Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная ассоциация клеточного белка циклофилина А с частицами вируса иммунодефицита человека типа 1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Функциональная ассоциация клеточного белка циклофилина А с частицами вируса иммунодефицита человека типа 1"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ М. В. ЛОМОНОСОВА Институт физико-химической биологии им А. Н. Белозерского

На правах рукописи

УДК 6Г8.23

БУКОВСКЙИАНАТ ОЛИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АССОЦИАЦИЯ КЛЕТОЧНОГО БЕЛКА ЦИКЛОФИЛИНА А С ЧАСТИЦАМИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ТИПА 1.

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте рака "Дана-Фарбер" Гарвардской медицинской школы (США) и в отделе взаимодействия вируса с клеткой Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ.

Научные руководители: Г. Готтлингер, МЛ}., профессор-ассистент патологии Гарвардской медицинской школы;

В. И. Агол, доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАМН.

Официальные оппоненты: Альтштейн А. Д., доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАЕН.

Гараев М.М., доктор биологических наук, профессор.

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН

Защита диссертации состоится 21 апреля 1997 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: Москва, Воробьевы Горы, Биологический факультет, МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан марта 1997 г.

Ученый секретарь

Актуальность темы

С момента открытия вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) уже насчитывается около десяти тысяч научных публикаций, посвященных изучению данного вируса и его патогенному влиянию на клетки и организм в целом. Однако, несмотря на растущий поток информации, проблема лечения СПИД и поиск путей защиты от вируса остаются неизменно актуальными. Существующие сегодня противовирусные соединения быстро теряют свое действие, что объясняется отбором мутантных вирионов, способных к репродукции в присутствии противовирусного соединения. Быстрая мутационная адаптация вируса к угнетающим его условиям окружающей среды является также основной причиной неспособности иммунной системы организма к своевременному генерированию реакций, ведущих к полной нейтрализации вируса. Таким образом, основным требованием, выдвигаемым к противовирусным соединениям, является их способность к блокированию или, по крайней мере, к существенной задержке репродукции вируса, что должно обеспечивать эффективное развитие иммунологического ответа организма.

Тот факт, что репродукция вируса находится в зависимости от белков клетки, позволяет предложить принципиально новый подход для противодействия мутационной изменчивости вируса. Так, с целью достижения противовирусного эффекта, в качестве мишени могут быть выбраны клеточные белки, которые выполняют существенную роль в процессе репродукции вируса. Т.к. все клеточные белки в норме защищены от мутирования клеточным механизмом репарации, дальнейшая репродуктивная способность вируса теоретически должна будет зависеть от' более сложного мутационного отбора вирионов. Одним из кандидатов на роль мишени противовирусных соединений является исследуемый в настоящей диссертационной работе клеточный белок циклофилин А, который, как это было установлено, специфически ассоциирован с частицами ВИЧ-1 (Thali М., Bukovsky A., Kondo Е., Rosenwirth В., Walsh С. Т., Sodroski J. & Gottünger Н.О. Nature 372:363-5 (1994), Franke E. К., Yuan H. Е. & J. Luban. Nature 372:359-362 (1994)).

Цель и задачи исследований

Цель настоящей работы состояла в Изучении природы обнаруженного феномена включения клеточного цитоплазматического белка цикпофилина А в состав частиц ВИЧ-1. В задачи исследований входило:

1. Точное картирование детерминанты ВИЧ-1 в составе полипротеина Gag, ответственной за включение циклофилина А в состав вирионов.

2. Изучение влияния соединений, связывающих циклофилин А, на способность вируса к репродукции.

3. Изучение влияния обнаруженного в вирусных частицах циклофилина А на жизненный цикл ВИЧ-1 на различных этапах.

Научай новизна н значимость работы

В работе обнаружено специфическое включение клеточного белка циклофилина А в составе частиц ВИЧ-1, и отсутствие этого белка у других ретровирусов.

Показана функциональная значимость циклофилина А в жизненном цикле ВИЧ-1, а именно на начальных этапах инфицирования клетки.

Впервые продемонстрирована возможность угнетения репродукции вируса путем воздействия на клеточный белок.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела по материалам и методам, экспериментальной части, обсуждения результатов,

выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация содержит _

страниц,_рисунков и библиографический список из_названий.

Апробация работы

Материалы исследований опубликованы в восьми научных статьях, а также представлялись на ежегодных конференциях, посвященных ретровирусам, в Cold Spring Harbor Laboratory (США, Нью-Йорк, 1994, 1995 и 1996 г.г.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД Ы

Клетки п клеточные линии

E.coli, DH-1, бактериальный штамм. Штамм использовался дня наращивания плазмидных ДНК. Получен из American Type Culture Collection (АТСС 4350).

E.coli, С/256 (dut-, ung-), мутантный бактериальный штамм. Мутации данного штамма приводят к частичному включению нуклеотидов урацила взамен тимина в состав трансформированных плазмидных ДНК. Штамм использовали для выделения одно'нитевых ДНК при помощи фага М13К07 (Stratagene). Однонитевые гшазмидные ДНК использовали для сайт-специфического мутагенеза (АТСС 9980).

HeLa, клеточная линия, изолированная из тканей карциномы матки человека (Cancer Res. 12: 264, 1952). Характерным свойством клеток этой линии является их способность прикрепляться к поверхности пластика культуральных сосудов. Линию использовали для количественного выделения препаратов вирионов после трансфекции клеток провирусной ДНК (АТСС CCL-2).

Cos-1. Клетки линии первоначально были выделены из почек африканских зеленых мартышек (AGM), затем трансформированы вирусом SV40, дефектным в области позднего промотора. Клетки содержат Т-антиген. Характерным свойством клеток этой линии является их способность прикрепляться к поверхности пластика культуральных сосудов. Линию использовали для количественного выделения препаратов вирионов после трансфекции клеток провирусной ДНК. (АТСС CRL-1650).

СЕМх174. Клетки линии являются гибридами трансформированных В и Т лимфоцитов человека, полученных за счет слияния их мембран в присутствии ПЭГ (полиэтиленгликоль). Клетки этой линии растут в суспензии. Линию использовали для оценки способности вирусов к репродукции (АТСС CRL-I99I).

Jurkai, клон Е6-1. Клеточная линия, изолированная из крови пациентов с Т-клеточной лейкемией. Клетки этой линии растут в суспензии. Линию использовали для оценки способности вирусов к репродукции (АТСС TIB 152).

РВМС, периферические мононуклеарные клетки крови человека. Клетки выделяли из донорской крови непосредственно перед экспериментом.

Используемые плазмиды

рНХВМ, плазмида, кодирующая инфекционный провирус ВИЧ-1 в составе коммерческого вектора pBR322 (Pharmacia). В отличие от родительского изолята НХВс2 данный провирус содержит открытую рамку считывания для гена vpu. Соответствующая последовательность провируса НХВ2 была заменена последовательностью vpu-положительного изолята ВН10. Экспрессия вирусного белка Vpu в дополнение к экспрессии полипротеинов Gag различных ретровирусов приводит к значительному увеличению количества высвобождаемых клетками вирионов.

pHXBIO/PR-, плазмида рНХВЮ, несущая точечную мутацию в активном центре гена, кодирующего протеазу ВИЧ-1. Вирусные частицы, высвобожденные клетками, трансфицированными данной плазмидой, содержали протеазу, не способную к расщеплению вирусных белков-предшественников.

