Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная роль полисахаридов Rhizobium leguminosarum bv. Viciae в бобово-ризобиальном симбиозе

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная роль полисахаридов Rhizobium leguminosarum bv. Viciae в бобово-ризобиальном симбиозе"

РГ Б и.,

2 2 МАЙ 1555 -----------

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ іи.Д.К.ЗАБОЛОТНОГО

на правах рукопису

КОСЕНКО -Лариса Вікторівна

ФУНКЦІОНАЛЬНА РОЛЬ ПОЛІСАХАРИДІВ шаговіїт ЬксиїанозАним Ьу. УІСІАЕ В БОБОВО-ШЗОБІАЛШОМУ СИМБІОЗІ

03.00.07 - мікробіологія

Авторвфер ат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Київ - 1995

Дисертацією е рукопис

Робота виконана у відділі біохімії мікроорганізмів Інститут; мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного КА.Н України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

М.Д.Луцик

доктор біологічних наук М.М.Нічик

доктор біологічних наук

І.К.Курдиш

Провідна установа: Інститут молекулярної біології

і генетика НАН України

Захист відбудеться "І/ и ХіРШХ " 1995 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 016,06.01 ш> захисту дисертацій на здобуття вченого ступеня доктора біологічних наук при Інституті мікробіології і вірусології -ім.Д.К.Заболотного НІН України за адресою:

252143, Кйїв-143, вул.Заболотного, 154

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім.Д.К.Заболотного НАН України

Автореферат дисертації розіслано "З " ОБ~ 1995 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук

Л.М.Дуріш

Актуальність проблеми. Полісахариди грають важливу роль у взаємодії бактерій з макроорганізмами. Припускається, ща ранні стадії формування симбіозу між бульбочковими бактзргя-ш /Rhizobium/ та бобовими рослинами здійсншяься за участи бактеріальних шшсахарвдів і рослинних лактячі» / si. ai- » 1981-1234, ІШ; Kijne al. , 1050, 1983, 1283, 1392; Solhein, 1975, 1983/. Ризобії: синтезують кілька типів поверхневих полісахаридів: иеетруктуровані екзополі сахариди /ЕПС/, капсулярні полісахаради/КЕС/, ліпополісахариди/ШС/, глюкани, роль яких у контролі розвитку ефективних бульбочок не диференційована. Нй визначені також фізико-хімічні особливості ризобіальннх полісахаридів, які детермінують їх біологічні властивості. Разом з тим встановлення ролі бактеріальних полісахаридів у формуванні бобово-ризобіальних структур виходить за межі вивчення симбіозу як такого. Ця проблема порушує питання специфічності бактеріально-рослинних партнерів, біохімічних основ інфекційності бактерій, імунітету рослин, механізмів загального регуляторного контролю, який дозволяв росливі-хазяїну розвивати адекватну відповідну реакцію при взаємовідносинах з різними мікропартнерами: симбіонтами, фі-топатогенами, асоціативною мікрофлорою. Крім того, здатність бульбочкових бактерій/б.б./ фіксувати атмосферний азот в екологічно чистим засобом поліпшення азотного живлення рослин і збагачення грунту азотом. Отже, дослідження ролі бактеріальних полісахаридів в бобово-ризебіальному симбіозі має важливе як теоретичне /встановлення хімічного фундаменту сумісності симбіонтів, виявлення механізмів реалізації біологічної активності бактеріальних полісахаридів, визначення місця лектин-полі-

сахарядної системи пізнавання в регуляторному контролі бульбочкового органогенезу/, так і суто практичне значення /нау-ково-обгруїковашй підбір ефектавнкх бобозо-разобіальнах пар, винайдення новшс природних /волісахарздного походження/ стимуляторів росту бобовис рослин/.

Матою -роботи було: вивчення функціональної ролі поверхне-В2Х полісахаридів Rhizobium leguminosarura. bv. viciae y формуванні ефективного бобово-ризобіалького симбіозу, виявлення зв'язку між функціонально-біологічними та фізико-хилічними ■

’ властивостями, ризобіальних полісахаридів.

В тгропесі тзоботи втоптувалися такі задачі:

1. Підбір штамів R. 1 є gumino a arum bv. viciae , що перехресно інфікують кормові боби, горох, вику і сочевицю та

' відрізштться між собою за симбіотичними властивостями.

2. Виділення та очистка полісахаридів екзогліканового ксшлексу/ЕГК/, ліпополісахарздів і глюканів із IS штамів R. leguminosaru» bv. viciae.

3. Виділення та очистка лектингн із різних сортів чотирьох рослин-хазяїв, визначення їх гвмаглвтинуючої активності та вуглеводної специфічності.

4. Визначення здатності ризобіальних полісахаридів взаємодіяти з росланциш лектинаш: і іншами природними, рецепторами та виявлення зв’язків між ступенем лею кн-по лісахаридної спорідненості симбіонтів та симбіотичними ознаками штамів і головними; показниками симбіозу, з одного боку, і фізико-хі-нічниш; параметрами полісахаридів, з іншого. ■

5. Дослідження індукторної ролі ризобіальних гліканів в нодуляційноіду процесі та формуванні ефективного симбіозу.

6. Вивчання гетарсгеняості клітинних і позаклітинних полісахаридів, встановлення їх иономерного складу, особливостей

- з - _ . _

макроструктурної організації як індивідуальних полісахаридів, так і усього полісахарндного комплексу в цілому у зв'язку з його функціонально-біологічними властивостями.

7. Вивчення впливу лехтину гороху на ріст бульбочкових бактерія гороху і біосинтез ншчт счзополісахарядіз.

8. Дослідження впливу мінерального азоту на експресію, ^Іл^іИ^лІмічиІ а^йістиксіе-РТ, ЯЯЯетЧ-р“Т^5П?0Г37 І ІІК7йХ0ї*іі' активність полісахаридів бульбочкових бактерій гороху.

Наукова новизна. На основі порівняльного вивчення функціонально-біохімічних властивостей полі сахарядів/ЕПС, КИС,

ЛПС, глюканів/ Н. Іец'итіпоеагит Ьт. уісіае вперше виявлено, до полісахариди поверхневого комплексу беруть участь у визначенні симбіотичного статусу ризобій: їх ступеня спорідненості до росянкЕ-хазягяа в перехресно заразгувакій групі бобових рослин, азотфіксуючої активності, ефективності, вірулентності, кондурентоздатності.

Вперше виявлена закономірні відаінності компонентного складу і макроструктурної організації полісахаридів клітинного і позаклітинного комплексів в залежності від симбіотичних властивостей К. 1е0ипіпозагит Ъу. Уісіае. Зрективні штамп в порівнянні з неефективними бактеріями характеризуються більшім спїБвіднощеншзи ІІЛС до низькомолекулярних клітинних полі сахариді в/Н’ДКП/, а у фракодї ШКП - більшим вмістом ге-терополі сахариду відносно клітинного глюкану; більш лабільним зв’язко:.! ЛПС з глюканом, більшим розміром О-полісахариду/О-ПС/ ЛИС, здатністю до утворення вільного фрагменту О-ПС. В ехзо-глікаковому кошлексі спостерігається більша кількість мано-зовмісного капсулярного полісахариду /МанПСД Неефективні штами синтезують меншу кількість ЛПС відносно фракції ШКП, в якій, з свою чергу, підвищується доля глюкану відносно ге-

терополісахариду; ЛПС маг менший розмір О-ПС, містить більш; кількість 3-окситетрадекаиовог кислоти; в ліпіді к. Ліпоііолі-сахаридю високоінфекційних ризобій гороху характеризуються матим вмістом сахарів, що входять до складу О-полісахариду, але більшою кількістю уронових кислот, які & компонентами кора. Екзополісахариди містять більшу кількість піровиноградної кислоти. •

Продемонстровано, сигнально-індукторні властивості ризо-біальняж полісахаридів, щодо гомологічних рослин-хазяїв.

Встановлено, що механізмом реалізації біологічної активності ризобіальних полісахаридів є система лектян-вуглеводно-го пізнавання симбіонтів. Показано, що полісахариди усіх досліджених штамів взаємодіять з лектинами усіх чотирьох рослин-хазяїв і не. зв'язуються з лектинами гетерологічних рослин /cat і пшениці/, що може, служити обгрунтуванням феномену перехресної заражуваності цілої групи бобових рослин /кормових бобів, гороху, вики і сочевиці/ бактеріями одного підвиду -

H. legwninosarum bv. viciae.

Вперше, встановлено, ща ризобіальні ЛПС виявляють найбільшу ступінь спорідненості до лектияу домінуючої рослини-хазяїна в перехресна заражуваній групі рослий. Вперше одержано біохімічні докази: взаємозв'язку факторів специфічності і ефективності в бобовот-ризобіальному симбіозі: встановлено, що> ступінь ШС-лектянової спорідненості бактеріально-рослинних партнерів, корелює із ефективністю симбіозу. І&зом з тим показано, ща не; тільки ЛИС, але глюкани і ЕПС такоа беруть участь у формуванні ефективних бульбочок: відповідність ЛПС-лактинових детермінант визначає специфічність симбіонтів, тобто рівень їх потенціальної симбіотичної ефективності,' але повнота реалізації цього потенціалу залежить від

присутності і властивостей і тих разобіальшсс глікоіндукторів..

Вперше виявлено, що в залежності від вірулентності шта-иа-продуцекту ризобіальні екзоглікани можуть виявляти різно-спрямований ефект - активувати або пригнічувати процес будь-бочкоутворення іншім гомологічним штамом. Встановлено, що у визначенні інфекційних властивостей ризобій і активності но~ дуляції беруть участь на тічм™ скссло2*с&шіждн, але таког ЛПС і пошана.

Вперше показано, що мінеральний азот, який пригнічує формування симбіозу, впливає на акценти полісахаридного синтезу ризобій, що виявляється у зміні співвідношення індивідуальних гліканів в полісахаридноиу комплексі, модифікації: ко»-понентного складу полісахаридів. Внаслідок цього порушується функціонування системи лектин-вуглеводного пізнавання симбіонтів, втрачаються сигнально-індукторні властивості полісахаридів.

На прикладі r. leguminosaxum 2526 вперше; показано, що

ризобіальні полісахариди/ЕПС, КПС, ЛПС/ мозуть бути рецепто-

і

раш власних аглютинінів бульбочкових бактерій.

Вперио встановлено, що ризобіальні ЕПС являють собов біосенсори, Бонз здатні трансформувати сигнали зовнішнього середовища в ультраззуя і- передавати його на далеку відстань від локального місця збудаення. •

Практична цінність 'роботи- Встановлені критерії симбіотичної активності б.б. Гороху /особливості компонентного складу екзогліканів і ЛПС, ступінь спорідненості ЛПС з лек-тином домінуючої рослини-хазяїна, екзогліканів - з манозо-с'пецифічкимя' лектинами/ можуть бутз використані для оцінки; штамів.при створенні нових бактеріальних добрив. Виявлена можливість стимулювати азотфіксуючу активність симбіозу додаванням ЕСС іншого штаму гомологічних ризобій може; бути вико-

ристана для підвищення врожаю сільськогосподарських культур.

Положення, які захитаються.

1. Поверхневі полісахаряда Е. Іебитіповагит Ьу. уісіае с індукторами програш розвитку ефективних бульбочок і визначають головні симбіотичні ознаки ризобій: специфічність,-азотфіксуючу активність, ефективність, вірулентність, конкурентоздатні сть.

2. Біологічні властивості ризобіадьних полісахаридів реалізуються завдяки функціонуванню багатоканального, регуляторного механізму лектин-вуглеводного пізнавання.

