Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фотографическая микрофлуориметрия ДНК в индивидуальных хромосомах человека

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Фотографическая микрофлуориметрия ДНК в индивидуальных хромосомах человека"

^ й"0 0;;

' ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ АКАДЕМИИ НАУК СССР

На правах рукописи

КАЛИМАГАМБЕТОВ Айткали Мажитович

ФОТОГРАФИЧЕСКАЯ МНКРОФЛУОРИМЕТРИЯ ДНК В ИНДИВИДУАЛЬНЫХ ХРОМОСОМАХ ЧЕЛОВЕКА

03.00.25 — КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЛЕНИНГРАД 1991

Работа выполнена в группе научно-методических основ цитодиагностики Института Цитологии АН СССР и лаборатории цитологии и патоморфологни Республиканского научно-исследовательского центра охраны здоровья матери и ребенка МЗ КазССР (Алма-Ата).

Научный руководитель-— кандидат биологических наук Б. Н. КУДРЯВЦЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук А. В. ЗЕЛЕНИН кандидат биологических наук Р. Ф. ФЕДОРЦЕВА

Ведущее учреждение — Ботанический институт им. В. Л. КОМАРОВА АН СССР

Защита состоится « . » _ 1991 г.

/2>

в « /г» часов па заседании специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии АН СССР по адресу: 194064, Ленинград. Тихорецкий пр., 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии АН СССР.

Автореферат разослан « . . » ЦУ^г<Л-е>^ 1-у _ 1991 г

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Л. Н. ПИСАРЕВА

v< ОБЩАЯ ХАРАКГЕР1КГПКА РАБОТЫ

T-v.*" Йктуальность проблем;, В настояцзе время известно, что ссг.^одер&ание ДШ в ядрах' нсриалыаж клеток соматических тканой довольно постоянно.- Иадешения количества генетического материала в них обусломснч, vjiaemм образом, предмлтотпчзс;<;;м синтсэсм ДНК или полиплоидией. Сведения о содержания ДШС я его вариабельное?!! в отдельна хромосомах крайне скудны, £!©зд! тс?! уста:!© гденно границ «оркалшой вариабельности содержания /i.U.'í на урогне индиведуалмвдс хромосом, пркпин я механизмов этой изменчивости имело бы' существенное значение для теории и практики.

Для исследования суммарного содеруаиия ДНК в хрокосшах сейчас применяю?с;! различные методы проточной цитсглетрин, абсорбционной и флуоресцентной гликрофотскетрпи на предает;«.« стеклах, каддай из которых иисет свои преимущества и недостатки. йетоды проточяоз цптокетрки поэволпэт с високой точное >: скоростью аналиа.чроаагь пзоллровакнью хромосомы (Carroño с;

al. , I'J76; Young st al., 1931; Langlois-ей al „, 1982; Harris ot al.Д9й6). Основной недостаток этих ыотодов связан с тем, что они требуют прнготовленил большие количеств изодкрос&ккых кетафазных хромосом, что возможно далеко не ссегда, Использование проточной цпгометрля кроме того затруднит получение информации об индивидуальности каждой клетки. Б подаьлкацем болышнетве метода,' основанккв на из?лерекии . свгтояропускения, используют для выявлен*"« ДНК стандартную реакцию й-элъгена ( Ven der Plosg efe al IS74; Groen, Van dor Ploeg, 1979) или окрашивание хромосом галлоцианин-хрсмсвики .чвасцами после'предварительной обработка препаратов FHK-азсЯ ( Kerdelsofcn st al., 1973; Mayall ct al,, 1964). Методы абсорбционной микрофотометрии, несмотря на целы?*, pj-д достоинств, обладают существенным недостатком, который связан, главнкч. образом, с их сравнительно низкой чувствительностью и производительностью. В этеи отношении привлекательны микрофяуоримегшческие. методы 'чувствительность которых, по некоторш оценкам, на три порядка прешла-

се чувствительность абсорбционных яетодкк ( Са-ааЬегп et а1. , 1957) и которые не требукт сложной измерительной, аппаратуры. Однако, предложенный ранее фотоэлектрический микрофдуоримет-ричаский метод определения содержания ДНК в индивидуальных хромосомах человека (Сухих, 1965) имел существенный недостаток, связанный с неодинаковом и значительным' зыцьбтаниеи хромосом лсд действием возбуждающего свата в процессе их последовательного измерения в кетафазной. пластинке. Использование для регистрации люминесценция хромосом высокочуистштельних фотоматериалов, обладающих к тому же хорошим разрешением, представляется в данном случае более перспективный, поскольку при равномерном воздействии воабувдшощего света за относительно короткое время экспозиции ошибки измерений, обусловленные Быцвстаиием объектов, значительно снижаются.

Применение фотографического способа регистрации люминесценции хромосом,'окрашенных на ДНК флуоресцентными красителями, в сочетании с известными методиками идентификации хромосом позволило бы получать надежную информацию о содержании и распределении веществ в индивидуальных хромосомах даже при наличии в препаратах, относительно небольшого количества метпфаз-кьгх пластинок.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования состояла в разработке фотографического микрофлуориметрическо-го метода определения содержания ДНК в индивитальных хромосомах челочка, помещенных на предметном стекле. Конкретные задачи работы состояли в следующем:

1. Разработать фотографический микрофлуоримегрическиП ыэтод определения содержания в индивидуальных хромосомах человека, ооноданный на предварительном дифференциальном окрааивании хромосом, их идентификации и последующем цитохимическом выявлении ДО в них' с помощью реактива типа Шифра, который позволил бы проводить исследования митотических хро-ьгасом при любой стабильности генома.

