-87.

90. Franconi F., Miceli M., Alberti L., Seghieri G., De Montis M.G., Tagliamonte A. Further insights into the anti-aggregating activity of NMDA in human platelets. // Br. J. Pharmacol. 1998. - V. 124. -№1. - P.35-40.

91. Frojmovic M.M., Milton J.G. Human platelet size, shape, and related functions in health and disease. // Physiolog. Rev. 1982. - V.62. - №1. - P. 185 - 261.

92. Furchgott R.F, Zawadzki J.V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. //Nature. 1980. - V. 288. - №5789. — P.373-376.

93. Furie В., Furie B. Thrombus formation in vivo. // J. Clin. Invest. 2005. - V.l 15. -№12. — P.3355-3362.

94. Galdal K.S. Thromboplastin Synthesis in Endothelial Cells. // Pathophysiol. Haemost. Thromb. 1984. - V.14. -P.378-385.

95. Garcia C.A., Ruiz R.S. Diabetes and the eye. // Clin. Symp. 1984. - V.36. - №4. -P.2-32.

96. Gedde M.M., Davis D.K., Huestis W.H. Cytoplasmic pH and human erythrocyte shape. // Biophys. J. 1997. - V.72. - №3. - P.1234-1246.

97. Geer C.B., Rus I.A., Lord S.T., Schoenfisch M.H. Surface-dependent fibrinopeptide A accessibility to thrombin. // Acta Biomater. 2007. - V.3. - №5. - P.663-668.

98. Giacobini E. Cholinesterases: new roles in brain function and in Alzheimer's disease. // Neurochem. Res. 2003. - V.28. - №3-4. - P.515-522.

99. Giangrande P.L. Six characters in search of an author: the history of the nomenclature ofcoagulation factors. // Br. J. Haematol. 2003. - V.121. - №5. - P.703-712.

100. Glynn P. Neural development and neurodegeneration: two faces of neuropathy target esterase. // Prog. Neurobiol. 2000. - V.61. - №1. - P.61-74.

101. Goncharov N.V., Radilov A.S., Mindukshev I.V., Yermolayeva Ye.Ye., Kuznetsov S.V., Glashkina L.M., Dobrylko I.A., Kuznetsov A.V. Effects of RVX Low Dose Chronic114

102. Exposure on Rat Platelet Aggregation and Physiology of Nerve Fibres. // In: Economy, Logistic, and Ecology in Armed Forces III. International Scientific Conference. Brno, 2003. - P.63-70.

103. Gupta M., Bagchi G., Bandyopadhyay S., Sasmal D., Chatterjee Т., Dey S.N. Hematological changes produced in mice by Nuvacron or Furadan. // Toxicology. 1982. -V.25. - №2-3. - P.255-260.

104. Gurwitz D., Cunningham D. D. Thrombin modulates and reverses neuroblastoma neurite outgrowth. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - V.85. - P.3440-3444.

105. Hallak M., Giacobini E. Relation of brain regional physostigmine concentration to cholinesterase activity and acetylcholine and choline levels in rat. // Neurochem. Res. -1986. V.l 1. - № 7. - P. 1037-1048.

106. Harpel P.C., Mosesson M.M. Degradation of human fibrinogen by plasma a2-macroglobulin-enzyme complexes. // J. Clin. Invest. 1973. - V.52. - P.2175-2184.

107. Heemskerk J.W.M., Bevers E.M., Lindhout T. Platelet activation and blood coagulation. // Thromb. Haemost. 2002. - V.88. - P. 186-193.

108. Hjort P.F., Hasselback R. A critical review of the evidence for a continous hemostasis in vivo. //Thromb. Diath. Haemorrh.- 1961,-V.15.-№6.-P.580-612.

109. Hoffman M., Monroe D.M. A cell-based model of hemostasis. // Thromb. Haemost. -2001.- V.85. -P.958-965.

110. Hoffman M., Monroe D.M., Roberts H.R. Cellular interactions in hemostasis. // Haemostasis. 1996. - V.26. - P.12-16.

111. Hsu S.H., Tsou T.C., Chiu S.J., Chao J.I. Inhibition of aIpha7-nicotinic acetylcholine receptor expression by arsenite in the vascular endothelial cells. // Toxicol. Lett. 2005. -V.159. — № 1. - P.47-59.