рНХВХО/ХЬа плазмида рНХВЮ/PR-, несущая дополнительный сайт рестрикции Xbal (введение сайта не меняло кодируемую аминокислотную последовательность) в области гена viif.

pHXB10/Gag-stop, плазмида рНХВЮ, несущая стоп-кодон взамен кодона, кодирующего первую аминокислоту полипротеина Gag.

pSIVSpSp-5' и pSIVSpE-З', плазмиды в составе коммерческого вектора pBR322 (Pharmacia). Плазмиды содержат инфекционный изолят вируса иммунодефицита обезьяны (ВИО) (SIVM/ia3у). Плазмида pSIVSpSp-5' содержит клонированный Sphl-SphI фрагмент ДНК изолята S1VMAC2№ включающий 5'-длинный концевой повтор, последовательность гена gagpol и часть последовательности вспомогательных генов, ограниченной сайтом рестрикции Sphl. Плазмида pSIVSpE-З' содержит клонированный Sphl-EcoRI фрагмент ДНК изолята SIVMAC239, включающий оставшуюся 3'-последовательность вспомогательных генов, ген ет и З'-длинный концевой повтор. Плазмиды были любезно предоставлены Р. Дезройзером. Для получения полной ДНК провируса в целях трансфекции, Clal-Sphl фрагмент (6.5 тысяч нуклеотидов) плазмиды pSIVSpSp-5' лигировали с Sphl-EcoRI фрагментом (4 тысячи нуклеотндов) плазмиды pSIVSpSp-3'.

pHXBlO/SIV«*, плазмида pHXBIO/PR-, несущая замену участка генома ВИЧ-1, кодирующего полипротеин Gag, на соответствующий участок ВИО клона SlVU/ia39. Экспрессия полипротеина Gag ВИО в данной конструкции определялась промотором 5'-длинного концевого повтора ВИЧ-1.

pHXBlO/RODm, pHXB10/LVm, pHXBlO/VISsn, плазмиды, несущие замены участка, кодирующего полипротеин Gag ВИЧ-1 плазмиды pHXBIO/PR-, на соответствующий участок ДНК вирусов: ВИЧ-2 (клон ROD), вируса лейкоза мышей Молони (MuLV) и вируса Висны (Visna) соответственно. Экспрессия полипротеинов Gag в данных конструкциях определялась промотором 5'-длинного концевого повтора ВИЧ-1.

pSVUIenv, плазмида, кодирующая ген епу ВИЧ-1 (клон НХВс2) в составе коммерческого вектора pSVHI (Promega). Экспрессия гена ет находится под контролем промотора SV40.

pHXBlOenr/CAT, плазмида рНХВЮ, несущая делецию в гене env, а также несущая ген cal (ген, кодирующий бактериальный фермент хлорамфениколацетилтрансферазу), встроенный взамен вирусного гена nef.

pTS18Urn, модифицированный коммерческий вектор pTS18U (United States Biochemical), имеющий orí репликации Fl бактериофага M13K07 (Stratagene). Высвобождаемая фагом однонитевая ДНК является минус-цепью исходной плазмиды. В присутствии плазммдной ДНК, содержащей orí репликации FI, бактериофаг М13К07 селективно упаковывает плазмидную ДНК взамен фаговой. Модификация вектора pTS18U заключалась в замене исходного полилинкера на полилинкер вектора pSL-1180 (Pharmacia).

pl8-SIV«"*, плазмида, кодирующая полипротеин Gag (участок ДНК провируса, ограниченный сайтами рестрикции Narl и BspHI) ВИО (изолят S1VUAC239) в составе вектора pTSI8Um.

SK+1.3SA, плазмида, кодирующая часть полипротеина Gag (участок ДНК провируса, ограниченный сайтами рестрикции SacI (нуклеотид 492) и Apal (нуклеотид 2005)) ВИЧ-I (изолят НХВс2) в составе коммерческого вектора pBluescriptSK* (Stratagene), имеющего Fl orí репликации бактериофага MlЗК07. Высвобождаемая фагом однонитевая ДНК является плюс-цепью плазмиды SKM.3SA.

Использованные олигоиуклеотиды

В ходе исследований было обнаружено, что при замене средней части капсидного белка ВИО, а именно аминокислотного мотива "QPAPQQ", на мотив "VHAGPIAP" средней части капсидного белка ВИЧ-1, химерный вирус приобретал способность к связыванию белка циклофилина А. С целью получения дополнительных мутаций в области мотива "QPAPQQ" капсидного белка ВИО был проделан ряд экспериментов по проведению сайт-специфического мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, показанных в таблице 1.

С целью оценки значимости каждой из аминокислот мотива "VHAGPIAP" во взаимодействии капсидного белка ВИЧ-1 с циклофилином А был проведен эксперимент "сканирования аланином". Замены аминокислот производили методом сайт-специфического мутагенеза с использованием плазмиды SK*1.3SAss в качестве матрицы для отжига олигонуклеотидов, показанных в таблице 2.

Сайт-специфический мутагенез проводили стандартным методом отжига синтезированных олигонуклеотидов на однонитевые ДНК-матрицы, полученные при помощи бактериофага-помощника М13К07. Кроме рестрикционного анализа, правильность полученных мутаций проверяли секвенированием. Праймер 5'-gtgtgggagaccatcaagc-3' использовали для секвенирования ДНК, кодирующей среднюю часть капсидного белка ВИО. Праймер 5'-atgcaaatgttaaaagaga-3' - аналогичный праймер для ВИЧ-1.

Таблица 1.

м nfa Олигоиуклеотад1 днк- нпркт1 Последовательность1 Сайт peCTpHIC- UHll4 Плязмиоя'

1 5'-tgggacttgcagcaccca gtgcacgcagggccaattgса ccaggacaacttagggagccg tc-3' pl8-SIVP«M va&SPlAP Muni, ApaLI P18-S1V-8

2 5' -cacccacaaccagctcca attgcaccaggacaacttagg gagccg-3' pIS-SIVfBS QPA'PXAP Muni p!8-SIV-C4

3 5'-tgggacttgcagcaccca gtgcacgcagggccacaacaa ggacaacttaq-3' P18-SIVW» VHAGPQQ' ApaLi PI8-S1V-N4

4 5'-ccacaaccagctgggccc caacaagqacaa-3' pie-SIV«ss QPAGPQQ A pal pl8-SlV-l

5 5'-cacccacaaccagctggg cccgcgcaacaaggacaa ctt-3' P18-S1VWM OPAGPAOQ Apal, BstUI pl8-SIV-la

С 5'-gcagcacccacagcacgc agggc-3" pl8-SIV-8sj QHASPI« Muni pl8-SIV-C7a

7 5'-gggccaattgcgcaagga caacttag-3' pl8-SIV-8sa VHAGPXAQ Fspl, Muni, ApaLI p!8-SlV-N7a

8 5'-agggccaattccaccagg aca-3' pl8-SIV-8ss VHAGPIPP ApaLI pl8.SIV.AFH«

9 5'-gggacttgcagcacccac caccggtagggccacttccac caggacaacttagg-3' pl8-SlV-8ss PPVGPLPP Agel P18-S1V-0'

10 5'-cacccacaacccgggcca attgcacca-3' p)8-SIV-C4a QPGPIAP Smal, Muni p]8-SIV-Ci

11 5'-cccacaaccagcgggccc aattgcaccag-3' pl8-SlV-C4ss QPAGPIAP Apal, Muni p!8-SIV-C5a

12 5*-gcacgcagggcccataca aggacaac-3' pl8-SlV-N4ss VHAGPIQ Apal, ApaLI PI8-S1V-N6

13 5'-gcacgcagggcccataca acaaggacaac-3' pl8-SIV-N4a VHASPigg Apal, ApaLI pl8-SlV-N6a

14 5' -ggccacaacaagccggcc aacttagggagc-3' p!8-SlV-N4ss VgAePQOH NgoMl, ApaLI p!8-SIV-N4a

' - Последовательность использованного олигонуклеотида;

1 - Название однонитевой плазмидной ДНК, служащей матрицей дик отжига данного олигонуклеотида (ss - single strand);

1 - Создаваема* мутагенезом аминокислотная последовательность взамен мотива "QPAPQQ " в хапсидном белке ВИО (аминокислоты соответствующего участка капсидного белка ВИЧ-1 выделены);

4 - Вводимые сайты рестрикции ДНК, предоставляющие возможность проведения рестрикционного анализа полученных мутаций;

» - Названия полученных плазмид. Номер в названии соответствует количеству вводимых аминокислот из мотива "VHAGPIAP" капсидного белка ВИЧ-1 (выделены в колонке 3). В случае, когда общее число аминокислот мотива равнялось восьми, в название ставилось расширение "а".