2. Сравнить точность разработанного фотографического викрофлуориметрического метода с другими известными методами определения содержания ДНК в индивидуальных хромосомах

человека.

3. Оценить с пемощьв разработанного катода абсолютное содержание Д1£К в индивидуальных хромосомах человека,.

4. Испытать разработанный метод в ряде практически исследований:

- определить относительное содержание ДНК в индивидуальных хромосомах: при некоторых наследственных заболеваниях человека (синдрош Дауна, Тернера, Клайнфелътера, "кошачьего" крина);

- определить относительное содержание ДНК в индквидуаль« ных хромосомах человека з случаях, когда наследственная природа заболевания предполагается {привычное незыкашизание берагекности);

• - .определил, абсолютное содеряаяие- ДНХ 0 шдивэдуольякх хромосомах постоянных клеточных линий человека, культизлруе-юа 1п -«.Ъгс в которых икеются раглпмпыэ структурииз нарссгройки и б случаях» когда наблюдается, портальная'корфо-jiov.iT. кариотола с цельо внявдеяия возшкяого "скрытого" асмснсннн генома.

Положения, екноскиыс на защиту:

2. Разработан высскочувсгвятельшй фо-?ограф;гаескк£ гликрофвуорилетржюсхкй метод, позволяющий определять содержание ДНК б индивидуальных хромосомах человека.

2. Степень епирализации хрокосец и различное по продол-кятельаости действие возбуждающего света на окрженнке хромосомы не изменяют соотношения в содержании ,ЯНЬС кещду индивидуальными хрокоссмаки в метафазной -пластинке»

3. Содержание ДЖ е'хромосоме 21 и Х- и У-хромосомах при синдромах Дауна, Тернера, Ягбйкфзльтера не отлт&зтвя от их содержания в аналогичных хромосомах нормальных индивидов,

4. Постоянные ликфэбластоидше к лейкезные клеточные линии человека даже с нормальной морфологией каркотипа ногу? иметь избыточное количество ДНК в индтядуеяьаих хромосомах, по сравнению с соо5естствузсяцш-ш хромосомами нормального генома человека.

- б -

5. Определено абсолютное содержание ДНК ( в фемтограммах) во всех 24 хромосомах генома человека.

Научная новизна работа. Впервые разработан высокочувствительный фотографический'ыикрофлуорадетрический метод определения содержания ДОС в индивидуальных хромосомах человека, позволяющей проводить исследования по определению содержания ДНК в митотических хромосомах любых видов млекопитающих при любой стабильности генома. Метод основан на предварительном окрашивании препаратов хромосом по <5-методу, для идентификации хромосом и последующем выявлении ДНК с использованием флуоресцентного варианта реакции Фельгена.

Показано, что состнощение в содержании ДНК между индивидуальными хромосомами метафазной пластинки с разной степенью их спирализации постоянно. Показано также, что интенсивность флуоресценции хромосом в метафаэных пластинках, окрашенных реактивом типа Шиффа аурамином -50^ равномерно снижается под действием возбуждающего света и таким образом не оказывает существенного влияния на соотношение в содержании ДНК между индивидуальными хромосомам^, которое остается постоянным.

Впервые исследовано содержание ДНК в хромосомах при наследственных заболеваниях человека, обусловленных анеуплоидией и структурной перестройкой. Показано, что содержание ДНК в хромосоме 21 при синдроме Дауна, Х-хроыосоме при синдроме Тернер, Х- и У-хромосомах при синдроме Кяайнфельтера не отличается от нормы. Показано, что содержание ДНК у кендан при привычном невшащиаании беременности в хромосомах I, 9, 16 и X не отличается от его содержания в соответствующих хромосомах женщич с физиологическим течением беременности.

Впервые определено абсолютное содержание ДНК { в фемто-грамыах) в индивидуальных хромосомах нормального генома человека, а также хромосомах трех клеточных линий человека: йки-1788, ¿Гигквь, сснр-БВ. Установлено, что вариабельность в содержании ДК в этих клеточных линиях связана не только с наличием маркерных хромосом, но и с избыточным количеством ДНК, присутствующим почти во всех хромосомах.

Научно-практическое значение работа. Разработанный метод может быть использован в области генетики человека, а частности медицинской генетике, генетики животных и растений для оценки нестабильности генома этих организмов. Особуп ценность представляет использование этого метода в области биотехнологии клеток для контроля за состоянием генома постоянных опухолевых и лейкоэных клеточных линий, использующихся для получений моноклональких антител.

Апробаций.работы. Основные результаты диссертации были представлены:на У1 Всесоюзном совещании "Структура и функция хромосом" (Пущино, 1988); научно-практической конференции НИИ акушерства и гинекология (Алма-Ата, 1990); Втором Всесоюзном съезде медицинских генетиков СССР (Алма-Ата, 1990). В целом диссертационная.работа апробирована на заседании Ученого совета Республиканского научно-исследовательского центра охраны здоровья матери и ребенка (Алма-Ата, 1991) и совместном научной семинаре лаборатории морфологии клетки, лаборатории биохимической цитологии и цитохимии и группы научно-методических основ цитодиагностики Института цитологии АН СССР (Ленинград, 1991). ' •

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы. Объем работы. Диссертация изложена на /¿Кограницах машинописного текста и состоит из традиционных разделов: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и список литературы, содержащий ¿-УА-публикаций отечественных и зарубежных авторов. Диссертация .иллюстрирована 10 рисунками и' 9 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДА ИССЩОВШЯ •

■ Б работе нспользоьаяд ыетафазше хромосомы нормальных индивидов, больных с синдромами Дауна, Тернера, Клайнфельто-ра и "кояачьего" крика, женщин с'физиологическим течением беременности и при привычном кевынаиавании беременности, а также хромосомы.постоянных лшфэбластоидных С ЕРМ1- 1783, ССНУ- БВ) и дейксзньх ( .ГигкеЪ ) линий человека, которнз

L;aли получены из банка клеточных культур Института цитологии АН СССР» Всего было исследовано 3800 метафазнкх хромосом.

