Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные взаимодействия белка NusG из Escherichia coli с компонентами транскрипционного комплекса

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональные взаимодействия белка NusG из Escherichia coli с компонентами транскрипционного комплекса"

РГ Б ОД 1 о АПР 19S5

На правах рукописи

БУРОВА Елена Игоревна

Функциональные взаимодействия белка NusG из Escherichia coli с компонентами транскрипционного комплекса

03.00.03 - Молекулярная биология.

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-1995

Работа выполнена б Интитуте молекулярной генетики РЛН(г.Москва) и в Институте рака Колумбийского университетаСг.Нью-Йорк,США).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук Л.Л.Александров

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук С.В.Машко, Кандидат биологических наук Г.Я.Холодий.

Ведущая организация:

Институт биоорганической химии им.М.В.Шемякина Российской академии наук.

Защита состоится 99Ьг. в часов на заседании

диссертационного совета Д09О.12.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов(Москиа,ПЗЬ41>,1-й Дорожный проезд,д.I).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке "ПМ;1 генетики и селекции промышленных микроорганизмов".

Автореферат разослан 1995г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В. 1». Щербакова

Общая характеристика работы.

Актуальность темы. Механизмы, регулирующие экспрессию генетической информации, действуют на многих этапах , ведущих от ДНК к получению белка. Одним из способов регуляции экспрессии геноо как у прокариот, так и у эукариот является модуляция терминации транскрипции. Эффективность модуляции определяется последовательностью нуклеиновой кислоты и белковыми факторами, которые взаимодействуют с этой последовательностью, с РНК-полимеразой и между собой.

Наиболее хорошо охарактеризованным примером такой регуляции является система N-антитерминации в бактериофаге \ . В этом процессе участвуют клеточные факторы, и один из них, NusG, был очищен как фактор, необходимый длл процессивной N-антитерминации in vitro. Генетически nusG был идентифицирован посредством мутации nusG4, которая супрессирует мутацию nusAI для XN-антитерминации. Недавние исследования предполагают, что NusG является также фактором, необходимым для Rho-зависимой терминации в Е. coli. Показано участие белка NusG в процессе терминации, осуществляемой Nun-белком фага НК022; эта система является примером фактор-зависимой терминации.

' Хотя продемонстрировано физическое взаимодействие белка NusG как с Rho-белком, так и с РНК-полимеразой, механизм действия NusG и его роль в процессах.терминации и антитерминации остаются неясными. Для изучения функционирования белка NusG in vivo нами был выбран следующий подход: изменять внутриклеточную концентрацию NusG либо путем деплсции, либо суперэкспрессируя NusG в клетке с целью проследить, как изменение концентрации NusG влияет на процессы элонгации, терминации и антитерминации транскрипции.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы было изучение роли и механизма действия белка NusG из Е. coli в процессах транскрипционной элонгации, терминации и антитерминации.

Экспериментальные задачи исследования заключались в следующем'

1. Изучить влияние белка NusG на элонгацию транскрипции in vivo и in

vitro.

2. Охарактеризовать in vivo взаимодействие NusG с другими белками транскрипционного комплекса.

3. Исследовать, является ли NusG необходимым фактором XN-зависимой антитерминации in vivo.

4. Локализовать участки белка NusG, необходимые для функционирования в Nun-зависимой терминации.

Научная новизна и практическая'ценность работы. В данной работе впервые продемонстрировано, что in vivo NusG участвует в процессе элонгации транскрипции и является фактором, стимулирующим элонгацию. Эффект стимуляции элонгации транскрипции белком NusG воспроизведен т viUo и является следствием супрессии пауз транскрипции белком NusG. Показано, что действие NusG на эло.:гацию и терминацию транскрипции не описывается моделью кинетического сопряжения этих двух процессов. Данные по эффекту

с

суперэкспрессии NusG на терминацию свидетельствуют об участии NusG в Rho-зависимой, но не в Rho-независимой терминации, и о непосредственном взаимодействии Rho и NusG. Впервые показано, что Rho-зависимая терминации в мутанте по Rho-фактору rlto026, может происходить в отсутствие NusG, хотя и с пониженной эффективностью. В экспериментах по деплеции NusG показано, что этот Оелок является необходимым фактором процесса XN-антитерминации на Rho-зависимом терминаторе. Впервые отобраны мутанты NusG, нарушающие его функционирование в Nun-терминационном комплексе и показана специфичность этих мутаций.

Результаты данной работы свидетельствуют о важной структурной и функциональной роли белка NusG в элонгационном комплексе Е. coli, модулирующем терминацию и анттерминацию транскрипции.

Система XN-антитерминации Е. coli на настоящий момент служит хорошей моделью для изучения механизма регуляции транскрипции в инфекционном цикле развития вируса ВИЧ-1 и в других эукариотических системах.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде докладов на международных конференциях "Лостинициационные функции РНК-полимеразы" (Маунтайн Лэйк, США, 1992), "Молекулярная генетика бактерий и фагов" (Колд Спринг Харбор, США, 1993) и "Молекулярная генетика бактерий и фагов" (Висконсин, США, 1994).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты исследования, Обсуждение результатов, Выводы. Диссертация изложена на 139 страницах машинописного текста, включая 6 таблиц и 19 рисунков. Библиография включает в себя 167 названий.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Ei работе использованы бактериальные штаммы и плазмиды из коллекции лаборатории М. Готтесмана (Колумбийский университет, США). Для экспериментов по суперэкспрессии NusG были сконструированы плазмиды pLB11, pLB14 и pLB16, экспрессирующие NusG. В плазмиде pLB11 экспрессия NusG индуцируется с pL промотора при 42°С и летальна для клеток. В плазмиде pLB14 экспрессия NusG происходит с ptre промотора и не летальна при 42°С.

В экспериментах по деплеции NusG использовали условно-летальный по NusG штамм. Для создания такого штамма клетки трансформировали плазмидой с температурочувствительным репликоном, несущей ген nusG. Хромосомную копию nusG инактивировали. При сдвиге на непермиссивную температуру белок NusG деплецируется по мере деления клеток (Sullivan and Gottesman, 1992).

