Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональные группы белков головного мозга в условиях гипероксии, гипоксии и их сочетания с гиперкапнией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональные группы белков головного мозга в условиях гипероксии, гипоксии и их сочетания с гиперкапнией"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

СМОЛЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

ИНСТИТУТ

На правах рукописи ГОРЕНКОВА Татьяна Ивановна

УДК 612.22.02+612.223,1.11] :616.831— 092.9

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ГРУППЫ БЕЛКОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА В УСЛОВИЯХ ГИПЕРОКСИИ, ГИПОКСИИ И ИХ СОЧЕТАНИЯ С ГИПЕРКАПНИЕЙ

03.00.04 — биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

те

Смоленск — 1990

Работа выполнена в Смоленском государственном медицинском институте.

Научный руководитель — доктор медицинских наук, профессор Н. Б. Козлов.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: доктор медицинских наук, профессор Л. Я. Тяхепыльд, доктор биологических наук, профессор Я. В. Велик.

Ведущее учреждение — 2-й Московский ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.

в « час на заседании специализированного Ученого со-

вета (К.084.34.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Смоленском государственном медицинском институте по специальности биологическая химия (214019, г. Смоленск, ул. Крупской, д. 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Смоленского медицинского института.

Автореферат разослан »_¿ЪЛ_1990 г.

Защита диссертации состоится

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук, доцент

Н. Ф. ФАРАЩУК

общая шттсгш рабош

Актуальность проблемы. Участие белков в осуществления специфических функций нервной системы ^о^хрловлено наличием в их составе различных функциональных групп, о? содэржшия а состояния которых во многом зависят нейрональная активность. Именно поэтому изучение общего содержания я реакционной способности функциональных групл в белках мозга при различных экстремальных воздействиях на организм, как я при многих его патологических состояниях, о'жгнь ваяно для поникания механизмов их развития. Однако подобных исследований пра условии воздействия на'организм искусственных газовых атмосфер, нарушающих его естественный газообмен, проведено мало.

Анализу состояния функциональных групп в белках мозга при воздействии на организм измененной газовой среды посвящены работы З.С.Гершенович п А.А.Крячавской (i960), А.М.Гольденберг (1964),

A.Г.Конопелько (1965) а более поздние публикации А.Г.Мендяеряцной п С.А.Лисоаской (1976), И.Н.Зыковой (1981), Н.А.Соколовой я соавт. (1983).

Эта отдельные исследования из носили комплексного характера, проводились на различных тавотных, в разных условиях эксперимента и касались, в основном, гапербаряческих воздействий кислорода иля тяжелых степеней гапобарачесяой гипоксия, которга, как известно, приводят к глубокому расстройству изтабодазиа а взрашниону повреждение клеточных ультраструктур (Аксенова A.Z., Мэрезянскяй

B.М., 1974; Нрачевская A.A., Луяаи А.й., 1975). Поэтов на основании анализа результатов указанных работ не только нельзя сделать каких-либо обобщающих выводов об ответной рзазсцан белков иозга на изменение газового рзетна оргашзма, но. и невозможно оценить конкретное участие я роль в этой процесса тех али иных функциональных групп.

Взгесте с тем, остается по-существу не осве^ннкм вопрос о содержания и роли функциональных групп белков мозга в общей ответной реакции нервной ткана на вдыхание гапонснчэских и гаперокси-ческих газовых сыесзй пря обычном барометрической давления. Известно, что таким воздейстэиям человек нередко подвергается пря выполнении работ з замкнутых пространствах, пря неисправностях наркозно-дкхательной аппаратур*, во время сеансов кислородной те-

рапии, при пользовании высотными кислородными приборами и т.д.

Очень важно изучение в этом плане и гиперкапняческих состояний, которые могут развиваться не только при нарушении функций внешнего дыхания (Низовцев В.П., 1973), но и могут быть следствием неисправностей систем регенерации искусственной атмосферы герметических помещений - орбитальных станций, батискафов, подводных лодок и т.д. В последнем случае это нередко приводит к развитию сочетании гипоксическо-гиперкапнических и гипероксическо-гипер-капнических состояний (Агаджанян H.A., Граменецкий П.М., 1977).

С учетом практической значимости сказанного, было предпринято изучение ряда важных функциональных групп в растворимых белках различных отделов головного мозга животных, подвергнутых в одинаковых и строго контролируемых условиях одчочасовоцу нормобаричес-коиу воздействие искусственных газовых смесей с различными парциальными давлениями кислорода, азота и углекислого газа.

Цель работы: установить общие закономерности участия функциональных: групп белков головного мозга в ответной реакции нервной тканк на вдыхание газовых смесей с различным содержанием кислорода и углекислого газа и на основании результатов исследования дать оценку возможности я целесообразности применения этих газов в определенных сочетаниях.

Задачи исследования: изучить содержание акидннх, аминных, всех типов карбоксильных и сульфгндрильных групп в растворимых белках различных отделов головного мозга белых крыс после одночасового, норыобарического воздействия на организм следующих газовых смесей:

а) воздушная смесь - контрольная серия экспериментов;

б) воздух + 10% <Х>2 (воздупно-гаперкапническая газовая смесь);

в) чистый кислород (гипероксическая газовая среда);

г) кислород + 10% СО*) (гипероксичзоко-гиперк&пническая смесь);

д) 10% кислорода + 90% азота (гипоксическая смесь с парциальным давлением кислорода, соответствуем высоте 6000 м);

е) 10% кислорода + 80% азота + 10% COg (гипоксическо-гипер-капническая смесь). •

Научная новизна работы состоит прежде всего в том, что в одинаковых и строго контролируемых условиях эксперимента одновременно изучено содержание и реакционная способность ряда важнейших функциональных групп в белках головного мозга крыс после одночасового воздействия на организм в нормобарических условиях некоторых

важных с практической точки зрения газовых смесей как с понижению!, так и повышенным, относительно нормы, содержанием кислорода, а также их сочетаний с углекислым газом.