Препараты метаЬазнык хромосом человека получали из первичной культуры лимфоцитов периферической крови. Цельную кровь в объеме 0,2-0,3 мл культивировали в среде RPMI с добавлением 15$ ияактквиробанной бычьей сыворотки и 4% рабочего раствора §ГА Difco V при 37°С а течение 72 ч, За 3 часа до окончания сро.та культивирования вводили колхицин из расчета 0,5 мкг на 1 мл питательной среды. После удаления надосадочной кидкости к осадку добавляли 5 ыл KCI (из расчета 5,55 г на I я дистиллированной воды) и термостатировали при 3?°С в течение 10 мин. Время гипотонии культур постоянных клеточных линий составляло £0-30 мин. После центрифугирования С? мин при 1000 об/мин) надосадочную квдкость удаляли, осадок оетороето и тшательно разбивали и фиксировали в трех сменах метанола и ледяной уксусной кислоты { в соотношении 3:1). Препараты метафазкых пластинок приготовляли путем нанесения взвеси клеток на влажные охлажденные предметные стекла. Аналогичная обработка применялась также для получения мета-фазных хромосом ко клеток» культивируекшс in vitro.

Ияенткфикаци» хсоиосом б метафазннх пластинках производила с помощью Q ~ окраски по методике, предлоненной Касперсоном (Csspersson et al. ,1570}. Сухие препараты споласкивали в дистиллированной воде» окрашивали в 0,005%-нок растворе акркхян-иприта шн »три 8°CS вновь споласкивали в дистиллированной воде, отмы.»ал:1 в буфере Шк-Илвейна (рН = 6,8-7,0) в течение 2-8 мин и заключали в смесь дистиллированной воды и глицерина (в соотнсшенл;? 1:1).

После каалотигшрования хромосомные препараты обесцвечивали в скесн метанол-ледяная уксусная кислота -вода (1:1:1) и высушивали на воздухе. Для выявления ДНК s хромосомах чело-зека применяла окрашивание реактивом типа Шиффа аурамином-БО^

С флуоресцентный вариант реакции Фельгена; Кудрявцев, /озанов, 1974). Продолжительность гидролиза препаратов в о и НС1 при температуре 20-£2сС составляла 8 мин. Окрашивание препаратов аураминоы-в02 ( 200 иг аурамина 00 в 100 мл дистил-

лированной вода о добавлением 0,2 мл тионил хлорида) производилось в холодильнике при температуре 2-4°С в течение 90 мин. После проводки через спирты (70°, 96°, 100°) препараты высушивали на воздухе. Для предотвращения выцветания го: хранили п темноте. Непосредственно перед микроскопированием препараты заключали в вазелиновое масло и покрывали покровными стеклами.

МетагЬазные пластинки, окрашенные с помощью Q -метода, фотографировали на микроскопе ЛЙШ,1 ИУФ-3, используя еввто--фильтры ФС-I (Z .та), объектив 90x0,65=1,25 МИ и фотопленку КН-2. При этом предварительно отмечали координаты пригодных для анализа метафазных пластинок. Метафазкые пластинка, окрашенные eypamran-SOg > фотографировали одновременно со ступенчатым ослабителем с помощью микрафяуориметра ИФ-155 (Барский п др., IS83) при использовании объектива 100x1.£5 &И v фотопленки "Изопснхром" типа А-42 в автоматическом ре-»vmc. Флуоресценция препаратов возбуядали спетом с длинами волн 365, 404 и 435 им, который выделяли из спектра излучения ртутной лампы ДРШ-250-2, используя для этой целя светофильтр $0-1 (4 мм). Для выделения света флуоресценции окрашенных объектов использовали светофильтры йЗС-19 (1,5 мл) и «C-I8 (1,5 мм). Поиск и фокусировку флуоресцирующих объектов, во избежание гас выцветания, проводили в очень слабом возбуждающем свете. Дгя проявления высокочувствительной пленки "йзопанхром" типа А-42 (^о.в = ^00 использовали метоло-вый мелкозернистый проявитель (Фздик, Барский, I97IL

Среднюю оптичаскуд плотность хромо $ош определяли путем сканирования негативов с помощью микрофотометра Carl-Zeiss Jena G XX.

Интегральную' флуоресценции индивидуальных хромосом в ме~ тафазной пластинке вычисляли как произведение средней яркости флуоресценции хромосом и их площади. Площздь хромосом измеряли планиметрически. Яркость вычисляли как среднее из 25-100 измерений интенсивности флуоресценции различных участков хромосом ( размер участков на негатиЕе 100x100 мнм).