Эффективность терминации или антитерминации на данном терминаторе определяли, используя хромосомные конструкции, в которых уровень экспрессии гена lacZили galK зависит от эффективности работы терминатора, стоящего между промотором и геном. Активность |Ьгалактозидазы определяли

по методике, описаной в Miller, 1992. Экспрессию до/А'измеряли по Adhya and Miller, 1979.

Для оценки скорости элонгации РНК-полимеразы in vivo измеряли первоначальную кинетику появления в клетке [i-галактозидаэной активности после индукции гена lacZс помощью ИПТГ (Kepes, 1969).

Для получения мутаций о nusG применяли метод PCR с использованием Taq ДНК-полимеразы (Zhou et al., 1991).

Определение последовательностей ДНК проводили на автоматическом секвенаторе фирмы "Beckmann" с использованием флуоресцентных меток по модифицированному методу (Sanger, 1977).

Результаты и обсуждение

Глава 1. Белок NusG стимулирует скорость элонгации транскрипции как in vivo, так и in vitro.

1_J_. .Деплеция_Ми5С_.замедляет.элонгациютранскрипции. Недавно была предложена модель, согласно которой эффективность Rho-зависимой терминации обратно пропорциональна скорости элонгации транскрипции РНК-полимеразой (Jin et al., 1992). Модель основана на изучении мутантов РНК-полимеразы, изменяющих скорость элонгации. Показано, что в мутантах с замедленной элонгацией эффективность Rho-зависимой терминации повышена, и наоборот. Модель предполагает наличие кинетического соответствия между действием Rho-фактора на РНК и движением РНК-полимеразы по матрице.

Известно, что NusG стимулирует Rho-зависимую терминацию in vivo (Sullivan and Gottesman, 1992). Мы решили проверить, езязан ли этот эффект NusG с замедлением скорости элонгации в соответствии с.вышеизложеной моделью. Скорость роста цепи РНК можно оценить по времени, необходимому для синтеза (î-галактозидазы после индукции гена lacZc помощью ИПТГ (Kepes, 1969). Мы использовали этот метод для сравнения скорости роста цепей РНК в клетках штамма SS287, из которых деплецировали NusG в течение 2.5 часов, и в контрольном штамма SS294, конститутивно экспрессирующем NusG (см. рис.1). Интервал времени, необходимый для появления в клетке |!-галактозидазной активности, на 30% больше для штамма с деплецированным NusG, чем для nusG+ штамма. Эффект деплеции NusG на элонгацию транскрипции очевиден: скорость элонгации снижена в клетках с уменьшенным содержанием NusG. Такой вывод справедлив при предположении, что NusG не влияет на скорость трансляции. Скорость накопления фермента одинакова в обоих штаммах, что подтверждает правильность этого предположения. Таким образом, эффект NusG на скорость элонгации противоположен ожидаемому: NusG стимулирует элонгацию транскрипции. Поскольку он стимулирует также и терминацию, эффект NusG не укладываете*. в рамки модели кинетического сопряжения элонгации и терминации (Jin etat., 1992).

14

o pSSl19 . pSSl20

>

10

и го

то 8 ?

^ с

< ь

G

4

2

Ol

i-«-.-,-,-1-.-1---

2 4 6 8 10

О

Time (min) after induction with IPTG

Рисунок 1. Влияние деплеции NusG на начальную кинетику индукции ß-галактозидазы.

Активность /1-галактозидазы отложена в координатах: по оси ординат- (Aß)™, по оси абсцисс-время взятия образца, Т. А/!-/!-галактозидаза в момент времени (T-t)-(T-O). Время, необходимое для появления /)■галактозидазы после . индукции, определяется по отрезку, отсекаемому на оси абсцисс кривой активности /1-галактозидазы (Schliefet al. 1973). Штаммы SS287 и SS294 являются производными N99, несущими аллель nusG::Kn и трансформированные плазмидами pSS119 и pSS120, соответственно. Клетки растили при 32"С до ранней логарифмической фазы, затем переносили на 42"С и растили в течение 2.5 часов для частичной деплеции NusG в штамме SS287. [>• галактозидазу индуцировали с помощью 1 мМ ИПТГпосле переноса клеток на

1.2 JbenOK NusG ускоряет_скррость эл.онгации транскрипции от yitro. Так ка< результаты экспериментов in vivo свидетельствуют о том, что NusG является фактором, ускоряющим элонгацию транскрипции РНК-полимеразой, мы решили проверить, воспроизводится ли данный эффект in vilro. На рис.2 представлены результаты эксперимента по влиянию NusG in vilro на кинетику транскрипции >.рЬоперона. Реакции проводились в два этапа. На первом этапе транскриционные комплексы синхронизировали в положении +15 матрицы путем исключения УТФ из транскрипционной смеси. На втором этапе добавляли все четыре рибонуклеозидтрифосфата, очищенный белок NusG и инкубировали при 32° в течение указанного времени. Реакция элонгации проходила медленно, так как концентрации трифосфагов (2 мкМ) лимитировали реацию. Продукты транскрипции анализировали с помощью электрофореза в 6% ПААГ,

25'С.

содержащем 8.3 М мочевины с последующей авторадиографией геля. На авторадиограмме, представленной на рис.2, видны несколько транскрипционных пауз и полноразмерный транскрипт, накапливающийся со временем. Видно, что добавление белка Мизв приводит к ускорению накопления полноразмерного транскрилта. В присутствии N1158 за 6 мим около 50% РНК-полимераз доходят до конца матрицы, тогда как в отсутствие МиэЭ только 5% РНК-полимераз. Это означает, что по крайней мере половина всех РНК-полимераз провзаимодействовала с ЫиэО в данном эксперименте. Добавление белка ЫизО но приводило к устранению пауз или изменению положения пауз. Однако добавление ЫиБО приводило к уменьшению Эффективности трех транскрипционных пауз. Эти результаты свидетельствуют о том, что N1^0 приводит к ускорению элонгации транскрипции посредством подавления транскрипционных пауз.

