Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональное состояние антиоксидантной системы и перекисное окисление липидов в крови у здоровых телят и при диарее

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние антиоксидантной системы и перекисное окисление липидов в крови у здоровых телят и при диарее"

ВИТЕБСКАЯ ОРДЕНА «ЗНАК ПОЧЕТА» ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

?тс ОД

- у ум иа

УДК 63б.22/.28:б12.015:577.12

ГЕРМАНОВИЧ Hataлья Юрьевна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В КРОВИ У ЗДОРОВЫХ ТЕЛЯТ И ПРИ ДИАРЕЕ

03.00.04-Биохимия 03.00.13 - Физиология человека и животных

Ашореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических нлук

ВИТЕБСК, 2000

Работа выполнена в Витебской государственной академии ветеринарной медицины

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.М. Холод.

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник И.З. Севрюк

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор, А.А.Чиркин

кандидат биологических наук, доцент Н.С. Мотузко

Оппонирующая организация-Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится «31» мая 2000 года в 14°" часов на заседании совета по защите диссертаций К 05.33.01 в Витебскойордена «Знак Почета» государственной академии ветеринарной медицины' по адресу. 210602, г. Витебск, ул. 1-я Доватора, 7/11, государственная академия ветеринарной медицины, тел. 37-06-83.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Витебской ордена «Знак П чета» государственной академии ветеринарной медицины

Автореферат разослан <Л£ » ¿1 /у^'ДчЧ 2000 г.

Ученый секретарь совета-по защите диссертаций ©// Г.Толкач

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы диссертации В последние десятилетия вопросы псрекисного окисления лппндон (ПОЛ) привлекают внимание как отечественных (А.И. Арчлков, 1983; H.IJ. Афанасьев, 1984; М.В Борисюк. с соавт, 1996; E.H. Бурлакона, 1976), так и зарубежных ученых (H.S. Basaga, 1990; D. Cornwell, 1986; M.R. Clemens. 1987). Звенья аптиоксидантной системы (АОС) и механизмы защиты от свободных радикалов, а также вопросы видовой специфичности к настоящему времени изучены достаточно полно, однако, относятся в основном к лабораторным животным и людям (F. Ursini, 1986; N. Hogg, 1998). Сведения о про-оксидантно-антиоксидантном равновесии в организме сельскохозяйственных животных, особенно крупного рогатого скота, весьма ограничены как числом публикаций, так и количеством изучаемых параметров (K.M. Аль-Кудзх, 1991; Г.Л. Антоняк, 1998; А.Р. Мяльдзин, 1990; М.И. Редкий, 1996). Вместе с тем, современные интенсивные технологии производства молока и мяса предполагают наличие многочисленных факторов, не отвечающих эволюци-онно обусловленной физиологии животных, что приводит к развитию стрессовых ситуаций и сопровождается значительными сдвигами в гомеостазе организма (С.И. Млященко, В.Т. Сидоров, 1987; Ф.И. Фурдуй, 1986). По сведениям отечественных ученых, важную роль в запуске каскадных реакций в отпет на стрессовую ситуацию играют промежуточные метаболиты ПОЛ, в то время как компоненты АОС во многом ответственны за леспецифическую резистентность и адаптационные возможности организма (В.А. Барабой, 1991; Н.Б. Поберезкина, Л.Ф. Осинская, 1989). Поэтому актуальным является комплексное изучение функционального состояния аптиоксидантной системы и интенсивности перекисного окисления липидов, характеризующих прооксидантно-антиоксидантное равновесие, у животных, наиболее подверженных действию неблагоприятных факторов внешней среды - у стельных коров и телят раннего постнатального периода развития.

Свял, работы с крупными научными программами, темами Работа проводилась в соответствии с направлением исследований Витебской государственной академии ветеринарной медицины на 1996-2000гг.: «На основе изучения иммунной реактивности, этиологии и механизмов развития различных видов патологии усовершенствовать существующие и разработать новые средства и способы диагностики, профилактики и лечения незаразных и заразных болезней животных, а также определить условия получения продукции животноводства высокого ветеринарного качества». Выполнена в рамках темы кафедры химии «Изучение химического состава биологических жидкостей, органов и тканей и его связь со здоровьем сельскохозяйственных животных», Госрегистрация № 19981779. Данная работа является разделом Государственной программы фундаментальных исследований "Изучение механизмов и процессов саморегуляции функций с целью разработки методов коррекции состояния организма» («Гомеостаз - 39»).

Цель и задачи исследования Цель настоящей работы - установить характер изменений функционального состояния антиоксидантной системы и процессов перекисного окисления липидов в крови телят раннего постнатального периода развития в зависимости от возраста и состояния здоровья.

В ходе исследования представлялось необходимым решить следующие задачи:

1. Изучить взаимосвязь состояния антиоксидантной системы и уровня перекисного окисления липидов у глубокостельных коров с состоянием здоровья полученных от них телят;

2. Изучить функциональное состояние антиоксидантной системы и интенсивность перекисного окисления липидов у здоровых телят и при диарее;

3. В опыте in vitro выяснить влияние некоторых лекарственных препаратов, применяемых для лечения больных животных, на биохимические параметры эритроцитов.

Объект и предмет исследования Объектом исследования являлись глубокостельные коровы и телята раннего постнатального периода развития. 1 !редметом исследования служила цельная кровь и ее составные компоненты - эритроциты, плазма (сыворотка).

Гшоп tew

Признание за процессами образования и нейтрализации свободных радикалов и пероксидных соединений роли ведущего унифицированного механизма неспецифической резистентности организма животных.

Методология и методы проведенного исследования В основу работы положен аналитический метод экспериментальной биохимии, который позволяет понять закономерности протекающих в организме процессов, а также их взаимосвязь с окружающей средой. В работе применяли биохимические и общеклинические методы. При обработке и анализе полученных данных применялись статистические методы исследования.