112. Hughes R.A., Gabriel C.M., Gregson N.A., Smith K.J. Treatment of inflammatory neuropathy. //Mult. Scler. 1997. - V.3. -№2. -P.88-92.115

113. Iwanaga S., Wallen P., Grondahl N.J., Henschen A., Blomback В. On the primary structure of human fibrinogen. Isolation and characterization of Nterminal fragments from plasmic digests. // Eur. J. Biochem. 1969. - V.8. - P. 189-199.

114. Jaiswal N., Lambrecht G., Mutschler E. et al. Pharmacological characterization of the vascular muscarinic receptors mediating relaxation and contraction in rabbit aorta. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991. - V.258. - № 3. - P.842-850.

115. Jamal G.A. Neurological syndromes of organophosphorus compounds. // Adverse Drug. React. Toxicol. Rev. 1997. - V.16. -№3. - P.133-170.

116. Jamieson G.A., Agrawal A.K., Greco N.J., Tenner Т.Е. Jr., Jones G.D. et al. Phencyclidine binds to blood platelets with high affinity and specifically inhibits their activation by adrenaline. // Biochem. J. 1992. - V.285 - №1. - P.35-39.

117. Jewell W.T., Miller M.G. Identification of a carboxylesterase as the major protein bound by molinate. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1998. -V.149. - №2. - P.226-234.

118. John S., Kale M., Rathore N., Bhatnagar D. Protective effect of vitamin E in dimethoate and malathion induced oxidative stress in rat erythrocytes. // J. Nutr. Biochem. — 2001. V.12. - №9. - P.500-504.

119. Johnson M.K. A phosphorylation site in brain and the delayed neurotoxic effect of some organophosphorus compounds. // Biochem. J. 1969a. -V.l 11. - P.487-495.

120. Johnson M.K. The delayed neurotoxic effect of some organophosphorus compounds. Identification of the phosphorylation site as an esterase. // Biochem. J. 1969b. - V.l 14 -P.711-717.

121. Johnson M.K. The primary biochemical lesion leading to the delayed neurotoxic effects of some organophosphorus esters. // J. Neurochem. 1974. - V.23. - №4. - P.785-789.

122. Johnson M.K. Improved assay of neurotoxic esterase for screening organophosphates for delayed neurotoxicity potential. //Arch. Toxicol. 1977. -V.37 - P.l 13-115.

123. Johnson M.K. Irreversible phosphorylation of brain neurotoxic esterase. The primary event leading to the delayed neuropathy caused by some organophosphorus esters. // Monogr. Neural. Sci. 1980.-V.7.-P.99-105.

124. Johnson M.K. The target for initiation of delayed neuroxicity by organophosphorus esters: biochemical studies and toxicological applications. // In: Reviews in Biochemical116

125. Toxicology. (Ed. by E. Hodgson, J.R. Bend, R.M. Philpot), Elsevier, Amsterdam, New York, 1982-P.141—212.

126. Joiner C.H., Franco R.S., Jiang M., Franco M.S., Barker J.E., Lux S.E. Increased cation permeability in mutant mouse red blood cells with defective membrane skeletons. // Blood. 1995. - V.86. -№11.- P.4307-4314.

127. Kanda Т., Iwasaki Т., Mizusawa H. Glycosphingolipid antibodies and blood-nerve barrier in autoimmune demyelinative neuropathy. // Neurology. 2000. - V.54. - №7. -P. 1459-1464.

128. Kawashima K., Fujii T. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: overview of non-neuronal cholinergic systems and their biological significance. // J. Pharmacol. Sci. 2008. - V. 106. - P. 167-173.

129. Kikuchi H., Y.Suzuki and Y.Hashimoto. Increase of beta-glucuronidase activity in the serum of rats administered organophosphate and carbamate insecticides. // J. Toxicol. Sci. 1981.- V.6.-P.27-35.

130. Kirkpatrick C.J., Bittinger F., Unger R.E. The non-neuronal cholinergic system in the endothelium: evidence and possible pathobiological significance. // Jpn. J. Pharmacol. -2001. V.85. - № 1. - P.24-28.

131. Kirkpatrick C.J., Bittinger F., Nozadze K., Wessler I. Expression and function of the nonneuronal cholinergic system in endothelial cells. // Life Sci. 2003. - V.72. - №.18-19. -P.2111-2116.

132. Klaidman L.K., Adams J.D. Jr., Cross R., Pazdernik T.L., Samson F. Alterations in brain glutathione homeostasis induced by the nerve gas soman. // Neurotox. Res. — 2003. — V.5. — №3. P. 177-182.

133. Krishnasamy S., Gross N.J., Teng A.L., Schultz R.M., Dhand R. Lung «surfactant convertase» is a member of the carboxylesterase family. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. -V.235. — P.180-184.