+ N115 6

Ите.тЬ 0 1 2 4 6 8 1216 1 2 4 6 812 16

ЯО

ез Ш ®

„йП

в

и Й '

III

м © © © ° 0 *

* © О о «

4* »

4» <1

& -

I * • » * ' ь ♦

Рисунок 2. Влияние Иивв на кинетику транскрипционной элонгации. Показана зависимость транскрипции от времени в отсутствие (-} или в присутствии (+) Ыизв. ЯО соответствует полноразмерному транскрипту. Три участка, в которых транскрипции заметно паузирует, обозначены как участки 1.11 и Ш.

1.3. Белок NusG подавляет паузирование РНК-полимеразы на паузе

LvL

Для определения количественного эффекта NusG на паузирование мы использовали искуственную матрицу ДНК ( Landick eta!., 1990 ). Эта матрица содержит сильную паузу транскрипции tipL и в подробностях была описана ранео ( Sagitov etal., 1993 ). Реакцию транскрипции начинали добавлением динуклеотида ApU. Элонгированные РНК-полимеразы были синхронизованы в положении +20 матрицы за счет того, что в транскрипционной смеси отсутствовал УТФ. Комплексы очищали на колонке Сефадекс G-50, и аликвоту, содержащую около 0.1 пМ очищенных комплексов, инкубировали с 2 пМ NusG или б-зз NusG в течение 5 мин. Затем элонгацию транскрипции возобновляли добаЕ1лением 50 мкМ каждого из трифосфатов. Аликвоты реакционной смеси отбирали через интервалы времени, и транскрипты анализировали с помощью электрофореза в 10% денатурирующем геле (рис.3). В отсутствиё NusG в

-NusG +NusG

time.min .5 1 2 4 .5124

Рисунок 3. Влияние белка Ыивв на паузирование РНК-полимеразы в ир1 паузе. Авторадиограмма геля, анализирующего продукты транскрипции. Показано положение полос, соответствующих транскриптам, заканчивающимся в 1гр1 паузе, в 1тр1 аттенюаторе ивкр1 герминаторе.

момент времени 30 сек более 25%-транскриптов задерживаются на trpL паузе, в то время как в присутствии NusG - только около 15% транскрипционных комплексов. Эти результаты свидетельствуют о том, что белок NusG частично сулрессирует паузирование РНК-полимеразы на tipL паузе. Обращает на себя внимание тот факт, что NusG но оказывает никакого олилнип на эффективность Rho-независимого IrpL аттенюатора.

Паузирование в trpL паузе индуцируется РНКовой шпилькой, которая образуется а паузированном транскрипционном комплексе (Landick and Yanofsky, 1984). Компьютерный анализ последовательности предполагает наличие РНКовых шпилек в паузах, которые представлены на рис. 2. В настоящий момент остается неясным, подавляет ли NusG транскрипционные паузы, в которых отсутствуют шпилечные структуры. Подавление белком NusG транскрипционных пауз может объяснить эффект стимуляции белком NusG элонгации транскрипции. Однако не исключена возможность, что NusG может также влиять на другие параметры транскрипционной элонгации.

Гпава 2. Суперэкспрессия NusG подааппет Rho-зависимую терминацию в Е.соН..

2.1.. Суперэкспрессип NusG подавляет ПЬо-заоисимую_терминацию в Д }L 1, ноне в лия етна Rh о ; независ и м уютерм и н а ц и ю ' в Xt|. Уменьшение внутриклеточной концентрации NusG приводит к подавлению Rho-зависимой терминации, но не влияет на Rho-незаоисимую терминацию (Sullivan and Gottesman, 1992). •Мы решили проворить, влияет ли избыток NusG в клетке на терминацию транскрипции. Для этой цели мы сконструировали плазмиду pLB11, суперэкспрессирующую NusG. В pLB11 nusG транскрибируется с XpL промотора, который активируется при переносе клеток с 32"С на 42ПС в результате инактивации \с!857репрессора.

Для измерения эффективности терминации использовали две хромосомные XpL-lacZконструкции (рис. 4Б). В одной конструкции (штамм N7599) между pL и lacZ расположен Rho-зависимый 111 терминатор. Во второй конструкции (штамм N7598) находятся два терминатора- tl1 и Rho-независимый t|. Проскок (L1 терминатора, определяемый по уровню экспрессии Ц-галактозидазы, возрастал в 5 раз в N7599 при трансформации его плазмидой pLB11 (рис.4А, правая панель). В качестве контроля брался N7599, трансформированный либо pLB12, в которой nusG ген делетирован, либо pLB13, в которой в которой л^бинактивирован вставкой. Данные этого эксперимента показывают, что избыток NusG, также как и его деплеция, ослабляет терминацию на XtL1.

Добавление Rho-независимого t| терминатора в конструкцию уменьшает экспрессию |)-галактозидазы в 4 раза, как в контрольном, так и в суперэкслрессирующем Nus^ штамме N7598 (рис. 4А, левап панель). Таким образом, избыток NusG в клетке не влияет на эффективность t| терминатора. Эти данные подтверждают участие NusG в Rho-зависимой, но не в Rho-независимой терминации.

t

А

сШ57 р1. I Ш N7599-^-0-

Рисунок 4. Влияние суперэкспрессии Ыивв на терминацию в АН 1 и Л// терминаторах.