' - Обозначения A, F, Н и О соответствуют названиям групп изолятов ВИЧ-1 базы данных "GenBank".

Таблица 2.

Олнпжуклопна Замешемш аммоюсжгга Сайт рестоасцня Плазмида

5'-RRCCct(tcatKCRCtMatícactc-3' Val218-Ala > Hhal SK+1.3SA/V218-A

5'-caataKjíccctl!CC|$CRactffiatRc-3' His 219-Ala SK+I.3SA/H219-A

S'-caatflKKccctccatKKactf>KatKC-3' Ala 220 - Gly Neo! SK+I.3SA/A220-G

5'-Rtírcaa!aRECRctítcatjícactjí-3' Gly 221 - Ala SK+I.3SA/G22I-A

54I?l!Ipcaa!c?cpccTpca!ecac-3 Pro 222-Ala Bstul SK+I.3SA/P222-A

5'-ÍPCCtKEt(!CCRCKRRCCCtgcat(f-3' De 223-Ala Bstul SK+1.3SA/I223-A

5'-ctcatct!ígccg>ígcccaata(íítccc-3' Ala 224-Gly Apal SK+1-3SA/A224-G

y«Hctíí«CíCf!!!caata»!TO-3' Pro 225-Ala Bstul SK+1.3SA/P225-A

'-Номер соответствует порядковому номеру аминокислоты в молекуле Gag ВИЧ-1. Приготовление модифицированных плазмвд

pHXB10/PR/CA19-21, pHXB10/PR-/CA43-45, pHXB10/PR7CA90-93, pHXB10/PR/CA102-106, pHXB10/PR-/CA132-136, pHXB10ÍPR/CA -R167-A -

плазмиды, аналогичные плазмиде pHXBIO/PR-, за исключением делеций (замен) в области капсидного белка по указанным в наименовании участкам (номера соответствуют порядковому номеру аминокислот капсидного белка). Плазмиды были получены путем клонирования фрагментов BssHIl-АраЦнуклеотиды 710 - 2009) из аналогичных плазмид, не несущих точечную мутацию в гене протеазы (рНХВ10/СА Дх), в плазмиду, имеющую данную мутацию (pHXBIO/PR-).

pl8-SrV«"« - плазмида была получена путем клонирования фрагмента Narl-BspHI (нуклеотиды 1080 - 3034) из pSIVSpSp-5' в полилинкер вектора pTS18Um по тем же сайтам. Результирующая плазмида имеет 60 нуклеотидов полилинкера (сайты Bsplll-Xbal) в направлении 3' от клонированного фрагмента.

pHXBlO/SIVra. плазмида (кодирующая Gag ВИО взамен Gag ВИЧ-1) бьиа получена путем клонирования фрагмента Narl-Xbal (нуклеотиды 1080 - 3034 изолята SIVUAС23Я и 60 нуклеотидов полилинкера) плазмиды р18-SlVe»« взамен участка генома ВИЧ-1 между нуклеотидами 637(Narl) и 5228(ХЬа1) плазмиды рНХВЮ/ХЬа.

pHXB10/SIV!"í/PS-HIV - плазмида pHXBlO/SIVw, несущая замену фрагмента PstJ-Spel (нуклеотиды 1940 - 2024 изолята SIVMÁC2K) гена, кодирующего белок капсида ВИО, на аналогичный Pstl-Spel фрагмент капсида ВИЧ-1 (нуклеотиды 1414 - 1504). Psll-Spel фрагмент (90 пар нуклеотидов) плазмиды SK+1.3SA клонировали взамен соответствующего участка плазмиды pl8-SIV«4 с образованием плазмиды pl8-SIV««!/PS-HIV. Затем Narl-Spel фрагмент плазмиды pl8-SIV«»s/PS-HIV клонировали взамен Narl-Spelучастка плазмиды pHXBIO/SIV«"«.

pHXB10/SIV-8 - Narl-Spel фрагмент плазмиды pl8-SIV-8, полученной сайт-специфическим мутагенезом (см. выше), клонировали взамен Narl-Spel фрагмента (нуклеотиды 1080 - 1504 изолята SIVMAC239) плазмиды pHXB10/SIV«4. Аналогичным образом были клонированы фрагменты плазмид, содержащих мутации, показанные в таблице 1.

pHXBlO/PS-SIV и pHXB10/PR-/PS-SIV - плазмиды рНХВЮ и pHXB10/PR- соответственно, несущие замену фрагмента Pstl-Spel (нуклеотиды 1414 - 1504) гена белка капсида ВИЧ-1 на аналогичный Pstl-Spel фрагмент (нуклеотиды 1940 - 2024) капсида ВИО. Pstl-Spel фрагмент (84 пары нуклеотидов) плазмиды pl8-SIV«« клонировали ' взамен соответствующего участка плазмиды SK.M.3SA с образованием плазмиды

SK+1.3SA/PS-SIV. Затем фрагмент BssHÍI-Spel плазмиды SK*1.3SA/PS-SIV клонировали взамен фрагмента BssHII-Spel плазмиды pHXBlO или pHXB10/PR- (нукпеотиды 710 -1504 последовательности ВИЧ-1.

PHXB10/V218-A и pHXB10/PR-/V218-A - плазмиды рНХВЮ и pHXB10/PR' соответственно, несущие замену аминокислоты валин в позиции 218 молекулы Gag ВИЧ-1 на аланин. Фрагмент BssHII-Spel плазмиды SK+1.3SA/V218-A был клонирован взамен BssHII-Spel фрагмента плазмиды рНХВЮ или pHXB10/PR- (нуклеотиды 710 - 1504 последовательности ВИЧ-1). Аналогичным образом были клонированы фрагменты плазмид, содержащих мутации, показанные в таблице 2.

pSrVSpSp-5VCA-8 - плазмида pSIVSpSp-5', несущая замену мотива "QPAPQQ" капсидного белка ВИО на мотив "VHAGPIAP" ВИЧ-1. Фрагмент Narl-BspHI (нуклеотиды 1080 - 3034 последовательности ВИО) плазмиды pl8-SIV-8, а также фрагмент BspHI-Pacl (нуклеотиды 3034 - 5384 последовательности ВИО) плазмиды pSIVSpSp-5' были клонированы по сайтам Narl-PacI плазмиды pSIVSpSp-5'. Аналогичным образом были клонированы фрагменты плазмид, содержащих мутации, показанные в таблице 1.

Полученные плазмиды использовали для трансфекции культур клеток млекопитающих с целью получения вирусных препаратов. lOienot, растущие на поверхности пластика культуральных сосудов, трансфицировали методом кальций-фосфатной преципитации. Клетки, растущие в суспензии, трансфицировали методом deae-декстран. Супернатанты трансфицированных клеток центрифугировали при 27000 об/мин в роторе SW-41 в течение 1.5 часов для осаждения вирионов, или непосредственно использовали для иммунопреципитации.

Количественное определение фермента обратной транскриптазы в супернатиггах вирус-продуцирующих клеток

Вирусные частицы, осажденные из аликвоты бесклеточного супернатанта, растворяли в реакционном буфере, содержащим меченый 3Н тимидин 5'-трифосфат, и инкубировали в течение часа при 37°С. Смесь переносили на фильтры (Whatman DE81) для связывания с ними синтезированных обратной транскриптазой 3Н-меченых цепей ДНК. Фильтры промывали в солевом буфере, затем высушивали и помещали во флаконы с сцинциляторной жидкостью. Для определения уровня включения метки использовали автоматизированный гамма-счетчик (DuPont).