3. Мінеральний азот- змінює акценти біосинтезу індивідуальних гйкоподімерів полісахаридного комплексу ризобій, модифікує їх склад, внаслідок чого порушується механізм лектин-вуглеводного пізнавання, втрачаються індукторні властивості.

4. Ризобіальні полісахариди являють собою молекулярні біосенсоря, які здатні трансформувати сигнали зовнішнього середовища в ультразвукові коливання і. передавати їх на далеку відстань.

Конкретна особиста, „участь автора в одержаних результатах.

Робота виконана автором особисто. Деякі дослідження проведені сумісно із співробітниками -біохімії мікроорганізмів, які працювали під керівництвом дисертанта - Т.М.Ковалевською, М.А.Пацевою, Ризобіальний аглютинін; Е1 з поверхні Е. іе^-шіпоаагит 2526 був одержаний співробітниками ІШШ РАН Л,В.Карпуніною та В.Є.Нікітікою., Лабораторно-вегетаційні доо-ліди при вивченні біологічної активності ризобіадьних полісахаридів частково виконували у співпраці з А.Ф.Антидчук і

В.М.Рангеловою, при дослідкенні впливу нітратного азоту на сигнальні функції, полісахаридів - з Н-М.Мандровською. Релаксаційні характеристики внутрішньомолекулярких коливань і

акустичні властивості полісахаридів визначені канд. фіз-мат. наук М.М. Коноплею.

Аппобанія роботи. Матеріали цієї роботи доповідалися на УІ, У11 з'їздах Українського мікробіологічного товариствз /Донецьк, 1984; Одеса, 1993/, Республіканській конференції "Сии~ биотрофные азотфяксаторы и их. использование в сельском хозяй-СТГО" /'ЧорПГГІЗ, ICS?/, У jfcpaiECbfc&tf ОІСХІиІЩОЬ« з'їзді /Івано-Франківськ, 1287/, 1 Республіканській конфоронції "Изучение и пршлененяо лектинов" /Таллінн-Тарту, IS88/, конференції "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений" /Тернопіль, 1991/, 2-й Всесоюзній науковій конференції "Результаты и перспективы научных исследований мякрсбпнх полисахаридов" /Ленінград, 1984/; УІ, ill), IX Всесоюзних Бамівських колоквіумах по азотфіксації /Тбілісі, IS83; Кобулоті, 1988*, Москва, 1995/, УП з'їзді Всесоюзного мікробіологічного товариства /Алма-Ата, 1985/, ill Всесоюзній кокфоренціж "Микроорганизма в сельском хозяйстве" /Москва, 1985/, Y Всесоюзному біохімічному з'їзді /Київ,

I98S/, П Всесоюзному з’їзді товариства фізіологів рослин /Мінськ, 1990/, Всесоюзній нараді секції Всесоюзного товариства фізіологів рослин "Азотфиксацвд и аэотпнй обмен" /Москва, 1989/, Всесоюзному семінарі-школі "Химия и биохимия углеводов клеточной поверхности" /Саратов, 1991/,. 16.-й конференції Федерації Європейських Біохімічних Товариств /FEES //Москва, 1984/, XI-й Міжнародній конференції по лектикам /Interlec -II/ /'ІЬллші-'Гйрту, 1989/, У111 Східно-Свропейсьісому симпозіумі по біологічній азотфіксації / Hitroganfix -92//Саратов, 1992/.

їїтблікапхг. По матеріалах- дисертації опубліковано 65 експериментальних робіт, у тому числі 22 статті у вітчизняних та зарубіжних журналах і збірниках.

Стотктуса та обсяг iroaui. Дисертація складається з вступу, трьох глав огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, шести глав результатів експериментів, обговорення результатів, висновків, списку цитованої літератури, усього 489 джерел. Робота викладена на 217 сторінках; машинописного тексту, ілюстрована 63 рисунками і 59 таблицями.

ЕКСПЕЙШЕНЇАЛЬНА. ЧАСТИНА.

Об'єкти та методи дослідження. Об'єктами дослідження були 16 штамів Bhizoblum. leguminosarum bv. тісіае — міжро-симбіонтів кормових бобів /74, 86, 87, 95, 97/, вики/145/, сочевиці/720/ і гороху/ІІ*, ЗІ*, 240а, 2406 , 250а, 250(3*,

248а, 2496 , 2526/, одержані з колекції. Rhizobium "ВШйСХМ ШЗСН", С.-Петербург-Цушкін та 1ЫВ ШЕ України/й/.

Культури вирощували на середовищі з гороховим відваром і І % мані ту на протязі 66 год. при 26-28 °С. Бактеріальну суспензію центрифугували при 40000 в на протязі 30 хв. ЕПС осаджували із надосадової рідини за допомогою сірчанокислого амонію /50 % насичення/. Капсулярні полісахариди одержували з поверхні сухих клітин бактерій екстракцією І %~нт розчином Каон / Zevenbulzen , 1984/, а також при очищенні препаратів ЕПС лектин-афіаною хроматографією на Сефарозі 4В-КонА /"serva "/ та іонообмінною хроматографією на dkae-tsk гелі їоуо-pearl Ш . ЛЕС екстрагували із сухих клітин бактерій 45 %~шш водним розчином фонолу при 72-74 °С за Weatphal.Jann /1965/, очищали 2 %-ти цетавлоном в 0,5 U. н-аСі .

Лекгини одержували із насіння чотирьох рослян-хазяхв: кормових бобів /сортів Поліські, Аушра, Дайва і Югева/, гороху /ІЬмонський, Уладовський ювілейний/, вики /несортової/, сочевиці /Дніпровська-3, несортової/ за методом Entlicher

et al. /1970/ в модифікації. Луцика /1974/. Очистку виконували афінною хроматографією з використанням афінного сорбенту - Сефадексу Г-ІОО.

Активність лектинів визначали реакцією гемаглютинації методом двократних серійних розведень в планшетах. Вуглеводну специфічність лектинів, мінімальні інгібуючі дози полісахаридів. ewirtü 'ir SSGpt^äöMUO'ii а лектякэ’.ГТ ВПЯЧОИ su XA-' азціеа пригнічення гсмаглатинуючої активності локтинів/НІГА/ із застосуванням нативншс кролячих еритроцитів /Луцик і спів-авт;, 1383/, а також методом кільцепраципітації.

Кількісний вміст вуглеводів в препаратах визначали за реакцією з фенолом і сірчаною кислотою / Duboia et al. 1956/, білка - за Lowry at ai. /1951/, нуклеїнових кислот - за методом Спіріна /1958/.

Моносахаридний склад досліджували газорідинною хроматог-рафіею/ГЕХ/, ферментативними методами з використанням глюкозооксидази і галактозооксидази. Амінокислота визначали на амінокислотному аналізаторі "Hitachi ", увонові кислоти - реакцією з карбазолом /Diahe , 1947/, ідентифікацію виконували за допомогою електрофорезу на папері і %-Я}.і?-спектроскопії. 2-ке-го-З-дезсксиоктонову кислоту/КДО/ визначала реакцією з тїо-барбітуровоа кислотою / Drage et al, 1370/, гептози - за оз-Ъот /1953/і піровиноградну кислоту - за методом Sloneker г Orentaa /1962/.

Молекулярну масу полісахаридів означали гель-фільтра-ціею на Сефадексі Г-І00 і Сефарозі 4В з використанням декст-раців фірм "Serva ", "Pharmacia ", “toba Chemie ", а також седиментаційнім методом на аналітичних центрифугах "ЗріпіаВ"

і ІШ 3170/в за методой Сведберга /Френкель, 1963/.

Електрофорез ліпополісахаридів виконувала в 5,6 ^-аому

- 10-

поліакриламідному гелі з додаванням Q.5 % додецилсульфату натрію / SDS-ПААГ/.

М’який гідроліз ЛПС виконували за допомогою І £-ної оцтової кислоти да протязі чотирьох-шести год. при ІОО °С. Галь-фільтрацію частково двградованих полісахаридів проводили на Сефадексі Г-50 в піридин-оцтовому буфері /pff 4,5/.

Фазово-конформаційні характеристики ЕПС вивчали за методом аналогового моделювання поведінки макромолекул полімерів в здвиговому потоці г фоторєєстраціею.

Симбіотичні властивості штамів і біологічну активність рязобіальних полісахаридів вивчали в лабораторно-вегетаційних дослідах з використавшім пісчаних культур і сольового середовища за Гельригелем /1964/. В вегетаційному сосуді вирощували по три-д’ять рослин. Досліди виконували в чотирьох-шестикратній повторності. Ефективність оцінювали за масою сухих рослин, азотфіксуючу активність - за ацетилен-редуктазним методом / Hardy et ей., 1368/, конкурентну здатність - за методом Берестецького і співавт. /1983/, вірулентність - за кількістю утворених бульбочок.

Математичну обробку експериментальних даних виковували за Доспеховим /1985/.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Для встановлення участі ризобіальних полісахаридів в но-дуляційному процесі проводили порівняльне вивчення їх дектиш-рецепторних, біологічних і фізико-хімічних властивостей у 16 штамів R. legumlnosarua bv. vloiae , які умовно були розподілені на групи в залежності від рослини-хазяїна в перехресно заражуваній групі бобових рослин, з ризосфера якої вони буди ізольовані /кормових бобів, гороху, вики і сочевиці/^ і від

ступеня вяраяеності- таких симбіотичних ознак як азотфіксуюча активність, ефективність, вірулентність, конкурентоздаткість.

Загальна симбіотична характеристика штамів, одержана в лабораторно-вегетаційних'дослідах, наведена в Табл.І.

Таблиця І

СимбІОТЯЧ“1* л. Іеісишіаовагшп Ьтг, тісі»«!

Рослляа-хазяїн Штам мікросимбіонту

Симбіотичні властивості

97 Високоефективний, високоактивний /за нітрогеназою/, високовірулентний, висо-коконкурентоздатний

95 Високоефективний, високоактивний, серед-ньовірулентний, неконкурентоздатний

Кермові боби 74 СередньоеФективний, сетэедньоактивний,

середньовірулентаий, середньоконкуренто-' здатний *

85’ СередньоеФективнкй* середньоактивний, середньовїрулентіши, слабо/не/кошсурен-тоздатний

87 Неефективний, неактивний, високовіру-лєнтний, високохонкурентоздатнлй .

Горох

Вика

240а

2406

ЗІ

250а

2506,

II "

Л

2526 Високоефективний,, високоактивній, се-редпьовірулентнии, неконкурентоздатний

Середньоефективаі, високо/середньо/активні, середньовірулентні, середньокок-курентоздатяі

Сдабоефектившій, слабоактивний, соред-ньавірулонтний, середньоконкурентоздат-

- НИЙ -

24861 Неефективні, неактивні, високовірулент-24363 н*» висококонкурентоздатйі

145 Високоефективний, високоактивний, се-редньовірулентниа, сзредньоконхураито-. здатний

Сочевиця

720 Високоефективний, високоактивний, се-редньозірудантішй, сервдньоконкувешо-здатний

- 12 -

І. Лектин-поиісахаридні взаємозв'язки в бобово-ризобіальному

симЗіозі

І.І. Взаємодія полісахаридів R.leguminosarum. bv. vlciae з рослинними лектхнат Для вивчення лектин-родепторноі активності разобіальних ' полісахаридів використовували лактони, одержані з насіння різних рослин-хазяїв, на яких визначалися симбіотичні властивості птамів. Всі лактини шли високу гемаглютинуючу активність/титри гемаглютинації їх 0,1 % розчинів становили 1:1024-1:2048/, була Д-глюкозо/Д-шиозо-специфічнями, але» відрізнялися між собою мінімальними інгібуючими дозами окремих сахарів.