Хромосомная конструкция АрЫасЕ отрицательно регулируется репрессором с!857. Штаммы трансформировали плазмидой р1ВМ, либо контрольными плазмидами р1В12 и р1В13, несущими пиввКлетки растили до ранней логарифмической фазы при 32°С, а затем переносили на 42"С. Активность р-галактозидазы измеряли в пробах через определенные промежутки времени после переноса на 42'С. А) р-галактозидазная активность как функция времени после переноса на 42*С; слева-штамм N7598; справа-штамм N7599. В) Конструкция в штамме N7598 содержит П/ю-независимый терминатор А(/ и Й1ю-зависимый терминатор АН 1 в тандеме; в штамме N7599 - только Я!ю-зависимый терминатор АН1.______

22. Суперэкспрессия ЯИо восстанавливает ВИо-зависимую терминацию в клетках с повышенным уровнем При индуцировании плазмиды р1.В11 белок N^0 составляет 2-3% тоталэного клеточного белка. Считая что константа диссоциации комплекса Я110-N1^ ш ига такал же как ю vilгo(Ю 'ЕМ'\ и е1а1., 1993), можно предположить, что концентрация суперэкспрессированого ЫизО ¡п то достаточна, чтобы связать весь клеточный Ию-фактор. Оттитровывание Я!ю-фактора белком

может приъэсти к подавлению терминации. Чтобы подтвердить эту гипотезу, мы проверили будет ли суперэкспрессия Rho подавлять эффект суперэкспрессии NusG.

Мы использовали штамм N7599, который несет хромосомную конструкцию XpL-XtL1 -lacZ, которая отрицательно регулируется \cl857 репрессором {рис.5). NusG и Rho экспрессированы с pi промоторов плазмид pLB16 и p39ASE. Оба белка находятся в высбкой концентрации после тепловой индукции. В штамме N7599 суперэкспрессия NusG увеличивает проскок tL1 терминатора почти в пять раз, что видно по активности ß-галактозидазы посла тепловой индукции (рис.5).

2000

(л

1 1500

0) сп со

Г2 1000

ш о

0 (О

Го 500

U)

1

со.

0

О 10 20 30 40 50 60 Time (min) after snift to 42° С

CI857 pL tu . lacZ N7599-Ё-[]-g^lg]

Рисунок 5. Влияние одновременной экспрессии Rho и NusG на Rho-зависимую терминацию.

Хромосомная конструкция ApL-lacZ отрицательно регулируется репрессором с1857в штамме N7599. Штамм N7599 трансформировали плазмидами pLB16 и pBR322 (- я ■), плазмидами pACYC184 и pBR322 {■ а -), плазмидами pLB16 и p39ASE (■ о ■) или плазмидами рАСУ С i 84 и p39ASE (• »•). Показана (1-галактозидазная активность как функция времени после переноса клеток на 42СС. Эксперимент проводился как описано в подписи к рис.4 за исключением того, что клетки выращивали в среде IB с добавками ампициллина (50 мкг/мл) и хлорамфенчкола (25 мкг/мл).

Суперэкспрессия Rho-фактора увепичивает эффективность XIL1 терминатора. В клетках, экспрессирующих как Rho так и NùsG, полностью восстанавливается терминационная активность XtL1. Результаты этого эксперимента позволяют предполагать, что избыток NusG можот связывать Rho о неактивной форме и ингибировать ого активность. Из наших данных можно также предположить, что в клетках Е.соН концентрация Rho-фактора является лимитирующей для терминации.

Мы проверили возможность того, что избыток NusG может подавлять Rho-зависимую терминацию образуя нерастворимый комплекс с Rho. Кроме того, существует вероятность того, что суперэкспрессия Rho может ингибировать синтез Rho-фактора. Мы проверили обе эти возможности, сравнив уровень растворимого Rho-фактора в индуцированных клетках N7599/pLB16 с уровнем в контрольных клетках N7599 и показали, что суперэкспрессия NusG не уменьшает внутриклеточную концентрацию Rho-фактора.

2.3. Влияние.внутриклеточной концентрации NusG. на терминацию в

rho026_мутантах.

Мутация rho026 блокирует процесс антитерминации у фага >. (Das et al., 1983) и у фага Т4 (Hinton, 1989), однако почти не влияет на терминацию в Е.соН. В отличие от Rho дикого типа, Rho026 не связывается с NusG на аффинных колонках при 42"С (Li et al., 1993). Чтобы объяснить, почему, !ю026 мутанты жизнеспособны при этой температуре, Ли и Гринблатт предложили модель, согласно которой мутация iho026 делает возможной Rho-терминацию в отсутствие взаимодействий Rho-NusG. Мы проверили это предположение, измерив эффект деплеции NusG на эффективность XtL1 в iho026 штамме (рис. 6А).

При наличии NusG, li-галактозидазная активность в rho* и г1ю026 штаммах одинакова и равна ~1100 единиц. При деплеции NusG проскок tL1 терминатора увеличивается в 6 раз в iho+ штамме, и этот терминатор становится почти нефункциональным. Проскок tL1 в rho026 штамме увеличивается всего в 4 раза, и эффективность этого терминатора остается на уровне 30%.

Из этого эксперимента следует, что Rho026 частично сохраняет терминационную активность при деплеции NusG из клеток, однако для полной терминационной активности как Rho дикого типа, так и Rho026 мутанта NusG необходим.

Так как in vitro методом аффинной хроматографии показано, что NusG связывается с Rho-фактором (Li et al., 1993), одно из воз можных объяснений эффекта суперэкспрессии NusG на Rho-зависимую терминацию состоит в том, что NusG оттитровывает Rho-фактор, уменьшая его эффективную концентрацию. Чтобы проверить эту гипотезу, мы измеряли эффект суперэкспрессии NusG на эффективность tLl в г!ю026 штамме (рис. 6В). В отличие от Rho, мутантная форма Rho026 слабо связывается с NusG на аффинных колонках при 42°С in vitro (Li et al., 1993), и терминация в rho026 мутантах частично независима от NusG (см. предыдущий эксперимент). Поэтому мы предполагали, что избыток NusG будет оттитровывать Rho026 из раствора не так эффективно, как Rho, В этом эксперименте эффективность Rho-заоисимой