134. Lacy F., Gough D.A., Schmid-Schonbein G.W. Role of xanthine oxidase in hydrogen peroxide production. // Free Radic. Biol. Med. 1998. - V.25. - №6. - P.720-727.

135. Lalu K., Lampelo S., Vanha-Perttula T. Characterization of three aminopeptidases purified from maternal serum. // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - V.873. - №2. - P.190-197.

136. Lane R.M., Potkin S.G., Enz A. Targeting acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in dementia. // Int. J. Neuropsychopharmacol. — 2006. V.9. - №1. -P.101-124.

137. Lang F., Lang K., Lang P., Huber S., Wieder T. Osmotic shock-induced suicidal death of erythrocytes. // Acta. Physiol. (Oxf). 2006. - V.187. - №1-2. - P. 191-198.

138. Lang K., Duranton C., Poehlmann H., Myssina S., Bauer C., Lang F., Wieder T. and Huber S. Cation channels trigger apoptotic death of erythrocytes. // Cell. Death. Differ. -2003. — №10. -P.249-256.

139. Lang K., Myssina S., Brand V., Sandu C., Lang P., Berchtold S., Huber S., Lang F. and Wieder T. Involvement of ceramide in hyperosmotic shockinduced death of erythrocytes. // Cell. Death. Differ. 2004. - №11. - P.231-243.

140. Lang K., Lang P. Bauer C., Duranton C., Wieder Т., Huber S., Lang F. Mechanisms of suicidal erythrocyte death. // Cell. Physiol. Biochem. 2005. - V.l 5. - №5. - P. 195-202.

141. Lang P., Kaiser S., Myssina S., Wieder Т., Lang F., Huber S. Role of Ca2+-activated K+ channels in human erythrocyte apoptosis. // Am. J. Physiol. Cell. Physiol. — 2003. -V.285. — P.1553-1560.

142. Lang P., Kempe D., Myssina S., Tanneur V., Birka C., Laufer S., Lang F., Wieder Т., Huber S. PGE(2) in the regulation of programmed erythrocyte death. // Cell. Death. Differ. -2005. V.12. — №5. — P.415-428.

143. Lee M J., Clement J.G. Effects of soman poisoning on hematology and coagulation parameters and serum biochemistry in rabbits. // Military medicine. 1990. - V.l55. - №6. - P.244-249.

144. Levin E.G., Marzec U., Anderson J., Harker L.A. Thrombin stimulates tissue plasminogen activator release from cultured human endothelial cells. // J. Clin. Invest. -1984. V.74. - №6. - P. 1988-1995.

145. Li В., Sedlacek M., Manoharan I. Butyrylcholinesterase, paraoxonase and albumin esterase, but not carboxylesterase, are present in human plasma. // Biochem. Pharmacol. — 2005. V.70. - №11. - P.1673-1684.

146. Lincoln T.M., Cornwell T.L. Intracellular cyclic GMP receptor protein. // FASEB J.- 1993. — V.7. P.328-338.

147. Lip G.Y.H., Blann A. Review von Willebrand factor: a marker of endothelial dysfunction in vascular disorders? // Cardiovascular Research. 1997. - V.34. - P.255-265.

148. Liu L., Choi H., Bernardo A., Bergeron A.L., Nolasco L., Ruan C., Moake J.L., Dong J.-F. Platelet-derived VWF-cleaving metalloprotease ADAMTS-13. // J. Thromb. Haemost. 2005. - V.3. - P.2536-2544.

149. Look A.T., Ashmun R.A., Shapiro L.H., Peiper S.C. Human myeloid plasma membrane glycoprotein CD13 (gpl50) is identical to aminopeptidase N. // J. Clin. Invest. -1989. V.83. - №4. - P.1299-1307.

150. Lorenzet R., Sobel J.H., Bini A., Witte L.D. Low molecular weight fibrinogen degradation products stimulate the release of growth factors from endothelial cells. // Thromb. Haemost. 1992. - V.68. - P.357-363.

151. Lotti M. Organophosphate-induced delayed polyneuropathy in humans: perspectives for biomonitoring. // Trends. Pharmacol. Sci. 1987. - V.8. - P. 175-176.

152. Lotti M. The pathogenesis of organophosphate neuropathy. // Crit. Rev. Toxicol. -1992. — V.21. — P.465-487.

153. Lotti M. Cholinesterase inhibition: complexities in interpretation. // Clin. Chem. -1995. — V.41. P. 1814-1818.

154. Lotti M. Organophosphorus compounds. // In: Experimental and Clinical Neurotoxicology. (Ed. by Spencer P.S, Schaumburg H.H, Ludolph A.C.). Oxford: Oxford University Press, 2000. - P.898-925.