Определение инфицирующей способности вирусных препаратов с использованием ХАТ метода

Принцип метода

Метод позволяет определить инфицирующую способность вирусных препаратов в результате одного раунда репродукции. Из плазмиды, кодирующей провирус ВИЧ-1, удаляли часть гена ет по двум сайтам рестрикции Bgll. При помощи сайт-специфического мутагенеза вместо гена nef вводили ген, кодирующий бактериальный белок хлорамфеникол ацегилтрансферазу (ХАТ). При трансфекции данной плазмидой, высвобождаемые вирусные частицы не содержат гликопротеин Ет и поэтому не способны к инфицированию, а следовательно, и репродукции в культурах клеток. Однако, при ко-трансфекции данной плазмиды с

s

плазмидой, кодирующей только гликопротеин Env, высвобождаемые частицы способны инфицировать клетки-мишени, т.к. в лизатах вновь инфицированных клеток может быть обнаружена ферментативная активность ХАТ, что возможно только в результате эффективного инфицирования клеток-мишеней модифицированным вирусом. Таким образом, в результате ко-трансфекции данных плазмид происходит фенотипическое псевдотипирование генетически дефектных вирусных частиц. Обнаружение экспрессии белка репортера говорит о том, что произошли следующие процессы: £лу-опосредовакное связывание вирионов с клеточным рецептором, слияние вирусной и клеточной мембран, обратная транскрипция вирусного генома, его интеграция в геном клеток-мишеней, экспрессия белка репортера ХАТ, а следовательно, и вирус-кодируемых белков.

Важно заметить, что ввиду отсутствия экспрессии функционального белка Env в клетках-мишенях, высвобождаемые ими частицы являются неинфекционными.

Метод

Клетки Cos-1 или HeLa ко-трансфицировали плазмидамк pHXBlOenv/CAT и pSVIIIenv с целью получения псеадотипированных гликопротеином Env вирусных частиц. Количество высвобожденных частиц определяли при помощи реакции обратной транскрипции. В суспензию клеток мишеней вносили одинаковые количества вирусных препаратов.

По истечении 72 часов с момента внесения псевдотипированных вирионов клетки промывали переосаждением в 0.25М буфере Tris-HCI (рН 7.5), и проводили 3-4 цикла быстрого замораживания/оттаивания с целью их разрушения. Клеточные обломки удаляли центрифугированием, а клеточный лизат испытывали на активность фермента ХАТ. Реакцию проводили в присутствии ацетил-КоА и меченого 14С хлорамфеникола при 37°С в течение 1.5 часа.

По завершении реакции ацетилирования хлорамфеникол экстрагировали этил-ацетатом, затем высушивали на вакуумном роторе. Осадок растворяли в небольшом количестве этил-ацетата и наносили на хроматографическую пластину (silica gel chromagram sheet, Kodak). Пластину помещали в камеру содержащую 5% раствор метанола в хлороформе. Разделение ацетилированной формы хлорамфеникола от не ацетилированной происходило по причине различной подвижности этих форм при движении растворителя через слой силикагеля за счет капиллярных сил. По достижении фронтом растворителя верхнего края пластины, ее вынимали и высушивали в вытяжном шкафу, после чего вместе с фотопленкой закладывали в светонепроницаемую кассету для экспозиции.

В дополнение к визуальной оценке, по мере необходимости, активность ХАТ также определяли количественно. Для этого участок пластины, содержащий ацетилированную форму хлорамфеникола, вырезали, помещали во флакон с сцинциляторной жидкостью и оценивали уровень радиоактивности с помощью гамма-счетчика. Активность ХАТ выражали в процентном соотношении радиоактивности ацетилированной формы к общему уровню радиоактивности для каждого из образцов.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Специфическая ассоциация циклофилина А с частицами ВИЧ-1

На начальном этапе исследований было необходимо подтвердить предположение о том, что белок, обнаруженный в препаратах вирусных частиц, содержащих полипротеин Gag ВИЧ-1, но не других ретровирусов, является циклофилином А (ЦфА). Для этой цели была произведена трансфекция клеток HeLa плазмидзми, кодирующими полипротеины Gag ретровирусов, указанных на рис. 1.

Трансфекцию производили методом кальций-фосфатной преципитации. По истечении 48 часов с момента трансфекции смеси среду заменяли на среду, содержащую радиоактивный 355-Метионин и продолжали инкубацию в течение 12 часов. Высвобожденные клетками вирусные частицы осаждали центрифугированием и наносили на полиакриламидный гель.

В дополнение к вирусным белкам анализ препарата частиц, содержащих Gag ВИЧ-1, выявил присутствие значительного количества белка с относительной молекулярной массой 18 кДа (рис. 1, верхние панели,

линии 2 и 5). Остальные препараты данного белка не содержали (рис. 1, верхние панели, линии 1, 3, 4,6, 7 и 8). Этот белок не был продуктом расщепления вирусного полипротеина Gag, т.к. все трансфицированные провирусы содержали точечную мутацию в гене протеазы (PR), что приводило к полному блокированию протеолитического расщепления полипротеинов Gag.

Среди белков, кодируемых вирусным геномом, только белок матрикса ВИЧ-1, имеющий молекулярную массу 17 кДа, мог бы комнгрировать с данным белком на геле, однако свободного белка матрикса в препаратах не было. Таким образом, было сделано заключение о том, что наблюдаемый белок имеет клеточное происхождение и специфически ассоциирован с частицами, образованными

полипротеином Gag ВИЧ-1.

Как показано на нижних панелях рис. 1, белок с относительной массой 18 хДа специфически осаждается из препарата частиц, содержащих Gag ВИЧ-1, антисывороткой против ЦфА. Эти данные позволили сделать заключение о том, что рассматриваемый белок является ЦфА. При использовании преиммунной сыворотки, а также сыворотки против циклофилина В человека, никаких белков на геле обнаружено не было.

Рис.) Ассоциация ЦфА с внрионаии. Верхние панели: белковый соств» вирусных препаратов. Нижние панели: имыунопрецигштацня тех же препаратов сывороткой прошв ЦфА. Препараты получены в результате трансфекции клеток HeLa плазиндами: линии 2 и 5 - pHXB10/PR*; линия 3 • pHXBlO/SIV; лини* б -рНХВЮ/ROD; лини« 7 • pHXBIO/VIS; линия 8 - pHXB10/LV; линии I и 4 - pHXBlO/Gag-atop.__

Влияние циклоспорина А и его производных на ассоциацию циклофилияа А с частицами ВИЧ-1

Одним из свойств ЦфА является его способность связываться с циклоспорином А (цсА). Так как цсА-связывающий центр ЦфА совпадает с его каталитическим центром, внесение в экспериментальную систему цсА препятствует связыванию ЦфА с его белковыми субстратами. Кроме того, комплекс ЦфА-цсА является ингибирующим фактором в каскаде передачи сигнала Т-клеточной активации в ответ на чужеродный антиген. С учетом того, что ЦфА был обнаружен в составе частиц ВИЧ-1, было необходимо исследовать влияние цсА на включение ЦфА в состав вирионов. При обработке клеток, продуцирующих вирионы, цсА, а также его неиммуносупрессирующим аналогом SDZ NIM 811, количество ассоциированного с вирионами ЦфА оказывалось уменьшенным. Соединение SDZ NIM 811 ([Melle-4J cyclosporin) является структурным аналогом цсА. Данное соединение сохраняет способность к угнетению цис-транс изомеразной активности ЦфА за счет связывания с ним, однако комплекс этого соединения с ЦфА не оказывает влияния на фосфатазную активность фосфатазы 2В, являющейся важным звеном каскада передачи сигнала активации Т-клсгок, а следовательно не является им муносупрессирующим.

Влияние циклоспоринов ва репродукцию вирусов в культурах клеток

Эксперименты, описанные в предыдущих разделах, показали, что при обработке клеток циклоспоринами, количество ЦфА, ассоциированного с высвобождаемыми вирионами ВИЧ-1, уменьшается. Кроме того, было показано, что ЦфА не был обнаружен в препаратах частиц, сформированных полипротеинами Gag других ретровирусов. Исходя из этого, было необходимо произвести сравнительную оценку влияния циклоспоринов на цикл репродукции вирусов ВИЧ-1 и ВИО в культуре клеток.