Научная новизна и значимость полученных результатов Получены новые сведения по возрастной динамике интенсивности процессов ПОЛ и состояния антиоксидантной системы в крови телят в раннем постнатальном онтогенезе. Продемонстрирован фазовый характер изменений активности антиоксидантных ферментов в крови здоровых телят в первые три недели жизни. Определены прооксидантно-антиоксидантные соотношения в кропи глубокостельных коров и установлена взаимосвязь их с состоянием здоровья приплода. Усовершенствован метод определения антиокислительной активности плазмы крови для крупного рогатого скота. Установлена взаимосвязь дисбаланса в прооксидантно-антиоксидантном равнове-

сми с заболеваниями телят диареей и степенью ее 1яжсстп. В опыте in vitro определено п.тяипс некоторых лскарстпснных препаратов на показатели аи-тиокендни.тнон системы зрнтроцитои телят.

Практическая значимость полученных pciy.ibniiiiiioii

Полученные экспериментальные данные по соотношениям активностей антиоксидантных ферментов у глубокостельных корон Moiyr быть.использо-вапы в качестве дополнительных тестов при определении напряженности ферментативного звена антиоксидантной защиты и выделения коров с субклиническими формами нарушения обмена веществ.

Адаптированный нами метод определения антиокислительной активности плазмы крови для крупного рогатого скота может использоваться для оценки буферной мощности неферментативного звена антиоксидантной системы, как у коров, так и у телят.

Экспериментальные данные по динамике активности антиоксидантпых ферментов и интенсивности процессов ПОЛ у телят раннего постиа-тальиого периода, могут быть рекомендованы как справочный материал по возрастной и клинической биохимии крупного рогатого скота.

Рекомендуется комплексное использование определения удельного содержания малонового диальдегида, антиокислительной активности плазмы крови, содержания восстановленного глутатиона и активности основных ан-тиоксидантиых ферментов, позволяющее оценивать прооксидантно-антиоксидантное равновесие в крови животных, для разработки профилактических мероприятий, а также при выборе адекватной стратегии лечения телят с диареей незаразного происхождения.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Особенности антиоксидантной защиты и перекисного окисления липидов в кропи у глубокостельпых коров и их влияние на здоровье телят.

2. Возрастная динамика интенсивности перекисного окисления липидов и состояния антиоксидантной системы у клинически здоровых телят в раннем ностнатальном периоде.

3. Функциональное состояние антиоксидантной системы и перекисное окисление липидов крови телят при диарее.

4. Биохимические показатели эритроцитов телят в опыте in vitro при действии лекарственных препаратов.

Личный вклад соискателя

Вся биохимическая часть исследований, статистическая обработка полученных результатов и их анализ выполнены соискателем самостоятельно и в полном объеме. Помощь при взятии крови, постановке диагноза и оценке клинического состояния животного оказывали сотрудники проблемной на-

учно-исследовательской лаборатории иммунопатологии животных и болезней молодняка ВГАВМ.

Апробация результатов диссертации

Результаты исследований доложены и обсуждены на 11 Международной конференции «Проблемы неинфекционной патологии животных» (Белая Церковь, 4-5 июня 1998г.), Н научно-практической конференции "Иаука-производству" (г. Гродно, ноябрь 1998г.), 11 Международной научно-практической конференции "Ветеринарные и зооинженерные проблемы в животноводстве и научно-методическое обеспечение учебного процесса" (г. Витебск, 1997), на научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки (ветеринарной лаборатории в Петербурге) (Санкт-Петербург, 1998); на Ш Международной научно-практической конференции (г. Витебск, 4-5 ноября 1999г.); на итоговых конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых Витебской государственной академии ветеринарной медицины (1997, 1998, 1999).

Onубликовапн ость результатоа

По материалам исследований опубликовано 8 работ (4 из которых без соавторов), в том числе 1 статья в журнале «Весщ Акадэми аграрных навук Рэспублш Беларусь", в которых изложены основные положения выполненных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста компьютерного исполнения; состоит из введения, общей характеристики работы, основной части, включающей три главы (обзор литературы, общая концепция и основные методы исследования, результаты собственных исследований), заключения, выводов, практических предложений, списка использованных источников и приложений. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 17 рисунками. Библиографический указатель содержит 145 работ на русском и 109 на иностранных языках.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Обзор литературы по теме и выбор направлении исследований

В обзоре литературы рассмотрены строение и свойства активных форм кислорода, а также их роль в перекисном окислении липидов, биологические аспекты протекания реакций ПОЛ, уровни и составные компоненты антиок-сидантиои системы организма. Рассмотрена роль ПОЛ в развитии патологических процессов в целом и в патогенезе желудочно-кишечных заболеваний

в частности. Обосновывается целесообразность изучения функционального состояния антиоксидантиой системы и интенсивности переписного окисления липидон у телят, содержащихся в условиях промышленных животноводческих комплексов, п ранний постиатальный период.

Общая концепция к основные методы исследования

Работа выполнялась в проблемной научно-исследовательской лаборатории иммунопатологии животных и болезней молодняка и лаборатории кафедры химии Витебской государственной академии ветеринарной медицины в 1996-1999 годах.

Объектами исследования служили 28 стельных коров приблизительно за две недели до отела и телята раннего постнатального периода развития. Выделение стельных коров в группы проводилось с использованием кластерного анализа. Телят исследовали до приема молозива и в 1, 3-4, 6-7, 1012, 15-16 и 20-21 сутки жизни, и в эти же сроки осуществляли взятие крови для биохимических исследований. Количество животных в группах составляло 5-8 голов. По результатам клинических исследований телят разделили на 3 группы. В первую группу вошли здоровые телята, во вторую - телята с диареей легкой степени, в третью - с диареей тяжелой степени. Объектом исследования в опыте in vitro служили эритроциты, полученные от 6 больных диареей телят.