Для оценки размера ген.ома_пеловека в абсолютных единицах

~ s -

использовали результата собственных исследований относительной величины генома человека, мышей и ряда видов амфибий:. Bufo calemita, Bufo viridis, Baña esculenta, Eaña teapo--raria u данные других авторов о содержанки ДНК' (в пикограммах) в геноме этих видов амфибий ÍBsc'пяапг. et al. ,1972; Olmo , Korcsoalchi , 1978). В работе использовали лимфоциты лимфоузлов человека, тикоцкти мыши, а такие'эритроциты указанных влдов амфибий. Измерения относительной величины гснэ-ков проводили методом проточной цитоыетряи. Обычно в огаггах использовали сыось клеток двух видов, для которых определяла относительный коэффициент содержания ßiK.

Небольшие кусочки биопсировакнкх лимфатических узлов человека разрезали в 1-2 мл раствора версена, образующуюся суспензию клеток отсасывали и разбавляли раствором вереска до концентрации I'IO6 - 2*10б клеток в I мл. Смесь клеток сравниваемых видов животных готовили слиянием исходных суспензий непосредственно перед окраской. Для окраски использовали комбинацию красителей оливомицина и бромистого этидля. Измерения проводили на проточном цитофлуорпметре, созданном на базе люминесцентного Микроскопа ЛШАМ.. Метод окраски и прибор описаны ранее (Розанов, 1968). Б калдом измерении анализировали от 10° до lofi клеток. Коэффициент вариации при измерениях с помощью проточного цнтометра составлял около

Л . w, ^ .

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУда^Е

В реальных условиях при использовании фотографического микрофлусримэтрического метода на точность измерения содержания ДгК в хромосомах может сказывать .влияние целый ряд факторов, таких, например, как выцветание окрашенных флуоресцирующими красителями хромосом под действием возбуадакчего cae: степень спирализация хромосом,, точность измерения площади объектов и почернения негативов и т.д. Влияние некоторых из этих факторов было исследовано в настоящей работе*.

Влиянт* выцветания хромосом, оксаденнкх аут-амином -SQ^ на точность определения в них содержания ¿Ж. Зацветание

у.икрообъектоз под действием возбуждающего света является одним из наиболее серьезных источников возможных ошибок' при проведении кинрсфлуорнхетричесхих измерений. Поскольку предлагаемый котод основан на двухступенчатом анализе, пр!? котором для идентификации хромосом к последующего выявления а шаг ДНК используются методики, основанные на применении флуоресцирующих красителей, эффекты выцветания препаратов под действием гозбуздакще^о света могут проявляться на обоих этапах. Влияние Ч-окрасииаияя хромосом на последующее выявление а них ДНК с помощью реакции £ельгена уже исследовалось ранее ( Еозяал ^ а1. , 1^77 а). Было показано, что даже короткой облучение (т0Х=44О нч) хромосом, окрашенных акрихином, приводит л заметкой снижения интенсивности окраииваекости объектов пэ £елыеку.. В связи с эти:.«, было предложено использовать при 'фотографировании <2-окрашенных хромосом короткое, время схспозиц/н (иргагерко 15 с), а также проводить дополнительную ¿.¡ксзгич препаратор сипсъг, кетаисл-форвтш-уксусная кислота перед окрашиванием по '?ельгену ( Бояаап ъЪ а!* ,1У77 а, ¡,¿77 б). В данной работе исследовалось влияние возбуздякицего сгега { Я -365, 405: и 436'ни, светофильтр шС-1, 4 :л0 на точность определения содержания ДНК з I! 2 и 3-й хроносо:.:ах после скравивзнил их с помощью (флуоресцентного варианта реакции Фельгена.

Из данных, представленных в таблице I, следует, что несмотря на увеличение продолжительности действия возбуждающего снега ка скрэеенные фяуоресцярл?щи« красителем хромосома, соотношение кезду содержанием ДНК в. I, 2 .и. 3-й хромосомах остается на одкоу уровне. Из этих даинкх можно9 по-вцдимоцу, сделать Гопьсд о тс:«, что действие возбуждающего света равномерно скил:а&т интенсивность флуоресценции хромосом б кссяеду--еккх мстзфазних пластинках и, -гаки« образом, не изменяет соотношения !.;е:эду хромосомами по содержанка ДКК»

степени слирапизации, хромосом на точность определения з них содержания ДМ. Измерения проводили на I, 2 и 3-й хромосомах генока человека. При этом использовали две группа хрскосом,с разной степень** спирзлиаации: с относительно

Влияние продолжительности воздействия возбуждающего света на относительное содержание ДНК в хромосомах I и 3, окрашенных аурамином - зо,.

гг^ллгт у ,-.„„,, „л? I Отношение содержания ДНК в хромосо-

Продолжительность дел-| „ах 1 и 3 к £е содержанию в хромосо-

стаия Еозбузкдающего сЪета на окрашенные хроиоссмы, с

ме 2,

х ± 8х

хромосома I

хромосома о

20 60 120

1.049 ¿0.010 (2?61)

1.048 + 0.021 (5.59)

1.055 + 0.016

(4Т08)

0.640 V 0.005 (2.ВЗ)

0.822 + О.ООо (2.0У)

О.832 + 0.012 (З.У7)

Таблица 2

Влияние степени епирализации 1,2 и 3-й хромосом человека на относительное содержание в них Дг!д

Степень епирализации хромое.--:

Отношение содержание в хромосомах I и 3 к ее содержании в хромосоме 2, х + а-

хромосона I

хромосома з

Еысокая

1.057 + 0.006

цТэй)

0.624 х 0.007

(2Тб2)

Низкая 1.052 + 0.007 0.824 ^ 0.СС9

(2Л0) (3.47)

. Примечание. В табл. I и 2 кагдое среднее значение получено для 30 хромосом. Б скобках указан коэффициент вариации (в %). х - среднее значение,

е- - стандартная ошибка среднего значения.