Клетки линии СЕМX174 были трансфицированы плазмидами рНХВЮ и ДНК-продуктом лигирования плазмид pSIVSpSp-5' и pSIVSpE-3' методом DEAE-декстран. По мере обнаружения активности обратной транскриптазы в супернатантах культур (4-6 дней с момента трансфекции), вирусные препараты собирали и использовали для инфицирования свежих клеток. Присутствие и количество вирусов в препаратах оценивали путем определения ферментативной активности обратной транскриптазы и выражали в единицах имп/мин (импульсов в минуту). Промытые суспензии инфицированных клеток разделяли на три части, каждую из которых в дальнейшем культивировали в среде, содержащей различные концентрации цсА или соединения SDZ NIM 811. Супернатангы каждой из культур ежедневно испытывали на ферментативную активность обратной транскриптазы (рис. 2).

Увеличение активности фермента соответствовало увеличению количества вирионов, высвобождаемых клетками. На рис. 2 показаны типичные кривые репродукции вирусов в присутствии соединения SDZ NIM 811. Аналогичные кривые были получены и при обработке культур цсА.

Наблюдаемое ингибирующее влияние циклоспоринов на репродукцию ВИЧ-1, коррелирует со способностью циклоспоринов к

предотвращению включения ЦфА вирионами. Циклоспорины не влияют на репродукцию ВИО, который не включает ЦфА в состав вирионов. Этот результат позволил выдвинуть предположение о том, что ингибирование репродукции ВИЧ-1 в присутствии ЦфА-связывающих соединений обусловлен предотвращением включения ЦфА в состав вирионов, что, следовательно, указывает на его роль в жизненном цикле вируса.

Я.Т.Ш»«*» ВИЧ-1 ВТшма/ммЛи ВИО

Рис 2. Сравнение эффекта неимиуиосупрессирующего аналога цсА • SDZ NIM 811 на репликацию ВИЧ-1 и ВИО. Инфицированные клетки инкубировали в среде, не содержащей <ц), либо содержащей 0.5 мхМ (А), или 2.5 нхМ (л) соелинсния SDZ NIM 811. Показана зависимость активности обратной трансхриптазы (имп/мин/мл) в бесклсточной супернатаитс от времени (в ди»х) после инфицировании.

Участок полипротеина Gag, ответственный за связывание с цихлофнлиюмА

- Данные, полученные при трансфекции провирусных ДНК в культуру клеток человека, указывают на то, что ЦфА становится компонентом частиц ВИЧ-1 за счет его взаимодействия с полипротеином Gag. Было необходимо идентифицировать участок Gag, ответственный за связывание с ЦфА. Тот факт, что вирусы ВИЧ-1 и ВИО обладают высоким генетическим сходством, но различаются по способности к включению ЦфА, подсказал удобный инструмент для определения искомой детерминанты путем создания химерных вирусов. Создание химерных белков имеет значительные преимущества перед другими методами мутационного анализа по причине сохранения общих свойств изучаемого белка. На первом этапе была получена химерная конструкция ВИО, содержащего капсидный белок ВИЧ-1. При трансфекции полученной плазмиды было обнаружено, что вирусный препарат химеры содержал ЦфА. Для более точного картирования детерминанты взаимодействия капсидного белка с ЦфА, была получена конструкция ВИО с использованием консервативных для геномов ВИЧ-1 и ВИО сайтов рестрикции Psi I и Spe I, расположенных в участке, соответствующем средней части домена капсидного белка. Участок генома ВИЧ-1 между сайтами Pst I и Spe I кодирует 30 аминокислот, а соответствующий участок генома ВИО кодирует 28 аминокислот (рис. 3). Tax как последовательности С-конца участков идентичны по 8 аминокислотам, результирующие химеры были названы соответственно ВИО-22 и ВИЧ-20. Правильность

последовательностей полученных химер была подтверждена ссквенированием.

Анализ препаратов химерных вирионов на полиакриламидном геле показал, что ЦфА может быть обнаружен только в вирусных препаратах, средней частью капсидного белка которых являются 22 аминокислоты средней части капсидного белка ВИЧ-1. Кроме того, при обработке клеток, трансфицированных ДНК химеры ВИО-22, различными концентрациями циклоспоринов наблюдалось дозозависимое уменьшение содержания ЦфА в составе высвобожденных химерных вирионов. Наблюдаемая зависимость была сравнима с зависимостью для ВИЧ-1.

вич-1 EWDRVHEjVHAGPIAP'GQMREPRGSDIAGTTS

ви0 DWDLQHPQPA_PQQJGQLREPSGSDIAGTTS

Рнс. 3. Сопоставление аминокислотных последовательностей участков капсидных белков ВИЧ-1 и ВИО, кодируемых Pst 1 - Spe I фрагментами геномов вирусов.

Сопоставляя аминокислотные последовательности, кодируемые фрагментами Pst I и Spe / геномов ВИЧ-1 и ВИО (рис. 3), нетрудно заметить, что наиболее выраженное отличие между этими последовательностями находится в области, обозначенной прямоугольником. Следует заметить, что в соответствии с базой данных "GenBank", остатки пролинов внутри рассматриваемого участка последовательностей ВИЧ-1 являются консервативными среди различных изолятов. Так как ЦфА является пролиновой изомеразой, можно было предполагать, что данный участок мог оказаться детерминантой взаимодействия ЦфА с капсидным белком ВИЧ-1.

Для проверки выдвинутого предположения, методом направленного мутагенеза была получена химерная конструкция ВИО-8. Данная химера содержала последовательность аминокислот "VHAGPIAP" ВИЧ-1, взамен соответствующей последовательности "QPA-PQQ-" ВИО (рис. 3). Анализ вирусного препарата, полученного в результате трансфекции ДНК химеры ВИО-8 показал, что перенос мотива "VHAGPIAP" в соответствующий участок капсидного белка ВИО является достаточным для приобретения химерным вирусом способности включать ЦфА в состав частиц. Таким образом, данный эксперимент показал, что детерминанта связывания ЦфА с капсидным белком ВИЧ-1 ассоциирована с восьми-аминокислотным мотивом "VHAGPIAP", локализованным в средней части домена капсидного белка.

Помимо полученных данных по локализации искомой детерминанты, было обнаружено, что химера ВИО-8 оказалась способной к репродукции в культурах клеток. На основании того, что химера ВИО-8, подобно ВИЧ-1, оказалась способной к включению ЦфА в состав ее частиц, а циклоспорины не влияли на репродукцию ВИО, являющегося исходным для химеры ВИО-8, было выдвинуто предположение о том, что данная химера окажется также чувствительной к циклоспоринам в культурах клеток.

На рис. 4 показаны кривые репродукции химеры ВИО-8 в присутствии и в отсутствии соединения SDZ NIM 811 в культуре клеток СЕМх174. Химера ВИО-8, в отличие от исходного ВИО, но подобно ВИЧ-1

оказалась чувствительной к обработке циклоспориками при репродукции в культуре клеток. Было сделано заключение о том, что перенос ЦфА-связывающего участка капсидного белка ВИЧ-1 взамен соответствующего участка ВИО передает химерному вирусу свои фенотипические проявления в отношении включения ЦфА в состав вирионов, и его чувствительности к обработке циклоспориками в культуре клеток.

RT ммо/мяи/мл ВИ08

Дна после тфшхромт» Рис. 4. Эффект иеиммуиосупрессирующего аналога цсА • SDZ NIM 811 на репликацию ВИО-8. Инфицированные клетки инкубировали в среде, не содержащей f[i), либо содержащей 0,5 мкМ (X) соединения SDZ NIM 811.

Определение критических аминокислот в составе ЦфА-связывающен детерминанты капецлного белка

Сужение искомой последовательности до 8 аминокислот позволило использовать широко применяемый метод "сканирования алаником" с целью определения критических для рассматриваемого взаимодействия аминокислот. Метод заключается в последовательной замене индивидуальных аминокислот предполагаемого функционального участка белка на аланин и в последующем анализе мутированных белков на их функциональность. В данном случае замена аминокислот производилась методом направленного мутагенеза. Аланины мотива "VHAGPIAP" были заменены на глицин, а оставшиеся 6 аминокислот были заменены на аланин. Мутагенез производился в контексте родительского клона ВИЧ-1. Результат эксперимента по сравнению белкового состава препаратов мутантных вирионов показал, что только 3 остатка из восьми-аминокислотного мотива являются критическими для ассоциации ЦфА с вирусными частицами. Введенные мутации не влияли на количество высвобождаемых частиц, однако препараты вирусов, несущих замены аминокислот А220, G221 и Р222 (обозначение соответствует номеру аминокислот в молекуле полипротеина Gag) не содержали ЦфА в своем составе.