155. Lotti M. Clinical toxicology of anticholinesterase agents in humans. // In: Handbook of Pesticide Toxicology. San Diego: Academic Press, 2001. - P. 1043-1085.

156. Low P.A. Endoneurial fluid pressure and microenvironment of nerv. // In: Peripheral Neuropathy (Ed. by Dyck P.J.) WB Saunders, Philadelphia, 1984. - P.599-617.

157. Lux S.E., John K.M., Kopito R.R., Lodish H.F. Cloning and characterization of band 3, the human erythrocyte anion-exchange protein (AE1). // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989. V.86. - №23. - P.9089-9093.

158. Lwaleed B.A., Bass P.S. Tissue factor pathway inhibitor: Structure, biology and involvement in disease. // J. Pathol. 2006. - V.208. - №3. - P,327-339.

159. Lyberg T. Clinical Significance of Increased Thromboplastin Activity on the Monocyte Surface A Brief Review. // Haemostasis. - 1984. - V.14. - P.393-399.

160. MacFarlane R.G. An enzyme cascade in the blood clotting mechanism and its function as a biochemical amplifier. // Nature. 1964. - V.202. - P.498-499.

161. Mack A., Robitzki A. The key role of butyrylcholinesterase during neurogenesis and neural disorders: an antisense-5'butyrylcholinesterase-DNA study. // Prog. Neurobiol.2000. V.60. - №6. - P.607-628.

162. Mahaut-Smith M.P., Sage S.O., Rink T.J. Rapid ADP-evoked currents in human platelets recorded with the nystatin permeabilized patch technique. // J. Biol. Chem. — 1992.1. V.267. — P.3060-3065.

163. Mahaut-Smith M.P., Ennion S.J., Rolf M.G., Evans R.J. ADP is not an agonist at P2X(1) receptors: evidence for separate receptors stimulated by ATP and ADP on human platelets. // Br. J. Pharmacol. 2000. - V. 131. - № 1. - P. 108-114.

164. Malik R.A. Masson E.A., Sharma A.K., Lye R.H., Ah-See A.K. et al. Hypoxic neuropathy: relevance to human diabetic neuropathy. // Diabetologia. — 1990. — V.33. — №5.1. P.311-318.

165. Mannucci P.M., Canciani M.T., Forza I., Lussana F., Lattuada A., Rossi E. Changes in health and disease of the metalloprotease that cleaves von Willebrand factor. // Blood.2001. V.98. - P.2730-2735.

166. Maroni M., Bleecker M.L. Neuropathy target esterase in humanlymphocytes and platelets. // J. Appl. Toxicol. 1986. - V.6. - P. 1-7.

167. Maroni M., Colosio C., Ferioli A., Fait A. Biological monitoring of pesticide exposure: a review. // Toxicology. 2000. - №143. - P.5-118.

168. McMullin M.F., Percy M.J. Erythropoietin receptor and hematological disease. // Am. J. Hematol. 1999. - V.60. - №1. - P.55-60.

169. Means G. E., Bender M.L. Acetylation of human serum albumin by p-nitrophenyl acetate. // Biochemistry. 1975. - V.14. - P.4989-4994.

170. Medda S., Swank R.T. Egasyn, a protein which determines the subcellular distribution of beta-glucuronidase, has esterase activity. // J. Biol. Chem. — 1985. — V.260. -№29.-P. 15802-15808.

171. Michiels C. Endothelial cell functions. // J. Cell. Physiol. 2003. - V.196. - №3. -P.430-443.

172. Mina-Osorio P., Winnicka В., O'Conor C„ Grant C.L., Vogel L.K., Rodriguez-Pinto

173. D., Holmes K.V., Ortega E., Shapiro L.H. CD13 is a novel mediator of monocytic/endothelial cell adhesion. // J. Leukoc. Biol. 2008. - V.84. - №2. - P.448-459.

174. Mindukshev I.V., Krivoshlyk V.V., Ermolaeva E.E., Dobrylko I.A., Senchenkov

175. E.V., Goncharov N.V., Jenkins R.O., Krivchenko A.I. Necrotic and apoptotic volume changes of red blood cells investigated by low-angle light scattering technique. // Spectroscopy Int. J. 2007. - V.21. - №2. - P. 105-120.