высокой, при которой длина хромосомы составляла для 1-й хромосомы 4.54 _+ 0.10 мкм, для 2-й - 4.37 + 0.09 мкм, для 3-й - 3.68 + 0.09 мкм; с относительно низкой, при которой длины I, 2 и 3-й хромосом составляли 10.54 + 0.38, 9.98 + 0.36 и В.53 jr 0.29 мкм, соответственно. Таким образом, длина хромосом различалась в двух группах примерно э 2.3 раза. Однако, несмотря на столь существенную разницу в длине хромосом, соотношения в содержании ДНК между отдельными хромосомами сохраняются на одном уровне; не происходит заметных изменений также и в точности определения содержания ДНК в отих хромосомах ( табл. 2 ).

Определение, содержания ДН.К в индивидуальных хромосомах человека с помочью метода фотографической микрофлуориметрии. Для измерения содержания ДЖ в хромосомах человека применяют методы, основанные на различных принципах выявления ДНК: фотографическая абсорбционная У1-мнхрофотометрия - средний коэффициент вариации при измерении содержания ДНК этим методом составлял 13,94;* ( Rudkin , 1965); абсорбционная микрсфо-тометрия хромоссм, окрашенных галлоцианином-хромовими квасцами - 10,62% ( Mendelsohn et si ., 1973) И 4,2!? ( Kajall et al., 19Ь4); фотографическая абсорбционная микрофотометрия хромосом, окрашенких по '»ельгену - 7,2?jí { Bosrsan et al 1977 в) И 7,Ь'( ( Iroeri, Van der Floeg , 1979); микрофдуори-метрия хромосом, с к районных по ¿ельгену { аурамин - so,; -IQ,'¿2£ \Сухих, Ivc'o); проточна:-, цитометрия хромосом окрашенных иодистым пронидием ( Katssoh , Sydberg , 1981) и бромистом атидием ( Krrrls et ni ., 1Хч>).

•¿отогра;}ический- микрофлуориметрпчеекий метод, предлагаемый в настоящей работе, основан на предварительной идентификации хромосом с помочью Q- окрашивания и последующем окрашивании карисгипированиюс хромосом по Еельгену с использованием флуоресцентного варианта этой реакция. Результаты измерения содержания ¿yL-Í в 24 хромосомах человека с помсцьа г^тогра.Ьгческогг м:гкро-.;лусриметри"еского метода приведены з табл. 3.

Относительное и абсолютное (в фг) содержание дДЧ в индивидуальных хромосомах человека кзмерскисЪ с помощью фотографической иикрофлуорииетрки хромосом, окрашенных аурамином - 302

Хромо-1Огкорительное содержание{Абсолютное содержание{ сома |ДНК, х +• а- |ДЬл, .5 + 8- | т

I 1.046+0.008 '313.3 2.4 2 к

2 1.000 + 0.006 299 ..5 Г 1.3 к - , v,'

3 0.843 + 0.009 252.5 + 2.7 5.3

4 0.775 + 0.009 232.1 ± 2.7 5,0

5 0.752 ± 0,008 225.2 х 2.4 5.0

6 0.710 ± 0.007 ' 212.7, + 2.1 4.6

7. 0.646 + 0.007 193.5 ± С Л 5,5

I 0,630 + 0.004 165.7 +1.2 2..2

8 0.617 1 0.006 184.8 +1.5 4.7

9 0.555 + 0.005 ' 169.2 + 2.7 8.3

10 0.557 + 0.005 166.5 1.5 4.2

II 0.551 7 0.006 165.0 + ].В 5.4

12 0.543 + 0.005 162.6 + 1.8 . 5.5

13 0.448 7 0.004 134.2 + 1.2 4.6

14 0.417 + 0.005 124.3 + 1.5 6.0

15 0.393 * 0.006 117.7 + 1.6 7.2

16 0.365 ± 0.005 109.3 + 1.5 7.3

17 0.349 ± 0.004 104.5 + 1.2 5.0

18 0.328 + 0.004 93.2 + 6.7

20 0.273 1 0.004 61,5 7 1.2 7.9

19 0.252 ¿0.005 75.5 - 1.5 а.в

У 0.218 V 0.005 65.3 - 1,5 7 с 7

22 0.206 + 0.004 61.7 + 1.2 8.9

21 0.176 I 0.004 52.7 7 1.2 11.7

Дрикечание. Относительное содержанке ДНК £■ хромосомах определяли по его отиове:-и» к асдероыи» ДНК в Хрокосоуо г. 2 - я:-*.?жив,

и- - стандартная ошибка среднего значения V - коэффициент вариация I ь ь ) • •'

Полученные результаты показывают, что относительное содержание ДНК в хромосомах человека, измеренное с помсщьл предлагаемого метода, очень хсроао совпадает с результатами полученными другими авторами.'

Полученное даяние позволяют сделать вывод« что суммарное влияние всех факторов (выцветание препаратов под действием возбуждающего света, степень епирализации, предварительная окраска по Q-методике для идентификации хромосом, ошибки фотометрии негативов, определение площадей хромосом) не оказывает существенного влияния на точность измерения ДНК в индивидуальных хромосомах, что и позволило испытать разработанный фотографический микрсфлуориметрический метод в практических исследованиях.