С учетом возможностей примененных катодов исследования, раскрыты новые, более конкретные закономерности участия каждого типа функциональных групп белков различных отделов головного мозга в общей ответной реакции нервной ткани на вдыхание организмом тех ила иных газовых смесей и на наличие и уровень в их составе отдельных газовых компонентов. На основании анализа полученных данных высказано предположение о возможности обратимого взаимодействия физически растворенного в цитозолэ нейронов углекислого газа со свободными аминогруппами белков мозга, что может вести к формировании карбаминовых группировок и изменения кислотно-основных свойств белковых молекул. Обсуждена вероятная роль такого обратимого карбаминирования белков в поддержании тканевого кислотно-щелочного баланса в условиях нарушенного газообмена.

На основании полученных результатов обоснована неблагоприятная тенденция в реакция белков мозга на одночасовое вдыхание в нормобарических условиях чистого кислорода я крайне отрицательное влияние кислородйо-гиперкапняческих воздействий на организм. Продемонстрировано благоприятное влияние на белковые структуры мозга добавок углекислого газа к вдыхаемым газовым смесям с пониженным содержанием кислорода.

В ходе выполнения исследований в соавторстве внесено 3 рационализаторских предложения, касающихся устройства для затравки животных проточными газовыми смесями, их забоя, а также методика потенциокетрического макро титрования белков (удостоверения на рационализаторские предложения Ш 643, 644, 687, ввдажше БРЙЗом • СГМИ).

Научно-практическое значение полученных результатов состоит' в том, что они не только расширяют уже существуйте представления о механизме влияния на организм и, в частности, на ткань мозга отдельных газовых компонентов нормобарической искусственной атмосферы и их различных в количественном и качественном отношении сочетаний, но и позволяют определить перспективное направление дальнейших исследований.

Полученные экспериментальные данные о крайне неблагоприятном воздействии на белки мозга вдыхаемой гипероксическо-гиперкапнячес-кой газовой смеси долины приниматься во внимание в клинической

практике при применении с лечебной целью газовых смесей типа кар-богена, а также при назначении кислородной терапии больным, у кото рых в силу тех или иных причин нарушен процесс элиминации из организма углекислого газа.

Результаты исследований необходимо учитывать как прт решении проблем создания искусственной атмосферы в замкнутых пространствах применительно к конкретным целям обитания в них человека, так и при разработке мер борьбы с нештатными ситуациями, вынувдаицими человека пребывать в газовой среде с измененными исходными параметрами.

Апробация работы. Материалы исследования апробированы; на 3-м Всесоюзном биохимическом съезде (Рига, 1974), на 7-й и 10-й Всесоюзных конференциях по нэйрохиюш (Ростов-на-Дону, 1976; Горький, 1987), на совместных заседаниях Смоленских отделений Всесоюзных обществ биохимиков, фармакологов, патофизиологов и биологов (1974, 1984, 1986, 1988), а такке на расширенном заседании кафедры биологической химии и лаборатории энзимологии отделения молекулярной биологии Туртуского государственного университета (1989).

Публикации. По теме диссертация опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 188 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, язлоюзнял полученных результатов н их обсуаденая, заключения, шбодов, а танЕЗ указателя литературы, занимающего 42 страница и вклочащзго 234 отечественных и 127 иностранных источников. В тексте дассертш^ш поводится 16 таблиц.

содержания работы

Материал и методы исследования. Исследования выполнены на 342 белых беспородных красах обоего пола массой 150-180 г. Затравку тавотных осуществляла ярото*мшга газовала смесями при обычном барометрическом давлении в специально сконструированной установке, позволявшей смешивать исходные газы в любых соотношениях. Скорость протока испытуемой газовой смеси через затравочную камеру объемом в 5,5 литра составляла 5 л/мин, что пойтостью исключало возможность изменения состава смеси за счет процесса внешнего дыхания еивотных. Содержание кислорода на выходе ез камеры периодически контролировали химическим методом на аппарате Ходдена, уровень углекислого газа постоянно регистрировался самошшупрм анализато-

ром двуокиси углерода типа 0А-2209.

Поста одночасовой экспозиция в соответствующей газовой среде животных моментально дакалитировали с помощьо гильотккы. Исследованию подвергала растворяше балки больших полузарпй, промежуточного и среднего мозга (совместно) и продолговатого мозга, экстрагируемые из соответствующих отделов мозга путем гомогенизации ткани с охлажденным 5% раствором хлорида натри с последующим замораживанием, оттаиванием и центрифугированием при -4°С, 15000^- в течете 20 минут. От низкомолекулярных соединений полученный супер-натант освобовдали посредством его гельфильтрации через колонки, заполненные сефадексом % -25. Содержание бзлка в полученных маточных растворах определяли по методу Хожи^ О .hf.tt oJy (1951).

Амидныэ группы в белках определяли методом ступенчатого гидролиза шшдшх связей в I н (Гершеновяч З.С.,, Крячевсяая A.A., i960) после предварительного удаления аз трихлоруксусных преципитатов белков прямеси нуклеиновых кислот (Пушкина Н.В.,1976). Содержание я реакционную способность S Н-гр/пп определял! модифицированным методом Веревканой И.В. я соавт. (1977) с использованием реактива Зллмана (6¿СтапЗ.^,. t 1959)5 количество аминогрупп - методом их химической модификации 2,4,б-тринятроб2нзол-1-сульфо-новой кислотой ОНБС) npi £Й = 7,4 и 9,0 {На&ееЛоЛ-ЗЗ.Л. ,1966); содержание«: , а также ß , f -карбоксильных групп - методом потен-циометрического микро титрования. (Кенчингтон А., 1963).

Полученные экспериментальные данные статистически обработаны с использованием коэффициента Стъоденга (Кокунян В.А., 1975), а в раде случаев - критерия Вилкоксона (Гублер Е.В., Генкин A.A.,1973).