А

8000

В

0 1 2 3 4 5 Time (hrs) after shift to 42°C

P

'c

и

Й •о

tt ¿3

CO. 200

10 го 30 40 SO Time (mln) after shift to 42° С

CI857 pL N7599 -

tu lacZ

-0—к&йшая

Рисунок 6. Влияние внутриклеточного уровня Ыизв на терминацию в г!ю026 мутантах. А. Эффект деплеции NusG. Штаммы т)ю+ и г!ю026 являются производными штаммов N7599 и Ы7599гЬо026, несущих аллель пизв::Кп и трансформированных плазмидой рББ! 19 или рЗЭ120. Конструкции содержат ИЬо-зависимый терминатор 1(11 и отрицательно регулируются репрессором с1857. В. Сравнение влияния суперзкспрессии М^б на терминацию АН 1 в г!ю' и г!ю026 производных штамма N7599. Штаммы содержат конструкцию кр1-пи11-Н ~Н 1-1ас2, отрицательно регулируемую репрессором сШ57. Штаммы трансформировали плазмидой р1В11 или контрольной плазмидой р1В13. Эксперимент проводился аналогично эксперименту, представленному на рис. 4.

терминации на tL1 была лишь немного меньше в rho026 мутантах, чем в клетках ди кого типа. Это соответствует данным in vivo, полученным ранее (Das el al., 1933). При этом суперэкспрессия NusG приводит к одинаковой степени супрессии 1L1 как в rho+, так и в rho02C штаммах (рис. 6В). Так как помимо Rho-фактора, NusG связывает только РНК-лолимеразу, полученый результат говорит в пользу того, что NusG непосредственно ингибирует.терминацию транскрипции, а не оттитроаывает Rho-фактор. Однако этот результат также может означать, что мутация rho026 не влияет на взаимодействия NusG и Rho in vivo в той же степени, в какой она влияет in vitro.

Мы показали, что фактор Rho026 обладает терминационной активностью в . отсутствие NusG. Однако этой активности недостаточно для поддержания жизнеспособности клеток в отсутствие гена nusG. Так, нам не удалось сконструировать штамм N99 rho026 nusG::Kn путем переноса аллеля nusG::Kn в штамм N99 tho026 PI -трансдукцией. Это свидетельствует о том, что либо терминационной активности г/ю026 в отсутствие NusG недостаточно для экспрессии жизненно важных генов, либо NusG выполняет в ,<летке функции независимые от функций Rho.

Гпава 3. Функциональные взаимодействия NusG с компонентами AN-антитерминационного комплекса.

3.1, Суперэкспрессия NusG. ингибируетЩ1антигерминацию_на^А1Я{ терминаторе;

Так как ряд данных свидетельствует о том, что NusG является частью XN-' элонгационного комплекса, мы решили проворить влияние на XN-антитерминацию суперпродукции и деплеции NusG. Плазмиду р|_В1.1 трансформировали в штаммы 1D1, 6D7 и LB75. Штамм 6D7 содержит конструкцию pfí-cro-nutn \R]-galK, в контрольном штамме 1D1 последовательности пи!Я и 1П1 делетированы. Штамм 6D7 является лизогеном по \cl8S7 Nam7,53. В изогенном штамме LB75, несущем supFаллель, N-активность восстановлена за счет трансляционной супрессии. Суперэкспрессия NusG не влияет на уровень галактокиназы в штамме 1D1 (рис. 7, панель А). В штамме 6D7 при суперэкспрессии NusG уровень галактокиназы возрастает вдвое (панель В, две нижние кривые). Мы видим, что суперэкспрессия NusG приводит к супрессии Rho-зависимого терминатора tR1. Этот же эффект был описан для 1L1 в разделе 2. В штамме LB75 стимуляция экспрессии GalK N-функцией (с 1.5 единиц до 6 единиц) уменьшается при суперэкспрессии NusG (до 4 единиц)- см. панель В, две верхние кривые). Суперэкспрессия NusG приводит к частичному ингибированию N-антитерминации на Rho-зависимом tRI терминаторе.

Данные по эффектам деплеции и суперэкспрессии NusG на элонгацию, терминацию и антитерминацию позволяют предложить следующую модель участия NusG в транскрипции . В норме элонгирующая РНК-полимера?ч ассоциирована с NusG, поскольку деплеция NusG влияет на скорость элонгации. NusG участвует во взаимодействии РНК-полимеразы с Rho при терминации транскрипции и с N (и другими Nus-факторами) при антитерминации, так как деплеция NusG подавляет эти процессы. Суперэкспрессия NusG также

»

с á

ш w ra с

о

о а

а о>

12 10 8 6 4 2 0

8 6 4 2 0 '

0

1D1 //

Р /

/ ... р!_В11

в/ —pLBl2

20 40 60 80

607 » +N

----pLBl1

-pLBl 2 / .о +N

Í..0-N

^ -N

20 40 60 80

В

Time (min) after shift to 42е

t!057 pR

101 -

gQ7 CI85? pR

С ь'!ГТХ

cfo* пыП

СЧЕТК

ws

ШШШ

CIO*

i

Рисунок 7. Влияние суперэкспрессии NusG на терминацию и антитерминацию в Rho-зависимом MR1 герминаторе.

Штамм 6D7 содержит конструкцию ApR-cro+-nutR-tR1 galK. в штамме 1D1 делегированы nutR и (R1. Штаммы являются лизогенами по ?,cl857Nam7,53 и. если указано, трансформированы плззмндами pLB11 или pLB 12. SupF производный штамма 6D7 экспрессирует N в результате трансляционной супрессии мутации Nam 7,53 ("+N"). Клетки растили до ранней логарифмической фазы при 32'С, затем переносили на 42'С.

подавляет Rho-зависимую терминацию и N-антитерминацию, и этот эффект нельзя объяснить простым оттитровыванием компонентов транскрипционного комплекса избытком NusG. Из этого следует, что, по всей вероятности, при внутриклеточном избытке NusG могут образовываться элонгационные комплексы, содержащие дополнительные молекулы NusG. Такие обогащенные NusG комплексы могут менее эффективно взаимодействовать с Rho, N и, возможно, NusA, тем самым подавляя

процессы терминации и антитерминации, хотя скорость элонгации этих комплексов не изменена.