При вивченні здатності ризобіальних полісахаридів служити рецепторами лактиніз бобових poems була виявлено, та усі м-ші досліджених поверхневих полісахаридів взаємодіють з лекти-нами усіх сортів чотирьох росляа-хазяхв і ке зв'язуються з пектинами гатерологічних рослин - сої і пшениці і що кожна вва-аати хімічним обгрунтуванням фєношиу перехресної заракузакос-ті цілої групи бобовис рослин одним підвадом бульбочкових бактерій — К. leguainosaruai bv, viciae.

Порівняння лектин-рецепторної активності екзогліканів і ЛПС у штамів, близьких за симбіотичною потенціє» /високоактивних. за нітрогеназою, ефективних, досить конкурентоздатних/; шт.97/6.6. кормових бобів/, шт.240а/б.б. гороху, шт.145/6.б. вики/, шт.720/б.б. сочевиці/ показало, що найбільшу ступінь спорідненості полісахариди виявили, до лектину рослиниг-хазяїна, з ризосфери якої вони були ізольовані /Рис.І/. Де вказує на існування в підвиді viciae виду R. leguminosaruai бактерій з більш вузькою приуроченістю щодо домінуючої' рослини-хазяїна в перехресно заражуваній групі рослин. В цілому лектина кормових бобів, гороху і вики мали більшу спорідненість до ри-

ЮТА., 55 100

50 _

ЛІС

<213

ОПС

Г т-г

120

п

яв

&

ЛКБ

лг

лв

лс

ЛКБ

ЛГ

лв

2С

Віс.І, Ступінь спорідненості ЛПС і ЕПС ефективних штамів

й. Івєитіпоаагит Ьу.уісіае 3 лектинами чотирьох рос-лин-хазяха: кормових бобів/сорт Поліські/ - ЛКБ гороху/сорт Рамонський/ - ЛГ, вики/не сортової/ - ЛВ. сочевиці/сорт Дніпровська-3/ - ІС. Бульбочкові бактерії: І - кормових бобів/шт.97/, 2 - гороху/шт.240а/, З - вики /шт.145/, 4 - сочевиці /шт.720/

зобіальпих ЖС, ніж. до ЕПС, а лектин сочевиці - до вкзополі-сахаридів дослідженого штаму б.б. сочевиці.

Для виявлення внеску бактеріальних полісахаридів до лек-гин-вуглвводної спорідненості мінро- і макроеимбіоіиів вивчали, яаагян-рвцвпїорну активність глікополімерів б.б. гороху і кориовгсс. бобів у штамів, які відрізнялися мія собою за симбіотичними властивостями. Аналіз одержаних даних показав чіткий зв'язок між ефективністю і азотфіксуючою активністю бактерій і їх ЛПС-лектішовсю спорідненістю. Лектини біль™ активно взаємодіяли з ЛПС високоактивних, високоефективних /97, 95,

83, 2526, 31х/, ніж езредпьоефективних ризобій /74, 240а, 2406, 250а, 2506й/. Найменшу спорідненість до дентину виявили ліпо-подісахарзда слабоактивного шт.ІІ і дефектних за азотфіксацією, неефективних штамів /87, 2496, 248б//Рис.2,3, я - дані на рисунках. не представлені/. Ці результати були підтверджені' також

йіс.2. Активність взаємодії лектину гороху /сорт Уладовський ювілейний/ з ЖС і ЕПС б, б. гороху /А/ в залежності від симбіотичних, властивостей ризобій /Б/: І - шт.252б,

2 - шт.2406, 3 — шт.250а, 4 - шт.2496, 5 - шт.2486

А - азотфіксуюча активність, с2^4 т .

_ 1г Зульо. А .

Е — ефективність, Е - конкурентоздатність, %,

В - вірулентність, кількість бульбочок/рослину .

ЛЕЮ ЕПС - Ефектно- Конкуренто-

ність здатність

Рис.З- Активність взаємодії лектину кормових бобів /сорт Поліські/ з ШС і ЕПС б.б. кормових бобів /А/ в залежності від симбіотичних властивостей рязобій /Е/: І - шт.97, 2 - шт.35, 3 - шт.86, 4 - шт.74, 5 - шт.87

- 15 - -

міішлальшіми дозами полісахаридів, що інгібують гвмаглютиную-т;у активність летшів. Еазом з тим була встановлена оберігана імралядія ніж лектиш-рецепторною активністю ЛПС і вірулентністю і конкурзнтоздатїііст» ризобій. Коефіцієнти кореляції/г / становлять -0,91 і -0,9а відповідно.

Лектини вважаються одним із факторів стійкості, рослиа до «іш«впівлм»9т та грпбпосох інфекції. ов‘яяу»чися у ?кл.*5раипаи рецепторе«, воші аглютинують бактерії, перешкоджаючи розвитку інвазійного процесу. Тому ризобіальний ліпополі сахарид повинен бути замаскований. Можна припустити, що цю захисну функцію виконують екзополісахариди, оскільки мій конкурентоздатні сто бактерій і лвктиш-рецепторном активністю їх. ШС ¿снує пвямий зв'язок як це було показано на групі кормових бобів /Рис.З/.

Отко, здатність бактеріальних полісахаридів взаємодіяти и дентином рослини-хазязсна виливає на симбіотичні властивості н. іепитіпооагип ь^.уісіае : азотфіксуюча активність і ефективність бактерій залежать від лектіш-рецешторної здатності.

Ех ЛПС, а інфекційні властивості - і ШС, і ШС.

Для виявлення ролі рослинній лектиців у формуванні ефективного /тобто спошіфітаого/ симбіозу були підібрані сорти кормових бобів, які. відрізнялися між собою за сприйнятливістю до інокуляції гомологічними; риз об і ями: два чутливі сорти Ауа-ра і Даііва та иалочутттїї сорт Йгева. Вже в процесі очищення лшстітіо стало ясно, що за лектиновои характеристикою сорт Югева істотно- відрізняються від Аушра і Дайш. В ньому було шлллено но один, а два лектягот, які десорбувалися з афінного сорбенту Сефадексу Г-ІОО за допомогою різних елюентів: розчинів 0,05 И глюкозя/Д-І/ і 0,1 М глюкозаміну/Л-2/. Гемаглатину юча активність обож лектинів була найменшою /1:512/, сумар-

-16-

на кількість в насінні - в чотири-п’ять разів меншою в порівнянні з іншими сортами. Л-2 відрізнявся від усіх, інших одержаних ваш. лектинів також, тим, що його гаптенами, окрім Д-глю-кози та Д-манози, буди, похідні Д-галактоЗи. Активність взаемо-дії полісахаридів чотирьох ефективних штамів /97, 95, 74 та 86/ була більш високою з лектинами двох чутливих сортів Аушра і Дайва, нія а лектинами нечутливого сорту Югева. Цей факт свідчить про те, що від лектинів рослини-хазяхна, так же як і від бактеріальних поверхневих полісахаридів, залежить молеку-яярно-хімічна відповідність симбіотичних партнерів. Характеристику- лектинового фонду кормових бобів, вірогідно, можна віднести до числа значущих сортових ознак, що визначать взаємовідносини рослин ЦЬОГО виду З Н. Іееитіпозагит Ьу. уіоіае.

Використання трьох вказаних сортів кормових бобів і п'яти штамів б.б. кормових бобів, які відрізнялися між собою за ефективністю на цих сортах, дало змогу створити групу 15 вузь-когомологічних: бобово-ризобіальних пар з широкою амплітудою ефективності симбіозу: від високоефективного до зовсім неефективного /Рис.4-А/. Порівняльне вивчення активності лектин-по-лісашридних взаємодій виявило пряму кореляцію між ефективністю симбіозу та ЛПС-лектиновою спорідненістю скмбіонтів/Евс.4-Е/. Коефіцієнт' кореляції, розрахований для усіх 15 боббво-ризобі-альних пар, становив 0,87 /Р=0,95/. Причому відмічається більша залежність активності ДПС-лектинової взаємодії від рослинного лектину /г =0,99/, тобто від сорту рослини-хазяїда , ніж від ризобіального ЛПС /г =0,87-0,90/. Це пояснюється тшл, що у формуванні повноцінного симбіозу, крім лі пополі сахариді в, беруть участь і інші полісахаридні рецептори; рослинного лектину. Так, з ефективністю симбіозу корелювала також лектш*-рецепторна здатність ШС / г=о,86//Рис.4-В/. До того ж з на-

Ефективність сиибіозу, %

150 100 -50

п

і

І

і п ш ат.97

П

№

ь_

X п ш

шт.95

і п а ¡та. 66

І П

п____ііа

I П И ит.87

Шк,%

ЦО-

20 _

0

І 2

І 2

І 2

І П Ш

піт .97

І П Ш шт.95

І П Ш шт.86

І П і шт,74

III І

кт ,87

В

Рис.4. Ступінь спорідненості ЛПС /Б/ та ЕГЮ /В/ бульбочкових бактерія кормових бобів з лектииани трьох сортів кормових бобів в залекності від ефективності симбіозу різних бобово-ризобіальних пар /А/

Сорти кормових бобів: .

Аушра - 1, Дайва - П; Югева - 1 /два лектяни: І та 2/

-18-

чення коефіцієнтів множинної кореляції 2-го порядку, яке характеризує залежність ефективності симбіозу тільки від одного* фактору /або ступеня ЛПС-лектинової, або ЕДС-лактинової спорідненості ® виключенням впливу іншого фактору/ були значно ыеяшими: /0,39 та 0,25 відповідно/, ніж у коефіцієнтів кореляції

1-го порядку. Це означає, що позаклітинні полісахариди та лі-поподісахариди взаємно доповнюють дію один одного в процесі формування симбіозу. Оскільки ефективність симбіозу свідчить про його специфічність, комплементарність толісахарид/ЛПС/-лектинових детермінант бобово-ризобіальних партнерів можна вважати принаймні одним із факторів їх специфічності. Ці дані можна такая трактувати як біохімічне свідчення взаємозв'язку факторів ефективності та специфічності симбіозу, декларованого ще 20 років тому /Марійська, 1975/. Залежність такого віддаленого результату симбіотичного кооперування,як врожай рослини-хазяїна, від лектин-рецепторної здатності ри-гобіальвих полісахаридів вказує на їх індукторну роль при: утворенні функціонально^ активних бульбочкових структур.

1.2. йізобіальні полісахариди - аугорецептори поверхневого ' аглютиніну свого штаму

функціонування лектин-вуглеводної системи пізнавання 8а участю рослинних лектинів та.рнзобіальних полісахаридів не виключає існування інших механізмів або інших ланок того ж самого механізму багатоетапного процесу формування симбіозу, в якому можуть брати участь і лектини бактерій, і зв'язку а цим вивчали ризобіальний лектин /аглютинін ї^/, ізольований з поверхні б.б. гороху /шт.252б/. За хімічною природою в1 є глікопротегном, в якому вуглеводи складають 26,9 % /Д-глю-коза - 10,3 %, Д-галактоза - 1,6 %, Д-глюкозамін - 15,0 %/. Вуглеводну специфічність а £ встановити на вдалося, незважаю-

- 19 -

чи на те, що для цього було використано 28 сахарів.