Для оценки функционального состояния ферментативного звена антиоксидантиой системы, мы определяли активность каталазы (КАТ), глутати-онпероксидазы (ГП1), глутатионредуктазы (ГР) и супероксиддисмутазы (СОД). Активность каталазы (1.11.1.6.) в эритроцитах и сыворотке определяли по методу М.А. Королюк с соавт. (1988). Принцип метода основан на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс с максимумом поглощения при Х=410 нм. Активность глутатионпероксидазы (1.11.1.9.) с перекисью водорода в качестве субстрата определяли методом D.D. Hafeman et al. (1974). Для определения активности глутатионредуктазы (1.6.4.2.) использовали спектрофо-тометрический метод, в котором мерой активности фермента является скорость окисления НАДФН, регистрируемая по уменьшению поглощения восстановленного НАДФ при длине волны 340 нм (Л.Б. Юсупова, 1989). Активность супероксиддисмутазы (1.15.1.1.) определяли спектрофотометри-чески по методу, предложенному В.А Костюк с соавт.(1984). Принцип метода основан на определении степени торможения реакции окисления кверцетина. За I условную единицу активности фермента принимали 50% ингибирования.

В качестве параметров, характеризующих неферментативное звено антиоксидантиой системы крови, мы выбрали антиокислительную активность (АОА) плазмы крови н концентрацию восстановленного глутатиона (GSH).

Антиокислительную активность шшзмы крови определяли по методу, основанному на исследовании кинетики окисления восстановленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола в присутствии и отсутствии биологического материала (B.J1. Семенов, A.M. Ярош, 1985) в нашей модификации [5]. Концентрацию восстановленного глутатиоиа определяли по методу J. Scdlak, R. Lindsay (1968) по окрашиванию продукта конденсации свободного GSH и реактива Эллмана при длине волны 412 им.

Для оценки интенсивности процессов ПОЛ мы измеряли содержание первичных - диеновых конъюгатов (ДК) и вторичных - малонового диапьде-гида (МДА) продуктов ПОЛ. Содержание диеновых конъюгатов определяли в гептан-изопропанольных экстрактах эритроцитов по методике Е.И. Львовской, И.А. Волчегорского с соавт.(1991). Концентрацию малонового диальдегида определяли по методу Ohkawa Н.(1979), в модификации работе Гаврилова с соавт.(1987).

Концентрацию общего белка сыворотки крови, общего холестерина, мочевины, общего билирубина, гемоглобина и метгемоглобина определяли унифицированными методами с помощью наборов НТК «Анализ - X». Концентрацию общих липидов определяли в гептан-изопропанольных экстрактах при помощи наборов той же фирмы.

В опыте in vitro получали эритроцитарную суспензию путем центрифугирования крови при 4°С и 300 g в течение 15 минут. Эритроциты трижды отмывали в 4 объемах 0,9% раствора натрия хлорида и ресуспендировали в изотоническом фосфатном буфере рН 7,4 с учетом гематокрита. В полученную суспензию добавляли растворы таких лекарственных веществ, как натрия гипохлорит, гемодез, изотонический раствор натрия хлорида и гидроли-зат казеина, в концентрациях, соответствующих терапевтическим, и инкубировали при 37° С в течение 5, 10, 20 и 30 минут. По истечении указанного срока эритроциты разрушали лизисом бидистиллированной водой. В полученных гемолизатах определяли активность каталазы, содержание восстановленного глутатиона, общих липидов и холестерина.

Цифровой материал обработан статистически с использованием программ «STADIA» и «EXEL».

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Прооксидантно-антиоксидантное равновесие в эритроцитах глубокостельных коров и его взаимосвязь с состоянием здоровья телят

При анализе результатов исследований выяснилось, что такие показатели, как содержание МДА в эритроцитах и плазме, супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в эритроцитах, антиокислителыюй активности плазмы имели значительные вариации у исследуемых животных. Это позволило нам сформировать 3 группы животных при помощи кластерного анализа (ди-визивная стратегия) с последующей проверкой правильности разделения на кластеры с помощью дискриминантного анализа.

У животных 1-ой группы содержание МДА в сыворотке по отношению к животным 2-ой группы было выше на 17,78% и по отношению к животным З-ей группы - на 44,04%. Более существенные рст/ычия в группах о казались не между абсолютными значениями МДА, а между удельными. Различия в содержании МДА в эритроцитах менее выражены, чем в плазме, что может свидетельствовать о более мошной антноксидаитной системе эритроцитов.

Однако содержание первичных продуктов ПОЛ у животных всех групп статистически достоверно не различалось и составляло соответственно по группам 0,881+0,065; 0,838+0,031 и 0,88010,029 отн. ед. Окислительный индекс липидоп эритроцитов также значительно не различался по группам и составил соответственно 0,63510,027; 0,625+0,026 и 0,634+0,0724 отн. ед. Полученные результаты свидетельствует о том, что интенсивность ПОЛ на этапах инициирования и развития цепи одинакова у животных всех групп, но вследствие различной буферной емкости антноксидаитной системы происходит различное накопление вторичных продуктов ПОЛ.

АОА плазмы крови у животных З-ей группы была максимальной и составила 1,3310,122-10* л мл'^мин'1, у животных 1-ой группы - минимальной и составила 0,334+0,146-10"3 л-мл''-мин"', а у животных 2-ой группы занимала промежуточное положение между значениями крайних групп и составила 0,51710,016 лмл-мин-10" \ Удельное содержание восстановленного глутатио-на в эритроцитах статистически достоверных различий не имело, однако наблюдалась тенденция к увеличению показателя у коров 2-ой группы (выше на 13,76% и на 8,63%, чем у коров 1-ой и З-ей групп соответственно).

Активность каталазы существенных различий по группам не имела и составила 33,3611,32; 38,8811,93; 33,2111,59 ммоль/мингНЬ. Активность глутатионредуктазы также у животных всех групп статистически достоверных различий не имела, в то время как различия в активности глутатионпе-роксидазы и супероксиддисмутазы были более резко выражены.

Вышеизложенные данные свидетельствуют о разнонаправленных изменениях активности аитиоксидантных ферментов по группам животных. Вместе с тем, следует отметить, что анализ активностей отдельных ферментов, хотя и дает представление о состоянии системы антиперекисной защиты, однако не позволяет судить о степени сбалансированности протекания ферментативных процессов этой системы. Наиболее полно характеризуют механизм их взаимосвязи отношения СОД/КАТ, СОД/ГП, КАТ/ГП и ГР/ГП. Связующий субстрат для первых трех - перекись водорода, для последнего -восстановленный глутатион.