3.2. NusG необходим для XN-антитерминации на Rho-зависимом tig? терминаторе,

На настоящий момент между данными, свидетельствующими об участии NusG в XN-антитерминации, имеются разногласия. Согласно данным in vitro, NusG необходим для стабилизации XN-антитерминационного комплекса и процессивной антитерминации (Mason and GreenblaU, 1991). Однако измерения in vivo показали, что при деплеции NusG из клеток, активность XN-функции на Rho-независимом II терминаторе не изменялась (Sullivan and Gottesman, 1992). Это означает, что либо стабильность, придаваемая комплексу NusG белком, важна для активности комплекса in vitro, но не in vivo, либо необходимость участия NusG в XN-антитерминации зависит от типа терминатора, • сугрессируемого N-функцией. Поэтому мы решили посмотреть, каков будет эффект деплеции NusG на N-антитерминацию в Rho-зависимом терминаторе. Эксперимент проводился на Rho-зависимом (|g2 терминаторе, которой находится в середине инссрционного элемента IS2 (de Crombrugghe el al., 1973). Такой элемент имеется, например, в лидерной области <7Л/-оперона в мутанте да!Е490'. Мутация да!Е490' приводит к полярному эффекту на генах gaITи galK за счет преждевременной терминации транскрипции в tjS2- выбрали терминатор t|g2 для наших экспериментов по той причине, что это единственный известный Rho-зависимый терминатор, который сохраняет 80% терминационной активности при деппеции NusG (Sullivan and Gotlesman, 1992). Измерения проводились на хромосомной конструкции lpL-nutL-galE490'-l\Q2 gaIK& присутствии или в отсутствие XN-белка, экспрессируемого с плазмиды pSSl25. X PL-промотор в этой конструкции репрессируется репрессором с1857и активируется при переносе клеток на 42°С. Чтобы определить, небходим ли NusG для N-антитерминации на t|S2. деплецию NusG из клеток проводили в течение 5 часов после переноса на 42°С и экспрессию N-белка индуцировали добавлением 1 мМ ИПТГ и 5 мМ цАМФ, после чего сравнивали эффективность N-антитерминации в nusG* и NusG-деплецированных клетках. Результаты эксперимента представлены на рис. 8. В отсутствие N-белка галактокиназная активность необнаружима в клетках, т.к. эффективность t|S2 терминатора равна 100%. Деплеция NusG увеличивает уровень экспрессии галактокиназы до 10 единиц, что отражает супрессию t|S2 терминатора. Экспрессия GalK увеличивается до 26 единиц в nusG* клетках, трансформированных плазмидой pSS125. Эта плазмида экспрессирует N в отсутствие индукции plac, что обнаруживается по стимуляции экспрессии GalK. При индукции экспрессии N с

Рисунок 8. Влияние деплецич Ыиэв на Шантитерминацию на РЬо-

зависимом терминаторе . ____~0.г „„

Клетки штаммов 1В49. ¿В50,1В54 н 1В55 растили на среде Ш при 32 С до ранней логарифмической фазы, затем переносили на <12'С и °

течение 5 часов. Экспрессию белка N индуцировали добавлением 1 мМ ИПТГ и 5 мМ цАМФ. Большой буквой N обозначена индукция экспрессии N с плазмиды ■рввМ, маленькой буквой ы< экспрессии о отсутствие индукции, -Ы -плизмнда рвв!25 и, соответственно, белок N отсутствовали в клетках.

plac промотора уровень галактокиназы сильно возрастает в nusG* клетках (до 100 единиц), но в NusG-деплецированных клетках остается на прежнем уровне (40 ед.). Из этого эксперимента следует, что N-антитерминацил но происходит в клетках, в которых деплецирован NusG. Таким образом, NusG является необходимым компонентом XN-антитерминации на Rho-зависимом t|g2 терминаторе.

Возможно, механизмы супрессии XN-функцией Rho-зависимых и Rho-независимых терминаторов различны, и роль NusG в антитерминации зависит от типа супрессируемого терминатора. Такое объяснение согласуется с моделью Ли и Гринблатта (Lee et al., 1993), предполагающей, что роль NusG в антитерминации состоит в том, чтобы препятствовать дестабилизации n-содержащего транскрипционного комплекса Rho-фактором.

Глава 4. Функциональные взаимодействия NusG с компонентами Nun-зависимого терминационного комплекса.

4.J._C упе р э к сп рес с и я NusG приводит к восстановлению размножения фагаА в.гшогенах по НК022.

Белок Nun фага НК022 предотвращает суперинфекцию E.coliфагом X. Nun-белок индуцирует преждевременную терминацию транскрипции на nut-сайтах фага X или вблизи них, и конкурирует с XN за связывание с /juí-сайтом мРНК. Показано, что деплеция NusG in vivo нарушает Nun-терминацию (Sullivan and Gottesman, 1992).

В экспериментах, описаных ниже, мы показываем, что избыток NusG в клетке также предотвращает действие Nun-белка. Супорэкспроссия NusG в плазмиде pLB14 частично восстанавливает размножение фага X в клетках-лизогенах по НК022 (см. таблицу 1): эффективность высева возрастает в 10^ раз для XN* фага и в 103 раз для \N~nin5 фага. Эффект не обусловлен усилением конкуренции Nun и N при суперэкспрессии NusG, так как частично Еосстанавливается размножение XN' фага в лизогене по НК022.

Ингибирующий эффект суперэкспрессии NusG на Nun-функцию снимается экспрессией Nun с многокопийной плазмиды pNUN, которая блокирует ■ размножение фага X даже в клетках с высокой концентрацией NusG.

Совокупность полученых данных свидетельствует о том, что в штаммах, суперэкспрессирующих NusG, для предотвращения суперинфекции фагом X требуется более высокая концентрация Nun-белка.

4.2. Избьггок KlusG стимулируе1_активность К1иг1-ли/-_сайтах.