Для виявлення можливих природних рецепторів з боку рос-лини-хазяїна вивчали здатність ризсбіального аглютиніну й1 взаємодіяти з лектином насіння і двома кореневими фракціями

4-х денних проростків гороху /сорту Уладовський ювілейний/: фракцією екзокомяонентів /Фр/, одержаної водносольопим г:.а-«ирешших. ексудатів ш не"Зраппга фракцією /&</, «ну ізолювали екстракцією коренів тритоном XI00 після вилучення водорозчинних: білків. Обидві фракції; являли собою гетерогенні білково-вуглеводні комплекси, які відрізнялися за складом сахарів чи; їх кількісним вмістом, як одна від другої;, так і від лектину гороху. Головними; компонентами Фц були Д-глокоз-аміж/51,6 %/, Д-глюкоза /9,0 %/ і урокові кислоти /8,0 %/, а Ф.(, - Д-галактоза /9,2 %/ і урокові кислоти /8,2 %/, Інші компоненти /Д-маноза, Ь -арабіноза, ь -фукоза/ становили від

0,4 до З,Є % від сухої ваги препарату. Реакцією інтерфазних кілець в желатиновому гелі було показано, що н1 взаємодіє з лектином гороху і обома кореневим* фракціями. Лінія преципітації; формувалася ишидше з лектином гороху/через 5-& год./, пія з фракціями: Ф^/чероз 18 год./ і Фц/через дві доби/.

Як рецептори з боку бактеріальної клітини використовували ЛПС, ЕПС, КПС тога * самого штаму. Добре окреслені кільця преципітації були виявлені при взаємодії ^ з ЕПС/через 18 год./, з манозошіским капсулярном акзоглікаком - через дві доби, у випадку їх порозділеного комплексу - через одну добу.

З ШС кільця преципітації; формувалися через одну добу.

Властивість бактеріального аглютиніну взаємодіяти із сполуками, що локалізуються на поверхні як макросимбіоиту, так і самої, бактеріальної клітини, дозволяє припустити його можливу участь в процесі кооперування симбіотичних партнерів

- 20 -

і свідчить про складний характер перехресних взаємозв'язків не тільки лектину рослишї-хазяхна, але і аглютинінів мікро-партнера з Її рослинними та бактеріальними рецепторами.

2. Індукторна роль ризобіальиих полісахаридів у формуванні ефективного симбіозу

Біологічні властивості ризобіальних полісахаридів дос-лідкували в лабораторно-вегетаційних дослідах. В першій серії дослідів 4-денні проростки гороху інкубували на протязі

4 год. з 0,15 %-іш водним розчином ЕПС штаеду-інокулянту /контроль/ або* шт.248б, а потім інокулювали одним з п’яти штамів: 2526 , 250а, 2406, 2496, 2486. В усіх, випадках активність бульбочкоутворення різко пригнічувалася і становила

5-13 % в порівнянні із варіантом звичайної інокуляції. Тому в подальших експериментах ЕПС і інші досліджувані нолісаха-рвдн додавали до клітин /відмитих дід власних екзополі сахаридів/ безпосередньо перед інокуляцією рослин. .

Встановлена, що ЕПС. найбільш вірулешших і конкурентоздатних: бактерій /шт.248б/ в 1,3-2,? рази збільшував буль' ’ * ' / бочкоутворення менш вірулентними ризобіями /2526, 2406, 11,

31/. І навпаки, БОС слабокснкурентоздатних штамів /2526, II/ на 50-90 % знижували нодудяційну спроможність більш інжекційних ризобій. Дри додаванні екзопояісахаридів середньові-рулентних бактерій /240б, II/ активність нодуляції слабоіа-фекдійних ризобій збільшувалася, а високовірулентних зменшувалася. Отже, ризобіальні ЕПС можуть як активувати, так і пригнічувати процес бульбочкоутворення /Вис.5/. Виявлено також, що стерильні препарати екзоглікадівб.б. гороху і кормових бобів здатні викликати на коренях поверхню стерилізованих /конц. 5 хв./, неіиокульовашіх рослин гороху

Кількість _ бульбочок, %

т-

400-

Інокуляція штамаші:

0

І

2

3

4

5

6 7

щт.252б

шт.250а

шт.ЗІ

шт.2406

ит.2496

шт.ІІ

шт.2486

п

&_

“?8ВГ>

2486

ЗІ

2526

ЕПС

2406

II

. Fie.5. Активність бульбочкоутвореннн ризобіями гороху на

рослинах гороху при додаванні ЕПС гомологічних штанів /контроль » додавання ЕПС свого штаму/

В, Ej, Б,

/а

<50100 в-

шт.ЗІ

О

мкЬМ

ж

ьА

ж

А

мкіі С2Й4/ росл.х

год

15

І. О 9,5

Вірулентність АзоїфЬсеувча Щюктшзнісїь Вміст 61г,

/В/ актявність/Б/ /V в уроках/

В, В,

•/5050

Ш

шт.2486

ЗШ

2зз'

Додавання полісахаридів свого £ чужого’ штаму*.

Г, Р—ШЇС-Гл

2, 2*- ЛПС

3, 3*- Пшкан

Вірулентність Ефектність

Вміст білка в уроюї/Б/

Рис.6. Вшшв клітинних полісахаридів риаобій гороху на формування симбіозу Вірулентність, ефективність, »міст білка в урожаї - в i по відношенню до контролю К/інокуляція нативнои культурою/

6

утворення дрібних, білих, неазотфіксувчих бульбочок, кількість яких варіювала в залежності від інфекційноеті продуценту ЕПС. Лдя EHC-24S6 вона становила 240, ШС-87 - 218, ЕПС-97 - 165, КЕС-97 - 14.5, ЕПС-ІЇ - 39 штук/росл. НІС найменш інжекційного, неконкурантоздагного шт.ЗІ на: індукував бульбочки у відсутності мікросямбіонту. .Одержані дані демонструють високу ступінь індивідуального впливу ШС на процес нодуляціг і вказують на та, що вони, вірогідно, е тригерами включення програми нодуль-ного органогенезу, генетично детермінованої в бобових рослинах.

При вивченні впливу екзополісахаридів на інші показники симбіозу відмічено, що ЕПС дефектного за азотфіксацією шт.248б достовірно /Р=0,95/ на 33 % підвищував азотфіксуючу активність бульбочок, сформованих активним шт.ЗІ, і не змінював г£ у бульбочок, утворених слабким азотфіксатором шт.ІІ. Заміна власних екзополісахаридів на ЕПС інших гомологічних бактерій призводила також до збільшення білка в урожаї зеленої маси в залежності від симбіотичної спроможності штама-інокулянту: на 22-43 % при інокуляції' рослиня-хазяїна штамом ЗІ, на 8-22 % -штамом II і на 5-16 % - штамом 2486. Електронно-мікроскопічні дослідження /виконані В.Е.Кораловим/ показали, що в присутності ШС б.б. гороху /шт.ЗІ, 250а/ спостерігається утворення більш розвинутого симбіотичного апарату: в бульбочках збільшується об’єм бактероїднох тканини, в симбіосомах зменшується розмір перибактероїдного простору.

Залежність модулюючої дії ЕПС на активність нодудяції від вірулентності і конкурентоздатності штамів, з яких ці глікополімери були одержані, вказує на їх роль у визначенні інфекційних властивостей б.б. гороху і безпосередню участь на самих ранніх стадіях встановлення симбіозу, а вплив на формування ефективного симбіотичного апарату - на те, що вони

е індукторами програма розвитку і більш пізніх стадій формування будьбочхойіх структур.

Важливу роль у встановленні симбіозу відіграють клітинні полісахариди - ліпополісахаряди і асоційований:, з ними перя-плазматичняй глкжан. В лабораторно-вегетаційних дослідах вивчали біологічну активність трьох видів препаратів: нероз-

ДІЛвИОГО ЛІ [(/“Ї'ЛПКЯНОВОРО тсл?.,тілі!:*ті!су /1ИІС *"3

гяюкаку, ізольованих з двох штамів /24Вб і ЗІ//Рис.б/.

Проведені дослідження показали, що препарат ЛПС-глшкан -вого комплексу із шт.248б збільшував бульбочкоутварюичу активність. як свого власного штаму /на 10 %/, так і шт.ЗІ /на 23 %{, Такий же препарат, одерваний із а. іерипіг.опа-гит ЗІ, ка змінював нодуляційшсс характеристик бактерій,

З присутності ЛИС-2436 активність нодуляціх шт.ЗІ була на 35 % більшою, кіл; при додаванні власних ЛЇЇС. Це підтверджує висловлену раніш думку про те, що не тільки ИІС, але і ЛПС беруть участь у визначенні вірулентності б.б. гороху.

Досить своєрідно впливали на процес нодуляції глюкани. Вони підвищували кількість бульбочок, індукованих кіт.2486 /на 36-55 %А і зменшували їх у шт.ЗІ /на 10-16 %/. Оскільїси інокуляцію рослин гороху виконували клітинами бактерій, відмитими від ЕЗС, шт.ЗІ формував бульбочка із зниженою здатністю до азотфіксації, яка не відновлювалася у варіанті додавання клітинних полісахаридів свого штаму. Під діє» таких же препаратів із аг.2486 азотфіксуюча активність бульбочок шт.ЗІ істотно, майке здзічі, збільшилася, найбільше - під впливом глзжану. Отке, глюкани сприяли посклений тих головних симбіотичних властивостей бульбочкових бактерій, які важ-' ливі для їх зберегення в природних умовах: підвищували вірулентність у високоінфекційних, але не здатних до азотфікса-

- 24 -

ції бактерій /шт.248(5/, до дає змогу цим бактеріям пасярувати ся через рослину-хазяїна, ке вступаючи з нею в симбіоз, і азотфіксуючу активність у ефективних, ризобій /шт.ЗІ/, утва-ршчи умови їх специфічного кооперування з рослякои-хазяїг-ном. . .

Виявлено також, що присутність клітинних полісахаридів в інокуляційній суспензії бактерій впливає на величину і структуру врожаю зеленої маси рослин. Найбільш активними виявилися препарати нерозділеного ЛПС-глюхакавого комплексу.

Так, при бактеризації рослин гороху штамом ЗІ вони сприяли підвищенню сухої маси рослив на 17-23 % і вмісту в ній білка - на 16-26 % в порівнянні із варіантом бактеризації нативною культурою; Ці дані, як і результати дії БОС на збільшення білка в врожаї, говорять про те, що стимуляція росту рослин гороху і накопичення в них. білка може здійснюватися не тільки за рахунок симбіотичної азотфіксації, але також і завдяки іншим механізмам інтенсифікації азотного обміну, мож-диво, в результаті виникнення підвищеного фону фітогормонів . під дією ризобіальних глікоіндукторів. Таке припущення підт1-верджуеться спостереженням значнбго викривлення коренів і утворення гроноподібних, скупчень бульбочок при інкубації проростків гороху з ЕПС, ЛПС, глюканами штамів II, ЗІ, 87, 2486, 250а у відсутності мікросимбіонту.

3. Фізико-хімічні властивості Полісахаридів

Для того, щоб зрозуміти» які особливості ризобіальних полісахаридів визначають їх біологічну активність, досліджували їх фізнко-хімічві властивості. .

3.1. Ліпополісахариди

Одержані препарати ЛПС містили 32-74 % вуглеводів, 0,7-

- 25 -

8,0 % білків і 0,4-І,9 % нуклеїнових кислот.

Ліпоиолісахариди ЯМгоЬіил дають таїсп'.і ке загальній план будови, як і ЛПС інших грамнсгативнлх бактерій, і складаються з 0-полісахариду' /О-ПС/, кар-олігосахариду і ліпіду А.