Так, у коров 1, 2 и 3 группы соотношение СОД/КАТ составило соответственно 0,029+0,0014; 0,04910,025 и 0,04010,0055 ед. Низкая активности СОД на фоне достаточно высокой активности каталазы может объясняться инактивацией фермента перекисью водорода. У коров всех групп отмечались достаточно высокие значения соотношения КАТ/ГП-6,2510,499; 6,1210,187; 5,4910,196 соответственно по группам. Приведенные выше соотношения ак-

тивиости антиоксидантных ферментов свидетельст вуют о высокой значимости каталазного пути инактивации пероксидаводорода в эритроцитах глубокостельных коров и его преимушественности по сравнению с глутатионпе-роксидазным путем. При анализе соотношснм активности антиоксидантных ферментов по группам животных оказалось, что у корой 1-ой группы по отношению к коровам 2-ой группы более низкое соотношение СОД/КАТ и СОД/ГП ( на 40,8% и 40,46% соответственно) при практически одинаковом соотношении КАТ/ГП и ГР/ГГ1. Это указывает на определенный дисбаланс в функционировании ферментативной АОС у воров 1-ой группы.

У телят, родившихся от коров первой фуппы, была наименьшая живая масса при рождении. У них регистрировали признаки физиологической незрелости. У животных, полученных от жоров второй и третьей групп, живая масса была несколько большей. Они также были более подвижны и имели удовлетворительный аппетит.

Все новорожденные телята, полученные от коров первой группы и третьей групп, заболевали на 4-5 сутки" жизни с признаками диареи. 11 (64,6%) телят, полученные от коров второй группы, также заболевали. Однако длительность и тяжесть болезни были наибольшими у телят нерпой группы -5,6± 1,21 суток, во второй группе -3,8 ± 0,37, в третьей - 4,0 ± 0,68 суток. Для лечения животных использовали диетотерапию, а также проти-вомикробную (антибиотики) и антитоксическую (натрия гипохлорит) терапию.

Интенсивность процессов ПОЛ и активность антиоксидантных ферменток в крови у клинически здоровых телят в ранний постнатальнмн период

В крови телят сразу после рождения отмечается низкое содержание продуктов ПОЛ, что связано с особенностями внутриутробного развития млекопитающих. После приема молозива содержание продуктов ПОЛ резко повышается. Содержание первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюга-тов - к концу 1-ых суток увеличивается в 1,58 раза по сравнению с их содержанием у животных, не получавших молозива. Так, удельное содержанке МДА в эритроцитах к концу первых суток повысилось в 1,75 раза, а в сыворотке - в 2,25 раза. Активация процессов перекисного окисления липидов в период постнатальной адаптации новорожденных телят в значительной мере обусловлена состоянием послеродовой гипероксии. Для МДА наблюдается второй пик повышения содержания на 6-7 сутки жизни. Так, по сравнению с предыдущим сроком исследования, концентрация МДА возросла в эритроцитах в 1,29 раз, а в сыворотке ~в 1,65 раз. Характерен и тот факт, что динамика содержания МДА в сыворотке и эритроцитах аналогична, хотя в эритроцитах наблюдается меньше-е, по сравнению с сывороткой, накопление вторичных продуктов ПОЛ.

Для оценки становления прооксидантно-антиоксидантного равновесия мы изучили возрастную динамику неферментативного звена антиоксидант-ной системы крови - антиокислительной активности плазмы крови и содер-

жаиис восстановленного глутатиона, представляющие звенья нефсрмепта-тпвпоП ЛОС. Динамика содержания восстановленного глутатиона в эритроцитах и плазме здоровых телят в первые сутки жизни имеет одинаковую направленность - к снижению уровня трипептида, а в последующем находится в лротивофазс. Снижение восстановленного глутатиона в эритроцитах в первые сутки жизни коррелирует с повышением содержания МДЛ. На 6-7 сутки также наблюдается снижение содержания восстановленного глутатиона на фойе повышения содержания МДА. В отличие от эритроцитов, »плазме динамика содержания восстановленного глутатиона и МДЛ носит сходный характер. Так, до 3-их суток происходит снижение содержания восстановленного глутатиона в плазме на фоне снижения МДА. На 6-7 сутки наблюдаются пики как и содержании МДА, так и в содержании восстановленного глутатиона. Следовательно, в плазме в обезвреживании продуктов ПОЛ задействованы другие механизмы.

Активность каталазы к концу первых суток жизни возрастает как в эритроцитах, так и в сыворотке, однако максимальный пик активности сывороточного фермента наблюдается на 3-й сутки жизни, тогда какэритроци-тарного - к концу первых суток. Вполне возможно, что к третьим суткам жизни происходит выход фермента из эритроцитов в сыворотку вследствие нарушения целостности эритроцитарной мембраны.

До 4-5 суток повышение активности глутатионпероксидазы сопровождает повышение активности глутатионредуктазы, в более поздние сроки исследования происходит инверсия в тенденциях.

Интенсивность процессов перекненого окисления лнпидов и активность, энтиоксидаитных ферментов в крови у телят при диарее

У животных второй опытной группы до 15-16 суточного возраста содержание ДК статистически достоверно по сравнению с клинически здоровыми животными не изменялось, а в 15-16 дневном возрасте и 20-21- дневном было выше на 11,55% и 13,36% соответственно по сравнению со здоровыми животными (см. табл.). У животных 3-ей группы увеличение содержания первичных продуктов ПОЛ происходило уже в 6-7 -дневном возрасте и по сравнению с животными 1-ой группы составило соответственно 16,53 %; 18,73 %; 19,4 1% и 18,39 % на 6-7, 10-12, 15-16 и 20-21 сутки жизни телят. Полученные данные свидетельствуют об интенсификации процессов ПОЛ на стадии образования конъюгированных диенов при диарее.