Результаты исследования я ях обсуждение

I. Функциональные группа белков мозга при вдыхания гиперкап-нической газовой смеси. У контрольных животных в белках исследо-' ванных отделов мозга не выявлено существенных различий в содержании Ы -карбоксильных, аминных и сульфгидрильных групп (таблицы I и 2). Содержание же амидных и J3 , Т -карбоксильных групп было б_-лее высотам в белках продолговатого иозга. В целом данные, полученные на контрольных животных, соответствуют датам литературы, основываагригся как на результатах аминокислотного анализа гидроди-затов белков мозга крыс, так и непосредственного определения в белках соответствующих функциональных групп (Сталькакова З.П., 1970; Соловьев A.C., 1973; Кричевская A.A., 1977; Кузнецов Д.Г., 1985; Вадалян И.А., Довтян М.А., 1986; Jiriau^/Ж.Ч/.dai. 1951

Одаочасовое воздействие на организм воздушо-гиперкапничес-кой газовой смеси приводит к уменьшению общей амидированности белков мозга (табл.1).

Таблица I. Содержание амидных и карбоксильных групп в белках мозга крыс после одночасового вдыхания воздуха в смеси с 10% СОо (мкЯ'г белка, М + т)

Тип функциональных Воздух (контроль) П/ = 14; Пг* 17 Возх Я/» 1УХ + 10% СОо 12; Пг= 14

групп I 2 1 3 I 2 1 3

САГ 534±18 515210 638±21 473±13 р-^0,02 483^14 565±15

ДАТ •276*11 280±16 327±16 230*9 р<0,01 21б±б 323^20 рс0,001

ПАГ 258±20 235±16 31Й23 243±16 267±13 242±21 р 4.0,05

ЛАГ/ПАТ 1,07 1,19 1,05 0,95 0,81 1,33

948±18 974±14 И24±3б 1029±21 р<:0,01 Ю30±17 ' 1259^36 р<0,02 р<0,02

©¿.-сош 259-19 254±23 284±29 247±15 247±21 295±25

Примечание: здесь и в доследующих таблицах цифра&а обозначены:

I - большие полушария, 2 - промежуточный и средний мозг, 3 - продолговатый мозг; ЛАГ - легкогидролизуемые амидные группы; ПАГ - прочносвязанные амидные группы; САГ - суммарное амидные группы. Значения "р" приведены только для достоверных по сравнению с контролем различий. Л/- количество опытов при определении аиадных групп, при определении карбоксильных групп.

Содержание суммарных ашдных групп достоверно снижается в белках больших полушарий и белках продолговатого мозга, причем в первом случае этот сдвиг обусловлен снижением содержания только лэгкогидролизуешх амидных групп, тогда как во втором - снижением уровня прочносвязанных. Соответственно этому коэффициент лабильности амидных связей в белках больших полушарий понизился, а в белках продолговатого мозга возрос.

Можно полагать, что белки мозга могут быть одним из источников свободного аммиака, накопление которого в нервной ткани при дыхании гиперкапначескима газовыми смесями отмечали некоторые исследователи (Прохоренко Л.Г., 1965; ^йШпА^. tЛ^xл-зtЛ.&ег!. 1966). Усиление процессов дезамидирования белков мозга может быть

одним из проявлений адаптивных свойств нервной ткани, направленных на борьбу с развивающимся в этих условиях дыхательный ацидозом. По данным Коваленко Е.А. и Чернякова И.Н. (1972), вдыхание воздуха в смеси с 10% С0£ приводит к снижению рН в крови яремных вен до 7,14, что свидетельствует об истощения буферных возможностей крови и развитии выраженного декомпенсярованного дыхательного ацидоза.

Изменения в амидном азоте белков обычно бывают сопряжены с изменениями в содержании белковых карбоксильных групп. Из данных таблицы I видно, что при отсутствии заметных изменений воС-карбок-сильных группах (это свидетельствует, в первую очередь, об интакт-ности пептидных связей) сдвига в содержании , -С00Н групп в сторону увеличения очень существенны и достоверны во всех отделах мозга. Характерно, что выраженность стих изменений в количественном отношении значительно превалировала над снижением содержания амидных групп. Следовательно, пр.ч вдыхании воздуха в смеси с СО^ з белках мозга помимо расщепляющихся амидных связей появляется какой-то дополнительный источник _/3 , У" -СОСН групп или иных функциональных групп, обладащих схонзй с ниш ионизационной способностью.

Установлено, что пребывание тавотных в гиперкапнической газовой среде приводит к достоверному снижению содержания ампнных групп в белках промежуточного, среднего я, особенно, продолговатого мозга (табл.2). В количественном отношении эти сдвиги выраяены почта одинаково при обоих значениях рН.

Причиной отмеченных изменений может быть снижение реакционной способности аминогрупп по отношению к ТНБС в связи с появлением в белках мозга при их дезамидировании дополнительных карбоксильных групп. Последние, обладая зарядом и группируясь около аминогрупп, могут не только создавать экранирующий эффект, препятствуя приближению к ним отрицательно заряженных молекул реагента, но и способны одновременно за счет эффекта поля повышать значения рКа их ионизированных форм (ШБС взаимодействует с де про тони ро ванными аминогруппами - &шоОпац Я А , ка.сЫа <&. Эг. , 1968; 1970).

Более вероятен альтернативный механизм, предопределяющий не кажущееся, а истинное уменьшение количества ^УКг -групп в белках мозга, например, за счет их вовлечения в какие-либо химические взаимодействия. В условиях опыта, когда в результате гиперкагни-ческого воздействия на организм отмечается выраженный рост напряжения С0£ в крови и тканях, велика вероятность прямого акцептнро-

7

вания этого газа свободны*® аминогруппами белков. Способность как сС-, так и<§—с/Я^-групп обратимо хидачвсюз связывать углехислый газ, что ведет к формированию карбаминовнх группировок, к настоящему времени доказана с&мыш различными пукемгля шзако-хиыическо-го анализа на примере целого рада природных белков и пептидов (Ыельничук Д.А., 1983; Роговский С.П. и др., 1968 1974; RethgeAT.J4.ttcК?., 1978; Щиг-и1ЯЛ. с{ о£. , 1979).