В ліпіді А ЛПС усіх ефективних штамів кормових бобів, гороху, вики і сочевиці виявлено п’ять оксижирних кислот:

3-ОН Ст,.с : Я-ПТТ Г!т- .. ; 5-0?. ; 3~Со Ст„.п і

. . 1-Х* и Хм «и ІЬ'Ти ¿О* и

2^-СН ^29:0 3 ЙЛіІЗЬК>Цу,Й молярашяі співвідношеннями - /3,6-4,0/:

/0,7-1,8/ : І : /1,2-І,4/ ї /0,4-1,3/. В ліпіді А дояких штамів присутні в невеликій кількості ївші жирні кислоти /я/к/: 3-ОН Сл25о /шт.2406/, 29-0Ы С30;д /шт.145/. Ліпід А неефективних штамів /24Вб і 87/ характеризувався збільшеним в 1,5-2,0 рази вмістом триокситетрадекановоїі кислоти відносно інших х/к КОШОНЄИТІВ І невеликим ВМІСТОМ ІНШИХ жирних КИСЛОТ: С£4-0« 25-ОН С2Є;0, 29-ОЯ С20;0 /шт.87/.

Вивчення нолісахаридної частина ШС наказало багатокомпонентні сть складу сахарів, число ягах досягає 12-14 /Табл.2/. Переважним зі вмістом нейтральним сахаром ЛПС є глюкоза /7,838,1 % від сухої вага/, що може пояснюватися присутністю асоційованого з ЛПС глюкану. З залежності від штаму вміст інших нейтральних сахаріз складає: для манози - 0,6-9,7 %, едкози -

0,2-13,0 %, рамнози - 0-12,2 %. У багатьох штамів виявлена араб і но за, у двох - ксилоза. До складу ЛПС усіх досліджених, бактерій входять дві урокові кислоти: глюкуропова і галактуронова, сумарний вміса Ех становив 3,4-9,5 %. В ЛПС штамів 74 і 2406 знайдена піровиноградш/ПВК/ кислота /2,8 та 2,1 % відповідно/. Сумарна кількість аміносахарів /глгакозаміну, галак-тозаміиу, хінавозаиіну/ варіює від 0,2 до 7,2 %* В усіх. ЛПС знайдені неідентифіковалі сахари, серед яких загальний для ЛПС всіх штамів був Хд /Трац о,9і/> в*“01, якого становив від елі-

Таблиця 2.

МоносахаридїШй оклад ЛПС й. Іе&хаїповатші Ьт. ■Поіав /в % від сухої ваги/

Компоненти

Хр/Тр:

Х^ТР'

Ал/1'

ам

’ам

¥АРам

0,91^

0,82у

Домінуюча рослина-хазяїн штаму

Кормові боби

4-

Горох

!Вика!ьочо.‘ і ¡виця

І 97 95 86 74 87 |2526 ЗІ 240а 2406 250а 2506 II 2496 248б| І45| 720

Глюкоза '

Галактоза

Маноза

Фукоза

Рамноза

Арабіноза

Ксилоза

Уронові кислоти

Піровиноградна

кислота

Гликозамін

Галактозамін

Хіновозамін

Неідентифіковані сахари

$5->ЇРам

КД0

28,0 36.0 5.7 1.2 г.г 2.0 3.3 3.9 34,0 22,4 38,1 3.5 5,3 1,6 3,0 0 6 6.0 2.5 2.3 2,5

оТв 9~,5 2,8 87о сл. 770 1.5 0,8' 4,8 2,5 9?0

2/7 о~,ч г~Л 0,4 0,4 г.о І~2 2,8 2,0 1.0 275 0,6 0,1

1.0 1,8 14,6 М .3,7

о'г з7б 0,2 - 0~,2 0,2 075

о.і 0,1 1.3 1.2 0,1

7.8 18,6 19,2 15,1 23,7 17,3 14,5 13,9 17,0 22,0 31,4

1.9 2,6 4,8 2,7 3,4 3.6 6,3 2,4 2.3 5,6 1,2

2,4 1,6 І І 3.6 1,6 0 8 0.6 " " ' '

5.2 1,7 0,2 10,3 5,1 0,4 0,3

2.2 мл. сл. 0,6 8.8 - . -

1.2 - - 0,5 0,8 - -

сл. 0,5 - -

7,3 8.1 7,1 8,2

9.7 .7,1 * 11,7 5,3 0.6

3,4 6,2 5.2 4,7 6,3

3.2

6.8

і7б

1.5

ігТг

1.2

1,1

СЛ.

0.7

- 2.1 -

0,1 2,2 2,1

- 0,2 0,2

0,5 0,2 1,0

2,5 сл. 1.1

- 3,7 2,5 0,8

0.4 - - -

0,2

0?5

сл.

6,4

0,3

о7в

1.5

сл.

1,0

2.5

сл.

1.0

4.7

1.7 0.6

3,3

0,4

0,2

сл. 2,3 1,9 0.2 5.0 1,4 - - - -

Примітка. означає:, що цей сахар не виявлено. Позначення Х];Арам £д/ було дано сахару, виявленому в ЕПС. ’

довог кількості до 14,6 %. Гептози виявлені не були. Кількість

2-кеїо-3~дезоксиоктоновох кислоти/КДО/ складала 0,1-8,2 %.

Проведення електрофорезу в поліакрилаліідному гелі в присутності додепрлсуліЛату натрію показало наявність різномоле-кулярних форм ЛИС: н - і Б -ЛПС з різним розміром О-ланцюга. Причому найбільш ефективні штами мали і білш ШІ варіант й-ЛПО /Ряс. 7/.

Пря гель-фільтрації на Сефарозі 4В препарати ЛПС розділялися на дві-трл фракції, співвідношення яких, як це встановлено для найбільш повно представленої; групи штамів - б.б. гороху, корелювало із симбіотичними властивостями бактерій /Еис.8/. Вивчення компонентного складу фракцій показало, що високомоленуляряі/І-П/ фракції /250-110-80 кДа/ являли собою ліпополісахариди міцно асоційовані з глюканом, а низькомолекулярні /Ш/ /6,3-18,6 пДа/ - суміш глюкану і уроноаміногалакто-зовмісного полісахараду /л.'.'ЛС/. У неефективних, але високові-рулентних ризобій переважала низькомолекулярна фракція, Ш, а в самій фракції спостерігалася тенденція зниження кількості НМПС відносно глюкану. 7 високоефективних рязобій домінувала високомолекулярні фракції.

Ліпополісахарядп б.б. кормових бобів і гороху відокремлені від глюкану ультрацентрифугуванннм при 105000 х піддавали м'якій деградації І £-ною оцтовою кислотою, яка розривав зв'язок між полісахаридною частішою ЛПС і ліпідом А. При цьому із іі -ЛІІС звільнюється коровий олігосахарид, а із Б -ЛПС - кор разом з 0-ланцюгом. При гель-хроматографії на Сефадексі Г-50 частково деградовані полісахариди ЛПС розділялися на дві-три фракціг, які судячи з ї‘х компонентного складу, відповідали двом вказаним типам полісахаридів: низькомолекулярні фракції містили, сахари, характерні для ризобіального

Рис.7. sds-ПААГ електрофорез ЛЕС

X - шт.250(5 .

2 - шт.2406

3 - шт.31

' 4 - шт.86

5 - шт.II

6 - ЕЬ -мутаЯ! Salmonella

/ % 3 Ц$6

я

•490

фракції.

А_ шт.2526 ’ ші.ЗІ

гг. 250^ ¿_шт.249б1

300 мл - V„

Високоефективний

штам

Середньоефактивні

шташ

Неефективні

шташ

Рве.8. ІЙЛЬ-фІЛЬїрецІЯ ДПС R. leguminosarum bv. vioiae на Свфарозі 4В

кора - галактозу, уронозі кислоти, манозу, а більш вясокомоле-кулярні - увесь набір старів JffiC /Табл.З/. Крім того, у найбільш ефективних штамів /97, 95, 2526, ЗІ/ була присутня незвичайна фракція, яка являла собою великий фрагмент 0-ланцюга /або увось ОЧІС/. Іа ояюційшіх проііілой деградованих ЛПС видно, що у двох найбільш вірулентних штамів /248б і II/ перева-ämüi ішимшмишкулярнт і»рв.КцГГ,- •годт*?' R-ЛПС, а 7 СЇ2ЇСТПБЕ2Х, навпаки - s-форма /Табл.З/.

Hä полісахаридних мутантах Rhizobiura встановлено, що нормальний розвиток бульбочок можуть індукувати тільки, бактерії, здатні до синтезу О-по лі сахариду. Одержані нами дані дають кількісну оцінку цьому явищу: більшою симбіотичною ефективністю характеризується штами, ліпополісахариди яких ¡лаять більший сумарний розмір tt-полхсахариду і які більш активно взаємодіють з локтішсм рослшш-хазяїна.

Одержані результати дозволяють припустити, що різні молекулярні форми ЛПС можуть відповідати за різні аспекти поведінки ризобій в процесі; встановлення симбіозу. Так, к-ЛПС, в якому ліпід А /який мав мітогенну активність/ і кор /що індукує в комнезаму волоску синтез полігалактуронази/ не екрановані О-полі сахаридом, моке робити свій внесок до інфекційних властивостей рлзобій. Проте, після проникнення бактерій через стінку кореневого волоска необхідно пізнавання дектиноіл рослк-нц-хазяїна їх s-ЛПС, який до-цього момент? повинен бути замаскований. У зв’язку з цим можна відмітити, що у ефективних штамів гдюкани відокремлюються від ЛПС більш легко, Eis у неефективних, відкриваючи останній для взаємодії з лектином рос-лини-хазяїиа. Hä цьому етапі може також мати функціональне значення існування лабільного зв'язка всередині О-полісахарвду /або Q-ПС з кором/, завдяки чому із ЛПС під діво специфічна.

Часткова деградація ДПС

Таблиця З

О-ДОЖ САХАРИД

1% С%СООН -ШГ|—ІвдоИ-Ішшд А 1 8 -же

(кор}—1кдоТ~Ндтд ¿1 Я-лис

N шта- му Гвль-хрома- тографія Сефадвкс Г-50 брак- Глю- Ві- Ш- фу- рам- Ара- Неї де нтиФі ковані щї: коза лак- ноза. коза ноза бі- сахари, їр^ *оза иоза

97 І 2*7 - 48.7 37.4 - 8.7 2.5 - -П 10.4 8.7 12.4 38.0 — 29.5 3.0 - -НІ '9.3 33.9 56.9 сл. - сл. ся. - -

95 [^/\ І. 13.0 10.2 21.4 39.1 - 7.2 6.3 - 2.8 И 15.5 ? - 12.0 40.0 ~ 12.2 12.0 - 8.3 Ні 21.3 Зб»2 38Л 1.8 - - Г.О - 1.0

252С Ш. І 3.3 20.6 36.8 20.3 19.0 - - - -Н 3.8 - 28.0 32.2 33.0 - 3.0 - -І 6.3 47.0 45.7 сл. сл. - - - -

ЗІ к І 2.4 - 18.6 40.8 28.0 3.7 - 7.5 -П 4.2 10.7 18*9 32.4 21.6 4.2 ~ 8.0 -Ш 3.2 45.2 42.9 1.7 1.0 5.6 - 0.4 -

86 Ж. І 9.0 28.7 24.6 20.5 - 1.3 15.9 - -Н 12.0 42.0 41.0 3.5 - - 1.5 - -

240а Ж: І 2.8 14.0 19.5 50.0 - 4.2 9.5 - -Ш 9.7 45.5 43.5 1.3 - - - - -

II Ж I 8.& 8.2 8.0 50.1 21.0 1.0 - 3.1 - II 3.6 3.4 3.4 53.0 30.4 2.0 - 4.2 -Ш 28.5 31.4 ЗЄ.0 2.3 1.8 сл. - - -

гт дД' І 19.0 56.0 Є.8 7.0 - 5.1 6.1 - -Ц 27.7 60.6 9.8 0.5 0.4 0*5 0.5 - -

-ЗІ-

поки що невідомих факторів вивільнюється О-полісахаридшїй фрагмент, який може грати роль сигнальної молекули.