Чтобы более объективно оценивать интенсивность ПОЛ, мы изучали также удельное содержание одного из вторичных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида в сыворотке и эритроцитах. У животных 2-ой опытной группы содержание МДА на 4-5 сутки жизни было выше, чем у телят первой группы, на 27,8%, на 6-7 сутки жизни достоверно не отличалось от содержания у здоровых телят, а на 10-12 сутки жизни превышение составило 69,12%, на 15-16 и 20-21 сутки соответственно на 40,85% и 50,85 %. У живот-

ных третьей опытной группы содержание данного метаболита было досто-оерно выше такового у животных 1-ой группы во все временные интервалы.

Удельное отношение малонового диальдегида к общим липидам в плазме у животных опытных групп было выше, чем в эритроцитах, что может быть обусловлено поступлением этого метаболита в сыворотку из других органов.

Анализируя вышеизложенные данные, можно сделать заключение о том, что при умеренном проявлении симптома диареи у телят до 6-7-дневного возраста интенсификация процессов ПОЛ в эритроцитах выражена незначительно. У более старших телят процессы пероксидации выражены сильнее, возможно, вследствие истощения буферных мощностей организма.

Интенсивность свободнорадикальных реакций ПОЛ на определенном уровне, необходимом для нормальной жизнедеятельности, поддерживает многоуровневая АОС. Каким образом реагируют различные звенья АОС на интенсификацию ПОЛ при различной степени тяжести диареи представляет несомненный интерес для того, чтобы соответствующим образом организовать лечебные мероприятия.

У животных второй опытной группы антиокислительная активность плазмы крови достоверно не отличалась от таковой у здоровых телят. У животных 3-ей группы в возрасте 6-7 суток данный показатель превышал значения, характерные для здоровых животных, на 31,08%, тогда как в остальных возрастах, особенно на 20-21 сутки жизни, был гораздо ниже. Концентрация восстановленного глутатиона в плазме у животных 2-ой группы1-возрасте 6-7 суток был ниже на 43,26%, а в 10-12-; 15-16 -20-21 -дневном был соответственно выше на 27,85%; 37,75% и 43,95%, чем у здоровых животных. Концентрация восстановленного глутатиона в эритроцитах телят второй группы была выше, чем у здоровых животных в 4-5 -дневном возрасте на 12,24%, в6-7-дневном возрасте-на50,21%, 10-12-дневном возрасте-на 28,53% и ниже на 25,57% - в 20-21-дневном возрасте. У животных третьей группы в разные возрастные периоды мы отмечали разнонаправленные изменения. Так, если у 4-5-, 10-12- и 20-21-дневных телят наблюдалось снижение показателя на 26,04%, 41,55% и 22,41% соответственно, то на 6-7 сутки жизни происходило увеличение в 1,97 раза. Полученные результаты могут свидетельствовать о том, что до 10-15 дня жизни активизируются компенсаторные механизмы, тогда как в более поздние периоды наступает стадия их истощения.

Активность каталазы в эритроцитах у животных 2-ой группы была выше, чем у здоровых животных на 26,39 %; 33,66 %; 18,94 %; 158,8 % и 21,14 % в 4-5-, 6-7-; 10-12-; 15-16-и 20-21-дневном возрасте соответственно (см. табл.). У животных 3-ей группы в 4-5- и 10-12-дневном возрасте активность изучаемого фермента была ниже, чем у здоровых животных на 16,02% и 22,91% соответственно, тогда как в 6-7-; 15-16- и 20-21-дневном возрасте была выше на 58,07%; 138,24% и 36,17% соответственно.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов, активность антиоксидантных ферментов и содержание _восстановленного глутатиона в эритроцитах здоровых телят и телят с диареей_

Показатели Труп Дни жизни

пы 4-5 6-7 10-12 15-16 20-21

МДА, 1 3,95±0,303 5,11+0,407 2,8510,283 2,35+0,217 2.95+0.145

мкмоль/мг липидов 2 5,0210,309* 5.19+0.319 4.82+0.433 3,31+0.110** 4.45+0.217**

3 4,79±0.217 6,48+0.170 4,1410.134 3,61+0,059** 3.79+0.090**

1 0,872+0,0047 0,796+0,0064 0,78510,0071 0.814+0,0056 0.75610.0055

ДК, отн ед 2 0,85810,0054 0,842+0.0063** 0.841+0.0048** 0,908+0,0119** 0.85710.0089**

3 0.889+0,0050 0,92810,0092** 0.93210,0097** 0,972+0.0025** 0.895+0.0028**

СБН, ммоль/г НЬ 1 3.8410,149 2,3710,089 4,3810.071 3.6110,074 3.48+0.020

2 4,3110,019* 3,56+0,122 ** 5.6310.206** 3,48+0,041 2.59+0.098**

3 2,8410,027** 4,68±0,197** 2,56+0,106* 3.59+0.021 2.70±0.078**

СОД. уел ед/г НЬ I 0,689+0,0034 0,789+0,0042 0.867±0,0048 0,98410,0059 1.02+0.086

2 0,72110,0039* 0,792+0.0051 0,74210,0064 1.8610,073** 2.04+0.089**

3 0,59610,0051* 0,712+0,069* 0,559+0,0051** 1,69+0.072* 1.69±0.054**

КАТ, 1 19,97+0,631 17,29+0,412 28,3611,176 17,4210,712 23.42+0,853

мм оль Н2О2/Г НЬ 2 25,24+0,243** 23,11+0,309* 33,7310,336** 45,2610,253*** 28.37+0.580*

3 16,77+0,140** 27,33+0,747** 21,8610,407 41,50+0,373*** 31.89±0.219**

ГП, 1 5,76+0,134 6,0110,274 3,84±0,121 9,1310.045 8.05+0.172

ммоль ОБН/мин- г НЬ 2 5,7310,126 6,81+0.062* 5,29+0.059** 9,3510.041 11,31+0.216**

3 6,05±0.060 7,7210.056** 9,64+0,187*** 5,9010.049** 5.49+0.114*

ГР, 1 6,13+0,153 3,7610,339 5,0910,604 3,9610,118 1.98+0.090

мкмоль НАДФН/ мин- г НЬ 2 6,19±0,151 6,29+0,104** 4,9810,210 3,3510,129* 5.8310.174***

3 5,3710,038** 5,3310.031** 2.04Ю.086** 2,7110,058** 3.47+0.074**

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,01. *** - р<0,001 (по отношению ктелятам 1 группы): 1 группа - пороные телята: 2 группа - телята с диареей легкой степени; 3 группа - телята с диареей тяжелой степени

Активность каталазы в сыворотке крови у телят второй и третьей групп всех возрастных периодов, за исключением 10-12-днсвного возраста, была выше, чем у здоровых животных. Полученные данные могут свидетельство-мать о том, что у телят с симптомокомплсксом диареи нарушается целостность мембран не только эритроцитов, но и клеток различных органов, так как активность каталазы в сыворотке очень мала и ее повышение свидетельствует об активизации цитолитических процессов.