Таблица 2. Содержание аминных и сульфгидрияьных групп в белках мозга крыс после одночасового вдыхания воздуха в скеси с 10% С0? (мжЫ/г белка, 2+м)

Тип функциональных групп

Воздух (контроль) n-i* 15; Лг= 8

Воздух 10% СО? т = 9 *

Ааднные 823*17 847Í22 851*20 789±22 761*26 735±17 при рНв9,0 р-<0,02 p-í0,001

Аминные 651*12 686*20 697*14 622*17 594*21 599*12 при рН=7,4 р<г0,01 'р-с0,001

% выявляв- . , . . .

моста пш 79,1*1,4 81,0*1,0 81,9*1,1 78,8*0,4 78,1*0,7 81,5*1,2

ff = 7,4_____________

¿¡Йгдеппи "»О11«6 105,0*3,8 101,2%,2 101,0*3,0 108,6*3,4 101,9*3,6

тупные»С~ 46,0*1,1 43,7*2,2 46,8*1,6 49,4*2,9 53,5*2,1 47,9*2,3

доступные 8,2*0,58 8,5*0,73 8.9*0,43 8,6*0,70 9,6*0,99 8,2*0,49

Недостуа- 44^,9 43,8*2,5 45,5*2,1 43,0*3,4 45,5*1,2 45,8*3,7

Пряшчанзе: п/ - коигезство опытов пш оаредзлекяи амзнных групп, Пг_~ при определениях ЗВ-групЕ.

Еиологнчоскай С?£ЦСЛ ПреДПОЛ&Г&Э&ОГЛ} Кpi'¡Гу.pOБ8iiця белков мозга в условиях гапзркапнни мотет сводиться, по нашему мнение, к ослабления эффекта накопления углекислого геле в цнтозоле нейронов н связанного с кии надувания внутриклеточного кислотно-иелоч-ного баланса. Не исключено, что при этой белки, а в первую очередь • белка-ферыенти, могут приобретать новые свойства и функциональные возмоЕНостн, предопределякшрае адекватную перестройку катаболизма.

Примечательно, что налболеа выраяены этя процессы в белках продолговатого мозга, то есть з филогенетическом отношении самого древнего его образования.

Предподстание о формировании карбадановых групп могло бы быть хорошим объяснением отмеченному вша факту выраженных количественных несоответствий наяду степенью дезамидирсзагыя белков мозга, вызываемого гяперкапничесшш воздействием, и явно превалирующим роете:.: в них числа уЗ , ¿Г-карбоксильных групп. Известно, что яар-баминовые группы обладают слабо выраженными кислотными свойствами и характеризуются значениями рКа, находящимися в диапазоне 5-6 единиц ОГаъсСЯ 1Ж гг а!. , гШ'уЬПЪгииъВ* , 1981). Следовательноа присутствуя в белка:?, карбамшогаэ группы, наряду с

, у -С00Н группами, тая асе могла бы вносить определенный вклад з общий буферный эффект кислотному сдвигу рН в процессе потенцао-метрического -титрования белков.

Одночасозое вдгпсешсе воздуха в смеси с 10% С0р_» как оказалось, не отражается на на степени доступности £К-групп для кодифицирующего реагента, ни на их общем содержании (табл.2). -Эти данные не позволяют говорить о сколько-нибудь значительных структурных перестройках в белках ьгозга, несмотря на азшнекия езх кислотно-основных свойстз. Во всяком случая, если эти язмэнзння я отражаются на хенфорыацяа белков мозга, то, вероятно, не в такой степени, чтобы повлечь за собой едгиги в содержании н реакционной способности их еульфгидрялъных групп.

2. Функциональные.группа белков мозга пра вдыхании чистого кислорода и его смеси с углекислым газом. Одночасовое вдыхание з нормобарических условиях частого кислорода праводат к небольшому, но достоверному снижению содержания суммарных а»идных групп только э белках проьвауточного а среднего мозга, что сочетается с более значительным увеличением колачэстчаьУ6, -С00Н групп (табл.3). Аналогичный по выраженности и направленно ста сдваг в содержании суммарных амвдных групп в бедках больших падуна рай не был статистически достоверным. В белках продолговатого мозга пра данном воздействии отмечается увеличение, лнпь коэффициента лабильности амид-ных сгязей (с 1,05 - в контроле, до 1,44 - а оште).

Следовательно, даже сравнительно кратковременное воздействие кислородной атмосферы на организм праводат к некоторому дез аудированию белков мозга и ослаблению прочности остающихся амидных связей. Подобные изменения э амвдком азоте белков козга была обна-

рукеньг и другими исследователями, но на начальных' этапах гипербарического воздействия кислорода (Стальмакова В.П., 1959; Эмирбеко-ва A.A. и др., 1976).

Добавление к кислородной атмосфере 10% COg усиливает ее дез-амидиругкций эффект на белки мозга. При этом в ответную реакцию вовлекаются уже не только белки промежуточного и среднего мозга, но и белки больпих полушарий, а также белки продолговатого мозга, в которых уменьшается, хотя и не достоверно, содержание обеих фракций амидаого азота при сохранении кх отношения.