176. Moore D. Low dose exposure to nerve agent. Long term health effects of nerve agent exposure // Rep. 1 symp. chem. and biological medical treatment. — Cairo, 1997. — Suppl. — P.34.

177. Morris M.B., Lux S.E. Characterization of the binary interaction between human erythrocyte protein 4.1 and actin. // Eur. J. Biochem. 1995. - V.231. - №3. - P.644-650.

178. Murachi T. A general reaction of diisopropylphosphorofluoridate with proteins without direct effect on enzymatic activities. // Biochim. Biophys. Acta. 1963. - V.71. -P.239-241.

179. Myers R.R. Powell H.C., Shapiro H.M., Costello M.L., Lampert P.W. Changes in endoneurial fluid pressure, permeability, and peripheral nerve ultrastructure in experimental lead neuropathy. //Ann. Neurol. 1980. - V.8. -P.392-401.

180. Nachmias V.T. Cytoskeleton of human platelets at rest and after spreading. // J.Cell. Biol. 1980. - V.86. - P.795-802.

181. Namba Т., Nolte C.T., Jackrel J., Grob D. Poisoning due to organophosphate insecticides. Acute and chronic manifestations. // Am. J. Med. 1971. - V.50. - 4. - P.475-492.

182. Norenberg M.D. A Hypothesis of Osmotic Endothelial Injury. A Pathogenetic Mechanism in Central Pontine Myelinolysis. // Arch. Neurol. 1983. - V.40. - P.66-69.

183. Nossel H.L., Yudelman I., Caned R.E., Bumz V.P., Spanondis K., Wimm G.D., Qumeas G.D. Measurement of Fibrinopeptide A in Human Blood. // J. Clin. Invest. 1974. - V.54.-P.43-53.

184. O'Neill J.J. Non-cholinesterase effects of anticholinesterases. // Fundam. Appl. Toxicol. 1981.-V.l.-P. 154-160.

185. Odman S., Levitan H., Robinson P.J. Peripheral nerve as an osmometer: role of endoneural capillaries in frog sciatic nerve. // Am. J. Physiol. 1987. - V.25. - P.335-341.

186. Olsson Y. Vascular permeability in the peripheral nervous system. // In: Peripheral Neuropathy (Ed. By Dyck P.J.) WB Saunders, Philadelphia, 1984. - P. 579-597.

187. Orlowski M., Sessa G., Green J.P. Gamma-glutamyl transpeptidase in brain capillaries: possible site of a blood-brain barrier for amino acids. // Science. 1974. -V.l84. -№132. — P.66-68.

188. Owen W.G., Esmon С.Т. Functional properties of an endothelial cell cofactor for thrombin-catalyzed activation of protein C. // J. Biol. Chem. 1981. - V.256. - P.5532-5535.

189. Padilla S, Wilson V.A, Bushnell P.J. Studies on the correlation between blood cholinesterase inhibition and target tissue inhibition in pesticide-treated rats. // Toxicology. 1994.-V.92-P. 11-25.

190. Palmer R.M., Ferrige A.G., Moncada S. Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. //Nature. 1987. — V.327. - № 6122. - P.524-526.

191. Palmieri F.E., Bausback H.H., Ward P.E. Metabolism of vasoactive peptides by vascular endothelium and smooth muscle aminopeptidase M. // Biochem. Pharmacol. -1989. V.38. -№1. - P.173-180.

192. Parnavelas J.G., Kelly W., Burnstock G. Ultrastructural localization of choline acetyltransferase in vascular endothelial cells in rat brain. // Nature. 1985. - V.316. -№6030. - P.724-725.

193. Peeples E.S., Schopfer L.M., Duysen E.G., Spaulding R., Voelker Т., Thompson C.M., Lockridge O. Albumin, a new biomarker of organophosphorus toxicant exposure, identified by mass spectrometry. // Toxicol. Sci. 2005. - V.83. - №2. - P.303-312.

194. Peerschke E.I., Ghebrehiwet B. Platelet interactions with Clq in whole blood and in the presence of immune complexes or aggregated IgG. // Clin. Immunol. Immunopathol. -1992. V.63. - №1. - P.45-50.

195. Peerschke E.I., Ghebrehiwet B. Clq augments platelet activation in response to aggregated Ig. // J. Immunol. 1997. -V. 159. -№11.- P.5594-5598.

196. Peerschke E.I., Ghebrehiwet B. Platelet receptors for the complement component Clq: implications for hemostasis and thrombosis. // Immunobiology. 1998. — V.199. -№2. - P.239-249.