Каждый из 8 рассматриваемых мутантных вирусов был проанализирован на способность реплицироваться в культурах клеток. Мутантные вирусы, несущие замены по каждой из трех критических аминокислот, оказались не способными к репродукции. Полученный результат находится в согласии с предположением о существенной роли ЦфА в жизненном цикле ВИЧ-1. Так, при анализе репродукции ВИЧ-1 в культурах клеток при различных концентрациях циклоспоринов наблюдалась зависимость степени угнетения способности вируса к

наблюдалась зависимость степени угнетения способности вируса к самоамплификации от количества добавленных циклоспоринов. Так как обработка клеток, продуцирующих вирионы, циклоспоринами приводит к высвобождению частиц с уменьшенным количеством ЦфА, вирусы, мутантные по критическим аминокислотам, можно считать полностью лишенными ЦфА и именно поэтому не способными к репродукции. Таким образом, напрашивающимся выводом из эксперимента является наличие корреляции репродуктивного дефекта с мутационным блокированием сайта взаимодействия капсидного белка ВИЧ-l с ЦфА.

Эти эксперименты позволили идентифицировать участок капсидного белка, являющийся детерминантой, ответственной за связывание с ЦфА. Данный участок находится в центральной части капсидного белка, состоит из 8 аминокислот и соответствует последовательности "VHAGPIAP". Из аминокислот этой последовательности, критическими для включения ЦфА в состав вирионов ВИЧ-1, а также для репродукции вируса в культурах клеток являются последовательно расположенные аминокислоты А220, G221 и Р222. Сделанные выводы согласуются с недавно опубликованными данными, полученными в результате анализа кристаллической структуры комплекса ЦфА с амино-концевой частью капсидного белка ВИЧ-1 [Gamble T.R., Vajdos F.F., Yoo S., Worthylake D.K., Houseweart M., Sundquist W.I. and Hill C.P. Crystal structure of human cyclophilin A bound to the ammo-terminal domain of HIV-1 Capsid. Cell 87:1285-1294 (1996)].

Рис. 5. Стерео изображение структуры комплекса ЦфА и капсидного белка ВИЧ-1. Обозначены аминокислоты взаимодействующие с гидрофобным карманом ЦфА. Нумераци» аминокислот соответствует аминокислотам капсидного белка (Р222 молекулы Gag соответствует Р90 молекулы капсидного белка). Изображение воспроизведено с разрешении д-ра Кристофера Хилла.

На рис. 5, показано стерео изображение структуры данного комплекса. Видно, что единственным участком молекулы капсидного белка,

находящимся в непосредственном контакте с молекулой ЦфА, является средняя часть петли, соединяющей четвертый и пятый а-спиральные участки капсидного белка. Данный участок, аналогично соответствующему участку циклоспоринов, погружен в гидрофобный карман ЦфА.

Анализ химерных вирусов ВИО с различными комбинациями аминокислотных остатков в области детерминанты, связывающей ЦфА

Перенос 8 аминокислот капсидного белка ВИЧ-1 в соответствующий участок ВИО придал химерному вирусу принципиально новые свойства, а именно способность к включению ЦфА в состав вирионов и чувствительность к циклоспоринам при репродукции в культурах клеток. Тот факт, что из восьми-аминокислотного мотива только три аминокислоты оказались критическими для включения ЦфА предполагает возможность того, что перенос меньшего количества остатков из мотива "УНАОР1АР" в капсид ВИО придаст способность химерному вирусу включать ЦфА.

Принимая конструкцию ВИО-8 за исходную, на первом этапе были получены химеры ВИО-С4 и ВИО-Ж. Конструкция ВИО-С4 сохраняла половину детерминанты "УНАОРТАР" в ее карбоксильной части, тогда как химера ВИО-Й4 сохраняла половину амино-части мотива (рис. 6). Так как химера ВИО-Ь'4 содержала все три критические для связывания с ЦфА аминокислоты, препарат, полученный в результате трансфекции ДНК данной химеры, должен был содержать ЦфА, чего, соответственно, не должно быть в случае химеры ВИО-С4. В результате трансфекции ДНК химерных провирусов ВИО-С4 и ВИО-Ж было обнаружено, что вирусные препараты обеих химер не содержали ЦфА. Данный результат выглядел весьма неожиданным. Этот неожиданный результат был объяснен с помощью дополнительных экспериментов.

Как было упомянуто ранее, количество аминокислот в составе рассматриваемого участка ВИО изначально на две аминокислоты меньше, чем в последовательности ВИЧ-1. Химера ВИО-8, способная к включению ЦфА, имела 8 аминокислот, помещенных взамен 6. Химеры ВИО-С4 и ВИО-К4 имели по 7 аминокислот в рассматриваемом участке. Исходя из этого, было выдвинуто предположение о том, что для ассоциации ЦфА с частицами, кроме состава аминокислот существует также требование и к их количеству. Для проверки этого предположения был получен дополнительный набор химерных вирусов, результаты анализа которых показаны на рис. 6.

Аналогом химеры ВИО-Ж является химера ВИО-Ша, которая, как и предполагалось, приобрела способность к включению ЦфА по мере восстановления количества аминокислот участка до 8. Способность к включению ЦфА при восстановлении числа аминокислот мотива до восьми была характерна и для другой пары химер.

Так, химера ВИО-Ы6, содержащая 7 аминокислот в рассматриваемом участке, в том числе все три критические (рис. б), была не способна к включению ЦфА. Однако, при восстановлении общего количества аминокислот до восьми (химера ВИО-Кба), способность частиц к включению ЦфА восстанавливалась до сходного с ВИЧ-1 уровня. Эффект восстановления способности к включению ЦфА частицами был также продемонстрирован для химер ВИО-1 и ВИО-1а (рис. б), однако в данном случае способность химеры ВИО-1а к включению ЦфА восстанавливалась не полностью.

Анализ химер, сохраняющих различное количество остатков мотива "VHAGPIAP" в их С-концевой части, показывает аналогичную зависимость способности вирионов к включению ЦфА от количества остатков в мотиве. Однако, в данном случае, в составе рассматриваемых химер, несущих не 8 а 7 аминокислот (ВИО-С4 и ВИО-С5), при этом отсутствует одна из критических, что, по-видимому, является дополнительной причиной неспособности химер ВИО-С4 и ВИО-С5 к включению ЦфА. Так, введение дополнительной аминокислоты аланина в позиции 3 (химера ВИО-С5а) восстанавливает критическую последовательность "AGP", а также общее количество аминокислот мотива, что, в свою очередь, придает химере способность включать ЦфА.

Испытуемая химара

' ЦфА

em-i

j ВИО

i ВИО Л

I 6HO-N4 | еио-ж«

i

j ВЖМУ ; ВИ0-С7» ; ВИ0ЧЗ*

, BW-CS

виомбв i ВИОНВ

I

I ВИО-1 ' ВИ0.1*

12345678 j

PVHAGPIAPG ;

fjQPA_PQQjG I

* I

PVHAGPIAPG !

pvhagpqqJs i

PjVHAGPQQAG j

PQPA_piapbi

pqhagpiapp

pqpagpiapg

PQP_gpiapg

pvhagpiqqg

pvhagpiq__g

pqpagpqq^b

pqpagpaqqg

Чукшшльностъ кцикпоелоримм

+ /-

s

R

S R D R S S R 0 R

R *

Рис. 6. Результаты анализа способности химер ВИО к включению ЦфА и их репродукции в присутствии цнклоспоринов. Обозначения: S • чувствительный, R -устойчивый, D - зависимый, * - химера не испытывалась.