Таблица 3. Содержание амидных и карбоксильных групп в белках мозга крыс после одночасового нормобарического воздействия на организм атмосферы чистого кислорода и кислорода в смеси с СОр (мкЭД/г белка, М + т)

Тип функциональных Чистый кислород п>/ = 12 ;!Лг= 12 Кислород + 1055 СОр п, = 12-пг = II ^

групп I Г 2 3 I 1 2 I з

САГ 494*11 478*15 п/П.Пй V ~ » — 637*29 434*18 463*13 rwf> ППТ Г, УП ПТ ' Г - ~ J ~--Г 590*32

ЛАГ 254*17 268*18 376*21 239*12 238*11 р^0,05 р^0,05 346*23

ПАТ 240*11 210*16 261*30 195*16 225*15 р<0,02 244*37

МГ/ПАГ 1,06 1,28 1,44 1,22 1,06 1,42

_)5,Г-СООН 998*22 1058*16 р 0,001 1116*38 1147*26 1110*34 р-^ 0,001 p^O.OI 1224*33 р= 0,05

ОС-С0Ш 295*23 302*21- 335*28 404*25 456*32 р^0,001 р-с 0,001 428*28 р^0,01

Примечание: значения "р" даны в сравнении с контрольными цифрами, приведенными в таблице - количество опытов при определении аыадных групп; при определении карбоксильных групп.

Таким образом, наличие углзкаслого газа во вдыхаемой кислородной атмосфере обусловливает весьма значительные изменения б амидных группах белков мозга, особенно в его наиболее молодых филогенетических образованиях (при вдыхании воздуха в смеси с СО2 аналогичные изменения были более характерна для белков продолговатого мозга).

Еозможно, что усиление процессов дезамвдирования белков мозга при вдыхании частого кислорода или кислорода в смеси с 10% Сй^,

как и в случае вдыхания воздуха, обогащенного СО^, есть отражение адаптивных процессов в нервной ткани, направленных на борьбу с раз-виваотршся ацидозом (при вдыхании чистого кислорода развитие тканевого ацидоза связывают с нарушением гемодинамики вследствие спазма церебральных сосудов (Жиронкин А.Г., 1972; Гладилов В.В., 1931).

Таблица 4. Содержание амданых и сульфгидрилъных групп

в белках мозга крыс после одночасового нормо-барического воздействия на организм атмосферы чистого кислорода и кислорода в смеси с 10% С02 (мкМ/г белка; И + т)

Тип функ- Чистий кислород Кислор од + ВД СОо

циональных п, = 10: «г = 8 /г, = 10 10 *

групп I 1 2 |3 I 1 2 ! 3

Ам^нныб

при рН=9,0 864±18 909223 8бб±26 913±35 597±54 935±40 __р<0,02 р<.0,01 р<0,05

^"ЗГ? 4 6Э6±12 75б±20 751±24 723±22 823±39 792±32

при рН-/,4 0>02 Р^0>05 р^О.Об р<0,01 р<0,01 р*0,01_

% выявляв- , , . . ,

мости при 80,6^0,8 83,2^0,8 84,8±0.б 79,2*1,0 82,б±0,б 84,7±0,7

рН = 7,4 р^0,05 р«с.0,05

Легкодоступные 48,1±2,5 53,722,5 47,б±1,3 54,6*2,0 56,9*2.2 р*0,0! р^О,ОЙ 50,5*1,7

Труднодоступные 9,3±0,87 8,4*0,57 7,6*0,45 7,9*0,52 Ь,£0,60 8,3*0,34

Недоступные 40,3*2,8 45,6^2,1 39,021.8 44,8-1,0 47,6-1,6 р^0,05 38,622,5 р<0,05

Пршечаниз: значения *р" даны в сравнении с контрольными цифрами, приведенные! в таблице 2;Л/- количество опытов пр: определении аишшк групп; ю*- пря определении оН-групп.

Вдыхание чистого кислорода приводит к изменению содержания в белках всех отделов мозга амянных групп, что проявляется почти в равноценном приросте их количества при обоих значениях рН (табл.4). £'го говорит об увеличении содержания преимущественно о<-аминних групп, поскольку в сравнении с £ -группами ос-

татков лизяна они обладают более низкими значениями рКа и поэтому полностью вовлекаются в химическую модификаций как при рН =7,4,

так и д[л рН = 9,0 (появление з озлках дополнительных & ~ И?_ -групп е аномально низкими значшйдки рКа на фоне роста содержания Ji , У"~С00Н групп ыало вероятно),

Источником вновь появляющихся аминных групп скорее всего являются расцепляемые пептидные связи. Эти данные, хотя и не получили подтверждений при изучении оi -C0i)H групп (столь го шраяенный прирост их количества не был статистически достоверна, иероятно, из-за кеньпеЯ чуэстЕИтельноста мзтодики определения - тгбл.З), все ке свидетельствуют о неблагоприятной направленноета изменений в состоянии белков мозга при избыточной оксигенацим организма в нормо-барических: условиях.

йзсестнс, что напряжение кислорода в нервной ткани резко возрастает при введении во вдыхаеьый кислород углекислого газа. По данным 3. А.Колаланко и И.Н.Черышзва (1972), добавление 10% СО о к кислороду } эедичивает его напрляение в структурах мозга в 2-4 раза. Следовательно, можно было ожидать, что при воздействии аналогичной газовой сжея не. организм будут усугубляться те изменения в функ-ЦЯОНГ'ЛЪНПХ' Г^'ПГ!П-'Г-, КОТОрН? ÇvJZÏ СТЫечеНЫ npïî ДЫХЗННИ ЧИСТНМ кислородом.

Действительно, как оказалось, вдыхание кислорода в смеси с 10% СОг, пшвэдит к выраженным и высокодостоверным изменениям в содержании гсах нзучзнных фулкциов^ьных групп, направленность которых была такой se, как и при воздействии чистого кислорода. В первую оадредь это относится к аудитам группам, уровень которых во всех отделах мозга возрос весьма значительно (на 10-20%) при обоих значегачх рН (табл.4). При этом процент выявляемое?« амкнных групп при 'рН - 7,4 остался примерно таким se, как и в случае вдыхания чистого кислорода. Ецэ более существенно (на 50-80%) увеличилось содержание в белках иозга о/ -кепОояеильншс групп (тебл.З).