Таким чином, характерною рисою ліпополісахаридів ЛПС н. legцminosarua Ьг. уісіав & їх гетерогенність, яка обумовлена одночасною присутністю молекул з різним розміром О-полі-сахарвду і міцною асоціацією ЛПС з глюканш і низькомолекулярні"»™ клїтіїнтаг готсро”иЛІеалар.ідо:і. Ідективш. штами^ <"і,ґ>т гороху в порівнянні з неефективними мають, більший вміст ЛЛС відносно низькомолекулярних клітинних гліканів, більший розмір 0-ПС в ШС, більшу лабільність зв'язку глюкану з ЛПС, здатність до вивільнення О-полі сахарвдного фрагменту; в низькомолекулярній фракції ЛПС-гліканового комплексу - мавший вміст' глюкану. У неефективних бактерій відмічається підвищений вміст триокситетрадеканової кислоти в ліпіді А.. Високоінфекційаі ризобії гороху характеризуються меншою кількістю сахарів, що входять до складу 0-по лі сахариду, _ і більшим вмістом уроновнк кислов, які е компонентами кора.

3.2. Екзогдікаші

Головним компонентом екзогліканового комплексу й. 1в^-тіпозагит ьу. уіоіае е неструктураваїшй.кислий глікан, якай саме і називають екзополісахаридом. За нашими, даними» вш складає, більша 90 % від загальної, кількості позаклітинних полісахаридів. Препарати ЕПС, одержані із безклітинного фільтрату культур осадженням сірчанокислим амонієм, етанолом чи. ацетоном, були гетерогенними і містили по два-три компонента, з; молекулярною масою 50000-110000, 28000-40000 та 7950-15850 /гельфільтрація на Сефарозі 4Д/* В них. виявлено 33-68 % вуглеводів, 1,4-3,7 % білка та 0,1-0,8 % нуклеїнових кислот.

__ ґ г

ШС послідовних, штамів були подібні міг. сабо» за складом

- 32 - -

моносахаридів /глюкоза, галактоза, глюкуронова кислота/ і відрізнялися за їх. співвідношенням. Піровиноградна кислота знайдена в кількості від 2,3 до 6,0 %. Окрім цих, характерних для R. legumlnosarum bv. vicias компонентів, препарата EUC містили також манозу, аміносахари /шт.І45/, фукозу і рамнозу /шт.720/, неординарні сахари /Табл.4/. Згідна з результатами: ГРХ-МС і %-ЯМР-спектроскопії, ліпофільний сахар Xg/Tj^=0,82/

& 6-дезоксигексозою /не фукозою і не рамнозою/, а Ха/Трам=0,69/ пентозою /не ксшюзою і на арабіноаою/. Загальним для всіх був кількість якого варіювала від 1,2 до 10,4 %. Наявність мавози та інших сахарів свідчила про присутність інших екзо-гдіканів в препаратах ЕПС. Причому для б.б. гороху було показано, що кількість манозовмісвого екзоглікаку /МанПС/ в препаратах ШС корелювала а ефективністю бактерій / г=0,89/ і їх азотфіксуючою активністю / г=0,80/. Обернена кореляція / г=-0,94/ виявлена по відношенню до конку ренто здатності штамів. Присутність різної кількості манозовмісного гдікану в препаратах ЕПС відтворює реальні співвідношення полісахаридів ва клітинній поверхні ризобій, а аалекність симбіотичних властивостей бульбочкових, бактерій від вмісту цього полісахариду в їх екзоглікановому комплексі вказує на можливу участь йога в формуванні симбіозу завдяки, його взаємодії на тільки, з лекг-хивом гороху, а і з якимось іншим, більш маноаофільним лектИг-ном тип; конканаваліну А /Кон А/. Виходячи з такої версії,

Кон А. був використаний для відокремлення МанПС /глюкоза: га-лактоза:ианоза:Х2=8:І:І:2/ від ШС методом лактяа-афіввої хроматографії ва Сефарозі 4В-Кон А. /Еис.9/.

Наявність в екзоглікановому комплексі кількох типів п&-дісахарвдів: ШС, МанПС, нейтрального галактоглюкану було також встановлено іонообмінною хроматографією на ДЕАЕ-тзк гелі

Таблшія 4

:{омосахар;:днлй склад ЕПС r. leguninosarua Ьт. vicias /з % від сухої ваги/

Домінуюча рослииа-хазяїн штаму

Моносахаридний!

Кормові (Зоб,;

Горох

! Вика ! Сочевиця

склад

97 і 95 86 74 87 Î2526 і ЗІ 240а 2406 250а 2506 II 2494 2486! ! 145! і 720 І П

29,1 29,1 21,0 30,0 36,3 19,4 24,4 25,4 21,5 33,0 27,8 24,6 19,2 6,0 5,8 4,0 6,1 6,1 3,9 8,1 2,3 2,3 3,8 6,8 8,0 2,3 0,4 1,2 1,0 1,7 4,1 3,7 1,1 1,8 1,3 1,2 0,6 0,4 0,5 20,9 20,2 19,І 18,9 4,7 4,4 3,3 2,7 0,3 1,3 4,2 -

8,7 7,8 8,5 8,0 9.8 8,2 8,1 6,0 5,2 8,8 8,1 10,0 S,3 11,3 7,8 7,0 н.в.

5,4 6,0 4,6 5,2 5,5 2,8 3,2 3,5 3,9 3,7 3,0 3,3 4,0 4,1 2,3 0,6 5,6 н.в. 1.8 -4.8 -

4,2 зд - н.з. - н.в.

2Д ІМ 2~7 0.1 6,1 4,1 :о,4 Сі од 2~4 6^0 7Д од 0~8 5/l 2~0 0,2 2,9 ІД -

Глюкоза .Галактоза Маноза Глюхуронова кислота

Піровиноградна

кислота

Рамноза

Фукоза

Глскозамін

Галактозамін

Неідентифіковані сахари:

уГ/ЇРам 1,23і/ ОгбАРам 0,827 СЗуІРам 0,46^ ¥ Рам 0,46'

- 0.1 -

5,7 -

03

со

Примітка* означас, £0 цей сахар не виявлено, "н.в." - не визначали.

Рїіс;9. Лектпа-афінна хроматографія веочищепих препаратів ЕПС на Сефарозі 4В - Кон А

Фракції: МІ - ЕПС, ІУ - МапЕС

Віс.ГО. Іонообмінна хроматографія екзогліканів па ДВІВ-тяк гелі Елюенти: початковий - 0.01 И фос£атшШ буфер /ФБ/,

А - 0.25 М ФБ + 0.25 М ЕаСІ , Б - 0.5 М ФБ + 0.5 Н ИаСІ, С - 0.5 М НаОН. Фракції: І - нейтральний галактоглшал, П - ЕПС, Ш - МанПС, ІГ - суміш полісахаридів.

. ... - 35 - .. .

t па прикладі штамів 2526, 87, 240а//Рис.І0/ та при екстракції капсулярних полісахаридів з поверхні ризобіальних клітин /штамів 2526 , 87, 86/ І Н КаОН / Zuvenhuizen, Van Neerven, 1983/.

Всі. виявлені полісахариди взаємодіяли з лектинами своїх рослин-хазяїв, а також з Кон А. Більйон лектин-рецепторною активністю характеризувалися МанПС: щодо лектину гороху -т-т, до коя А. - стуаіш, еаорізшюсхі з сбеїа

лектпнама мали ЕПС /42-45 %/ і нейтральний галактоглюкан /3S-40$/. Таким чином, кожний з позаклітинних полісахаридів робить свій внесок до лектин-вугле водних взаємодій симбіонтів і саме своєрідність їх співвідношень забезпечує специфічну біологічну активність усього екзогліканового комплексу. .

Щоб наблизитися до розуміння фізико-хімічного механізму фугжціонування молекул ЕПС, вивчали їх поведінку в здвигових та релаксировавгах течіях. Встановлено, що молекули ЕПС у водному розчині утворюють полімолекулярні кластери, всередині яких існують глобулярні і клубкові зона різного розміру. Щд дією зовнішнього фактору /в даному випадку - здвигового потоку/ вони; за рахунок розгортання окремих молекул розтягуються в 1.5-3.0 рази. Причому найбільшу конформаційну еластичність мали зразки полісахаридів, які містили або найбільиу кількість МанПС в препараті ЕПС /шт.252б/, або піровиноградної, кислоти в самому ЕПС /шт.249б, шт.248б/. Тббто, конформаційна лабільність ЕПС визначається як їх власними особливостями складу і структури, так і присутністю асоційованими з ними іншими глі-кополімерами. Характерно, що саме від цих нюансів залежала такое. і спорідненість ЕПС з лектином гороху.

Відомо, що при збудженні структури полімерів І конформат-ційній перебудові молекули полімеру спочатку акумулюють енергію, а потім при релаксації звільнюють їж у зовнішнє оерадо-

- 36 -

вище. Ба основі математичного аналізу одержаних експериментальних даних, який виконав канд. фізико-математичншг: наук М.М.Коношш, встановлено* ща ризобіальні полісахариди звільнюють акумульовану енергію у вигляді коливань в області ультразвукового/у/з/ діапазону частот для водного середовища, тобто генерують ультразвук /200-400 кГи/, який в результаті збудженая сусідніх молекул і синхронізації процесу може переноситися на значну відстань. В експериментах на акустичному стенді було виявлено, що екзополісахариди з різних штамів б.б. гороху мають свою індивідуальну акустичну характеристику, і що . при певних умовах розчин; ЕПС може фокусувати сигнал від точея-ного у/з випромінювача і за рахунок цього передавати його на більш далеку відстань, ніж він. був би переданий через воду. Такий феномен; - служити, молекулярними генераторами, детекторами. і трансформаторами ультразвукового випромінювання - не описаний для будь-якого з полімерів і відкритий нами вперша. Можна припустити, що виявлені властивості полісахаридів грають важливу роль в життєдіяльності бактерій. Розташовані на периферії клітини, екзополісахариди першими сприймають сигнали, зовнішнього середовища /рН, температуру, тиск/ і в трансформованому вигляді можуть передавати їх на клітинну мембрану. З іншого боку, енергетичні збудження на мембрані можуть трансформуватися полісахаридами в у/з сигнал і передаватися на далеку відстань від клітини, що може бути засобом комунікації бактерій і регуляції їх поведінки як членів однієї популяції. Отже, бактеріальні полісахариди можна вважати молекулярними біосенсорами, за допомогою яких на рівні енергетичних процесів, які притаманні бактеріальній клітині і тому можуть бути нею розшифровані, відбувається детекція, трансформація та дистанційна передача фізико-хінічних сигналів середовища.

- 37 - _ .