+

+

+

На основании данных, полученных при анализе химер ВИО с различными комбинациями аминокислот в области, ответственной за связывание с ЦфА, можно заключить, что для ассоциации ЦфА с вирионами соответствующий участок их капсидного белка должен содержать последовательно расположенные аминокислотные остатки "AGP", при этом общее количество аминокислот участка должно составлять не менее восьми.

Рассмотренные химерные вирусы были проанализированы на способность к репродукции в культуре клеток CEMxl 74, а также влияние

циклоспоринов на репродукцию (рис. 6). Способными к репродукции оказались химеры, содержащие 7 аминокислот в участке, ответственном за связывание с ЦфА (химеры BHO-N4, BHO-N6, ВИО-С4, ВИО-С5), причем как и предсказывалось, данные химеры оказались способными к репродукции в присутствии соединения SDZ NIM 811 в равной мере как и при отсутствии этого соединения. Среди химер, включающих ЦфА и имеющих 8 аминокислот в составе рассматриваемого участка, способными к репродукции оказались только химеры, сохраняющие карбоксильную часть мотива "VHAGPIAP" (химеры ВИО-С7а и ВИО-С5а). Репродукция данных химер в присутствии соединения SDZ NIM 811 оказалась подавленной, как и в экспериментах с ВИЧ-1 или с химерой ВИО-8. Химеры, сохраняющие последовательность мотива в его амино-части (включающие ЦфА и содержащие 8 аминокислот в рассматриваемом участке) оказались не способными к репродукции.

Тот факт, что ни одна из химер, сохраняющих амино-часть мотива "VHAGPIAP" и способных к включению ЦфА (BHO-N4a и BHO-N6a) оказалась неспособной к репродукции, был весьма неожиданным. При сравнении последовательности "VHAGPQQA" химеры BMO-N4a, неспособной репродуцироваться, с последовательностью "VHAGPQQ-" химеры BHO-N4, способной к репродукции, можно было заметить, что данные последовательности практически идентичны, за исключением того, что химера BHO-N4a имеет дополнительно в своем составе аланин. Возможность того, что введение дополнительного аланина в состав мотива влечет за собой репродуктивный дефект общего характера, маловероятна. Так, на примере химеры ВИО-8 было показано, что ни увеличение числа аминокислот участка до 8, ни приобретение данной химерой способности включать ЦфА, не повлекли за собой репродуктивного дефекта. Поэтому было выдвинуто предположение о том, что, если включение ЦфА химерой BHO-N4a является причиной ее неспособности к репродукции, то именно обработка инфицированных клеток циклоспоринами позволила бы данной химере репродуцироваться. Данное предположение основывалось на том, что при обработке клеток-продуцентов циклоспоринами, образованные частицы химеры BHO-N4a не будут содержать ЦфА, что фенотипически приравнивало бы данную химеру к химере BHO-N4, которая в норме не содержит ЦфА в частицах, но способна реплицироваться. Аналогичные рассуждения применимы и к другой паре химер: BHO-N6 (содержит мотив "VHAGPIQ-", не включает ЦфА и способна к репродукции) и ВИО-Nöa (содержит мотив "VHAGPIQQ", включает ЦфА и не способна к репродукции). Выдвинутая гипотеза была проверена экспериментально. Было обнаружено, что химеры BHO-N4a и ВИО-Nöa оказались способными к репродукции в присутствии цсА. Таким образом, можно заключить, что в отличие от ВИЧ-1 а также химер ВИО-8, ВИО-С7а и ВИО-С5а, являющихся циклоспорин-чувствительными, химеры BHO-N4a и ВИО-Nöa являются циклоспорин-зависимыми. На основании результатов данного эксперимента можно также заключить, что для полной функциональной значимости ЦфА, включенного в состав вирусных частиц, помимо описанных в предыдущих разделах требований к самому процессу включения белка, также существует требование и к аминокислотному составу карбоксильной части мотива "VHAGPIAP".

Роль ЦфА в жизненном цикле ВИЧ-1

Для изучения значимости ЦфА в жизненном цикле ВИЧ-1 был произведен ряд экспериментов по сравнению общих свойств вирусных частиц с нормальным уровнем ЦфА и уровнем, пониженным в результате обработки вирус-продуцирующих клеток циклоспоринами. На данном этапе следует рассмотреть правомерность предположения о том, что обработка клеток продуцирующих вирионы цсА и его производными кроме связывания с ЦфА, и поэтому невозможности включения последнего в состав высвобождаемых вирионов, не имеет дополнительных эффектов. Так, можно предположить, что либо сами циклоспорины, либо их комплексы с ЦфА могут оказывать ингибирующее влияние на жизненный цикл ВИЧ-1, наблюдаемое при репродукции ВИЧ-1 в культурах клеток. Такое предположение, хотя и возможно, все же маловероятно по следующим причинам: во-первых, обработка клеток циклоспоринами не влияет на кинетику репродукции ВИО, родственного ВИЧ-1; во-вторых, ВИО становится чувствительным к циклоспоринам при условии приобретения всего 8 аминокислот последовательности ВИЧ-1. Другими словами, если бы чувствительность ВИЧ-1 к циклоспоринам зависела от других факторов, то приобретение ВИО только ЦфА связывающей детерминанты оказалось бы. недостаточным для приобретения чувствительности.

Сравнительный анализ частиц ВИЧ-1, полученных в присутствии или в отсутствии циклоспорина А или соединения 802г№М-811 не показал существенных различий. В качестве критериев сравнения были использованы: данные электронной микроскопии, данные анализа белков вирусных препаратов в полиакриламидном геле, способность вирусных частиц адсорбироваться на поверхности СП4-положительных клеток, а также отношение количества вирусной обратной транскриптазы в препаратах к ее ферментативной активности.

Уровень экспрессии вирусных белков после инфицирования частицами ВИЧ-1 дикого типа и частицами с пониженным содержанием ЦфА в результате обработки клеток-продуцентов циклоспоринами определялся измерением ферментативной активности хлорамфеникол-ацетилтрансферазы (ХАТ), кодируемого модифицированным ВИЧ-1. Ген белка-репортера ХАТ, помещенный в состав вирусного генома может быть экспрессирован в клетках-мишенях только по мере эффективного прохождения вирусом основных внутриклеточных стадий жизненного цикла, начиная со связывания вирионов с поверхностным рецептором и заканчивая экспрессией ранних генов вируса. Таким образом, если испытуемый вирусный препарат является дефектным на одной из исследуемых стадий, уровень экспрессии белка-репортера, а соответственно и других вирусных белков, оказывается уменьшенным (подробнее см. раздел "Материалы и методы").

В качестве клеток-мишеней использовали либо лимфоциты линии Лгка1, либо мононуклеарные клетки периферической крови человека, стимулированные фитогемагглютинином. Клетки-мишени инфицировали одинаковым количеством вирусов и выдерживали в инкубаторе а течение 72 часов. Инкубацию инфицированных производили в среде, не содержащей циклоспорины, как для испытуемых, так и для контрольных образцов. Это позволило разграничить определение инфекционной способности

внесенных вирионов от возможного воздействия соединений на клетки-мишени во время процесса инфекции.

Лизаты клеток-мишеней анализировали на активность ХАТ. Из приведенных на рис. 7 данных видно, что уровень экспрессии вирусных белков в клетках-мишенях зависит от содержания ЦфА в вирионах испытуемых препаратов. Так, с увеличением концентрации циклоспоринов при обработке клеток, продуцирующих вирионы, а следовательно, с уменьшением ассоциированного с вирионами ЦфА, уровень экспрессии белка-репортера уменьшался.

SDZ NIM 811 (мкМ) О 2.S 10

I-к--II-1

% ацетилирования 1.7 7.4 30.1 1.2 1.4 11.7 0.4 1.4 4.7

t ^ W ^ ^ VfJl* ® ф ®

Количество

добавлены* единиц BT 1 5 25 1 5 25 1 5 25 (тысяч с.р.т.)