Одновременный рост содержал амшных и ос-карбоксильных групп яслязтся вашам косвенный доказательством усиления протеоли-тических процессов в нервной тксит при воздействии на организм ге-пероксяческо-геперкапнической газовой сшсн. Усиление прогеолиза кожет беть ревультатом повышенной атакуемости ткйнзвюю протзазавд белков ыэзга, чему способствует г условиях опыта потеря ими ашднз-го азота (Лукав А.И. и др., IS83; fticwfr.S étal. , 1979). Не исключена такие вероятность повреждения лазосомального аппарата клеток с коследупцим высвобождением различных про теологических ферментов. Согласно исследованиям Р.А.Копаладзе в соавт. (1986), 30-ин-

путное вдыхание карбогена, то есть су,вся кислорода с '?% ССо, сопровождается резким усилением процэсзов перехненогэ окислен::.-? ли-пидов в мембранных структурах мозга- что неизбег::о должно вести к дезинтеграции и т. структуры и функции.

Непосредственной причиной отжчэнных столь неблагопрнктчих изменений, очевидно, является значительный (в 2-4 раза) рост напряжения в ткани мозга кислорода, но не углекислого ra—î, поскольку СО^ в той те концентрации s составе воздуха не псвыдалs а напротив, понижал урс-вень белковыхИ^-груап. Что же касается вэзмскнос-ти прямого связывания COg свободна;* аминогруппами белков, то есть карбаматообразопашя, о котором шла речь выше, то, по-видимому, этот предполагаешь процесс имеет шсто и при вдыхании кислзродно-гиперкапнической газовой смеси. Косвенным доказательством зтгку являются: во-первых, возрастание в белках количества <*-С00Н групп, намного (на 50-60 мкЛ) превышающее увеличение числа ¿//"¿-групп; во-вторых, как в при воздушно-гиперкапническом воздействии, существенные количественные несоответствия между величинами потерь белками амидного аэгта а явно превагарущим ростом в них содержания Ji, у -C0Œ групп. Возможно, что при вдыхании кислорода з смзся с 10% CQg процесс образования карбщдакових связей в белках иэяга идет параллельно с протеолиэом, но в количественном гтногюьж: еы/ уступает и потоку как бы маскируется быстро прогресслрукцкм приростом о<-j/Hîгрупп, высвобовдающзьхся из пептидам/. связей.

В откгне от -петого кислорюда, вдыхание кп-.;гореда з 2«ьси с COg приводит к увеличению общего содержания су£ь.! гидраяьных групп в белках больших полушарий, прошкуточного и ср. -чего мозга (табл.4). Наиболее вероятной причиной эткх измене может би?ъ их вясвобоздение из яаккх-либо внутримолекулярных спя:..'1 и, яр«гдг-< всего, дясульфйднах. Известно, что части«гшй проуеолкз белков стимулирует ферментативные реакций тиолдисульфидного обмена, при которых за счет .S H -групп низко^олекулярикх таолов ьге-яет идет восстановление белковых Л -3 связей Ç£'a-vid$ûn Û.5 , ?~игсС¥S.fL_ 1957; Jc.ojac.% Z , frinAtty ff, , 197'Л. Раз га в да сульфидных связей сопровождается частичным разверп-ыванкем белковых глобул,, что, е свою очередь, не только повышает их а*ацуе*о«э протзохгтиезмш-wj ферментами (Агаджанян А.Г. и др., IS875, но и увеличивав? доступность функциональных групп белков для реагенте:;. С этим c/Jctoi-тельством может быть связано то, что прирост общего содержания ¿H-групп при гипероксйческо-гяперхаганческоч воздействия пропехо-

дат за счет легкодоступных для кодифицирующего реагента форы (табл.4).

Таким образом, результаты исследования показывают, что кислородная атмосфера, особенно обогащенная углекислым газом, оказывает довольно сложное и притом неблагоприятное воздействие на белковые структуры мозга и прежде всего в его филогенетически молодых образованиях. Это может иметь прямое отношение к хорошо известным фактам значительно худшей переносимости организмом вдыхаемого кислорода при добавлении к нему СС^.

3. Функциональные группы белков мозга при воздействии на ор-; ганизм гипоксической газовой смеси и гипоксической газовой смеси с добавлением 10$ СОо. Вдыхание в нормобаричэских условиях гипоксической газовой смеси, содержащей 10% кислорода и 90% азота, не приводит к сколько-нибудь значительным изменениям в амидированности белков мозга (таб.5). Это соответствует данным литературы (Голь-денберг A.M., 1964).

Таблица 5. Содержание амидкых и карбоксильных групп в белках мозга крыс после одночасового воздействия на ор-гаипзи гипоксйческой гааивий смеси и гипоксической газовой смеси с добавлением 10% С02 (мкЦ/г белка; М + т) .

Тип функ- Гипоксическая смесь Гипоксическая смесь с СОо

циональных П/ = II. /U = 10 п, = 10 пг, = 9

групп I 1 2 1 3 I 1 2 1 3

САГ 554*28 523*17 629*42 •525*22 532*26 613*41

ЛАГ 295*11 272*13 328*34 287* 9 272*12 439*47

1 251*15 р -¿0,02

ПАГ 259*27 301*43 238*23 260*17 174*28

р ¿0,001

1АГД1АГ 1,14 1,08 1,07 1,21 1,05 2,52

Я.Г-ым 690*20 917*22 1057*33 926*25 946*16 1107*38

р/ 0,05 р^0,05

•at-СООН 277*19 280*22 294*26 277*27 276*21 306*33

Примечание: значения "р" даны в сравнении с контрольными цифрами, приведенными в таблице количество опытов при

определении амидных групп, нри определении карбоксильных групп.

Вместе с тем, при гипоксичзском воздействии в белках мозга отмечено снижение содераания ^Р, У" -СООН групп (табл.5). Этот эффект, с учетом отсутствия изменений в амидном азоте белков, не

может быть обусловлен прямым акцептированием ими свободного аммиака.