Чтобы количественно измерить эффект избытка NusG на эффективность и специфичность Nun-белка, мы трансформировали плазмиду pLBl5, экспрессирующую NusG, или pLB13, контрольную плазмиду, в серию штаммов-лизогенов по фагам Ximm21 и НК022 (Baron and Weisberg, 1992): ЕН12-ЕН13, ЕН14-ЕН15, ЕН16-ЕН17, ЕН18-ЕН19 и ЕН20-ЕН21. Один член каждой пары штаммов содержит профаг НК022 с геном nur, дикого типа, другой- nun, инактивированный вставкой ТпЮ. Профаги Ximm21 содержат конструкции

Таблица 1. Суперэкспрессия NusG восстанавливает размножение фага ?. на штаммах, лизогенах по НК022.

Штаммы являются производными N99 и содержат профаг HK022nun+ или НК022 nurt::Tn10, либо pNUN плазмиду, которая зкспрессирует Nun. Штаммы был,! трансформированы плазмидой pLBI4, экспрессирующей NusG, либо контрольной плазмидой рТтс99А. Эффективность высева определена относительно таковой на штамме N99 при 37СС. Экспрессию NusG с plac промотора в плазмиде pLB14 или экспрессию Nun с plac промотора в плазмиде pNUN индуцировали добавлением t mM ИПТГна чашку со средой.

Клетка-хозяин р nusG Эффективность высева IN* Wmn5

№9(НК022лш") ■ 1 1

+ 1 1

№9(НК022лш+) _ 10-7 10'5

+ 0.01 0.01

N99/pNUN 10-7

+ 10-9 10-7

типа pL- nulL-lacZс nut-сайтом дикого типа (ЕН12 и ЕН13), с делецией да/ сайта (ЕН14 и ЕН15), или сточенной мутацией в ЬохВ nutcawa (остальные штаммы). Рспроссор CI857, экспрессируомый со второго профагп регулирует активность pL промотора. Nun терминация измерялась по |\-галактозидазной активности через час после активации pL промотора переносом клеток на 42"С.

Результаты этих экспериментов представлены в таблице 2. В контрольных штаммах в отсутствие Nun-фактора суперэкспрессия NusG не оказывала влияния на экспрессию lacZ(колонки 1 и 2). Делеция nulL области и мутация G55>T в ЬохВрезко уменьшают уровень экспрессии |(-галактозидазы. Причина этого ингибирования неясна, но, возможно, отражает изменения в связывании Nus-факторов, Rho или каких-то других транскрипционных факторов с nut-сайтом.

Nun-фактор полностью блокирует экспрессию lacZa конструкциях с nutL+, и супэрэкспрессия NusG не влияет на этот эффект.

Однако эффект суперэкспрессии NusG на Nun-активность наблюдаем в эксперименте, где в качестве теста используется размножение фага X (Таблица 1). Мы считаем, что размножение фага- более чувствительный тест активности Nun-белка, чем тест на хромосомной конструкции, так как в первом случае Nun-белок взаимодействует с большим числом транскриптов, чем во втором случае.

Наши данные согласуются с полученными ранее: мутации в ЬохВ приводят к уменьшению терминации (см. таблицу 2). Неожиданным оказался результат, демонстрирующий, что суперэкспрессип NusG усиливает Nun терминацига о 3 4 раза в конструкциях, содержащих точечные мутации в ЬохВ (сравните колонки 3

и 4 в таблице 2). Это означает, что избыток N1^0 в клетке приводит к уменьшению специфичности Ыип-белка, позволяя ему лу"ше терминировать в мутантах по пи(-сайту.

Таблица 2. Влияние супорэкспроссии NusG на терминацшо, осуществляемую фактором Nun о районе nulL сайга.

A). В первом столбце показаны одиночные замены в ЬохВ районе nulL сайга, содержащиеся в конструкции ApL-nutL-lacZ штаммов, которые являются лизогенами по НК022пип+ или НК022 пип::Тп 10. Промотор XpL отрицательно регулируется репрессором Хс!857 и активируется при переносе на 42°С. Активность /¡-галактозидазы измеряли в клетках спустя 1 час после переноса на 42°С. Во второй и третьей колонке представлена активность ß-галактозидазы в отсутствие Nun. В четвертой и пятой колонках дано значение активности //• галактозидазы при наличии Nun. Штаммы трансформированы контрольной плазмидой pLBl3 ("■") или плазмидой pLB15, зкспрессирующей NusG ("+"). В скобках приведена эффективность терминации Nun-фактора.

B). Последовательность /,nu!L.

C). Конструкция ApL-nutL-lacZ.

А

р nusG Единицы Ц-галактозидазы

nun" nun*

- + - +

генотип nutL

nutL* 163 159 <1 (100) <1 (100)

Anut 16 14 14(13) 14(0)

C51->A 137 130 102 (26) 31 (76)

C53->A 154 171 123 (20) 32 (81)

G55->T 26 20 20 (23) 5(75)

В

51 53 55 А А Т

т т т

CGCTCTTAAAAATTAAGCCCTGAAGAAGGGCAGCATT Box А ВохВ

С

CI857 pL nutL lacZ

, >

!

Мы предполагаем, что уменьшение специфичности Nun при суперэкспрессии NusG может приводить к тому, что клеточные РНК. содержащие ЬохВ-подобные последовательности, оттитровывают Nun-белок. Такой механизм может объяснить частичное восстановление размножения фага I в клетках, несущих профаг НК022, при суперэкспрессии NusG. Совокупность этих данных указывает на возможное непосредственное взаимодействие NusG и Nun белков in vivo.

4.3. Мутации в NusG, специфически нарушающие Nun-зависимую терминацию.