197. Phan S.H., Gannon D.E., Varani J., Ryan U.S., Ward P.A. Xanthine oxidase activity in rat pulmonary artery endothelial cells and its alteration by activated neutrophils. // Am. J. Pathol. 1989. - V. 134. - №6. - P. 1201 -1211.

198. Pisano J.J., Finlayson J.S., Peyton M.P. Cross-link in fibrin polymerized by factor 13: epsilon-(gamma-glutamyl)lysine. // Science. 1968. - V.160. - №830. -P.892-893.

199. Pohlman Т.Н., Harlan J.M. Adaptive responses of the endothelium to stress. // J. Surg. Res. 2000. - V.89. - №1. - P.85-119.

200. Pope C.N. Organophosphorous pesticides: Do they all have the same mechanism of toxicity? Hi. Toxicol. Environ. Health. В Crit. Rev. 1999. - V.2. - P. 161-181.

201. Pope C., Karanth S., Liu J. Pharmacology and toxicology of cholinesterase inhibitors: uses and misuses of a common mechanism of action. // Environ. Toxicol. Pharmacol. -2005. -V. 19. №3. - P.433-446.

202. Poulsen E., Aldridge W.N. Studies on esterases in the chicken central nervous system.//Biochem. J. 1964. - V.90.-№3. - P. 182-189.

203. Prall Y.G., Gambhir K.K., Ampy F.R. Acetylcholinesterase: an enzymatic marker of human red blood cell aging. // Life Sci. 1998. - V.63. -№3. - P. 177-184.

204. Quistad G.B., Klintenberg R., Casida J.E. Blood acylpeptide hydrolase activity is a sensitive marker for exposure to some organophosphate toxicants. // Toxicol. Sci. 2005. — V.86. - №2. - P.291-299.

205. Ray D.E., Richards P.G. The potential for toxic effects of chronic low-dose exposure to organophosphates. //Toxicol. Lett.-2001.-V.120. -P.343-351.

206. Ray D.E. Organophosphorous esters: An evaluation of chronic neurotoxic effects. // Leicester, 1998. -p.62.

207. Richards P.G., Johnson M.K., Ray D.E. Identification of acylpeptide hydrolase as a sensitive site for reaction with organophosphorus compounds and a potential target for cognitive enhancing drugs. // Mol. Pharmacol. 2000. - V.58. - P.577-583.

208. Rink T.J., Smith S.W., Tsien R.Y. Cytoplasmic free Ca2+ in human platelets: Ca2+ thresholds and Ca-independent activation for shape change and secretion. // FEBS Lett. -1982. V.148. -P.21-26.

209. Roeschlau P., Bernt P., Gruber W. Enzymatic determination of total cholesterol in serum.//J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1974.-V. 12-P.457-464.

210. Ruttmann E., Brant L.J., Concin H., Diem G., Rapp K., Ulmer H. Gamma-Glutamyltransferase as a Risk Factor for Cardiovascular Disease Mortality. // Circulation. -2005. V.l 12. - P.2130-2137.

211. Saida K., Kawakami H., Ohta M., Iwamura K. Coagulation and vascular abnormalities in Crow-Fukase syndrome. // Muscle Nerve. 1997. - V.20. - №4. - P.486-492.

212. Santos S.C., Vala I., Miguel C. Expression and subcellular localization of a novel nuclear acetylcholinesterase protein. // J. Biol. Chem. 2007. - V.282. - № 35. - P.25597-25603.

213. Scrutton M.C. The platelet as Ca2+-driven cell: Mechanisms which may modulate Ca2+-driven responses. Mechanisms of platelet activation and control. // New York: Plenum Press, 1993.-P.1-15.

214. Sedgwick E.M, Sananayake N. Pathophysiology of the intermediate syndrome of organophosphorus poisoning. // J Neurol. Neurosurg. Psychiatry 1997. - V.62 - P.201-202.

215. Seigneur M., Dufourcq P., Conri C. Plasma thrombomodulin: new approach of endothelium damage. // Int. Angiol. 1993. - V.12. - P.355-359.

216. Senanayke N., Karalliedde L. Neurotoxic effects of organophosphorus insecticides: an intermediate syndrome. //N. Engl. J. Med. 1987. - V.316. - P.761-763.

217. Shimada K., Ozawa T. Release of heparan sulfate proteo glycans from cultured aortic endothelial cells by thrombin. // Thromb. Res. 1985. - V.39. - P.387-397.