Противоположные изменения в данной серии экспериментов выявлены в содержании аминных групп: их количество очень существенно и высокодостоверно возрастало во всех отделах мозга, но только в случае, когда химическая модификация проводилась при рН = 9,0. Это предопределило достоверное снижение процента выявляемости «УНд-групп при рН = 7,4. Указанные изменения могут быть обусловлены появлением в белках дополнительных & - л£4-групп, но не концевых аминогрупп, которые, как отмечалось, подвергаются полной химической модификации при обоих значениях рй. Отсутствие изменений в уровне белковыхоС-С0Ш групп (табл.5), свидетельствующее об инт» актности пептидных связей в белках мозга при гипоксическом воздействии, подтверждает сказанное.

Установленный факт увеличения количества аминных групп вряд ли может быть следствием электронных эффектов, оказывающих влияние на их реакционную способность по отношению к ИБС. Отмеченное снижение содержания в белках мозга ^, ^--СОШ групп действительно могло бы ослабить экранирующий эффект их ионизированных форм- на отрицательно заряженные молекулы реагента или даже уменьшить значения рК& аминных групп и тем самым увеличить их реакционную способность. Однако в обоих случаях эта изменения в большей степени проявились бы при рН = 7,4, а не при рН = 9,0, следствием чего было бы не снижение, а напротив, увеличение процента выявляености аминных групп.

Наиболее вероятная причина прироста количеств.' 8 - -У^-групп э белках ггозга - их высвобождение из каких-либо внуч ^¡молекулярных связей, напринзр, карбаминовых. Способность аминогруш. боковых радикалов остатков дпзина к карбаматообразованию доказана для некоторых природных белков (УУИЬтап. & , Цьс^. , 1981).

Ложно полагать-, что прямо противоположные изменения в содержании белковых аминных и , -С00Н груш при данном гипокся-чэскоы воздействии взаимосвязаны а определяются вероятно, разрушением пиенно карбаютовых группировок з составе белков. В этой связи, отмеченный выие эффект скитания количества в белках , у

-СООН групп следует считать в определенной степени "артефактом", поскольку он, будучи не связанным с азменением количества и свойств боковых радикалов аспарагановой я глютаминовой кислот, обусловливается потерей белками углекислого газа вследствие разру-

шения карбаминовых связей. Определенные количественные несоответствия в отмеченных сдвигах (преобладание роста количества ^//¿-г-рупл над снижением содержания -С00Н груш) могут опре-

деляться тем, что область ионизации карбаминовых груш белков лишь частично перекрывается с областью ионизации £ , -СОШ групп в верхнем ее диапазоне, о чем уже говорилось выше.

Таблица 6. Содержание аминных групп в белках мозга крыс после одночасового воздействия на организм гипоксической газовой смеси и гипоксической газовой смеси с добавлением 10% С02 (мкН'г белка; М + пг)

Тип функциональных Гипоксическая смесь /ь = 12 Гипоксическая смесь с СО? /г = 10 4

групп I 1 2 3 I | 2 3

Аминные при рй=9,0 929±21 938±25 р< 0,001 р«£0,01 961224 р^0,01 847±29 89б±33 р ¿0,05й 859±16 р 0,01*

Аминнне при рВ=7,4 685±14 718±21 738-19 620±26 679±25 рс0,05* 654±13 р^0,05 р<0,01*

% выявляз- ?3,7±0,9 7б,5±0,5 76,8±0,4 73,2±1,0 75,8±0,9 7б,1±0,5 Р<0,01 р-<0,0Г р-сО.ОО! р<0,01 р<г0,01 р-с0,001

Примечание: значения "р" даны в сравнении с контрольными цифрами, приведенными в таблице 2; рК - в сравнении с гяпокси-ческим воздействием.

. Из представленных материалов следует, что, вероятно, я в норме, то есть у контрольных животных, какая-то часть аминогрупп в белках мозга пребывает в связанном с углекислым газсм состоянии. Непосредственной же причиной высвобождения С0£ из карбаминошх связей в белках при гипоксической гипоксии моюзт быть всегда ей сопутствующая гипокапния, обусловливающая падение тканевого напряжения СО2. Известно, что способность к карбаматообразованию у белков линейно зависит от концентрации С0£ в среде (йи/скЛаЛяС £?, & й. "г./гл.к.o¿ 10*. Л". % 1979). В этой связи выявленные изменения в функциональных группах белков мозга при гипоксическом воздействии на организм можно рассматривать как проявление адаптивных процессов в нервной ткани, направленных на поддержание в ней исходного значения рСХ^.

Несмотря на значительные изменения в кислотно-основных свойствах белков мозга, в данной серии экспериментов не было выявлено

изменений в содержании и реакционной способности пх сульфгидриль-ных групп. По-еидикому, флуктуации зарядов на "поверхности" белковых глобул, обусловленные изменением соотношения аминннх и карбоксильных групп в связи с «токсическим воздействием не вызывают глубоких, то есть более грубых, структурных перестроек белковых молекул.

Для предотвращения гипокалния, которая в значительной мере может отягощать гапохсические состояния, во вдыхаемую газовую смесь рекомендуют, как известно, вводить углекислоту.

Наши исследования показали, что при вдыхании гипоксической газовой смеси, обогащенной 10% С0£, изменения в аминных и карбоксильных группах белков (таблицы 5 и 6) уке не носят столь выраженного характера и при той ?.з направленности они не были статистически достоверный. Что касается ашдных групп, то при исследованном гипоксическо-гиперкашшческом воздействии изменения отмечаются только в белках продолговатого мозга и сводятся она к ослаблению прочности акидаых связей. Свидетельством этому является значительное (в 2,5 раза) возрастание коэффициента ЛАГД1АГ. Это еще раз подтверждает, что лабидизецая амндных связей является характерным проявлением ответной реак1?1и белков фялогенетячсскн наиболее древнего образования мозга на вдыхание газовых скесей с повышенной концентрацией

Следовательно, целесообразность введения во вдыхаемую гипокси-че с куп гаэовуа сшсь СО^ могят быть обоснована из только физиологические эффектам этого газа, но а установленные фактом его нормализующего зоздействая на содержание п состояние ф^;-*етр1ональных груш а белках козга.