4. Вплив лектину рослини-хазяїна на ріст ризобій і біосинтез

ншяь екзогліканів

Встановлення взаємовідносин між бульбочковими бактеріями і рослиною-хазяїном починається з Ех дистанційних взаємодій. Відомо, цо з насіння бобових- при прорастакні виділяється лек-тин. Еивчаючи вплив лектину з насіння гороху на ріст гомологічних бульбочкоmrx батстсрій, '.'s.rrr, псгдзпіїо, ~с тірп ~с:щс:гг-раціх 10-200 мкг/мл він стимулював ріст ризобій, а при 0,5 мкг/ші і менша./на бобово-манітному середовищі/ і 0,01-0,001 мкп/мл /на мінералько-і.анітному середовищі/ інгібував його.

При додаванні, в інокулят ростостішудюючої дози лектину гороху /100 мкс/ли/ збільшувалася питома швидкість росі7 ризобій, яка у штамів 2506, II, ЗІ і 2486 в звичайних умовах росту становила 0,027, 0,028, 0,049 і 0,054 год-1', а при. культивуванні в присутності лектину - 0,040, 0,058, 0,079 і 0,069 год“^ відповідно. Приблизно в І,3-2,5 рази збільшувалася кількість клітинної біомаси в стадії стаціонарного росту /Ric.II/.

Активація ростових процесів бактерій супроводжувалася новодшсііл змеїмеїшш сшітозу позаклітинних, вуглеводів в цілому, при цьому доля зис0:;с”0лскулярппх EUG в окзогяііїнісбсму комплексі зішьіглася з 90 до 70 %, а низькомолекулярних екзогліканів, які більш активно, нік ЕПС, взаємодіють з лектином гороху навпаки збільшилася з 10 до ЗО %. Імовірно, в природних умовах стимуляція росту і модуляція полісахаридного синтезу лектином рослкші-хазяхна є одшш із першах кроків в підготовці ризобій до процесу симбіотичного кооперування.

5. Вплив мінерального ааоту на біосинтез і функціонально-біохімічні властивості полісахаридів б.б. гороху

Оскільки зв'язаний азот вважається одним із факторів, що

ZM 48 7Z 26 год. 2.4 48 7Z 96 roa.

■ vac ч<хс.

Рис. II. Вшшв лектину гороху /сорт Уладовський ювілейний/ на ріст б.б. гороху і біосинтез ЕПС на бобово-манітно«у середовищі

Звичайні умови культивування: біомаса - а, ЕПС - г, Культивування в присутності лектину /100 мкг/мл/: біомаса - б, ЕПС - в.

контролює встановлення бобово-ризобіального симбіозу, вивчали його вшшв на акценти біосинтезу бактеріальних полісахаридів і їх фізико-хімічні і функціональні властивості.

При вирощуванні б.б. гороху /шт.252б, шт.250а, шт.249б, шт.2486, шт.2406/ в чистій культурі в присутності 20-75 мМ ко3" спостерігалося зниження синтезу вуглеводів усіма дослідженими штамами. в 4-6 разів. При цьому співвідношення ЕПС до сумарної кількості низькомолекулярних гліканів/НМГ/ мало змінювалося, але у складі ШГ зменшувалася доля гетерополі-сахаридів відносно, гомополі сахариду глюкану. При 20 мМ нітратів бактерії втрачають здатність до експресії ЫанПС, що підтверджується відсутністю манози в препаратах ЕПС/Табл. 5/.

_ - 33 - . .

ТЬблиця 5.

Моносахаридний склад ЕПС і ШС й. Іевшпіпоаагит 2406 в за» лежяості від нітратного фону в середовшці/в % від сухої ваги/

шс [ ліс"

Компонентній

склад

ї-

мМ НО£ і кСІ Ь’03

20 40 Т 0 20 40

Глюкоза 2І,о 21,Й 24,Ь [Ь,{ 17,6 їй,4

іалактоза 2,3 2,5 3,3 2,7 2,2 1,3

Маноза 1,3 - - 1,6 0,7 0,7

Фукоза , - - - 1,7 1,7 1,7

ЗДГоьм о 6*° 6’7 5,8 - І,І 1,5

Щ/Чш о’іг - - - 2,5 0,9 1,0

Глюкозаміні - - - 2,1 1,6 1,3

Хіновозамін - - - 0,9 1,0 0,9

Піровиноградна

кислота 3,9 3,0 2,2 - - -

Уронові кислоти 5*2 5,6 7,7 4,7 4,9 4,7

КДО______________________- - - 2,2 3,4 3,7

Примітка. означає, що цей сахар не виявлений.

В самому ЕПС зменшується з 3,9 до 2,2 % кількість піровиног*-радног кислоти. Виявлено також, що макромолекули ЕПС втрачають конформаційну еластичність /довжина макромолекулярних кластерів нри розтягуванні знижується в 1,5-2 рази/, що е важливим для їх взаємодії з іншими <5 і опалі мерами. Внаслідок цих змін, а також, імовірно, і інших неврахованих нами, активність взаємодії ЕПС з лектином гороху знижується з 36 до 21 %.

Відмічено) зміни; і в ЛПС глікановому комплексі. При під-вищещіі в середовищі рівня нітратного азоту спостерігається зниження кількості фракції низькомолекулярних клітинних полісахаридів /НШШ/ відносно ЛПС /дані гель-фідьтрації на Сефа-розі 4Е/. При 40-60 мМ ію3“ фракція НГЛКП внаслідок інгібування синтезу клітинного низькомолекулярного гетеропо лі сахариду, містить тільки глюкан.

Зменшення клітинних і позаклітинних низькомолекулярних ’втерополісахаридів/ГПС/ відносно глюкаяів/Гл/ при вирощуванні

О

- 40 -

бактерій на середовищі 'з високим нітратним фоном і зниження співвідношення ГПС/Гл у, неефективного штаму б.б. гороху/2486/ в порівнянні з ефективними/2526, 2406/ свідчить про можливу участъ низькомолекулярних ШС у визначенні симбіотичної компетенції ризобій. В свою чергу, збереження синтезу глюкану в різних умовах, вирощування бактерій може вказувати на його захисну роль при. засоленості середовища, оскільки припускається /Cangeloal et al. , 1990, Kennedy , 1982, Miller et al. » 1990/, що, окрім специфічних функцій при формуванні симбіозу, низькомолекулярні глюкани беруть участь в процесі осмоадапта-цїї бактерій. .

В ліпополісахаридах, синтезованих на високому нітратному фоні, з'явився новий компонент - Xg/Tpay Q 82/, який равілю виявлявся тільки у складі екзогліканів, змінився вміст деяких вуглеводних компонентів /Табл.5/. В ліпіді А підвищилася відносна кількість триокситетрадеканової кислоти, що є характерним для ЛПС неефективних штамів 87 і 2486. Картина sns-ПААГ у "Нітратних" ЛПС відрізнялася від такої у звичайних ЛПС. 'Her-зважаючи, на ці зміни, ступінь спорідненості лектину гороху з ЛПС практично не змінилася.

Таким чином, б.б. гороху а умовах високого забезпечення мінеральним азотом синтезують модифікований комплекс позаклітинних. та клітинних, вуглеводів, який характеризується як змі-ненням співвідношень індивідуальних полісахаридів /ЕПС, ЛПС, І/днПС, клітинного низькомолекулярного гетерополісахариду, позаклітинного і периплазматичного глюканів, тощо/, так і компонентного складу окремих полісахаридів /вміст ПВК в ШС, мо-номерний та жирнокислотішй склад ЛПС/.

Біологічні властивості модифікованих полісахаридів ризобій вивчали в лабораторно-вегетаційних дослідах. Інокулят

Таблиця Є.

Біологічна активність полісахаридів, синтезованих б.б. гороху /шт.250а/ на середовищі з високим азотним фоном

Бфектив-іКількість іАзотфіксуюча нісгь ¡бульбочок; активність

її

ц/п

Варіант

шт/росл. ¡шсМ /

І . і, -

1. Клітини + ЕПС

2. Клітини. + ЕПСзОмМ

3. Клітини2омМ + ЕПС

4. Клітинним + ЕПС20мМ

5. Інокуляцію не. проводили! /контроль на стерильність/

1,70*0,07 29,6*1,4 2,67

1,68*0,12 26,4*3,1 0,43

1,77*0,12 30,4+2,3 1,11

1,55*0,18 18,4*2,5 . 0,50

1,64*0,08 0,1*0,1 0

бактерій вирощували на мінеральао-маніткому соредовищі, яке містило 6 ММ Н03" /контроль/ І 20 ¡¿І N0^“ /дослід/. Рослини вирощували на середовищі із 1,2 мМ но^-. Лдці представлені на Таблиці б.

Встановлено, що. при використані повністю “Нітратного" Ідолуляту /іШТ1ШИ2амц + Ш^ощу/ в 1,6 рази знижується кількість бульбочок і більЕз, пі= в 5 разів, - їх азотфіксуюча активність. Заміна "нітратного" ЕПС на звичайний в 2,2 рази підвищила азотфіксацію бульбочок, в той час як в присутності "нітратного" ЕПС звичайні клітини формували слаборозвинуті бульбочки. Оскільки в цих дослідах рослини гороху вирощували на невеликій дозі азоту /1,2 мМ но^-/, то після інокуляції ризобії розмножувалися вже в нормальних умовах і синтезували нормальний яодісахаридний комплекс. Той факт, ща використання в івокуляті "нітратних." ЕПС або клітин призводить да формування бульбочок із слабкого нітрогеназною активністю, свідчить,

по-перше, про значну втрату синтезованими на високому азотному фоні глікополімерами ризобій своїх сигнальних функцій /особливо це стосується екзогліканів/, а пот-друге, що індукторні властивості ризобіальних полісахаридів виявляються на самих перших етапах встановлення симбіотичних взаємовідносин.

При вирощуванні рослиш гороху на середовищі із 7,2 мМ Я0у~ утворюється незначна кількість маленьких, білях, не-азотфіксуючих бульбочок /0,4-1,8 шт./росл./. В цих умовах характеристика інокуляту не мала принципового значення для формування симбіозу.

Оскільки, як вказувалося вище, лектин рослики-хазяїна здатний стимулювати ріст ризобій, вивчали, чи відбувається цей 'процес на фоні зв'язаного азоту. Для цього я. іееиіаіпоаагит 250а вирощували в чистій культурі на мінерально-манітному середовищі, яке містило 50 мМ і різні концентрації лекти-

ну гороху /0,001-50 мкг/мд/. Встановлено, що в присутності високої концентрації нітратних іонів лектин не актизує ростові процеси ризобій, що є важливим моментом в XX підготовці до симбіотичного кооперування. Однією з причин цього явища може бути порушення функціонування системи лектин-вуглеводного пізнавання внаслідок синтезу бактеріями на високому азотному фоні модифікованого полісахаридного комплексу.

ВИСНОВКИ

І. На основі вивчення екзополісахаридів/ВДС/, капсуляр-них полісахаридів/КПС/, ліпополісахаридів/ЛПС/ і глюканів з 16 штамів ШіігоЬіїт Іевитіповахит Ьу. уісіае встановлено, що комплекс поверхневих полісахаридів визначає симбіотичні властивості бульбочкових бактерій: ступінь їх специфічності по відношент дорослини-хазяїна, ефективність, азотфіксуючу

....... - 43 -

активність, вірулентність, конкурентоздатність.

2. Виявлено, що фізико-хімічні особливості полісахарядного ансамблю, які впливають на симбіотичний статус бульбочкових бактерій, полягають не тільки в тонких модифікаціях складу і структури індивідуальних, глікополімерів, але і в їх різних співвідношеннях і характері асоціативних зв'язків міх аобоа а идігішщц. і иозакліишлих коіяхлвасаі.