218. Siess W. Molecular mechanisms of platelet activation. // Physiol. Rev. — 1989. -V.69. — № 1.-P.58-178.

219. Silveira C.L., Eldefrawi A.T., Eldefrawi M.E. Putative M2 muscarinic receptors of rat heart have high affinity for organophosphorus anticholinesterases. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1990. - V.l 03. - P.474-481.

220. Simeon-Rudolf V., Reiner E., Evans R.T. Reversible inhibition of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase by 4,4'-bipyridine and by a coumarin derivative. // Chem.-Biol. Interact. 1999. - V.l 19-120. - P.165-171.

221. Small D.H., Michaelson S., Sberna G. Non-classical actions of cholinesterases: role in cellular differentiation, tumorigenesis and Alzheimer's disease. //Neurochem. Int. 1996. - V.28. - № 5-6. - P.453-483.

222. Snawder J.E., Chambers J.E. Osteolattyrogenic effects of malathion in Xenopus embryos. // Toxicol. Appl. Pharmacol. -1993. V.212. -P.210-216.

223. Spater H.W., Poruchynsky M.S., Quintana N., Inoue M., Novikoff A.B. Immunocytochemical localization of gamma-glutamyltransferase in rat kidney with protein A-horseradish peroxidase. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. - V.79. -№11.- P.3547-3550.

224. Sporn L.A., Marder V.J., Wagner D.D. Inducible secretion of large, biologically potent vWf multimers. // Cell. 1986. -V.46. - P.l85-190.

225. Spycher M.O., Nydegger U.E. Participation of the Blood Platelet in Immune Reactions Due to Platelet-Complement Interaction. // Infusionsther. Transfusionsmed. — 1995. V.22. — N.l. — P.36-43.

226. Suidan H.S., Stone S., Hemmings В., Monard D. Thrombin causes neurite retraction in neuronal cells through activation of cell surface receptors. // Neuron. 1992. — V.8. — P.363-375.

227. Suidan H.S., Nobes C.D., Hall A., Monard D. Astrocyte spreading in response to thrombin and lysophosphatidic acid is dependent on the Rho GTPase. // Glia. 1997. -V.21. —P.244-252.

228. Szasz G. A Kinetic Photometric Method for Serum y-GIutamyl Transpeptidase. // Clinical Chemistry. 1969. - V. 15. - P. 124-136.

229. Talke H., Schubert G.E. Enzymatic urea determination in the blood and serum in the Warburg optical test. Article in German. // Klin. Wochenschr. 1965. - V.43. - №1. -P.174-175.

230. Tervo T. Histochemical demonstration of cholinesterase activity in the cornea of the rat and the effect of various denervations on the corneal nerves. // Histochemistry. — 1976. -V.47. — № 2. P. 133-143.

231. Tildon J.T., Ogilvie J.W. The Esterase Activity of Bovine Mercaptalbumin. The reaction of the protein with p-nitrophenyl acetate. // J. Biol. Chem. 1972. - V.247. -P.1265-1271.

232. Trinder P. Determination of glucose in blood using glucose oxidase with an alternative oxygen acceptor. // Ann. Clin. Biochem. 1969. - V.6. - P.24-25.

233. Tunek A., Hjertberg E., Mogensen J.V. Interactions of bambuterol with human serum cholinesterase of the genotypes EuEu (normal), EaEa (atypical) and EuEa. // Biochem. Pharmacol. 1991. - V.41. - 3. - P.345-348.

234. Uchiyama Т., Matsumoto M., Kobayashi N. Studies on the pathogenesis of coagulopathy in patients with arterial thromboembolism and malignancy. // Thromb. Res. -1990. V.59. - P.955-965.

235. Uemura M., Tatsumi K., Matsumoto M., Fujimoto M., Matsuyama Т., Ishikawa M., Iwamoto Т., Mori Т., Wanaka A., Fukui H., Fujimura Y. Localization of ADAMTS13 to the stellate cells of human liver. // Blood. 2005. - V. 106. - P.922-924. /

236. Van Hinsbergh V.W.M., Sprengers E.D., Kooistra T. Effect of thrombin on the production of plasminogen activators and PA inhibitor-1 by human foreskin microvascular endothelial cells. // Thromb. Haemost. 1987. - V.57. - №2. - P. 148-153.

237. Van Rhijn I., Van den Berg L.H., Bosboom W.M.J., Otten H.G. and Logtenberg T. Expression of accessory molecules for T-cell activation in peripheral nerve of patients with CIDP and vasculitic neuropathy // Brain. 2000. - V.123 - №10. - P.2020-2029.