ВЫВОДЫ:

1. Одкочасовоз эдыхание воздуха в «геса с 10% СО2 (гзперкап-ническое воздействие) приводит к повьшеняв содержания в белках кэзга >3 , ^-карбоксильных а снижению уровня аз-янклх и амидных групп. Содержание с^-карбоксильных а сульфглдр 'ьних групп, а такта реакционная способность'последних по отяосению я модифицирующему реагенту (ДЭДБК) остается при этом неязияздоя.

2. Вдихаккв а течение часа в нориобарячзекнх условиях атмосфера чистого кислорода понижает общув ашдарованность белков промежуточного и среднего мозга я повшает лабильность амидных связей в белках продолговатого мозга. Отмеченное пря этом воздействии воз-

растание уровня белковых аианных групп, выявляемых реакцией с ШБС при рН = 7,4, а также некоторый рост количества od-COOH групп свидетельствуют о неблагоприятной направленности изменений в состоянии белков мозга при избыточной оксягенации организма.

3. Добавление 10% углекислого газа к вдыхаемому кислороду усиливает его отрицательное воздействие на белковые структуры мозга, Свидетельством этого является: частичная потеря белками всех отделов мозга амидного азота, лабилизация остающихся адшдных связей, повышение содержания аминных, всех типов карбоксильных групп, включая ^-карбоксильные, а также общих а легкодоступных сульфгид-рильных групп. В своей совокупности эти изменения можно считать результатом не только определенных конформационных перестроек белков мозга, но и их усиленного протеолитического расщепления.

4. Вдыхание гипокоической газовой смеси, содержащей 10% кислорода и 50% азота, не отражается на содержании в белках амидных, о< -карбоксильных и общих сульфгидрильных груш. Шесте с тем, данное воздействие приводит к снижению уровня J>, У" -карбоксильных и увеличению содержания в белках всех отделов мозга аминных групп, что сочетается со снижением процента их выявляемости при рН = 7,4. Как следствие этих изменений, отмечено повышение щелочных свойств белков, что не влияет однако на доступность отдельных классов их SH-групп для модифицирующего реагента.

5. Воздействие на организм гипоксическо-гиперкапнической газовой среды 60% $2 + 10% Og + 10% COg) не отражается на кислотно-основных свойствах белков мозга и не вызывает тех изменений в изученных функциональных группах, которые характерны для раздельного влияния как гипоксического, так и гиперкапнического факторов. Эти данные указывают на целесообразность добавления COg к вдыхаемой гипоксической газовой смеси.

6. Во всех случаях вдыхания гиперкалначеских газовых смесей наиболее выраженные изменения отмечается со стороны функциональных групп белков продолговатого мозга, тогда как при гипероксическом

л гипоксическом воздействиях более подвержены изменениям белки больших полушарий,промежуточного и среднего мозга.

7. Полученные данные в совокупности свидетельствует о непосредственном участия белков головного мозга в общей ответной реакции нервной ткани на вдыхание различных газовых смесей и об определенной роли их функциональных групп в поддержании кислотно-щелочного баланса в нейрональном цятозоле.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Длительные ингаляции кислорода не могут быть рекомендованы больным с нарушенным процессом элиминации COg из организма.

2. Применение с лечебной целью газовых смесей типа "карбоге-на" необходимо проводить под контролем pCOg в крови.

3. При создании искусственной атмосферы в замкнутых пространствах применительно к конкретным целям пребывания в них человека

и разработке систем ее регенерации необходимо учитывать крайне отрицательное влияние на организм смеси высоких концентраций кислорода и углекислого газа.

4. Одной из мер борьбы с последствиями гипоксической гипоксии должно быть устранение тканевой гипокапнии.

Основные положения диссертации изложены в следующих работах:

1. Киреенкова Т.И., Стунжас Н.М. Влияние атмосферы различного состава на содержание аминного азота в растворимых белках головного мозга крыс // 3-й Всесоюзный биохимический съезд. - Рига, октябрь 1974. - T.I. - С.193.

2. Стунжас Н.М., Горенкова Т.И. Изменение содержания некоторых функциональных групп растворимых белков головного мозга крыс в условиях их пребывания в атмосфере различного газового состава // Л1 нейрохимическая конференция. Ленинград, 1976. - С.161.

3. Козлов Н.Б., Горенкова Т.И. Функциональные группы растворимых белков головного мозга в условиях нормобарической гипоксии, гипероксии и их сочетания с гиперкапнией // X Всесоюзная конференция по биохимии нераной системы. Фундаментальны*,- достижения нейро-химии - медицине. - Горький, 1987. - С.44-45.

4. Горенкова Т.И. Амидные и карбоксильные группы белков мозга животных в условиях нормобарического воздействия на организм некоторых газовых смесей. - Смоленск, 1987. Депонировано в ВИНИ1И 23.09.87, Р 6842. - В87. - 28 с.

5. Горенкова Т.И. Аминные и сулвфгидрильные группы белков мозга животных при вдыхании газовых смесей с и :оким содержанием кислорода и углекислого газа. - Смоленск, 1989. Депонировано в ВИНИТИ 20.12.89, 9 7537 - В89. - 29 с.

НК 0Н9В. Подписано к печати 05.90 Формат бумаги 60Х84'/|» Тир.100 Зак. ¿6-10 Печ. листов У

Смоленская городская типография Упрполиграфнэдата Смоленского облисполкома Индекс 214000, ул. Маршала Жукова, 16