Активность глутатионпероксидазы эритроцитов у телят второй группы и 4-5 и 6-7- дневном возрасте статистически достоверно не отличалась от таковой у здоровых телят, в 10-12- и 20-21 -дневном возрасте была выше, чем у здоровых телят, на 37,76% и 40,0 % соответственно. У телят третьей группы в 6-7 - дневном возрасте активность изучаемого фермента была выше на 28,45%, а в 10-12-дневном возрасте - на 151,04%, чему здоровых животных. В 15-16-и и 20-21- дневном возрасте активность глутатионпероксидазы снижалась на 35,38 % и 31,80 % соответственно.

Активность глутатионредуктазы, обеспечивающей функционирование каталитической редокс-системы глутатиона в эритроцитах животных 2-ой группы в 4-5- дневном возрасте статистически достоверно не отличалась от тп копой у здоровых животных, а в 6-7 - и 20-21-днспном возрасте была ниже па 32,27% и 52,28% соответственно. В 10-12 - и 15-16- дневном возрасте по-нмшепие активности глутатионредуктазы соответствовало повышению глутатионпероксидазы. У животных 3-ей опытной группы в 4-5-, 10-12- и 15-16-дпсвном возрасте происходило снижение активности фермента на ¡2,89%; 59,69% и 31,56% соответственно, тогда как в 6-7- и 20-21-дневном возрасте происходило повышение активности на 41,76 % и 75,25% соответственно.

Из приведенных данных видно, что у телят при диарее наблюдаются разнонаправленные изменения в активности антиоксидантных ферментов эритроцитов на фоне интенсификации процессов ПОЛ, что определяет смещение окислительно-восстановительного равновесия в эритроцитах в окислительную сторону. Поэтому интерес представляет изучение концентрации таких метаболитов липидного, пигментного и белкового обмена, как холестерин, билирубин и мочевина, которые могут дать оценку направленности метаболических процессов. С 6-7-дневного возраста концентрация холестерина в сыворотке телят опытных групп повышена по сравнению со здоровыми животными, причем максимум повышения наблюдался у животных 1516-дневного возраста.

Концентрация билирубина у животных третьей группы значительно превышает таковую у здоровых животных (на 95,24 %; 112,32%; 242,83 %; 248,42 % соответственно в 4-5-, 6-7-, 10-12-, 15-16-дпевном возрасте), что может свидетельствовать о том, что патологический процесс при диарее тяжелой степени приобретает генерализованный характер. Тот факт, что у животных 3-ей группы 20-21-дневного возраста концентрация общего билирубина ниже на 44,82%, чем у здоровых животных того же возраста, свидетельствует о нарушении катаболизма гемоглобина. Об интенсивности процессов катаболизма белков может свидетельствовать и увеличение концен-

трации мочевины в сыворотке крови у животных опытных групп. Не менее показательно и отношение мочевина/общий белок.

Биохимические показатели эритроцитов в опыте in vitro при действии лекарственных препаратов

При действии на эритроциты, полученные от больных телят, лекарственных препаратов, применяемых на практике для лечения желудочно-кишечных заболеваний телят с симптомом диареи, в опыте in vitro обнаружено, что физиологический раствор практически не изменял содержание восстановленного глутатиона на протяжении всего периода инкубации. В действии же других лекарственных препаратов наблюдались значительные различия. При контакте эритроцитов с гидролизатом казеина в течение 5 минут не происходило значимых изменений в содержании GSH, при дальнейшей инкубации концентрация изучаемого трипептида возрастала на 29,11%; 36,71% и 42,41% соответственно 10, 20 и 30 минутам инкубации, что может быть обусловлено реакцией сульфгидрильных групп данного лекарственного препарата. При действии гемодеза на эритроциты больных телят установлено повышение концентрации GSH на 14,77%; 5,01%; 16,48% и 42,41% соответственно 5, 10, 20 и 30 минутам инкубации. Натрия гипохлорит оказывал действие, противоположное действию гемодеза. При контакте эритроцитов с ги-похлоритом натрия в течение 5 минут наблюдалось снижение количества восстановленного глутатиона на 66,19 %, в течение 10 минут - на 93,83%, а к 20-ой и 30-ой минутам инкубации концентрация данного трипептида возра-щалась к исходному уровню. Полученные данные можно объяснить окислительным действием натрия гипохлорита на сульфгидрильные группы, а возвращение к исходному уровню тем, что под действием данного лекарственного препарата происходит отщепление сульфгидрильных групп от белковых молекул. На активность каталазы лекарственные препараты, за исключением натрия гипохлорита, который статистически достоверно снижал активность фермента, влияния не оказывали. Гемодез и натрия гипохлорит в первые минуты инкубации также снижали концентрацию общего холестерина и повышали активность СОД.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные нами исследования по выяснению этиологической роли нарушения прооксидантно-антиоксидантного равновесия в системе мать-новорожденный выявили, что у части клинически здоровых глубокостельных коров наблюдается дисбаланс в функционировании антиоксидантной системы при повышенной интенсивности процессов ПОЛ, что создает предпосылки для возникновения у телят желудочно-кишечных заболеваний с диарейным синдромом.