Определение содержании ДНК в индивидуальна хромосомах при ачболе эаниих человека,tс вязаниях с численными и структурными нарушениями хромосом. Б настоящее время не известна вариабельность в содержании AiiX в индиъидеальных хромосомах обусловливающих лолисомные и моносомныз варианты хромосомных болезней.

• Проведено сравнительное исследование содержания ДНК в хромосомах 5, 21, л- л У-хромосомах у клинически здоровых ладей и Зольных с раздичними синдромами: "кошачьего крика? дауна, Тернера, КлаЯнфелътера. Обнаружено, что содержание Д11К в хромосомах 21 при синдроме Дауна, Х-хромосоме при синдроме Тернера, Х- у ¿'-хромосомах при синдроме Клайнфельгера, не отливается от, содержании ЦЖ в. соответствующих хромосомах здоровей ладсЛ. Совпадает с нормой и вариабельность содержания ДНК в исследованных хромосомах. Содержание ¿¡¿¡К в хромосоме 5 с долецней части короткого плеча ( del 5 р 13) у больной . с сивдромом "кошачьего крика" оказалось на 15$ ниже по сравнена» с гомологом, что составило потерю 0,45% ДНК от ее содержания б геноме человека. Полученные результаты свидетельствует, чго сбплзнсированность генома у Сольных с наследственными синдромами не ведет, по-видимому, к дальнейшей его нестабильности а фенотипическнй эффект в этих случаях определяется дозоЧ генов.

Определение содержания ДЧК в индивидуальных хромосомах у женщин при привычном невынашивании беременности. В настоящее время отмечается связь полиморфизма хромосом, в частности С-гетерохроматиновых вариантов хромосом 1, 9 и 16 с нарушением репродуктивной функции человека. Данные литература по этому вопросу противоречивы. Отмечается как увеличение { Дветко-ва, 1980; Каретникова, 1988; Ford, 1982), так и уменьшение С-гетерохроматина (Крушин, 1У57; Brecevic , Kern , 1988; Rodriquez-Gomez , 1988 ) у кенщик с привычными шкидьоайи. Имеются сведения также о том, что репродуктивная функция у носителей гетерохроматиновых вариантов хромосом является нормальной ( Carothers et al ., 1982; Bobrow 1925).

Проведенное сравнительное исследование содержания ДНК в хромосомах 1,9, 16 и Х-хромосоме у женщин с привычным иеьы-капиванием беременности по сравнению с еа содержание?* п аналогичных хромосомах у женщин•с физиологическим течением беременности не выявило достоверных различий в содержании ДНК в исследованных хромосомах. Совпадает и вариабельность содержания ДНК в исследованных хромосомах. Так, у кенщин с привычным невынашиванием беременности среднее содержание ДНК (отн.ед.) в хромосомах I, 9, 16 и X составило 1.045 (3,6%); 0.574 (6,В£;; 0,368(6,6%); 0,64.6 (6,С#), соответственно, а у мешцин в контрольной группе - 1.046 (3,6%); 0,568 (5,Ц£); 0.355 (6,fc'i); 0,639 (5,6%) в тех ке хромосомах.

Из полученных данных üosho сделать вывод о той, что различие в характере распределения к сочетаемости С-гстерохрок£-тшовых блоков в хромосомах 1, 9 и 16 у яенцпп с нпрутиение:.: репродуктивной функции по сравнению с нормой, вероятно, связано с явлением эу- и гегерохроматкзацки ( Восток, С&лнер, 1981) прицентромерного района соответствующих хромосом, поскольку количество ДНК в индивидуальных хромосомах остается примерно постоянным.

Оценка размера генома человека. Но существу во всех работах, в которых проводили оценку содержания ДНК в xpcv.ocouax человека, конечный результат выражали в услсикх единицах (по отношению к 2-й хромосоме) либо в процентах от размера

диплоидного генома человека. В цитофотометрических исследованиях по определению содержания ДНК з хромосомах при различных хромосомных заболеваниях, а также з хромосомах постоянных клеточных линий данный подход является непригодным, поскольку хромосома 2 сама может являться носителем различных структурных перестроек ( Вого^гк ей а!., 196?; Не1<исЬ efc а1., 1567;

2з11ар1оо1а ,, 19В8; КГтко эь а1 1988). Совершенно очевидно, что в таких случаях содержание ДКК з этой хромосоме будет отличатьсн от нормальной. Кроме того, в настоящее время существует ряд задач, для решения которых необходимо иметь не только величины, страдающие соотношение содержания ДНК между отдельными хромосомами, но и величины абсолютного содержания ДНК в индивидуальных хромосомах. Подобная задача, однако, сопряжена с целым рядом трудностей. В настоящей работе была сделана попытка оценить содержание ДКК а каждой хромосоме генома человека з граммах»

На осново собственных измерений относительной величины геномов человека, ньшей и нескольких видоз амфибий, а такле на основе данных ммеющнхо: в литературе об абсолютных величинах геномов у некоторых амфибий ( БасЬ^мп ей а1 1972; Охао,

Ко1*озсл1сЫ ., 1978) было установлено, что диплоидный геном человека содержит 7.33 пг ДНК. Исходя из этой величины и данных по определению относительного содержания /¡да з хромосомах было определено абсолютное содержание ДНК а разных хромосомах человека ( я фемтограчмах ) ( см. табл. 3 ).