Рис. 7. Уровень экспрессии белков ВИЧ-1 в клетках Jurkal в результате одного раунда репродукции в процессе инфицирования вирионами ВИЧ-1, полученными в присутствии указанных количеств соединения SDZ NIM 811. Показана ферментативная активность белка-репортера ХАТ, выраженная в проценте ацетилирования радиоактивного хлорамфеникола.

На основании результатов данного эксперимента можно заключить, что ингибирование циклоспоринами репродукции ВИЧ-1, наблюдаемое в культурах клеток, является следствием дозозависимого понижения иифекционности вновь высвобождаемых вирусных частиц инфицированной культуры.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящей диссертационной работе приведено доказательство использования вирусом иммунодефицита человека типа 1 клеточного белка ЦфА в репродукционном цикле. Наиболее интересным фактом, является возможность угнетения репродукционной способности ВИЧ-1 путем воздействия на клеточный белок, что является принципиально новым в исследованиях ВИЧ-1. Это позволяет рассмотривать производные циклоспорина А в качестве антивирусных соединений. В настоящее время уже имеются косвенные данные о противовирусном влиянии циклоспорина А на угнетение болезни СПИД. Так, пациенты, находящиеся в латентной стадии СПИД и перенесшие операцию по трансплантации органа, подвергались продолжительной обработке циклоспорином А с целью подавления естественной реакции отторжения чужеродного органа. Было зафиксировано, что во время обработки ни один из пациентов не прогрессировал к заключительным стадиям СПИД. Существующее объяснение данному явлению на настоящий момент заключается в том, что

по мере блокирования активации Т-клеток организма циклоспорином А, уменьшается число потенциальных мишеней для вновь образуемых вирусных частиц. Однако данные, описанные в настоящей работе, указывают на возможность другой или по крайней мере дополнительной, принципиально отличной причины влияния циклоспорина А на течение болезни, состоящей в угнетении способности ВИЧ-1 к репродукции вследствие связывания необходимого вирусу ЦфА.

Выбор производных циклоспорина А для использования в качестве антивирусного агента в клинике, безусловно будет зависеть от возможного отрицательного влияния на общее состояние организма ках в плане токсичности, так и в плане явно невыгодной иммуносупрессии. Так как при рассмотрении любого соединения в качестве антивирусного препарата, в конечном итоге подразумевается активное действие иммунной системы организма, выбор иммуносупрессирующего производного циклоспорина представляется нелогичным.

Как показано в настоящей работе, неиммуносупрессирующие соединения, блокирующие изомеразную активность циклофилинов, обладают не меньшей антивирусной активностью и поэтому могут быть подходящими кандидатами. Следует заметить, что концентрация циклоспоринов, необходимая для полного блокирования ВИЧ-1, выше концентрации циклоспорина А, не вызывающей токсический эффект в организме, однако официальных данных по токсичности неиммуносулрессирующих аналогов циклоспорина А на настоящий момент не имеется. Имеются данные о некоторых неиммуносупрессирующих производных циклоспорина А, обладающих антивирусной активностью при гораздо меньших концентрациях. В лаборатории автора настоящей работы имеются также экспериментальные данные, показывающие значительное усиление угнетающего действия циклоспоринов на репродукцию ВИЧ-1 в культурах клеток при уменьшении начальной дозы вируса, используемой для инициации инфекции. Такое условие протекания инфекции является более близким к происходящему в природе, так как в организме, находящемся в латентной стадии СПИДа, отношение инфицированных клеток к неинфицированным является довольно низким. Имеющиеся на сегодня данные о блокирующем ВИЧ-1 действии циклоспоринов говорят о реальности использования данных соединений в качестве противовирусных.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально выявлено участие клеточного цитоплазматического белка циклофилина А в жизненном цикле ВИЧ-1.

2. На основании сравнительного анализа способности ряда ретровирусов (ВИЧ-1, ВИЧ-2, ВИО, вируса Висны и вируса лейкоза мышей Молони) к включению ЦфА в состав их вирионов обнаружено, что данное свойство является специфическим только для ВИЧ-1.

3. Показана возможность подавления способности частиц ВИЧ-1 к связыванию с ЦфА путем обработки вирус-продуцирующих клеток циклоспорином А и его неиммуносупрессирующим структурным аналогом SDZ NIM 811, при этом обнаружено, что инфекционность частиц с уменьшением концентрации ЦфА понижается.

4. В результате анализа репродукции ВИЧ-1 в культурах клеток в присутствии циклоспоринов в сравнении с ретровирусами, не

включающими ЦфА, обнаружено, что ингибирующее действие циклоспоринов коррелирует со способностью вирусов к включению ЦфА.

5. Выявлено, что способность частиц ВИЧ-1 к связыванию с ЦфА определяется доменом капсидного белка полипротеина Gag, а именно участком с последовательностью "VHAGPIAP".

6. Проведен анализ роли отдельных аминокислот в этом мотиве путем последовательной замены его аминокислот на аланин и оценки способности мутантных вирусов к репродукции в культуре клеток, что позволило идентифицировать аминокислоты "AGP" мотива как критические в плане взаимодействия с ЦфА.

7. С учетом различия способности вирионов ВИЧ-1 и ВИО к включению ЦфА, а также на основе высокого генетического сродства между ними был создан ряд химерных вирусов, способных к репродукции в культуре клеток. Анализ полученных химерных вирусов показал, что кроме наличия в мотиве критических аминокислот, дополнительным условием взаимодействия с ЦфА является также число аминокислот в мотиве.

8. Продемонстрировано, что перенос минимального циклофилин-связывающего мотива капсидного белка ВИЧ-1 взамен соответствующего участка ВИО является необходимым и достаточным условием для переноса химерному вирусу способности к включению ЦфА, а также чувствительности к циклоспоринам. Кроме того, среди созданных химерных вирусов были выявлены вирусы не только чувствительные к циклоспоринам, но и являющиеся циклоспорин-зависимыми. Анализ последовательности данных химер предполагает дополнительную функциональную значимость карбоксильной части детерминанты "VHAGPIAP".

Материалы диссертации отражены в следующих печатных работах:

1. Thali М., Bukovsky A., Kondo Е., Rosenwirth В., Walsh С. Т., Sodroski J. & GottlingerH.G. Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions. Nature 372: 363-5 (1994)

2. Dorfman Т., A. Bukovsky, A. Ohagen, S. Hoglund & H. G. Gottlinger Functional domains of the capsid protein of human immunodeficiency virus type I. J Virol 68:8180-8187 (1994)

3. Mammano F., E. Kondo, J. Sodroski, A. Bukovsky & H. G. Gottlinger. Rescue of human immunodeficiency virus type 1 matrix protein mutants by envelope glycoproteins with short cytoplasmic domains. J Virol 69: 3824-3830 (1995)

4. Bukovsky A. & Cottlinger H.G. Lack of Integrase can markedly affect human immunodeficiency virus type 1 particles formation. J Virol 70:6820-6825, (1996)

5. Wilk Т., Pfeiffer Т., Bukovsky A., Moldenhauer G. & V. Bosch. Glycoprotein incorporation and HIV-1 infectivity despite exchange of the gpl60 membrane-spanning domain. Virology 218:269-274 (1996)

6. Bukovsky A.A., Dorfman Т., Weimann A., and Gottlinger H. Nef association with human immunodeficiency virus type 1 virions and cleavage by the viral protease. J. Virol. 71:1013-18 (1997)

7. Levin R., Mhashilkar A., Dorfman Т., Bukovsky A., Zani C., Bagley J., Hinkula J., Niedrig M., Albert J., Wahren В., Gottlinger H.G., Marasco W.A. Inhibition of early and late events of the replication cycle by cytoplasmic Fab

intrabodies against the matrix protein, pl7. Molecular Medicine; 3/2: 94-108 (1997)

8. Bukovsky A.A., Weimann A., Acola M. and Gottlinger H.G. Transfer of 8 aminoarids from capsid protein of HIV-1 into SIV is sufficient for transfer of both, cyclophilin A incorporation and cyclosporin A sensitivity. (Submitted).

rasa*J7TI

(3 ¿»Wdso' B*

^DSSsraGacQsaE9