Первые дни жизни телят отмечены чрезвычайно высокой напряженностью обменных процессов, что проявляется увеличением содержания про-

дуктов ПОЛ и скачкообразными изменениями в активности супероксиддис-мутазы, каталазы, глутатионпероксидазы. Повышение содержания МДА у клинически здоровых телят происходит на 1-ыс, 3-й и 6-7-ые сутки жизни, в го время как повышение активности антиоксидантных ферментов происходит в другие сроки, что создает определенный дисбаланс в прооксидантно-антиоксидантном равновесии и характеризует критические периоды в раннем онтогенезе. К 20-21 стукам жизни у клинически здоровых телят происходит стабилизация процессов ПОЛ на фоне повышения активности антиоксидантных ферментов и антиокислительной активности плазмы крови.

При диарее наблюдается повышение как первичных, так и вторичных продуктов ПОЛ, активности каталазы в сыворотке и эритроцитах, глутатионпероксидазы в эритроцитах. Концентрация восстановленного глутатиона в эритроцитах и сыворотке, а также антиокислительная активность при диарее легкой степени увеличивается, а при диарее тяжелой степени - значительно снижается. Выявленный дисбаланс в равновесии ПОЛ-АОС сопровождается повышением концентрации продуктов белкового катаболизма (мочевины и билирубина), а также повышением концентрации общего холестерина. Лекарственные препараты гемодез, гидролизат казеина в опыте in vitro снижают в эритроцитах концентрацию общего холестерина и повышают удельное содержание восстановленного глутатиона. Натрия гипохлорит вызывает повышение активности СОД и снижение содержания диеновых конъюгатов и общего холестерина.

ВЫВОДЫ

1. Дисбаланс между содержанием продуктов перекисного окисления липи-дов и функциональной активностью антиоксидантной системы в крови клинически здоровых глубокостельных коров, проявляющийся увеличением малонового диапьдегида на фоне снижения активности супероксидцисмутазы и глутатионпероксидазы (ГП1), приводит к рождению телят с низкими адаптационными возможностями [1,6].

2. Резкое усиление окислительных процессов у клинически здоровых телят в первые сутки жизни, выражающееся повышением концентрации малонового диальдегида, приводит к увеличению антиокислительной активности плазмы крови и активности каталазы, глутатионпероксидазы, супероксид-дисмутазы [3,4]..

3. Снижение активности глутатионредуктазы и концентрации восстановленного глутатиона на фоне повышенного содержания малонового диальдегида, отмечаемое как в 3-х, так и (или) в 6-7- дневном возрасте, может как предшествовать, так и сопровождать развитие диареи. Стабилизация процессов ПОЛ и функционального состояния антиоксидантной системы крови - как неферментативного, так и ферментативного звеньев у клинически здоровых телят происходит к 20-21 суткам жизни [7].

4. У телят раннего постнатального периода при неспецифической диарее наблюдается дисбаланс в функционировании прооксидантно-

антиоксидантного равновесия в крови телят, выражающийся в нарастании продуктов 1IOJ1 при разнонаправленных изменениях антиоксндантных ферментов и снижении концентрации исфермеатнмх антиоксидаитоп [2,7].

5. У телят при диарее сильной степени на 20-21 сутки жизни прооксидант-по-аитиокендантное равновесие резко смещено в сторону окислительных процессов, вызывающих нарушение клеточных мембран. Данные процессы сопровождаются также усилением белкового катаболизма, выражающемся в увеличении отношения мочевина/общий белок и увеличением в- сыворотке концентрации холестерина и билирубина [2].

6. Лекарственные препараты (гемодез и гидролизат казеина), применяемые для лечения телят при желудочно-кишечных заболеваниях, вызывают снижение в эритроцитах концентрации общего холестерина и повышение удельного содержания восстановленного глутатиона, в опыте in vitro [8].

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

!. Полученные данные по показателя^, характеризующим проокси-даитно-антиоксидантное равновесие в крови здоровых телят раннего постна-тального периода развития, могут быть использованы как справочный материал по возрастной и клинической биохимии и физиологии крупного рогатого скота и разработке профилактических мероприятий.

2. В качестве дополнительных тестов для выделения в группы коров и телят с метаболическим» нарушениями, предлагаем комплексно использовать концентрацию восстановленного глутатиона, активность и соотношения активностей антиоксндантных ферментов и удельные соотношения МДА/общие липиды.

3. Определение антиокислительной активности плазмы крови по скорости окисления 2,6-дихлорфенолиндофсиола рекомендуем использовать для оценки неферментатишюго звена антноксидантной системы плазмы крови у крупного рогатого скота при следующих условиях: длина волны 600 нм, концентрация плазмы в реакционной смсси 2-5 мл/л, время инкубации 3 минуты [5].

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1, Диагностические тесты для выявления метаболических нарушений у глубокостельных коров / Севрюк И.З., Макарсвич Г.Ф., Германович 11.10., Николадзе М.Г. // Ученые записки Витебской государственной академии ветеринарной медицины,- Витебск, 1998,- Т. 34.- С.71-72.

2. Метаболические нарушения у телят при острых заболеваниях желудочно-кишечного тракта / Германович Н.Ю., Холод В.М., Севрюк И.З., Белко А.А. // Весщ акадзмп аграрных навук Рэспублш Беларусь.- 1999,- №4.-

3. Германович Н.Ю. Перекисное окисление липидов у новорожденных телят // Ветеринарные и зооинженерные проблемы в животноводстве и научно-методическое обеспечение учебного процесса: Материалы 2 международной науч.-практич. конф., Витебск, 23—25 сент. 1997 г. - Мн., 1997. -С.86—87.

4. Германович Н.Ю. Некоторые аспекты перекисного окисления липидов у телят // BicHiK Бтоцерювського держ. аграр. утвер. / Проблемы неин-фскц. патол. тварин: научн. статьи 11 межд. конф.- Б1ла Церква, 4-5 червня 1998 г. ~ Белая Церковь, 1998,- Вып.5.- Ч.1.-С.168 - 170.

5. Германович Н.Ю. Изучение параметров реакции, влияющих на антиокислительную активность плазмы крови //Мат. научн,- произв. конф.- С.-Пб., 1998.- 4.1.- С. 61-62.

6. Состояние перекисного окисления липидов и аитиоксидаптной системы системы у глубокостельных коров / Германович Н.Ю., Холод В.М., Севрюк И.З., Макаревич Г.Ф. И Наука - производству: Мат. второй межд. на-учно-практ. конф.,Гродно,ноябрь 1998. -Гродно, 1998.-С. 13-16.