Воспроизводимость при обработке негативов и измерения площадей составляла в целом для 1-Я хромосомы 0.74%, а для У-хрошсомы - 1.01%. Средний коэффициент вариации при измерении содержания ДНК в хромосомах наша методом составлял о .035. Это означает, что разрешение нашего метода при анализе хромосом среднего размера составляет величину порядка 0.1% от размера генома человека.

Определение абсолютного содержания ДНК в индивидуальных хромосомах клеток, культивируемых з-а уЛ^го . При помощи разработанного нами метода проведено исследование абсолютного ссдорзаниь ¿йй з индивидуальных хромосомах постояяншс й-лиайо-

бласгоидных «легочных линий человека BFMI - 1788 и CCEF-ВВ и Т-клетках лейкозной линии человека Juykat .

Расчеты абсолоткого содержания ДНК в хромосомах этих клеточных линий проводилась исходя из шлеюдихся данных по абсолютному содержании ДНК на геном в этих клеточных линиях, которые были получены D.M. Розановым (Институт цитологии АН СССР, Ленинград) с помоцью метода проточной цитсшетрии и составили 7.58, 7.90 и 7.46 яг,соответственно. Идентификация хромосом этих клеточных линий была разработана С.Е.Мамаевой (Институт цитологии АН СССР, Ленинград)« Кариотил линии KPMI - 1788: 47, £У, * И (маркерная хромосома ¡л определена как изохромосоыа по длинному плечу хромосомы 3 { i , 3<з ). ¿Неточная линия с CR? -SB имеет нормальный кариотип 46, ХУ. Кариотил линии Jur&afc : 47, ХО, - 2, + 20, + Mj_ * М2 { М^-del(2) ( 2qter-~ р 23:); Ug - del (У) ( pter -*- <j 12:).

Полученные результаты показали (табл.4), что маркерная хромосома М клеточной культуры HpMI - I7ä8 содержит на 8,6% ДНК больше, чем нормальная хромосома 3 этой .же клеточной линии Ери анализе содержания ДНК в отдельных хромосомах клеточной культуры Jurlcat выявлено, что маркерная хромосома Mj- содержит на II,Q& ДНК меньше по сравнению с нормальной хромосомой 2. Вторая маркерная хромосома li^ - на 26,8% ДНК меньше, чеы У -хромосома из метафазной клетки периферической крови человека с нормальным кариотипом. В исследованной клеточной культуре абсолютное содержание ДНК и его вариабельность в трисомных хромосомах 20 совпадает с ворьшй.

Анализ содержания ДНК в хромосомах клеточной культуры ССШ? - SB показал значительную вариабельность в содержании ДНК по всем хромосомам в этой культуре по сравнению с ее содержанием в хромосомах человека с нормальным кариотипом. Со-деркание ДНК на геном клеточной линии CCEF - БВ ка 0,57 пг (7,8^) больше содержания ДНК в геноме человека. Полученные результаты показали, что содержание ДНК во всех хромосомах линии ССК? -SB . больше чем в соответствующих хромосомах нормального генома человека, однако избыточное количество ДНК в геноме данной клеточной линии распределено неравномерно

Содержание ДНК (в фг У а индивидуальных хромосомах клеточных ланий ЯРМ1 - 1788,

Jurlcat и ССКР-ЗВ

• ^МРМГ - 1788* ^ | Я

Хромосома

^игка^

фг

* ± ! - ! г < £ ! -

I 314.2 + 3.8 5.9 эго.4 + 2.7 4.3

2 2У5.7 + 3.5 5.8 309.6 Иг 6.3 7.0

3 244.2 + 2.9 5.9 250.9 + 3.2 6.8

4 228.9 2.8 6.0 225.3 2.3 5.2

5 221.7 + 3.2 7.1 229.9 £ 2.7 6.0

б 212.5 £ 2.4 5.5 212.2 2.8 7.0

7 191.1 £ 2.1 5.3 194.9 ч- 2.7 7.3

X 181.6 2.6 5.0 180.8 3.3 6.4

8 174.7 + 2.2 6.1 177.8 + 2.1 6.1

9 169.1 + 2.2 6.4 166.8 + 2.1 6.7

10 162.2 2.6 7.9 169.1 + 2.2 6.7

II 165.4 2.0 6.0 165.9 + 2.3 7.3

12 161.1 2.2 6.7 162.9 + 2.5 8.2

13 133.3 1.4 5.1 135.7 2 Л 8.0

14 129.6 2-6 9.6 128.6 + 1.7 6.7

15 121.9 £ 1.4 5.8 122.3 £ 2.3 9.7

16 110.3 1.8 7.Ь 117.9 £ 1.6 5.9

17 107.0 £ 2.0 а.б 106.2 £ 7.2 7.2

18 99.7 £ 1.6 7.7 95.4 + 1.3 7.4

20 80.0 т- 1.5 9.1 85.0 1.0 7.2

19 79.0 + 1.5 9.5 Ь0.2 + £.3 8.7

У 72.7 1.1 4.9 - -

22 62.2 +■ 1.2 9.6 70.0 + 1.7 12.3

21 56.3 + 0.7 6.1 56.1 1.0 8.7

Мт 265.7 + 3.4 4.4 275.6 £ 4.6 о.5

- - 47 .Й 1.2 .о

Таблица 4 (продолжение)

Хромосома ^ОСЕН-ЗВ ' . 1 V | ^ССЙР-БЗ ~ ( %)