Используя тот факт, что NusG является фактором необходимым для Nun-зависимой терминации ( Sullivan and Gottesman, 1992), оказалось возможным отобрать мутации о NusG, нарушающие Nun-терминацию. Для селекции использовали штамм SS340, который имеет следующий генотип:

a) хромосомную конструкцию pR-nutR-galK. которая чувствительна к Nun функции. Штамм также является лизогеном по НК022, и поэтому имеет фенотип Gal' при переносе на 42"С.

b) Кп вставку, инактивирующую хромосомный ген nusG.

c) температурочувствительную плазмиду pSSl 19, экспрессирующую nusG. Штамм SS340 трансформировали плазмидой pLBl4, экспрессирующей мутантный nusG. Для мутирования фрагмента длиной 580 нуклеотидов, кодирующего nusG, применяли метод PCR с использованием Taq полимеразы (Zhou etat., 1991). Taq ДНК-полимераза не имеет 3'-5' экзонуклсазной активности и привносит в амплифицированную последовательность мутации с частотой 10 '5-10'4 на нуклеотид. Результирующую рекомбинантную ДНК трансформировали в штамм SS340 электропорацией и высевали на чашки со средой Mac-Gal при 42" С. При этой температуре единственным источником nusG в клетке является мутагенизированная плазмида. Мутации в nusG, подавляющие активность белка Nun, приводят к экспрессии Gal* в лизогене по НК022, и мутантный штамм отбирали по красному цвету колонии среди белых колоний на среде Mac-Gal. В результате селекции отобрали несколько мутаций. Две из них лежат в соседних аминокислотах (Phe144Tyr и Asn145Asp), третья- на расстоянии (Trp80Arg). Все мутации находятся в эволюционно консервативном домене С-концевой области белка NusG. Эти мутации рецессивны. Мутации были отобраны как подавляющие активность Nun в XpR опероне, однако они также подавляют активность Nun в XpL опероне. Это свидетельствует о том, что мутации не являются специфическими по nul сайту. Отобранные мутации в NusG оказывают действие только на Nun-терминацию; клетки, несущие мутантный NusG, жизнеспособны и не проявпяют специфического фенотипа ни в размере колоний, ни в потребностях питательных веществ. Более того, в этих мутантах не нарушена N-антитерминация и размножение фага ?..

Отбор мутантов NusG, специфически подавляющих Nun-терминацию, позволил локализовать участки белка, важные для его функциональной роли в Nun-зависимом терминационном комплексе.

Выводы

1. Для изучения механизма действия жизненно важных белков in vivo предложен подход вменения их внутриклеточной концентрации в широком диапозоне посредством деллеции и суперэкспрессии. Подход продемонстрирован на примере белка NusG из Е.coli. Для данной работы сконструирован ряд штаммов Е.соИ и суперэкспрессирующих NusG плазмид.

2. Впервые продемонстрировано, что NusG участвует в процессе элонгации транскрипции и является фактором, стимулирущим элонгацию как in wVotqk и in vitro. In vitro NusG подавляет специфические паузы транскрипции. Показано, что действие NusG на элонгацию и терминацию транскрипции не описывается моделью кинетического сопряжения этих двух процессов.

3. Сулерэкспрессия NusG в клетке подавляет эффективность Rho-зависимых терминаторов ?.tl_1 и XtR1, но не влияет на эффективность Rho-независимого >.tl терминатора. Эти данные свидетельствуют об участии NusG в Rho-зависимой терминации и непосредственном взаимодействии NusG и Rho in vivo.

А. Суперэкспрессия NusG ингибирует Ш-антитерминацию на Rho-зависимых X tLt и XtR1 терминаторах. Дзплеция NusG подавляет Ш-антитерминаци. на Rho-зависимом t|g2 терминаторе. Высказана гипотеза о том, что роль NusG в антитерминации может зависеть от типа терминатора, е'.трессируемого N-функцией.

.5. Показано, что мутант Rho026 может осуществлять терминацию in vivo а отсутствие NusG, хотя и с пониженой эффективностью.

6. В клетках, суперэкспрессирующих NusG, активность фактора терминации Nun фага НК022 понижена. Подавление суперинфекции фага \ Nun-белком восстанавливается при увеличении клеточной концентрации Nun-белка. Суперэкслрессил NusG приводит к стимулированию Nun-терминации в мутантах по ЬохВ«у/ сайга. Эти данныо свидетельствуют о возможном прямом взаимодействии NusG и Nun.

7. Мутация nusG4 супрессирует мутацию nusAt как для XN-антитерминации, так и дпр. Nun-терминации. Данные свидетельствуют о том, что супрессорные взаимодействия nusA 1 и nusG4 мутаций влияют на общие факторы

• элонгационного комплекса, а не специфически на N- или Nun- белок.

8. Отобраны мутанты no NusG, специфически нарушающие Nun-зависимую

. терминацию. Мутации попадают в консервативную С-концеоую область белка. Данные по мутациям свидетельствуют о разной функциональной роли NusG в Nun-, Rho- и N-элонгационных комплексах.

9. На основе полученых данных предложена модель участия NusG в транскрипции.

Список опубликованных работ

1. Kalambet, Yu.A., Burova, E.I., Zhuchkov, A.A., Knorre, V.L., and Alexandrov, A.A. (1988). Measurement of DNA-protein binding constants by a computerized chromotograph Millichiom. In: Kalasz, H., and Eltre, L.S. (eds) Chiomatogmphy-87, 251-268, Budapest.

2. Burova, E„ and Gottesman, M.E. (1993). NusG concentration atfects lactor-dependent transcription termination and antitermination in vivo. In: Molecular biology of bacteria and phages. Abstracts ot papers presented on the meeting. Cold Spring Harbor, NY, p.32.

3. Burova, E., and Gottesman, M.E. (1994).NusG mutants that block transcription termination by phage HK022 Nun protein. In' Molecular biology of bacteria and phages. Abstracts of papers presented on the meeting. Madison, Wl, p.117.

4. Burova, E., Hung, S.C., Sagitov, V., Stitt, B.L . and Gottesman, M.E.(1995). Escherichia coli NusG protein stimulates transcription elongation rate in wVoand , in vitro. J. Bacteriol, 177, 5.

5. Burova, E. and Gottesman, M.E. (1995). NusG overexpression inhibits Rho-dependent termination in E. coli. Mot. Microbiol{submitted).