3. Визначено закономірні відмінності компонентного складу; в усіх трьох структурних частинах ЛПС /О-по лі сахариді, корі і ліпіді А/ і його макроструктурної організації, в залежності від симбіотичних ознак бульбочкових бактерій. Високоефективні. штами в порівнянні з неефективними синтезують ШС переважно в в -формі з більшим розміром О-солісахариду, який має більш лабільний зв'язок з кором. У неефективних, штамів домінує й -ШС з більшим вмістом 3-окситетрадеканово£ кислоти, в ліпіді А. ЖС високовірулентних ризобій характеризується меншим розміром О-ланцюга і більшим вмістом уронових кислот, які

е компонентами кора. Показано, що ЕПС високоінфекційних ризобій гороху містить більшу кількість піровиноградної кислоти.

4. Встановлено, що лектини з насіння рослин-хазяїв, що перехресно інфікуються Н. І0£итігюзагит Ьу. уісіае : кормових бобів /чотирьох сортів/, гороху /двох сортів/, вики /одного сорту/, сочевиці /двох сортів/ е глюко з о/мано з о-специ-фічними і відрі знятться між собою за гемаглютинуючою активністю і вуглевод—зв'язуючими властивостями.

5. Всі типи досліджених полісахаридів: ЕПС, КПС, ЛПС і клітинні глюкани е рецепторами лектинів рослин-хазяїв.

6» Лектин-рецепторна активність ризобіальних полісахаридів корелюе з симбіотичними властивостями штамів. Ступінь спорідненості бактеріального ліпополісахариду і рослинного

- 44 -

лектину е одним із Акторів специфічності бобово-рлзобіально-го симбіозу і визначає його ефективність. Встановлено пряму кореляцію між конкурентоздатністю і активністю взаємодії лек-тину рослини-хазяїна з ЕПС і обернену по відношенню до ЛПС.

7. Еа прикладі й. іеєитіпозагит 2526 показано, що бактеріальні екзоглікани і ліпополісахариди є також ауторецепторами поверхневого аглютиніну й, того я самого штаму.

8. В лабораторно-вегетаційних дослідах виявлена залежність впливу ЕПС та ЛПС на процес бульбочкоутворення від вірулентності їх штаму-продуценту. ЕПС високоікфекційних ризо-бій гороху здатні підвищувати, а ЕПС помірновірулентних, не-конкурентоздатних бактерій, навпаки, знижувати активність бульбочкоутворення іншими гомологічними штамами. Ліпополісахариди високовірулентних ризобій здатні посилювати вірулентність у менш інфекційних бактерій. Характер впливу глюканів на формування симбіозу залежить, в першу чергу, від симбіотичних властивостей штаму-інокулянту.

9. Показана індукторна роль ЕПС у розвитку функціонально активних бульбочкових структур. Виявлено препарати ЕПС ризобій гороху, які сприяють формувати) бульбочок з підвищеною азотфіксуючою активністю.

10. Встановлено, що екзополісахариди бульбочкових бактерій являють собою молекулярні біосенсори з акустичними властивостями, які виявляються в ультразвуковому діапазоні частот /200-400 кГц/ для водного середовища.,

11. Мінеральний азот в середовищі інгібує загальний біосинтез вуглеводів, повністю пригнічує синтез симбіотично важливого манозовмісного КПС. В цих умовах ЕПС продукується в значно меншій кількості і модифікованій формі /зменшується вміст піровиноградної кислоти/, внаслідок чого знижується кон-

- 45 -

формаційна еластичність ЕПС, його спорідненість до лектину рослини-дазяпіа, втрачається біологічна активність щодо контролю розвитку ефективних бульбочок.

12. Показано, що лектиіг із насіння гороху з концентрації 50-200 шсг/мл збільшує швидкість росту бульбочкових бактерій гороху.і накопичення їх біомаси. При рості на середовищі із иінерадьшдл азотом, імовірно внаслідок синтезу ■ ризобія«*“ моїтп-фікованого полісахарпдного комплексу, лектин рослини-хазяїна втрачає можливість стимулювати ростові процеси, бактерій -першого етапу їх підготовки до кооперування з макропартіїером.

13. На основі порівняльного вивчення біохімічних, фізи-ко-хімічних. характеристик поверхневих полісахарвдів R. îegumi-nosarum Ът. vloiae, їх лектин-рецепторної активності, результатів лабораторно-вегетаційних дослідів, кореляційного аналізу одержаних, експериментальних даних встановлено, що екзоглі-каїш, ЛПС і клітинний глюкан беруть участь як на самих ранніх етапах формування симбіозу, так і е індукторами більш пізніх стадій його розвитку.

Основні роботи, надруковані за темою дисертації:

1. Косенко Л.В., Воцедко С.К., Ковалевская Т'.М. Молекулярная масса экзополисахаридов Rhizobium loguminosarum // Микробиол. яурн.-І984.-46> H 5.-С. 8-12.

2. Ковалевская Т.М., Косенко Л.В., Воцелпо С.К. Гетерогенность липополисахаридов Rhizobiua leguminocorum // îiffi-робиол. sypH.-I984.-4S, Я 6.-С. 14-18.

3. Ковалевская Т.М., Косенко Л.В,, Захарова И.Я. йэноса-харидкнй состав экзополисахаридов перокрестно зараяающей Группы Rhizobium legumino s arum // МикробЙоЛОГИЯ.-І985.-54,

B.S.-C. 810-814.

- 46 -

4. Захарова И.Я., Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., Барес-

тецкий O.A., Новикова А.Т. Полисахариды но различных, штаммов клубеньковых, бактерий кормовых бобов // Шкробиология.-I98S.-55, В.4.-С. 656:-66I. .

5. Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., Зазарова И.Я. Селективность взаимодействия полисахаридов Hhizobiun: leguminosarum с лектинамш растенкй-хозяев // ”лкробиология.-1987.-56, в.4,-С. 698-702.

6. Косенко Л.В., Ковалевская Т.М., Захарова И.Я., Новикова А.Т., Берестецкий O.A. Взаимодействие полисахаридов клубеньковых бактерий кормовых бобов с лектинами доминирующего растения-хозяина // Микробиология.-1988.-57, в.4.-С. 675-679.

7. Косенко Л.В., Пацева Ы.А., Захарова И.Я. Взаимодействие. полисахаридов клубеньковых, бактерий гороха с лектином доминирующего растения-хозяина // Микробиология.-1989.-58, в.5.~ С. 812-817.

8. Косенко Л.В., Ковалевская Т.Н. Липополисахариды клу-

' беньковых бактерий, перекрестно заражающих кордовые бобы, горох, вику и чечевицу // Микробиология.-I989.-58, в.6.-С. 927233.

• 9. Косенко Л.В., Ковалевская Т.М. Значение лектин-угле-водных. взаимосвязей в формировании бактериально-растительных, симбиотических систем // Ученые записки Тартусского ун-та "Изучение и применение лектиков". Тарту: Изд-во ТЕУ,1989,-Вип.870.-Т.2, Лектины в биологии и медицине,-С. 17-24.

10. Косенко Л.В., Пацева М.А., Лахтин: В.М. Использование конканавалина А для изучения полисахаридов клубеньковых, бактерий гороха // Tat.» же.-C. II3-II8.

11. Косенко Л.В., Рангелова В.Н., Антипчук А.Ф. Полисахариды Rhizobiun; leßuminosarum И ИХ взаимодействие С Л6КТИ-

- 4? - - ......

нами растения-хозяина // Ыкробиол. яурн.-198Э.-51, к 5.~

С. 71-77. '

12. Косенко Л.В., Пацева М.А., Захарова И.Я. Мопосаха-

ридкый состав поверхностно локализованы^ полисахаридов клубеньковых. бактерий гороха // ;.1икробпологм.-19°0.-5Э, в.2-

С. 289-293. ‘

13. Паттотл М.Л., Косенко ».В. Биологическая активнее!;, экзоиоллсахаридов Rhizobiua leguxainosorum в нодуляцианнсм процессе // Мккробиология.-1991.-60, в.2.-С. 273-278.

14. Kosenko L.V. Leguae-RhizobSum symbloaia is regulated by lectin-polysaccharide relations // Lectins: Biology, Biochemistry and Chemical Biochemistry, vol.8, Copenhagen: Textop Publishers, 1993 (Van Dries3che E., Frans H., Beeck-mana S., Pfiiller U., Kallikorm A., Bog-Напзеп 5.C., eds.).

15. Козепко L.V., Patseva U.A. The influence of nitrate

nitrogen in vivo on the chemical properties and lectin-binding ability of Rhizobium leguminosarmn polysaccharides // Ibid. '

IS. Hikitina V.Ye., Karpunina L.V., Kooenko L.V., Patseva M.A. Hemagglutinins of Rhiaobium leguroinosarum // Ibid.

17. Косенко Л.В. Лектан-углевсдные взаимодействия клубеньковых бактерий кормовых бобов и Vicia faba как фактор специфичности и эффективности их. симбиоза // Микробиология,— I992.-5I, в.С.-С. I043-1050.

18. Косстко Л.З., Рангелова В.Н., Антшчук А.Ф. Влияние ЛбНТИНа горо.'^а на рост Rhizobiun leguminoaanun // МзкрсбИОЛ. 2QfpH.-I993.-55, И I.-C. 65-70.

19. Косенко JLB., Антшчук А.Ф., Рангелоаа В.Н. Влияние экзополисахаридов клубеньковых бактерий гороха на формирование бобово-ризобиального симбмоза и его эффективность //

- 48 -

Микробиология.-I995.-64, в.2.

20. Карпунина Л.В., Никитина В.Е., Колтунова Е.Ф., Косенко Л.В., Пацева М.А., Чернева И.Н. Взаимодействие агглютинина к1 Rhizobium leguminosarum 252 с ауто- и растительными! рецепторами. // Мшфобиол. журн..-1995.-57, Hl.-C. 64-70.

21. Косенко Л,В., Захарова И.Я», Генина О.С., Жизнев-ская ГЛ., Измайлов С.Ф., Русса Р., Лоркиевич 3. Кирнскислот-ный состав липида А. липополисахаридов, выделенных из Hhisso-bium leguminosarum // Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений. Респ. конфер. /Тернополь, 1991/: Тез. докл.-Киев, 1991. С. 34.

22. Kosenko L.V., Patseva М. A., Zakharova I.Ya. The ef-

fect of nitrate nitrogen oa chemical properties and lectin-binding ability of Rhizobium leguminosarum polysaccharides // Eleventh Internet. Lectin Conference "Interlec-11" /Tallinn-Tartu, 1939/» Abstracts, И 70. .

23. Kosenko L., Patseva М., Zatovakaya X., Mandrovskaya K., Krugova E. The influence of the mineral nitrogen on the biosynthesis and properties of surface Rhizobium leguminosa-rum polysaccharides // YHI-th Eastern Europe Symposium on.-Biolog. Nitrogen Fixation "Hitrogenfix-92" /Saratov, Russia, 1992/: Absracts.-L.27.

24« Konoplya Ы.Ы., Kosenko L.V. Dynamic autoregulation of bacterial(rhizobial) acidic exopolysacchaxides in water solutions // XYII-th Intern. Carbohydr. Symp. /Ottawa, Canada, 1994/: Abstracts.-Cl.6,-P.393«

25. Kosenko L., Konoplya II. Hhizobial exopoly saccharides are molecular biosensors // 10th Intemat. Congress on Nitrogen Fixation /St. Petersburg, 1995/s Abstracts.