■ к ± 1

I 337.7 ¿ 2.3 3.3 7,8

2 320.4 ¿2.2 3.3 7,0

3 265.9 ± 2.6 5.1 5,3

4 251.0 ± 2.1 4.1 ел

5 239.6 ± 2.0 4.2 6,5

б 226.5 + 1.7 3.7 6,5

7 ■ 216.2 7 1.9 ■ 4.4 11,7

X 200.5 ± 2.1 5.4 6,2

6 291.2 + 1.7 4.2 • 3,5"

9 161.4+2.0 5.4 7,2

10 181.2 + 1.4 3.7 8 „6

11 179.3+1.5 4.0 8,7

12 175.6 + 1.8 5.0 8.0

13 141.7 + 1.1 з.е 5.6

и 136.4.+ 1.6 5.4 9,2

15 133.6 + 1.7 6.2 13,5

16 125.3 +1.6 6.2 14,6

17 III.9 + 1.3 5.8 7Д

16 104.9 + 1.8 8.4 6.8

20 86.0 Г 0.7 4.3 5Д

19 81.2 + 0.9 5.4 7,5

у 68.6 ± 1.3 6.6 5,1

22 65.6 + IЛ 7.6 6Р3

21 Мт 63.3 7 1.0 7.2 20 Л

Ц2 - - ...

Примечание*- содешсание ДКК (в $г> 2 ¡¡шщреду-алькнх хоомосомах; содержанке да (в йг) ь ккдквзду-' аяышх хоомосомах нормального генома челозека» которое принято.за ЮОК остальниз обозначения те ко, что и í табл« 2.

по всем хромосома;,! и варьирует от 3,5$ (хромосома 8) до 20,1%.(хромосома 21) по сравнения с содержанием ДНК а соответствующих, хромосомах нормального генома человека ( см. табл.Л).

На основании данных, полученных при определении абсолютного содержания ДНК в индивидуальных хромосомах постоянных клеточних линий человека, можно сделать вывод о том, что вариабельность в содержании ДНК im геном этих клеточных линий связана не Только с наличием или отсутствием маркерных хромосом, но и с вариациями в количество ДНК в индивидуальных хромосомах. Феномен избыточного количества ДНК в хромосомах клеточной линии CCR7 -SB с нормальным карнотипом обусловлен, вероятно, увеличением количества равномерно рассеянных по асе-?<гу геному высскоаорторяющихся последовательностей ДНК, э частности - КрпХ - повторов и Alu-последователыюстей.

ВЫВОДЫ

1. Разработан высокочувствительный фотографический микро-фдуориметрический метод определения содержания ДНК э индивиду-атьных хромосомах человека, позволяющий регистрировать,разницу в содержании ДНК порядка 0,1% от размера генома.

2. Установлено, что выцветание окрашенных хромосом под действием возбуждающего света и степень их епирализации не влияет на соотношение содержания ДНК в индивидуальных хромосомах метяфазной пластинки.

3. Показано,, что содержание ДНК в хромосоме 21 при синдроме Дауна, Х-хромосоме при синдроме Тернера, Х- и У- хромосомах при синдроме КлаГшфельтера не отличается от содержания ДНК в аналогиями хромосомах фенотипически нормальных индивидов. Содержание ДНК б хромссоме 5 с делецией части короткого плеча

у больной с синдромом "кошачьего крика" оказалось на 15% меньше по сравнению с нормальным гомологом, что соответствует потере ü,45'3 ДНК от ее суммарного количества в геноме человека.

4. Показано, что содержание ДНК а хромосомах I, 9, 16 и Х-хромосомз у женщин с привычным невьэтааиэаниегл беременности

не отличается от содержания ДНК в соответствующих хромосомах кенщии с физиологическим течением беременности.

5. Показано, что вариабельность в содержании ДНК на геном постоянных клеточных линий человека RH-'.I -1768, Jurkat

связана не только с количественными и структурными нарушениями хромосом, но и со значительной вариабельностью б содержании ДНК в сапах хромосомах. При этом в одних хромосомах наблюдается уменьшение содержания ДНК по срагаен«л с соответствующими хромосомами нормального генома челог-яхп, в в других - увеличение.

6. Установлено, что избыточное количество ДЩ f. геноко , В-лимфобластоидной клеточной линии ССКУ-ЗЗ с нормальным ка-риотипом неравномерно распределено по всем хромосомам.

Список работ, опубликованных, по томе дисс.пртапип:

I. Сухих Т.Р., Калимзгамбетсв A.J.5., Барский И.Я., Хомгн-кова С.А., Виноградов А.Е., Розанов Ю.М., Кудрявцев Б..4. Фотографический микрбфлуорикзтркческий метод определения содержа-кия. ДНК ь индивидуальных хромосомах человека // Цитология.-1989.- Т.XXXI. - Ii» II. - С. 1329-1338.

Z. Калкмагамбетов A.M., Сухих Т.Р., Кудрявцев E.H. Содержание ДНК в хромосомах больных с синдромом Дауна, Тернера, Клайнфельтера и "кошачьего крика'.' // Б кн.: Второй Всесоюзный съезд медицинских генегиков, Алма-Ата.- 4-6 дек.- 199U.-Тез.догл.- К.- 1990,- С.223.

3- Сухих Т.Р., Калшагамбетов A.M. Исследование стабильности содержания ДНК в индивидуальных хрскосоках человека б норме а при наследственных заболеваниях, связанных с анеуплри-дией половых хромосом и с делецией аутоеомы. // В кн.: Первая конференция "Геном человека" Переславль-ЗалесскиЯ.- fc-Iс окт.-2990.- Теэ.секц. и стенд, сообщ.- Li.- 1990.- С.5э-о9.