7. Германович Н.Ю. Состояние перекисного окисления липидов и содержание восстановленного глутатиона в крови телят с расстройствами пищеварения // Ученые записки ВГАВМ: Материалы III междунар. иаучно-практ. конф., г. Витебск, 4-5 ноября 1999 г. / ВГАВМ.- Витебск, 1999.-Т.35. - 4.2. - С.35-37.

8. Некоторые аспекты действия гипохлорита натрия на изолированные эритроциты телят / Германович Н.Ю., Мацинович A.A., Германович И.Н., Белко A.A. // Молодежь, наука, аграрное образование и производство: Сб. статей научно-практ. конф. / ВГАВМ.-Витебск, 1999.-С.53-56.

С.59-61.

РЕЗЮМЕ

Германович 11аталья Юрьевна

Функциональное состояние аитиоксидантной системы и перскисиое окисление липидов в крови у здоровых телят и при диарее

Ключевые спова: аитиоксидантная система, перекисное окисление липидов, кровь, телята, коровы, восстановленный глутатион, шипиокислителышя активность, каталаза, супероксиддисмутаза, глутатиоипероксидаза, глу-татионредуктаза, диарея.

Объектами исследования служили глубокостельные коровы, телята раннего постнатального периода развития, кровь и ее составные компоненты - эритроциты и плазма (сыворотка).

Целью настоящей работы явилось выяснение функционального состояния аитиоксидантной системы и перекисного окисления липидов в крови телят раннего постнатального периода развития и их роли в обеспечении гомеостаза. Активность антиоксидантных ферментов, содержание продуктов ПОЛ и некоторых метаболитов белкового, липидного и пигментного обмена, определяли на основе спектрофотометрических методик с использованием спектрофотометра с термостатируемой кюветой.

В результате проведенных исследований установлено, что у некоторых клинически здоровых коров выявляется недостаточкл.а функционирования аитиоксидантной системы на фоне повышенной интенсивности процессов пероксидации, что служит предпосылкой для рождения телят с низкими адаптационными возможностями. Установлено нарушение проок-сидантно-антиоксидантного равновесия в крови телят при диарее. Определение активности антиоксидантных ферментов, их соотношения, антиокислительную активность плазмы крови и содержание продуктов ПОЛ рекомендовано использовать как справочный материал по клинической и возрастной биохимии и физиологии, при написании учебников и при разработке профилактических мероприятий.

РЭЗЮМЭ Германов1ч Иаталля Юр'суна

Функцыянальнм стан антыакадантпам Ыстэмы ] лерамснае аюслспнс л'нндау у крыв! цялят 1 пры дыярэе.

Ключиаыя слоем: аиц'тксчдаптная скпгма, псракюше акЧслсиие лЫдау, узноулспы глутацШн, атрашсляльная актыунасць плазмы, катала-за, сулеракс/ддысмутаза, глутацШнперакс/даза, гпутац'шнрэдуктаза, кроу, цяпяты, каровы. дыярэя.

Аб'ектам) даследвання был'| сцельныя каровы, цяляты ранняга пост-натальиага перыяду развщця, кроу 1 яе састауныя камланенты - эрытрацы-ты 1 плазма (сыраватка).

Мэтай работы з'яв1лася высвятленне фуикцыянальнага стану ан-шакадантнай астэмы I пераюснага амслення /пшдау (ПАЛ) у крыв'1 цялят ранняга постнатальнага перыяду развщця ¡х рол'1 у забеспячэтп гамеаста-зу. Актыунасць анц1ашдантных ферментау, колькасць прадуктау ПАЛ I некаторых метабал1тау бялковага, лтщнага I шгментнага абмену вызначал'1 на падставе спсктрафатаметрычных методык з выкарастаннем спектрафа-тометра з тэрмасташруемай кюветай.

У вын'|ку праведзеных даследванняу высветлена, што у некаторых клпйчна здаровых кароу вызначаецца недастатковасць функцыяшравання аншакадантнай астэмы на фоне павышанай ¡нтэнаунасц! працэсау пе-раксщацьп, што служыць пасылам для нараджэння цялят з шзюм! адапта-цыённым! магчымасцямь Высветлена парушэнне праакс!дантна- ан-щаксшантнай раунавап у крыв'1 цялят пры дыярэе. Актыунасц1 ан-щаксщантных ферментау, ¡х суадноснасщ, анц1аюсляльную актыунасць плазмы крыв1 ! колькасць прадуктау ПАЛ рэкамендавана выкарыстоуваць як даведачны матэрыял па шпшчнай 6(ях'[мГ| 1 фЫялогн, пры иашеанш ву-чэбнжау I распрацоуке прафшактычных мерапрыемствау.

Suni mary Germanovich Natalya Y.

Functional status of'lhe antioxidant system and lipid peroxidation in the blood of healthy calves and of the diarrhea»

Key words: antioxidant system, lipid peroxidation, blood, cows, calves, reduced glutathione, antioxidant activity, catalase, superoxide dismutase, glutathione reductase, glutathione peroxidase, diarrhea.

Subjects under investigation were deeply pregnant cows, calves at the early postnatal period of the development, the blood and its components - erythrocytes and plasma (serum).

The objective of the given work is to clarify the functional status of the antioxidant system and lipid peroxidation (LPO) in the blood of calves at the early postnatal period of development and their roles in the homeostasis provision. The activity of antioxidant enzymes, LPO products compounds as well as some metabolites of protein, lipid and pigment exchanges were defined on the basis of spectrophotometry techniques the spectrophotometer with a termostaticable qu-vctte being appeied.

As the results of the given investigation it has been states that some clinically healthy cows show insufficiency of antioxidant system functioning on the background of the increased intensity of peroxidational processes, which serves as a premise for giving birth to calves with low adaptational abilities.

Prooxidant-antioxidant imbalance in calves blood has been found in case of diarrhea. The definition of antioxidant enzymes activity, their correlatrions, the antioxidant activity of blood plasma and LPO products contents are recommended to be included into monitoring investigation.