238. Vane J.R., Anggard E.E., Batting R.M. Regulatory functions of the vascular endotnelium. //New Engl. J. Med. 1990. - V.323. - P.27-36.

239. Von Kaulla K., Holmes J.H. Changes following anticholinesterase exposures. Blood coagulation studies. // Arch. Environ. Health. 1961. - V.2. - P. 168-177.

240. Wada H., Ksneko Т., Ohiwa M. Increased levels of vascular endothelial cell markers in thrombotic thrombocytopenic purpura. // Am. J. Hematol. 1993. - V.44. - P.101-105.

241. Wagner D.D. Cell biology of von Willebrand factor. // Annu. Rev. Cell. Biol. -1990.-V.6.-P.217-246.

242. Wahlefeld A.W. Methods of enzymatic analysis. // Academic Press, 1974.

243. Walker C.H. The classification of esterases which hydrolyse organophosphates: recent developments. // Chem. Biol. Interact. 1993. - V.87. - №1-3. - P. 17-24.

244. Walsh P.N. Factor XI. // In: Hemostasis and thrombosis: basic principles and clinical practice (Ed. by Colman R.W., Hirsh J., Marder V.J.), 4th ed., Ch.ll. Philadelphia: Lippincott, Williams and Wilkins, 2001. P.l 91-202.

245. Wang L., Ostberg O., Wihlborg A., Brogren H., Jem S., Erlinge D. Quantification of ADP and ATP receptor expression in human platelets. // J. Thromb. Haemost. 2003. -V.l. — №2. — P.330-336.

246. Weiss P., Wang H., Taylor C., Edds M.J.Jr. Proximo-distal fluid convection in the endoneurial spaces of peripheral nerves, demonstated by colored radioactive (isotope) tracers. // Am. J. Physiol. 1945. - V.143. - P.521 -540.

247. Weksler B.B., Ley C.W., Jaffe E.A. Stimulation of Endothelial Cell Prostacyclin Production by Thrombin, Trypsin and the Ionophore A 23187. // J. Clin. Invest. 1978. -V.62. - P.923-930.

248. Winrow C.J., Hemming M.L., Allen D.M., Quistad G.B., Casida J.E., Barlow C. Loss of neuropathy target esterase in mice links organophosphate exposure to hyperactivity. //Nat. Genet. 2003. - V.33. -№4. - P.477-485.

249. Worek F., Koller M., Thiermann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning. // Toxicology. 2005. - V.214. - P.182-189.

250. Wright I.S. The nomenclature of blood clotting factors. // Can. Med. Assoc. J. -1962. V.86. - №8. - P.373-374.

251. Yachie A., Niida Y., Wada Т., Igarashi N., Kaneda H., Toma Т., Ohta K., Kasahara Y., Koizumi S. Oxidative stress causes enhanced endothelial cell injury in human heme oxygenase-1 deficiency. // J. Clin. Invest. 1999. - V. 103. - №1. - P. 129-135.

252. Yuan Y., Bergmann M., Gerfelmeyer G., Kuchelmeister K. Giant axonal neuropathy. A case report. Article in German.//Pathologe. 1996. - V.17.-№3. - P.213-218.

253. Zeiher A.M., Drexler H., Saurbier В., Just H. Endothelium-mediated coronary blood flow modulation in humans. Effects of age, atherosclerosis, hypercholesterolemia, and hypertension. // J. Clin. Invest. 1993. - V.92. - №2. - P.652-662.

254. Zhang S.C., Schultz D., Ryan U. Receptor-mediated binding of Clq on pulmonary endothelial cells. // Tissue and Cell. 1986. - V.18. -№1. - P. 13-18.

255. Zheng X.L., Sadler J.E. Pathogenesis of Thrombotic Microangiopathies. // Annu. Rev. Pathol. 2008. - V.3. - P.249-277.

256. Zhou J.F., Xu G.B., Fang W.J. Relationship between acute organophosphorus pesticide poisoning and damages induced by free radicals. // Biomed. Environ. Sci. 2002.1. V.15. — №2. -P.177-186.

257. Ziemen M. Platelet function and coagulation disorders in organophosphate intoxication. Article in German. // Klin. Wochenschr. 1984a. - V.62. - №17. - P.814-820.

258. Ziemen M. Thrombocyte function and plasma coagulation following poisoning with organophosphates. Article in German. // Klin. Wochenschr. 1984b. - V.62. - №17. -P.814-820.

Информация о работе

Войтенко, Наталья Геннадьевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Гемостаз и эстеразная активность крови крыс при интоксикации фосфорорганическими отравляющими веществами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы