Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях

Водовозова, Елена Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ им академиков ММ ШЕМЯКИНА иЮ А ОВЧИННИКОВА

На правах рукописи

ВОДОВОЗОВА Елена Львовна

ФОТОАФФИННЫЕ ЛИПИДНЫЕ ЗОНДЫ С ДИАЗОЦИКЛОПЕНТАДИЕН-2-ИЛКАРБОНИЛЬНОЙ МЕТКОЙ СИНТЕЗ И ПРИМЕНЕНИЕ В МЕМБРАННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

03 00 04 - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

003065417

Москва - 2007

003065417

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им академиков ММ Шемякина и Ю А Овчинникова Российской Академии Наук.

Официальные оппоненты член-корреспондент РАН,

доктор химических наук, профессор Цетлин Виктор Ионович

доктор химических наук, профессор Каплун Александр Петрович

доктор биологических наук, Торховская Татьяна Ивановна

Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В Ломоносова

Защита состоится " 10 " октября 2007 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.019 01 при Институте биоорганической химии им академиков М.М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН (ИБХ РАН) по адресу 117997, В-437, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИБХ РАН

Автореферат разослан " 7^'* сентября 2007 года

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор химических наук В А Несмеянов

Актуальность темы Метод фотоаффинного мечения (photoaffinity labeling, PAL) широко применяется в структурно-функциональных исследованиях биологических систем Он позволяет получить прямые доказательства пространственной близости молекулярных компонентов Зонд, аналог природного вещества, несущий фотофор (фотоаффинную s фотоактивируемую = фотореактивную метку), вводят в изучаемую систему и подвергают облучению При фотолизе метки образуется высокореакционноспособный интерме-диат - карбен, нитрен, бирадикал и др. - способный ковалентно связываться (сшиваться) с ближайшим фрагментом биомолекуяы Для детектирования продуктов реакции - модифицированной макромолекулы и, в конечном счете, участка ее модификации - зонд должен содержать репортерную группу (радиоактивную, хромофорную, флуоресцентную, иммунореактивную) В итоге возможно определить, например, аминокислотные остатки (а о) белка, входящие в контакт лигандом Для получения такой информации чаще всего применяют рентгеновскую кристаллографию (РСА) и ЯМР высокого разрешения Сейчас эти мощные методы анализа поддержаны технологиями получения рекомбинантных ДНК, которые позволяют получать миллиграммовые количества полипептидов и полинуклеотидов Однако такой анализ невозможен или крайне затруднен в целом ряде случаев при изучении комплексов транскрипционных факторов, рибосом, белков в составе везикул, локальных структурных образований цитоскелета и интегральных сигнальных комплексов Здесь PAL является важнейшим методом идентификации субъединиц и картирования активного центра, наряду и в дополнение к исследованиям с помощью точечного мутагенеза и связывания моноклональных антител Главное преимущество PAL состоит в том, что оно применимо к нативным белкам Роль биологических мембран и липид-белковых комплексов в функционировании клетки и организма в целом сложно переоценить Наряду с физическими методами изучения строения мембран - электронной микроскопией, спектроскопией ЯМР, применением ЭПР- или флуоресцентных зондов, - а также химическими - с использованием моно- и бифункциональных реагентов, разработан метод исследования мембран с помощью фосфолипидных фотоаффинных зондов {Khorana Н G, 1975, Stoffel W, 1978, Brunner J, 1980) Развитие этого метода путем поиска новых высокочувствительных фотофоров и синтеза на их основе липидных зондов - актуальная задача мембранологии

Требования, предъявляемые к фотофорам, включают- инертность в отсутствие актиничного света, активацию в условиях, не разрушающих компоненты биологической системы, малое время жизни (меньше времени жизни лиганд-рецепторного комплекса) и высокую реакционную способность возбужденного состояния, минимальный размер, доступность, то есть несложность синтеза. Зонд должен содержать репортерную группу, наличие которой существенно облегчает подготовку и анализ образцов даже при использовании современных масс-спектрометрических (MS) методов идентификации продуктов PAL (Jahn 0, 2004, Kotzyba-Hibert F, 2006) В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись арилазиды и фенил-диазирины Первые довольно легко синтезировать, и они фотолизуются в мягких условиях, однако генерируемые при этом нитрены имеют невысокую реакционную способность Фенилдиазириновая и и-(3-трифторметилдиазири-но)фенильная (Tfd) группы при фотолизе образуют высокоактивные карбены, но синтезы соединений, меченных этими фотофорами, трудны

Домены мембраносвязанных белков и участки апобелков в липид-белковых комплексах, контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены неполярными а о Эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотофоров, реагирующих даже с неактивированными СН-связями Наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа Синтез исходного соединения для ее введения - 2-диазоцикло-пентадиенкарбоновой кислоты - не представляет большой трудности (.Martin J С, Bloch DR, 1911) До наших работ Dcp-rpynna лишь однажды применялась для создания зондов, причем нелипидной природы {Nielsen РЕ, 1983) Впервые синтез !4С- и 3Н-меченых фосфатидилхолинов (PC) и сфингомиели-нов, несущих Dcp-rpyraiy в ю-положении жирнокислотной цепи, был осуществлен в ИБХ РАН (Карюхина МО, 1988) с использованием подходов, разработанных для зондов с 2-нитро-4-азидофенильной (Nap) меткой [2-8] Сравнение способности зондов, несущих в «и-2-положении остатки N-Nap-амино-ундекановой и N-Dcp-аминододекановой кислот, ковалентно связываться с []4С]дипальмитоил-РС или [14С]холестерином в везикулах из димиристоил-РС, подтвердило более высокую активность Dcp-метки

Цель исследования Целью настоящей работы явились детальные исследования фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной

группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов, содержащих удобный в работе высокоактивный радионуклид (1251)

Другой важнейшей задачей было применение полученных зондов для изучения ряда мембранных биологических систем как с целью доказательства эффективности PAL с использованием Dcp-фотофора, так и для получения новых данных об организации различных липид-белковых комплексов Данная часть работы проведена в сотрудничестве с коллегами из различных лабораторий ИБХ РАН, а также других исследовательских учреждений

Научная новизна и практическая ценность Диссертация суммирует результаты оригинальных разработок и синтезов, которые формируют новое направление в рамках развития метода фотоаффинного мечения

В настоящей работе впервые детально исследованы фотохимические свойства Dcp-группы Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, высокой реакционной способности и мягким условиям фотолиза известные и широко применяемые фотофоры [17,22,35,41,45]

Осуществлены синтезы новых 14С-меченых РС-зондов для мембранных исследований, содержащих Dcp-rpynny при концевом атоме углерода ациль-ных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы С помощью этих зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране Полученные данные хорошо коррелируют с результатами конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями авторов, применивших другие методы исследований [9,32]

В ходе разработки синтезов 14С-меченых зондов найден новый основный катализатор - 4-аминопиридин (4PyNH2) - для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей Применение 4PyNH2 в синтезах фосфо- и гликолипидов позволяет существенно увеличить выход при ацилировании малореакционноспособной вторичной ОН-группы глицерина, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых, дорогостоящих или нестабильных соединений [10-14,27,31,33]

Обнаружена способность Dcp-группы легко подвергаться иодированию в стандартных условиях окислительного процесса Показано, что при этом фотохимическая активность сохраняется, и заметной потери иода при фотоли-

зе не происходит Найденные свойства превращают Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, который позволяет осуществлять синтез нерадиоактивных зондов, а высокоактивный нуклид Ш1 вводить в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением Положение радиоизотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов PAL Эффективность применения 1251-меченого Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена на хорошо изученной биологической модели -вирионе гриппа [17,22,35,41,45]

Разработан синтез алифатической кислоты, несущей при ш-углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь Целевыми биомолекулами в структурных исследованиях с применением PAL чаще всего являются белки, и наличие сложноэфирной связи, лабильной в щелочной среде в отличие от пептидной, должно облегчить анализ продуктов фотомечения хро-матографическими и MS методами Кислота служит синтоном при получении различных зондов для изучения неполярной области липидного бислоя Синтезирована и максимально короткая карбоновая кислота (в виде активированного эфира) с Dcp-оксигруппой, с помощью которой можно получать зонды для мечения полярных областей мембран и других биологических систем [22] Новые ганглиозидные зонды [22,23,41], синтезированные на основе ли-зоганглиозида GM1 и несущие шМ)ср-фотофор в ацильной части церамидно-го остатка на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы применены для исследования взаимодействия различных субъединиц цитоки-новых рецепторов с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах Получены сведения, важные для понимания механизма сборки рецептора интер-лейкина-2 и проведения сигнала внутрь клетки [29,44],

С помощью нового зонда, несущего !251-Вср-фотофор в олигосахаридной части молекулы ганглиозида GM1 вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты, определены фрагменты молекулы интерлейкина-4, взаимодействующие с ганглиозидом Исследования проведены в рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиозидами Полученные данные в перспективе могут быть использованы при создании пептидов для цитокинотера-пии различных заболеваний [46]

Впервые для идентифицикации субъединиц мембранного субкомплекса F0 митохондриальной Н+-АТР-азы, непосредственно контактирующих с липи-

дами мембраны, применен фотоаффинный фосфатидилхолин Для многосубъ-единичного интегрального белка MS метод анализа продуктов PAL липидным зондом был использован впервые [21,24,37,38]

В рамках изучения механизма взаимодействия потенциальных носителей противоопухолевых препаратов - липосом, несущих углеводные детерминанты - с клетками опухолей [14-16,18-20,26,30,31,34,36,39,40,42,43,48-52], разработан синтез неогликолипидных конъюгатов с Dcp-фотофором, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом [25] Зондирование 125Ы)ср-мечеными липосомами показало, что на поверхности исследованных опухолевых клеток действительно есть рецепторы (предположительно, лекти-ны), опосредующие взаимодействие с липосомами, оснащенными различными углеводными лигандами [28,47]

Результаты данной работы показывают, что диазоциклопентадиен-2-илкарбонил, будучи компактной, доступной, стабильной в отсутствие акти-ничного света и фотолизующейся в мягких условиях меткой, кроме того обладает высокой реакционной способностью наряду со свойством подвергаться прямому введению 1251, что обеспечивает удобство получения зондов и высокую чувствительность метода Указанные качества превращают Dcp-фотофор в ценный инструмент для биологических исследований

Объем и структура работы Диссертация изложена на 229 стр текста Она состоит из введения, обзора литературы «Метод фотоаффинного мечения и его применив в структурно-биологических исследованиях», 10 глав, посвященных результатам и их обсуждению, экспериментальной части и выводов Работа иллюстрирована 41 рисунком, 16 схемами и 7 таблицами Список цитированной литературы включает 370 наименований

1. Изучение фотохимических свойств Dcp-группы

Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты (DcpOH) 1 осуществляли как описано (Martín JC, 1971) (Схема 1) Кислоту 1 отделяли от 3-диазоцик-лопентадиенкарбоновой кислоты' хроматографией на силикагеле В отсутствие УФ-облучения DcpOH может храниться годами, устойчива к действию мягких кислот и щелочей, надуксусной кислоты и других окислителей Dcp-Меченый жирный ацил реагирует с циклогексаном и гРгОН, и внедряется в

1 Эффективность диазоциклопентадиен-3-илкарбонильной группы как фотофора существенно ниже, чем Dcp-группы (Nielsen РЕ, 1983)

Na / /РЮН

2 H

COOSiMe,

TosN3/Pip

COOS¡Me3

"A" fUCTVcOOS'Mes

COOH

—COOH

SiMe3CI / Py

COOSiMe,

COOH

H,0

COOSiMe,

COOH

-17 1

Схема 1 Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты (1)

СН-связи в модельных мембранах (Карюхина, 1988) Продукты пришивки регистрировались молекулярными пиками MS, либо радиоактивностью на пластинках ТСХ Мы поставили задачу определить структуру аддукта Оср-содер-жащей молекулы с C6Hi2 и получить количественные характеристики реакции фотолиза в циклогексане Способность к внедрению в неактивированные СН-связи - показатель максимальной реакционной способности фотофора

При фотоактивации диазоциклопентадиен образует циклопентадиени-лиден, карбен, основным состоянием которого является триплетное Однако химические реакции в растворах протекают на базе синглетного состояния, и внедрение в СН-связи происходит очень эффективно (Ando W, 1973) Ход фотолиза зонда минимального размера DcpOMe (2) представлен на Рис 1 Время полужизни (ti/2) диазогруппы в указанных условиях < 30 сек После фотолиза к раствору добавляли C6DI2 и регистрировали спектр 'Н-ЯМР, с последующим анализом методом двойного резонанса (Рис 2) С максимальным выходом образовался самый неполярный продукт (ТСХ) Мы интерпретировали единственный основной продукт (кроме смолы) как структуры За или 36 (Схема 2)

Положение сигнала протона циклогексила Н1 в очень слабом поле (3 55 м д) подтверждено двойным резонансом на соседних циклогексильных протонах в сильном поле (1 53 м д) при изучении спектров в dt-метаноле

О существовании изомеров по двойным связям замещенных циклопен-тадиенов сообщалось ранее (Mironov VA , 1963) Изомеры находятся в термо-

314 нм

- О мин

—--0 5 мин

— — 10 мин

2 0 мин

Рис. 1 Фотолиз БсрОМе 2 в циклогексане (6 мМ), Х>300 нм Облучение светом ртутной лампы среднего давления мощности 30 Вт (А,макс 365 нм) на расстоянии 7 см, светофильтр - стекло Пирекс

260

320 „ , 380

А/нм

Л__1

ЗаЬ

ЗаЬ ЗаЬ

ЗаЬ

-/ V

I"" I" "I" "I "" I " 111' " I 11111 > < 11111111 > 11 1111 11 11111 III | | |! III || II1111III11 I ч 11II 111111 111 11 и I и II || | м 11 | Н||

6 80 6 70 6 60 б 00 Б 90 3 70 3 60 3 50 3 10 3 00 5 (ррт)

Рис 2 Спектры 'Н-ЯМР (СбБ^) БсрОМе 2 до (верхний) и после (нижний) фотолиза в циклогексане, фотолиз проводился до 80%-ной конверсии Спектр не изменялся при хранении раствора несколько сут при 4 С

динамическом равновесии, их соотношения зависят от характера заместителя^)2, переходы происходят путем переноса Н от С5 к соседнему С-атому

СООМе

За 36

Схема 2 а) И ц Л > 300 нм, 3 мин, циклогексан

2 Например, метилциклопентадиенкарбоксилат представлен в основном 1,3-диеном (в нашем случае структура 36)

При соотнесении интегральных интенсивностей сигналов эфира 2 до и после фотолиза продукт внедрения в СН-связь составил 42% Фотолиз Tfd-производного в СбН12 дает ряд соединений, среди которых продукт внедрения в СН-связь - 58% для 2 мМ раствора и 28% для 30 мМ (анализ ГЖХ) (Вгиппег J, 1995) Следовательно, по реакционной способности карбены, генерируемые Dcp-rpynnofi и Tfd-меткой, признанной лучшим фотофором, сравнимы Важно и то, что молярная экстинкция Dcp-группы (s~16000, Х=3 14 нм) существенно выше, чем Tfd (s~300, ^,=353 нм, tm 25 сек при облучении 3 мМ раствора в С6Н12 ртутной лампой 450 Вт на расстоянии 4 см {Вгиппег J, 1980)) Этот факт делает Dcp-rpynny более привлекательной в качестве фотофора для изучения динамических и высоколабильных систем

2. Синтез 14С-меченых3 фосфолипидных зондов, содержащих Dcp-rpynny

Мы поставили задачу оптимизации всех стадий синтеза Бср-фосфоли-пидов Для синтеза длинноцепных зондов использовали разработанную ранее схему [2,3] (Схема 3) На заключительной стадии кислота 8 вводится в реакцию конденсации с лизо-РС или сфингозин-1-фосфохолином в присутствии DCC4 и катализатора (DMAP, РРу, 4-пиперидинопиридин) В зависимости от реакционной способности ОН- или NH2-rpynnbi и основности катализатора, ацилирующий интермедиат - О-ацилизомочевина - необратимо перегруппировывается в N-ацилмочевину, побочный продукт реакции Сфингоидная NH2-rpynna реагирует довольно эффективно, замена хроматографии на сшга-кагеле5 гель-фильтрацией на липофильном сефадексе и разделением на обращенной фазе позволила повысить выход сфингомиелина 10 до 60% (в 2 раза) при эквимольном количестве кислоты 8 Ацилирование же ОН-группы, особенно вторичной, протекает гораздо медленнее Оптимизация этой реакции -важная задача в химии липидов, т к модифицированные фосфолипиды (фос-фатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и т д.) обычно получают из PC ферментативной переэтерификацией Известные методы ацилирования етор-ОИ-

3 14С-Меченые соединения мало подвержены радиолизу и имеют высокую эффективность жидкостно-сцинтилляционного счета, в отличие от 3Н-меченых

4 Сокращения DCC - дициклогексилкарбодиимид, DMAP - 4-диметиламинопиридин, РРу - 4-пирролидинопиридин, SDS-PAGE - электрофорез в полиа!филамидном геле с до-децил-сульфатом натрия, TEA - триэтиламин, DMSO - диметилсульфоксид, DMF - диме-тилфор-мамид, TFA - трифторуксусная кислота

5 Необратимая сорбция микромолярных количеств веществ на силикагеле в случае Dcp-ме-ченых соединений усиливается темновой реакцией пришивки больше, чем Nap-меченых

Схема 3 d) K[14C]N, 6) HCl, в) H2/Pt, г) МеОН/НС1, д) S02Cl/Na2C03, е) DcpCl + 6/ТЕА, ж) КОН, ¿Рг0Н-Н20, з) HCl, и) лизофосфатидилхолин, DCC/DMAP, к) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP

группы не лишены недостатков (низкие выходы, необходимость избытка производных жирных кислот) Развитие получил метод синтеза сложных эфиров глицерофосфолипидов из ангидридов кислот в присутствии БМАР (Югогапа Н в, 1977) Но и применение более сильного катализатора РРу требует некоторого избытка ангидрида- в пересчете на саму жирную кислоту - более 2 экв Вариант, где лизо-РС, жирная кислота (небольшой избыток), БСС и катализатор реагируют в 1 стадию дает приемлемые (20-50%), но маловоспроизводи-мые выходы целевого РС (Молотковский Юл Г, 1982)

Мы нашли, что введение 5-ти и более экв РРу (но не БМ АР) существен'

но ускоряет ацилирование лизо-РС [14С]пальмитиновой кислотой Эффект был обусловлен примесным веществом в препарате фирмы Fluka - 4-аминопири-дином (4PyNH2), который является побочным продуктом синтеза РРу Сложно представить, чтобы соединение с первичной NH2-rpynnoñ катализировало реакцию ацилирования по ОН-группе Однако показано (Joule JA , 1972), что ацилирование 4PyNH2 проходит через стадию образования высокореакцион-носпособного енамида по эндоциклическому атому N Мы полагаем, что в результате быстрого l-N-ацилирования 4PyNH2 О-ацилизомочевиной образуется енамид (*) (Схема 4), который и ацилирует гидроксил субстрата

СН3(СН;

[14С]РС

Схема 4 Механизм катализа О-ацилирования 4PyNH2 в присутствии DCC

Данный механизм подтверждается тем, что катализ происходит лишь при введении избытка 4PyNH2 или его сочетания с более сильным основанием РРу (Табл 1), что должно вызывать ускорение образования енамида Побочный продукт при избытке 4PyNH2 более 4-5 экв - продукт необратимой перегруппировки енамида (*) в амид (**) Вещество выделено (FAB-MS 334 [М]+)

Применение 4PyNH2 для получения зонда PC 9 (стадия и, Схема 3) дало увеличение выхода до 54% (против 17%) Первичный же гидроксил 1,2-дигли-церида ацилируется количественно в присутствии 4PyNH2 в течение минут Синтез 14С-меченого PC 12, несущего Dcp-rpynny на близком расстоянии от полярной головки, осуществляли на основе [1-14С]глицина (Схема 5) Первый вариант (стадии а,б,в,г) - ацилирование лизо-РС 5ос-[1-14С]глицином

Таблица 1 Выходы [14С]РС при аци-лирования лизо-РС [14С]пальмитино-вой кислотой в присутствии БСС и

катализаторова_

а Из 2 мкмоль лизо-РС и экв количества [14С]пальмитиновой кислоты после очистки реакционной смеси гель-фильтрацией и хроматографией на КР-18 получен [,4С]РС (Схема 4) с выходом 58%

в присутствии БСС и 4-пиперидинопиридина с последующим деблокированием и введением фотофора на последней стадии - дал выход РС 12 менее 1% Тогда мы применили схему синтеза РС 9 (стадии д,е Схема 5) Пониженная активность производных а-аминокислот и стерические трудности взаимодействия в положении т-2 обусловили лишь 50% конверсию при аци-лировании лизо-РС в присутствии 4Ру>Щ2/РРу РС 12 дополнительно очищали хроматографией на А120з, так как зонд по размерам и гидрофобности мало

Катализатор Время реакции, ч

2 17 24

РРу (5 экв) 12 30 32

4PyNH2 (5 экв) 66 72 73

РРу (2 5 экв) + 4PyNH2 (2 5 экв ) 59 73 75

4PyNH2 (1 экв ) 3 3 5 3 5

Схема 5 а) Вое20, б) лизо-РС, DCC/4-пиперидинопиридин, в) TFA, г) DcpOH, DCC/4-пиперидинопиридин, д) MeOH/HCl, е) DcpCl/TEA, ж) КОН, /РгОН-Н20, з) HCl, и) лизо-РС, DCC/4PyNH2+PPy

отличается от лизо-РС Тем не менее, выход в 26% на этой стадии в 3 раза больше наших прежних результатов, выход, исходя из [1-|4С]глицина, - 12 %

3. Изучение топографии цитохрома Р-450 2В4 в мембране

Среди биологических катализаторов цитохром Р-450 (CYP) - универсальная гемсодержащая монооксигеназа - не имеет себе равных по множеству изоформ, индукторов, субстратов и типов катализируемых реакций Полипептидная цепь мономерного гемопротеина (44-60 кДа) содержит 45-55% неполярных а о Среди мембранных ферментов CYP изучены наиболее тщательно, но относительно их топологии в липидом бислое полной ясности ко времени нашей работы не было Мембранные CYP на N-концевом фрагменте цепи несут короткий гидрофобный участок от 12 до 21 а о Он выполняет роль якорного пептида и содержит сигнальную последовательность, ответственную за встраивание белка в мембрану За ним расположена стоп-сигнальная последовательность (а о 18-29 для CYP2B4), останавливающая встраивание пептида Были приняты минимум две модели ориентации в мембране микросомального CYP, построенные на основании расчета конформаций цепи с учетом вторичной структуры и гидрофобности, или по результатам трипсинолиза CYP2B4 в протеолипосомах, а также мечения сайт-специфическим флуоресцентным реагентом и моноклональными антителами к а о стоп-сигнального пептида Общим было то, что большая часть гемопротеина находится вне липидного бис-лоя эндоплазматического ретикулума (ЭР) субстрат-связывающий участок контактирует с липидами, а гем расположен параллельно плоскости мембраны между двумя спиральными высококонсервативными последовательностями 287-307 и 435-466, связанными с поверхностью мембраны Отличия были в организации мембраносвязанного N-концевого фрагмента в одной модели предполагался трансмембранный якорь в виде спиральной шпильки из первых ~46 а о , пронизывающей мембрану, где N-конец локализуется на цитоплазма-тической стороне ЭР (Nelson D R , 1988), а в другой - один трансмембранный пептид с выступающим в просвет ЭР N-концом (Vergeres G, 1991)

Мы сопоставили эти модели с результатами зондирования микросомального CYP2B4 (491 а о , ~49 кДа) в протеолипосомах, сформированных из яичного PC и фосфолипидов, несущих фотофоры на различном расстоянии от полярных головок (РС-зонд, 9 1) Dcp-PC-зондов 9 и 12, и короткоцепного Nap-сфингомиелина 13, синтезированного нами ранее После облучения про-

О-Р-О

I -

НО, JH

теолипосомы разрушали детергентом (SDS) и освобождали от несвязаших-

ся ковалентно липидов экстракцией органическими растворителями Де-

02N'

N3 натурированный белок растворяли в 70%-ной НСООН и обрабатывали

BrCN6 Лиофилизованную смесь пептидов растворяли в 30% НСООН в zPrOH и подвергали пред-ВЭЖХ на колонке с фазой Superose 12 в той же системе Хроматограммы приведены на Рис За-с Связывающий участок для PC 9, зондирующего неполярную область мембраны, представлен узким пиком (Рис За) В случае PC 12 и сфингомиелина 13 (Рис ЗЬ и Зс, соответственно), несущих фотофоры вблизи от поверхности мембраны, видны три разделяющихся пика На колонку наносили равные количества белка (~ 7 мг), следовательно PAL заглубленным в мембрану фотофором прошло наиболее эффективно (до 6000 имп/мин) В обоих случаях PAL у поверхности большая часть липидов (до 2000 имп/мин) связывалась с сегментом, локализованным в последовательности 273-313 (первый из трех меченых пиков на Рис ЗЬ и Зс) Два других участка связывания включали 700-1200 имп/мин Эффективность PAL для зондов 12 и 13 мало отличалась, вероятно, из-за тушения карбенов и нитренов водой, содержащейся в приповерхностной зоне мембран Далее анализировали фракции с наибольшей радиоактивностью их разделяли на колонке U1-trapore C3RSC (Рис 3d-f) Пептиды идентифицировали по последовательности 5-ти N-концевых а о Единственным пептидом, меченным зондом PC 9 оказался N-концевой фрагмент 1-46 (Рис 3d) Зонды 12 и 13 (Рис Зеи Заметили одни и те же пептиды 273-314,427-491 и 1-46 - 1-й, 2-й и 3-й пики радиоактивности, соответственно Три липидных зонда связывались лишь с тремя пептидами Следовательно, большая часть полипептидной цепи CYP2B4 экспонирована в водную среду

Анализ фрагмента 21-119 на наличие В-эпитопов с помощью метода пептидного сканирования PEPSCAN показал высокую плотность сайтов с антигенной активностью Следовательно, только фрагмент 1 -20 глубоко погружен в мембрану или даже пронизывает ее По данным компьютерного моде-

6 Дальнейшая работа проведена сотрудниками Института биомедицинской химии РАМН, Москва, в содружестве с Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, Gottmgen, Germany

10 И 12 13 14 Time mm

42 |

10 11 12 13 14 Time mln

10 11 12 13 14 Time trun

Рис 3 Хроматографическое разделение BrCN-пептидов модифицированного цитохрома Р-450 2В4. (а-с) Разделение на Superase 12 после фотоаффинного мечения зондами РС 9 (а), РС 17 (b), SM18 (с) (d-f) Разделение пептидов, связанных с зондами РС 9 (d), PC 17 (е), SM 18 (f) на колонке Ultrapore СЗ RPSC (из Eur J Biochem 1994,222,485)

лирования (Рис 4), последовательности 21-119,273-314 и 428-491 большей частью локализованы на той же стороне молекулы, что и гидрофобная N-концевая спираль Так как другие части фрагментов 273-314 и 428-491 нахо-

дятся в зонах связывания субстрата и гема, возможно, структурные изменения поверхности мембраны влияют на каталитическую активность CYP2B4.

Рис. 4, Компьютерное моделирование пространственной структуры цитохрома Р-450 2В4. (из Eur. J. Biochem. 1994, 222, 488)

Наиболее вероятные кандидаты для взаимодействия с мембраной - сайты в районе а.о. 283-292 И 471-480. Регуляция скорее всего осуществляется через первый сайт - торцевой участок к-спирали, который, попадает непосредственно к сайт локализации гема. a-Спирали предшествует [З-изгиб-Сайт снязыванин с мембраной, расположенный вблизи С-кон на, имеет неупорядоченную кон-формацию, и изменения и организации лилидного бислоя инициированные в этой области, не могут эффективно передаваться на большое расстояние. Наши результаты хорошо коррелируют с данными, полученными позже при изучении площади внедрения молекулы CYP2B4 н монослой из дишшьмито-илфосфатидилэтаноламина с помощью фосфатидплэтаноламинош.гх / РС монослоев Лэнгмюра-Блоджета (Sligar S.G., 199S), и с результатами определения сайта, формирующего канал доступа субстрата в мембране, полученными для другого CYP - простагландин-Ь-сишгазы (Wu J,, 2003) - при изучении в заим о-действия синтетических пептидов с мицеллами из додсцил-РС с помощью двумерного 'hl-ЯМР.

4. Иодирование дназоциклолентадиен-4-илкарбонильиоЙ группы

Для увеличения чувствительности PAL требуется применение высоко-

активных изотопов. Но такой зонд должен быть использован сразу после приготовления. Выход из этого затруднения — синтез холодного зонда, который может сохраняться долго и в который изотоп можно ввести прямо перед опытом. Введение радиометки в остаток фотофора облегчает анализ продуктов сшивки. Наиболее подходящим изотопом можно считать 1251, который вводится ü ароматическое ядро, активированное электронодонорным заместителем.

путем окислительного иодирования В реакцию при этом вступает иод-катион 1+, образующийся при окислении иодида подходящим агентом (гипохлорит, хлораминТ(GreenwoodFC, 1963), Н202 + лактопероксидаза(Bayse GS, 1971), надуксусная кислота {MoerleinSM, 1988)) Разработаны методы функ-ционализации ряда фотофоров, в том числе бензофенонового {Prestwich G D, 1994) и Tfd {Brunner J, 1995), позволяющие вводить в них 1251, однако эти модификации значительно усложняют синтез меток и зондов Поэтому для PAL чаще применяют производные доступных арилазидов, легко подвергающихся радиоиодированию, хотя они существенно уступают карбен-генерирующим фотофорам Прямое иодирование Tfd-алкоксипроизводных {Hashimoto М, 2006) с использованием комбинации 12 и (CF3COO)2IPh в CH3CN сложно адаптировать к условиям радиоиодирования зондов (микромоли), когда источником 1251 является коммерческий препарата Na,25I (2000 Ки/ммояь, 0 5 нмоль)

Мы обнаружили, что Dcp-метка может быть легко иодирована в условиях окислительного процесса, причем в реакцию одинаково легко вступает как сама кислота DcpOH 1, так и ее производные Способность диазоциклопента-диена вступать в реакции электрофильного замещения известна {CramDJ, 1963), однако прямое галогенирование еще не было описано Мы исследовали продукт(ы) иодирования субстрата-зонда минимального размера DcpOMe 2 (Схема 6, избытки реагентов увеличивают выходы продуктов иодирования)

Разделением ВЭЖХ были получены индивидуальные продукты 4-моно- (14), 5-моно- (15) и 4,5-дииодпроизводные (16) (Схема 6, 'Н-ЯМР и MS см Табл 2) При иодировании меняется УФ-спектр А,макс эфира 2 314 нм смещается для продуктов 14,15 и 16 - Хмахс 322,316 и 328 нм, соответственно7 Кислота 1 и Dcp-аминопроизводные образуют смеси моно- и дииодпродуктов вне зависимости от соотношения Nal-субстрат в интервале 0 5-10 (мол )

14 R1 = I, R2 = Н (76%)

15 R5 = Н, R2 = i (20%)

16 R1 = R2 = | (4%)

Схема 6 a) Nal (10 экв), хлорамин Т (12 экв ), МеОН

7 Молярные коэффициенты экстинкции едля эфиров 2,14-16 определить сложно из-за их летучести, значения должны быть близки найденным для метил-11-(Оср-окси)ундеканоата (Я-макс 314 нм, е 15000, ЕЮН) и смеси продуктов его иодирования (^Макс 326 нм, е 16700)

Таблица 2 1Н-ЯМР (500 МГц, ОА2,25°С, 51м. д, //Гц) и МБ (электронный удар, 70 эВ) характеристики соединений 2,14,15 и 16

Н-3 Н-4 Н-5 СН3 т/г (%)

2 6 62 5 91 6 79 3 69 149 (100, М+-Н), 121 (40, М+-Н-К2),

дд(1Н) дд(1Н) дд(1Н) с(ЗН) С7Н6^02 (М+) соотв 150 0469

4=3 15 /4,5=4 64 /5,3=1 95

/3,5=1 95 /4>3=3 15 /5,4=4 64

14 6 66 — 6 91 3 70 276 (90, М+), 233 (100, М+-1М2-Ме),

Д(1Н) Д(1Н) с(ЗН) С7Н5Ы2Ю2 (М+) соотв 275 9367

5=2 20 /5,3=2 20

15 651 6 17 — 3 70 276 (85, М+), 233 (100, М+-Ы2-Ме),

Д(1Н) Д(1Н) с(ЗН) СуНзЫгЮг (М+) см выше

Уз 4=3 42 У4,3=3 42

16 6 70 — — 3 70 402 (62, М+), 359 (90, М+-1\т2-Ме);

с(1Н) с(ЗН) С7Н4М21202 (М+) соотв 401 8333

Важный вопрос - сохранение фотофором своих свойств после иодирования, так как тяжелые атомы облегчают интеркомбинационную конверсию возбужденного синглетного состояния в триплетное, реакции которого могут приводить к простому отрыву протона (7и?го/V/, 1978) Существен и вопрос об устойчивости СГсвязи Фотолиз смеси соединений 14-16 в СбН^ сопровождался изменениями УФ-спектра (Рис 5) Индивидуальные эфиры 14,15 и 16 подвергали фотолизу в СбН12 3 мин и анализировали реакционные смеси, как описано для эфира 2 Кроме небольшого количества смолы (ТСХ), образовались неполярные продукты пришивки карбена к циклогексану (МБ) Характерный спектр 'Н-ЯМР представлен на Рис 6 Мы предложили для фотореак-

324 нм

О мин

0 5 мин

1 0 мин

2 0 мин

200

260

320 380

к! нм

Рис 5 Фотолиз иодированного БсрОМе (14+15+16) в цикло-гексане (6 мМ), А,>320 нм (светофильтр - насыщенный щ Си804).

18а

rvA^

A J

I 18b 18b

17b

17b 17b

JJLJ

18a, 18b, 17b

18b

WW1''

|ЦШ|1|||Ц)|1|||Ц|1|)||||||ЦИ||)Ш||НЦ|И |Ч|||1И|И|ЦИ|1]Ш||1Щ|И»|И||)))||||1И| |ш||т|щ||щ||нщш||ипцт|ип|ил| ццшцщщ м|||ш||||фш[111||шфш|ш|||ш|н|111 ¡|и|;шц||||[|||||)и|||||||

7 00 6 92 6 84 6 68 6 60 6 52 6 18 6 10 6.02 5 10 5 06 3 74 3 66 3 S8 3 28 5 (ррш)

Рис 6 Спектры 'Н-ЯМР (C6Di2) 5-иодо-РсрОМе 15 до (верхний) и после (нижний) исчерпывающего фотолиза в циклогексане, анализ методом двойного резонанса

ции Схему 7 Механизм изомерных превращений, приводящих к образованию соединений 17-19, пока не выяснен. Отметим главное - отсутствие сигналов эфиров За (36) (Рис 2), иодфторфенилазиды при фотолизе образуют > 8% деиодированного продукта СН-внедрения (Keana JF W, 1992) Вероятно, по аналогии с иодфенилдиазиринами (Brunner J, 1995), отсутствие заметных по- Ъ-.'

¿^СООМе + 18а

17а

- 1 0 05 04

"СООМе

176

СООМе

176

18а

186

-1 0 04 03

<г\

СООМе

Схема 7 a)hv,X> 320 нм, 3 мин, циклогексан

терь иода обусловлено более длинноволновой областью поглощения иодированного Dcp-хромофора, по сравнению с фенилазидами, что ускоряет фотоактивацию в условиях PAL

При сравнение интегральных интенсивностей сигналов в спектрах 'Н-ЯМР эфиров 14-16 до и после фотолиза в CgH¡2 (6 мМ) найдены выходы продуктов (17аб, 18а), (18аб, 176) и 19 — 30, 30 и 26 %, соответственно Эффективность внедрения в неактивированную СН-связь иодированной Dcp-метки немного ниже, чем неиодированной (ср 42%),8 но достаточно высока, чтобы предположить, что при фотолизе фотофор реагирует как синглетный карбен

При анализе результатов PAL наличие 1251-Оср-метки в виде смеси moho- и дииодпроизводных можно не учитывать Для увеличения включения нуклида 1251 в субстрат коммерческий препарат Na125I (без носителя, 1 мКи ~ 0 5 нмоль) используют без разбавления холодным Г, и иодированной оказывается ничтожная доля зонда Мечение 1251 необходимо при разделении продуктов ограниченного протеолиза методами электрофореза и ВЭЖХ При дальнейшем анализе меченого пептида с помощью MS сигналы молекул, связавшихся с иодированным Бср-фотофором, зарегистрировать невозможно

5. Синтез фосфатидилхолинового и ганглиозидных зондов

Мы синтезировали Dcp-меченые аналоги липидов, предназначенные для последующего радиоиодирования ддинноцепной фосфатидилхолин 23 (Схема 8) и ганглиозиды 27 и 28, несущие фотофор на различном расстоянии от углеводной части молекулы (Схема 9) Ганглиозиды - гликосфинголипиды, несущие один или несколько остатков сиаловой кислоты - обязательные компоненты плазматических мембран эукариот, они играют важную роль в процессах межклеточного узнавания, модулируют клеточный рост и дифференциацию, выполняют функцию рецепторов, участвуют в переносе информации и в процессах апоптоза (Hakomori S -1, 1990, Spiegel S, 2003) Определяющая роль здесь принадлежит углеводной части молекулы, но конформационные изменения затрагивают и рецепторы, находящиеся вблизи церамидной части ганглиозида внутри клеточной мембраны Важно, что введение метки в цера-мидную часть молекулы не нарушает структуру олигосахаридной детерми-

8 Ср для метил-4-азидо-2-иодо-3,5,6-трифторбензоата - 12% (препаративная ТСХ) (Кеапа JF W, 1992), для 2-иодо-4-[3-(трифторметил)-3#-диазирин-3-ил]бензилацетата - 48% (ГЖХ/MS) (Brunner J, 1995) при исходных концентрациях 2 мМ в циклогексане

нанты, и зонд сохраняет специфичность исходного ганглиозида

Наличие лабильной связи между фотофором и остальной частью молекулы зонда существенно облегчает анализ продуктов PAL Поскольку чаще всего изучаются липид-белковые взаимодействия, подходящей является сложноэфирная связь, лабильная, в отличие от пептидной, в условиях щелоч ного гидролиза Мы разработали синтез жирной кислоты с Dcp-оксигруппой при со-углероде 22, являющейся синтоном при получении липидных зондов, предназначенных для изучения центральной части мембран Длина ацильной цепи с меткой соответствует длине пальмитоильного остатка, присутствующего в природных фосфо- и гликосфинголипидах 11-Гидроксиундекановую кислоту получали из доступной 11-аминоундекановой реакцией дезаминиро-вания под действием HN02 (выход 38 %) Попытки получить эфир 21 путем

Схема 8 а) HN02/H20,100°, 6) MeOH-HCl, в) Tf20/Py, -10°С, г) DcpOH/TEA, ацетон, д) КОН, zPr0H-H20,22°С, е) HCl, ж) лизо-РС, DCC/4PyNH2

ацилирования ю-ОН метил-11-гидроксиундеканоата хлорангидридом DcpCl 7 или конденсацией с DcpOH + DCC (Схема 8) успеха не имели Для создания сложноэфирной связи мы активировали спиртовую компоненту получили трифлат 20 (выход 86% без очистки) и ввели в реакцию с DcpOH с небольшим

избытком ТЕА, выход эфира 21 50 % (МБ, 'Н-ЯМР) Омыление эфира 21 вели до появления следов БсрОН (20 ч) скорость щелочного гидролиза эфира псевдоароматической Бср-кислоты 1, гораздо ниже, чем эфира алифатической кислоты Двукратной хроматографией на силикагеле и обращенной фазе выделяли кислоту 22 (выход 40%), конденсировали ее с 1 экв лизо-РС в присутствии ВСС и 4РуТ\Щ2 (5 экв) и получали зонд 23 с умеренным выходом 44% ('Н-ЯМР, МБ высокого разрешения)

Ганглиозидные зонды 27 и 28 (Схема 9) получали ацилированием лизо-ганглиозида ОМ1 (лизо-ОМ1 - дезацилированный по сфингоидной №12-груп-пе ганглиозид вМ1) и-нитрофениловыми (Ир) эфирами в БМБО в присутствии ТЕА Обычно для этой реакции применяют 1\т-гидроксисукцинимидные, пентафторфенильные и др эфиры, как правило, в ОМР (Зоптпо 5, 2004) Мы нашли, что Нр-эфиры жирных кислот в ОМБО реагируют с лизо-ОМ1 количественно Кислоту 22 превращали в Кр-эфир 24 обработкой к-нитрофенилтри-фторацетатом и на силикагеле выделяли эфир 22 (выход 50%), который с небольшим избытком (1 2 экв ) вводили в реакцию с лизо-ОМ1 После полной конверсии лизо-ОМ1 (12-16 ч) зонд 27 выделяли гель-фильтрацией, выход 98% (1 мкмоль, определяли по УФ-поглощению Бср-метки)

СООЫр

соон —-

СООЫр

он

но

но— нисоснз 28 т = 1 п ~3 (~40%)

Схема 9 а) СР3СООМр/Ру, б) лизо-ОМ1/ТЕА, в) НОМр, ОСС, г) БсрОН/ТЕА

Зонд 28, несущий метку вблизи от полярной головки ганглиозида, получали немного иначе Синтезировать Ир-эфир иодуксусной кислоты 25 аналогично эфиру 24 с использованием и-нитрофенилтрифторацетата не удалось, так как реагент мало отличается по хроматографическим свойствам от целевого продукта Эфир 25 получали конденсацией 1СН2СООН с «-нитрофенолом в присутствии БСС Вещество ранее не описано ('Н-ЯМР, элементный анализ, т пл ) Эфир 25 вводили в реакцию с ОсрОН в сухом ацетоне в присутствии ТЕА и хроматографией на силикагеле выделяли продукт 26 (выход 84%). Ко-роткоцепной зонд 28 получали из лизо-ОМ1 аналогично зонду 27 Несколько меньший выход (88 %) связан, очевидно, со стерическими затруднениями при ацилировании ИНг-группы сфингозинового основания Структуры зондов 27 и 28 подтверждены спектрами 'Н-ЯМР и МБ высокого разрешения Высокие выходы мы объясняем преимуществами использования БМБО в качестве растворителя для реакции лизоганглиозида с Ыр-эфирами 22 и 26, а также применением для очистки микромольных количеств целевого продукта гель-фильтрации вместо адсорбционной или обращенно-фазовой хроматографии

Для точного определения высокоаффинных сайтов связывания при изучении лиганд-рецепторных взаимодействий желательно расположить фотофор в олигосахаридной части ганглиозида, не нарушая его сродство к изучаемому рецептору Мы получили ОМ1-зонд 30, несущий компактную Оср-группу вместо ацетильной при N-5 остатка нейраминовой кислоты9 (Схема 10) В качестве исходного синтона рационально использовать дезацетил-СМ1, который присутствует как промежуточный продукт в ходе модификаций вМ1 с целью получения из него различных производных по церамидному остатку 10

Ыр-эфир БсрОН 29 (получен впервые, выход 64%, 'Н-ЯМР) в реакцию с дезацетил-СМ1 вводили сначала с небольшим избытком (1 33 экв ) Попытки провести эту реакцию аналогично ацилированию лизо-ОМ1 при получении зондов 27 и 28, не имели успеха Очевидно, МН2-группа дезацетилированной сиаловой кислоты, соединенной с остатком галактозы, находящимся внутри пентасахаридной головной группы, стерически экранирована Важную роль здесь могут играть водородные связи Реакцию вели в среде тщательно перегнанного сухого БМБ в присутствии ТЕА при 50°С в течение 90 ч, дважды

9 Сиаловые кислоты - 1Ч-5-ацильные производные нейраминовой кислоты

10 Лизоганглиозид вМ1 и дезацетил-СМ1 любезно предоставлены к х н ИИ Михалевым (лаборатория химии липидов ИБХ РАН)

прибавляя дополнительные количества эфира 29 (1 33 и 0 3 экв) до полной конверсии дезацетил-ОМ1 Гель-фильтрацией и хроматографией на обращенной фазе выделяли зонд 30 (выход 23% по УФ-поглощению Бср-метки) Невысокий выход может объясняться недостаточной чувствительностью детектирования конверсии исходного дезацетил-ОМ1 в условиях работы с субмик-

ромольными количествами Структура зонда подтверждена MS ESI (молекулярный ион m/z 1622 2) Очевидно, при использовании зонда 30 для структурно-биологических исследований необходимо в каждом случае проводить контроль сохранения аффинности этого аналога GM1 к изучаемому рецептору

6. Фотоаффинное зондирование белков мембраны вируса гриппа

Для проверки способности 1251-меченого Dcp-фотофора в составе PC 23

зондировать интегральные белки мы выбрали хорошо изученную биологиче-

скую систему - вирион гриппа (Wilson JA , 1981) Оболочка вирусной части-

цы образована липидным бислоем и двумя гликопротеинами - гемагглютини-

ном (НА) и нейраминидазой (NA), собранными в шипы, выступающие на поверхности. Мономер НА состоит из двух субъединиц, связанных SS-связью: малой субъединицы НАз, проникающей глубоко в не полярную область ли-пилного бислоя, и большой полярной субъединицы НА;. Внутренняя поверхность вирусной мембраны выстлана матриксным белком (МО, который контактирует с нуклеокапсидным белком (NP). Был использован хорошо изученный штамм вируса гриппа типа А - вирус классической чумы птиц (FPV).

Применив в качестве окислителя надуксусную кислоту, аналогично радиойодированию Tfd-производного (BrunnerJ., 1995). мы получили ' меченый РС-зонд 23 с высокой удельной радиоактивностью (-500 Ки/ ммоль; выход 90% из исходного Na;bI). Ятя сравнения, с помощью хлорамина Т высокое включение ,i5í (48% для зонда 23) достигалось лишь при соотношении Nal - хлорамин Т - Оср-субстрат, ~ 1:10:100, подобно мечению тирозина (Farah К., 1998). Мы не отделяли ш1-зопд от исходного РС 23, так какВЭЖХ (нрепаративная ТСХ в данном случае неэффективна) субыаномольных количеств Dep-субстрата усложнила бы всю процедуру и привела к потерям зонда.

Рис. 5. Фотоаффинное мечепие белков вируса гриппа (FPV) ('25[)РС-зондом 23. Суспензию вируса (0.1 мг белка) инкубировали с зондом (0.16 имоль, 80 мкКи) 3 ч при 37°С, затем подвергали облучению 5 мин при Л > 320 нм. После делипиди-зирования смесью СНСЬ-МеОН. 1:3, материал разделяли в 12.5% SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. Гель окрашивали кумасси голубым (левая полоса), затем проводили авторадиографшо (правая полоса) в течение 24 ч при —70"С, Справа указаны массы белков-стандартов (кДа).

uil-PC 23 встраивали в наружный монослой мембраны вириона11 инкубацией мицеллярного раствора в вирусной суспензии (зонд - вирусный PC ~ V. 100, мольв,), как описано (Молотковский Юл.Г., 1984). Поеле фотолиза не-связавшиеся лип иды удаляли экстракцией органическими растворителями, а остаток анализировали SDS-PAGE в стандартной системе (Laemmli U.K.. 1970), где поведение белков FPV хорошо изучено. Представленные на Рис. 5

11 Образцы к пруса очищены и любезно предоставлены к.х.н. Л. В. Мочаповой (ИБХ ГА11).

электрофореграмма и авторадиограмма показывают, что единственным меченным белком оказалась субъединица НА2 Такая картина PAL полностью согласуется с общепринятой моделью организации вирусной оболочки

Таким образом, Dcp-фотофор является эффективной карбен-генерирую-щей меткой и одновременно может служить носителем высокоактивного радиоизотопа U5I, который легко ввести в фотоаффинный зонд непосредственно перед его использованием для структурных исследований

7. Взаимодействие различных субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах

Явление сброса (шеддинга) ганглиозидов опухолевыми клетками описано давно, и его биологическая роль изучена (Hakomori S, 1996) циркулируя в кровотоке, ганглиозиды ингибируют некоторые иммунные ответы и стимулируют развитие опухолей, защищая их от разрушения иммунокомпетентными клетками Однако механизмы осуществления шеддинга и иммуносупрессии изучены недостаточно Ганглиозиды являются мощными ингибиторами цито-кин-опосредованной пролиферации мышиных и человеческих Т-клеток Причем ингибирование, например, GM1 осуществляется по смешанному типу (конкурентному и неконкурентному), что предполагает помимо прямого взаимодействия с цитокинами и другие типы ингибирукмцего влияния на пролиферацию Т-клеток Экзогенные ганглиозиды, встраиваясь в плазматическую мембрану клеток IL-2-зависимой лимфоидной линии (CTLL-2, активированные Т-лимфоциты), способны интенсивно маскировать а-, 3- и у-субъединицы рецепторов интерлейкинов 2 (IL-2R) и -4 (IL-4R) от последующего связывания с антителами к соответствующим субъединицам рецеторов(Молотковская ИМ, 1996). Особенно ярко эффект проявляется при инкубации клеток с ганглиозидом GM1 Однако на основании наблюдаемого феномена нельзя сделать вывод о локализации ганглиозидов в ближайшем липидном окружении изучаемых рецепторов, поскольку нельзя строго показать отсутствие их интерна-лизации или шед динга Для проверки предположения о непосредственном взаимодействии ганглиозида с субъединицами IL-2R и IL-4R мы применили (1251)Бср-аналоги GM1 27 и 28, зондирующие мембрану на различной глубине

Мицеллы из смеси зондов с ганглиозидом GM1 (1 100) инкубировали 40 мин с клетками, подвергали облучению и проводили электрофорез отдельных субъединиц IL-2R и IL-4R, полученных иммунопреципитацией с соответству-

ющими антителами Для короткоцепного зонда 28 была также проведена регистрация результатов PAL компонентов всей фракции плазматических мембран, выделенной из клеток после мечения 12 На авторадиограмме (Рис. 6) определяется полоса белка с массой ~ 75 к Да, соответствующая Р-субъединице IL-2R (Рис 66, 3) Эта полоса обнаруживается электрофорезом иммунопреци-питата с антителами к р-субъединице IL-2R после проведения PAL зондом 27 В то же время, иммунопреципитаты, полученные после PAL короткоцепным зондом 28 не выявили на авторадиограмме полосы ни для одного из использованных антител (данные не приведены) Иммунопреципитация проводится антителами, специфичными к определенному эпитопу белковой молекулы Зонд 28 мог непосредственно сшиться либо с эпитопом, либо ковалентно связавшийся ганглиозид мог его маскировать, делая невозможным извлечение продуктов PAL иммунопреципитацией Поэтому был проанализирован весь пул белков плазматических мембран после PAL ,25I-GM1 -зондом 28 и на авторадиограмме удалось зарегистрировать полосу, соответствующую по массе р-субъединице IL-2R (Рис 76,2) Карбен, образуемый зондом 28, гораздо более доступен для тушения водой из-за малой глубины погружения в бислой, что может быть причиной его слабой по сравнению с зондом 27 сшивки с IL-2RP (Рис 66, 3) Это обусловливает и появление прореагировавших с водой мономеров, которые вместе с липидными димерами образуют на авторадиограммах яркую полосу в области соединений с низкими массами в образце липидного экстракта плазматических мембран (Рис 16, 4) В образце делипидизирован-ных мембран (Рис 76, 3) сшивка зонда 28 с IL-2Rp не детектируется, вероятно, из-за частичной потери модифицированного ганглиозидом белка в органический экстракт и выхода за пределы чувствительности

В настоящее время широко обсуждается проблема сборки IL-2R, имеются разные данные относительно локализации а- и р-субъединиц рецептора до и после получения клетками сигнала от лиганда (IL-2) Наши результаты свидетельствуют о том, что в клетках линии CTLL-2, не активированных IL-2, ганглиозид GM1 локализуется в ближайшем липидном окружении р-субъеди-ницы IL-2R Кроме того, получены косвенные доказательства сшивки короткоцепного зонда 28 с пептидом IL-2Rp, расположенным на С-конце субъеди-

12 Работа проведена И В Холоденко в лаборатории межклеточных взаимодействий ИБХ РАН под руководством к б н ИМ Молотковской (Дисс на соискание уч ст к б н, 2006)

Рис. 6. 10%SDS-PAGE белков активированных Т-лимфоцитов после PAL клеток '"l-G Ml-зондом 27 и имму но преципитации (а) и результаты а вто радио граф и и (2 мес) (б)\ I - стандарты Sigma; 2 - белки клеток после фотомече! 1ия и последующей иммунопрецииитации антителами к и-субъсдинице IL-2R; 3 — то же. но с антителами к р-субъединкце; 4 то же, но с антителами к у-субъедн-нице; 5 - то же. но с антителами к ÍL-4R. Окрашивание серебряным реагентом; 60 мкг белка'дорожка.

Рис. 7. 10% SDS-PAGE белков мембран активированных Т-лимфоцитов после фотомечения li5I-GMl~ зондом 28 (я) и результаты авторадиографии (2 мес) (6): 1 - стандарты Sigma; 2 - белки плазматических мембран после PAL; 3 - то же, но с последующим делипидизированием СНСЬ-МеОН (1:3); 4 - органический экстракт.

ницы. Таким образом, применение зондов с фотофорами, расположенными в соположении жирно кислотных остатков различной длины, позволяет определить места взаимодействия с рецептором со значительной точностью.

8. Определение фрагментов молекулы 1L-4, участвующих во взаимодей-

ствии с гаиглнозидом GM1

Молекулярные механизмы иммуносупрессии ганглиозидами связывают,

я том числе, с их прямым взаимодействием с IL-2 и IL-4; гаигднозиды перехватывают шггокнны, необходимые для активации Т-лимфоцитов, усугубляя нммуносупрессию, развивающуюся при опухолевой патологии. В данной ра-

боте мы применили GM 1-зонд 30, несущий метку в олигосахаридной части молекулы, для идентификации сайта(ов) связывания 1L-4, В перспективе по-

I 1 3 4 5

13 4 3

150 IN íj|

100 : ; 1 1

75 * ■■** 5

so 1 #

37 £ f i

25 mm,

t 2 3 4

2 3 4

лученная информация может быть полезной для создания новых препаратов, способных эффективно перехватывать циркулирующие в крови свободные ганглиозиды, но лишенных недостатков молекул рекомбинантного интерлей-кина Ранее с помощью зонда GDlb, несущего арилазидный фотофор в глицериновом остатке концевой сиаловой кислоты, был установлен сайт связывания ганглиозидов в молекуле токсина столбняка (Shapiro R Е, 1997)

Изучение влияния замены ацетила нейраминовой кислоты в молекуле GM1 Dcp-группой на сродство к IL-4 с помощью кинетического анализа в функциональных тестах с Т-лимфоцитами потребовало бы существенных количеств зонда В качестве модельных исследований мы проверили, образует ли GM1 30 в условиях PAL продукт сшивки с В-субъединицей холерного токсина (СТВ), который можно зарегистрировать с помощью MALDI-MS13 GM1 - высокоаффинный рецептор СТВ, причем во взаимодействии участвует сиа-лильный остаток (Sia) После PAL (СТВ/зонд 30, 2 1, мольн ) в масс-спектре наряду с молекулярным (m/z 11622 4) и двухзарядным (m/z 5812 3) пиками исходной субъединицы было отмечено появление пиков одно- (m/z 11724 8, 11775 3, 11965 9, 12002 9) и двухзарядных ионов (m/z 5862 3, 5888 6, 5930 7, 5984 9) производных СТВ, несущих фрагменты зонда Фрагментация ближе всего соответствует отщеплению модифицированной Sia-группы по глико-зидной связи, что чаще всего и происходит с молекулой GM1 в условиях MS MALDI Полученные данные косвенно свидетельствуют о возможности применения аналога GM1 30 для изучения взаимодействия ганглиозида с IL-4

Прежде чем приступить к PAL молекулы человеческого rIL-4, был проведен полный MS-анализ белка и его фрагментов после протеолиза эндопро-теиназой Glu-C Применение данного фермента позволило получить важные для нашего исследования регистрируемые фрагменты петлевых участков

Смесь rIL-4 и 125I-GM1-зонда 30 в PBS (10 нмоль/10 нмоль/0 5 мл) инкубировали 1 ч при 37°С, фотолизовали, высаживали белок ультрацентрифугированием и подвергали протеолизу эндопротеиназой Glu-C Полученные фрагменты разделяли с помощью ВЭЖХ, отбирали фракции характеризующиеся высоким поглощением амидной связи и радиоактивностью (до 20000 имп/мин) одновременно, и подвергали их MS-MALDI-анализу

13 Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории межклеточных взаимодействий отдела иммунологии (см сноску 1!) и группы масс-спектрометрии ИБХ РАН под руководством д ф -м н В А Олейникова

В результате пришивки Вср-зонд образует производное, содержащее циклопентадиенкарбонильный остаток («ср») В условиях МБ МА1ЛЭ1 молекула Оср-ОМ1 реагирует с матрицей и расщепляется по амидной связи («ср»-остаток Бга) или по гликозидной связи 8т2-ЗОа1 Расчеты ожидаемого увеличения масс пептидов приведены в Табл 3 С учетом данных МБ МА1ЛЭ1 про-

Таблица 3 Массы фрагментов ОМ 1-зонда 30, ожидаемых в составе комплексов пептид - фрагмент зонда (фрагментация в процессе М8 МА1ЛЭ1)

теолитических фрагментов rIL-4, были рассчитаны массы ожидаемых пиков меченых пептидов Отсутствие в MS фрагментов, содержащих церамидную часть подтверждается отсутствием парных пиков, отличающихся на 28 Да (зонд 30 содержит две формы сфингозинового основания, отличающие длиной на два метилена, Схема 10) Был выявлен ряд меченых пептидов (в том числе, приведенные в Табл 4) 1-8 (KCDITLQE), 122128 (KYSKCSS), 19-25 (QKTLCTE), 41-42 (КЕ), 103-109 (ANQSTLE) и 110113 (NFLE) По данным РСА (Muller Т, 1995), эти фрагменты IL-4 содержат а о , экспонированные в раствор, и находятся в неупорядоченных петлевых участках цепи (за исключением фрагмента 41-42, образующего начало а-спирали, и 103-109- содержащего короткую ß-структуру 106-108)

Анализ локализации фрагментов 19-25 и 103-113 на модели пространственной структуры молекулы rIL-4 показал, что они располагаются на двух

Таблица 4 Сравнение расчетных и экспериментальных масс сшивок пептидный фрагмент 1Ь-4 -фрагмент зонда СМ1 30

антипараллельных петлях, сближенных в пространстве Очевидно, эти фрагменты образуют составной сайт-ловушку для взаимодействия с олигосахаридной

Фрагмент Масса, Да

«ср» + Н+ 92

«ср» + Na+ 114

«ср» + К+ 130

Sia + Н+ 341

Sia + Na+ 363

Sia + К4 379

Sia-0 + Н+ 357

Sia-0 + Na+ 379

Sia-0 + K+ 395

Расчет, MS, m/z, Отнесение

Да Да

913 41 - (19-25) + («ср» + Н4)

935 39 937 17 + («ср» + Na+)

951 37 953 24 + («ср» + К4)

853 38 854 93 (103-109) + («ср» + Н4)

875 36 876 87 + («ср» + Na4)

891 34 892 86 + («ср» + К+)

862 27 - (110-113) + (Sia + Н4)

884 25 887 17 + (Sia + Na4)

901 23 903 27 + (Sia + К4)

878 27 881 06 + (Sia-0 + Н4)

900 25 903 27 + (Sia-O + Na4)

916 23 919 28 + (Sia-0 + К4)

частью молекулы ганглиозида Участки 1-8 и 122-128 - N- и С-концевые, то есть наиболее доступные для неспецифического взаимодействия, а фрагмент 41-42 находится в начале a-спирали, которая формирует жесткий каркас, малодоступный для связывания

9. Идентификация субъединиц Fo-сектора митохондриальной Н^-АТР-азы, контактирующих с липидами мембраны

Синтез и гидролиз АТР, сопряженные с транслокацией протонов через мембрану по градиенту электрохимического потенциала (Ацн+)) осуществляется ферментом FiFo-ATP-азой (Н^-АТР-аза F-типа) Несмотря на некоторые отличия в субъединичном составе и каталитических характеристиках, F]F0-АТР-азы митохондрий, бактерий и хлоропластов близки по строению и механизму действия Структурно и функционально их подразделяют на интегрированный в мембрану Fo-сектор, осуществляющий перенос протонов, и периферический каталитический F]-сектор, несущий центры синтеза и гидролиза АТР Пространственная структура фермента напоминает гриб F]-комплекс составляет сферическую глобулу «шляпки», от нее отходит «ножка», состоящая из субъединиц Fr и Fo-комплекса Фермент митохондрий (КФ 3 61 34) содержит более 15 типов субъединиц, Fi-ATP-аза хорошо изучена (PCА, Abrahams JP, 1994) Строение сектора Fo менее изучено Считается, что в митохондриях млекопитающих он состоит минимум из 10 субъединиц (a, b, с, d, e,f, g, F6, A6L и OSCP), стехиометрия и топография которых полностью не ясны В наиболее популярной ко времени нашей работы модели субъединицы ашЬ расположены снаружи кольца с^-олигомера (Engelbrecht S, 1997)

Для идентификации субъединиц сектора F0, контактирующих с липидами внутренней мембраны митохондрий, мы применили [14С]РС-зонд 9 и (1251)РС-зонд 23 в модельной системе - протеолипосомах из смесей димири-стоил-РС - дипальмитоил-РС -зонд, 1 0 8-1 0 2-0 0025, и FiFo-комплекса митохондрий сердца быка (белок-липид, 1 4 по массе)14 Протеолипосомы получали методом диализа смеси компонентов с дезоксихолатом, реконструированный фермент сохранял активность Однозначные результаты при анализе продуктов PAL методом SDS-PAGE не были получены, не удалось иденти-

14 Работы проведены Л Г Зайцевой в ИБХ РАН и на кафедре биоорганической химии биологического факультета МГУ им М В Ломоносова под руководством к х н Т В Овчинниковой и кхн В А Гринкевича (Дисс на соисканиеуч ст кхн, 2000)

фицировать субъединицы, которые при делипидизировании протеолипосом экстрагировались вместе с липидами Поэтому мы применили MS MALDI -метод, который до нас не использовался для анализа состава полисубъеди-ничных мембранных белковых комплексов и липид-белковых аддуктов15.

В спектре FiFo-ATP-азы, как стандарта (Рис Ы), почти все субъединицы присутствуют в виде молекулярных ионов пики с m/z 5662, 7975, 8233, 8972,9328, 10267,11344,15129,18626,20947,24765, 30194, 33155, 51622, 55203 с учетом точности метода (0 5 % для М10-56 кДа) можно соотнести с молекулярными ионами субъединиц s (М5651 Да), A6L (7964), е (8189), F6 (8958), AI (9582),/ (10209), g (11328), 5 (15065), d (18603), OSCP (20967), a/b, у (30141), T (32836), ß (51595), а (55161), соответственно Кроме того, некоторые субъединицы в условиях получения данного MS образуют двухзарядные

•[C+KJ*

пик m/z| Соотнесение с субъединицами АТР-азы

1 7629 ic + Naf

2 8297 модифицированная с-оубъединица

3 13348 модифицированная а-субъединица

Рис 8 МБ МАЦ)1 белкового осадка модифицированной в протеолипосомах II типа Н^-АТРазы митохондрий сердца быка (Б) и стандарта (А) 8* - субъединица 5 с «растрепанным» М-концевым участком,Т - АШУАТР-транслокатор

(m/z 27685,25851,12380 и 3834 - a-, ß-, a-/b- и с-субъединицы) и трехзаряд-ный (т/г 17253, ß-субъединица) ионы Разрешающая способность прибора (Vision 2000, Thermo BioAnalysis, США) не позволила зафиксировать субъе-

15 Работа проведена сотрудниками группы масс-спектрометрии ИБХ РАН Н Б Поляковым и М И Титовым под руководством д х н С Е Есипова

диницы а (М 24815 Да с учетом N-концевого формилирования) и b (М24668 Да) раздельно они дают усредненный пик с m/z 24765 Субъединица с дает кластерный ион [М + К]+ {m/z 7649) Причем она никогда не наблюдалась без катионов (К+, Na+), что подтверждается и в других работах {Griffiths D, 1996) Протеолипосомы I типа получали на основе димиристоил-РС - пальми-тоил/олеоил-РС, 1 1, II тип содержал также нерадиоактивный аналог РС-зонда 9 (10% от PC) Важно, что в MS зонда есть пики молекулярных ионов с m/z 812 5 (Z1, 72%, см схему 3, п=1) и m/z 841 (Z2,28%, п=3) Оба типа протео-липосом облучали и делипидизировали смесью СНС13-МеОН, 1 2 Собирали отдельно белковый осадок, водную и органическую фазы, их лиофилизовали и растворяли в 75% НСООН, затем обессоливали гель-хроматографией и анализировали MS MALDI

В MS белкового осадка протеолипосом I типа присутствовали пики молекулярных ионов субъединиц s,/, g, 5, d, OSCP, у, (3, a, alb и кластерных ионов [М+ К]+ - с и/ Пик с m/z -12400 может быть наложением пиков [а]2+ и [6]2+ Сравнение спектров стандарта и белкового осадка показало значительное уменьшение содержания субъединиц с и F6 Спектр водной фракции содержал, в основном, фактор F6 В MS органического экстракта (Рис 9А) были найдены пики, соответствующие [а]+, [я]2+, [с + К]+и [с + 2К]2+ (m/z 24825, 12416, 7650 и 3838) Пик с m/z 15353, вероятно, относится к 8-субъединице

Анализировали продукты фотомечения J-Г-АТРазы в протеолипосомах II типа В MS белкового осадка (Рис 8Б) присутствует полный набор пиков, характерных для этой фракции немодифицированного фермента Появились и новые пики, отсутствующие в стандарте (Рис 8А) Пик 2 с m/z 8297 можно объяснить присоединением зонда к субъединице с {m/z 7608), хотя приращение массы составляет -690 Да, а не ожидаемые 785 (Z1-28) или 813 (Z2-28) Очевидно, в растворе 75% НСООН, где готовят образцы для MS MALDI, фос-фоэфирная связь гидролизуется и ковалентно связанный PC теряет остаток фосфохолина (166 Да), превращаясь в диглицерид Тогда приращение массы для зонда Z1 - 620, а для Z2 - 648 Да, что с учетом ошибки измерения и детектирования с-субъединицы только в виде кластерных ионов, хорошо согласуется с полученным результатом и доказывает непосредственный контакт олигомера с-субъединицы с липидным бислоем Появление плохо разрешенных пиков 3 в районе 13348 m/z, а также отсутствие пика [а]2+/[6]2+ позволяет

сделать вывод о множественной модификации субъединиц а или b и, следовательно, их контакте с липидами мембраны

В MS органического экстракта (Рис 9Б) не были идентифицированы пики [а]+ и [д]2+ (субъединица b не экстрагируется) Очевидно, а-субъединица промодифицировалась практически полностью, причем множественность сшивок подтверждается пиками с m/z 13701 (4, Рис 9Б) и 13348 (3, Рис 8Б) Появились пики 2 и 3 (m/z 8302 и 8959, Рис 9Б), соответствующие (с потерей фосфохолина) пришивке одной или двух молекул зонда к субъединице с Приведенные спектры (Рис 8 и 9), позволяют рассчитать, что немодифицирован-ными осталось -15% всего количества с-субъединиц, то есть 2 из 12-ти

пик т/г| Соотнесение с субъедииицаш АТР-азы

1 7650 [о + кГ

2 8302 модифицированная с-субъединица

3 8959 модифицированная с-субъединица

i 13701 модифицированная а-субъединица

Рис 9 МБ МА1Л)1 хлороформ-метанольных фракций модифицированной (Б) и ^модифицированной (А) ЬГ-АТРазы митохондрий сердца быка в протеоли-посомах типа II и 1, соответственно

Из значения miz 13348 (Рис 8Б) следует, что стехиометрия продукта сшивки РС-зонд/а-субъединица > 3 1 Субъединица а присутствует в FjF0-комплексе в одной копии, причем основная часть ее молекулы погружена в липидный бислой, и как предполагается, образует 6-7 трансмембранных а-спиральных тяжей Субъединица а выполняет как бы роль статора для ротора, образованного 12 с-субъединицами (Fearnley IM, 1986) Наши результаты показывают, что этот статор - компактное образование, экранирующее от контактов с липидами довольно незначительную часть ротора С|2-олигомера

10. Поиск лектинов на поверхности опухолевых клеток

Клетки опухолей экспонируют на своей поверхности лектины, специфические углевод-связывающие белки, которые на нормальных клетках отсутствуют или экспрессируются в малой степени (GabiusH-J, 1988) Это явление было предложено использовать для доставки носителей лекарств к опухолям (Monsigny М, 1988) Углеводные лиганды имеют невысокое сродство к лекти-нам (K¿ ~1 мМ), но оно резко возрастает при переходе к олиго- или поливалентным (с множеством углеводных остатков) гликоконъюгатам за счет формирования многоточечных контактов с лектинами, как это происходит в природе Липосомы как носители лекарств особенно подходят для оснащения их липидного бислоя углеводными лигандами, которые за счет латеральной диффузии стягиваются и подстраиваются под структурированные на поверхности клетки молекулы лектина (Zalipsky S, 1996) Мы использовали липосомы со встроенными в мембрану липофильными гликоконъюгатами для доставки ли-пидных пролекарств к злокачественным клеткам in vitro и in vivo и показали перспективность такого подхода [20] Специфичность лектинов опухолевых клеток определяли с помощью флуоресцентных углеводных зондов 16

Внутриклеточный транспорт лекарственных липосом и эффективность действия доставленного препарата зависят от механизма их рецепции клетками В нашем случае, липосомы, вероятно, связываются с мембранными лектинами Мы решили выявить эти рецепторы с помощью PAL и с этой целью разработали синтез неогликолипидных зондов (38-41, Схема 11), предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом Расположение Dcp-метки в непосредственной близости от остатка углевода позволяет полностью сохранить его структуру Детерминанты трисахарид A (Atri) 38, сиалил-LewisX (SiaLex) 39 и сульфат-LewisA (SuLeA) 40 определены нами для клеток меланомы МЗ и лейкоза HL-60, соответственно Зонд 41, несущий неактивный пентаол, предназначен для контроля неспецифического связывания

Проведена серия PAL-экспериментов с клетками и 200-нм-липосомами состава яичный PC - фосфатидилинозит - (1251)зонд 38-41, 8 1 0 5-1 (мольн ) Для детектирования связывания с рецепторами на поверхности, клетки инкубировали с липосомами 5-10 мин при 20°С, заметное накопление фосфолипи-

16 Углеводные флуоресцентные зонды - конъюгаты моно- и олигосахаридов с флуоресце-ин-меченым полиакриламидом - и 3-аминопропилгликозиды синтезированы в лаборатории химии углеводов ИБХ РАН (зав лабораторией проф Н В Бовин)

нЛ/О^^он ^ сЛ^^у

CI 6,6

n = 9 -16

соо

ОН = ROH

ион ■

д е ж,г ■ RONp —RNH^/COOH -■■■»- RNH^^COOH -- RNH^^-COONp

' 34

Fucal-2

Gaipi- O^^/NH-

GalNAca1-3

<->

трисахарид A

Neu5Aca2-3Gaipi-4GlcNAe0.

Fucal

CH,

сиалил-LewisX

Fucal-4

HS03-3Ga.g1-3 GlcNAcP1-O^^NH-<->

сульфат-LewisA 40

он он он

OH OH NH-

аминоглюцит

Гликозид о

nh2 или аминоглюцит

ООСС„Н„

полиэтиленгликольныи -е—->

спейсер мембрашый

А якорь

необходим для эффективного взаимодействия углевода с рецептором на поверхности клетки-мишени

Схема 11а) S0Cl2/Na2C03, 6) гас-1,2-диолеоилглицерин, 0 1 экв, в) вода, г) CF3COONp/Py, д) s-Boc-лизин, TEA, DMSO, е) TFA, ж) DcpOCH2COONp 26

дов лнпосом в цитоплазме начинается через 30 мин инкубации при 37"С ¡26], На Рис. IOcí представлены электрофореграммы и авторадиограммы белков клеток МЗ после инкубации с Atri-липосомами. Соответствующие профили радиоактивного счета приведены на Рис. 10б. Основной уровень PAL - в зоне самых легких {14-15 кДа) и массовых белков. Еще один пик приходится на слабую полосу при -18 кДа (профиль 1. Рис. 106). Инкубации в присутствии свобод но го углевода, в прямой зависимости от его количества, привели к явному снижению уровней PAL (Рис. \0а,2А,ЗА: Рис. 106, профили 2,3). Наиболее выражен эффект ингибирования для 18-кДа-зопы (Рис. 106).

Рис. 10. PAL белков клеток МЗ Atri-липосомами (зонд 38). 12.5% SDS-PAGE после однократного делипидизирования (СНС13-МеОН, 1:3); а -- электрофоре-граммы (слева) и авторадиограммы: / и 1А - инкубации клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А - то же в присутствии 10 экв свободного трисахарида А, 5 и ЗА -то же в присутствии 100 экв.: б~ профили радиоактивности электрофоре-грамм, соответствующие а. Стрелки слева и внизу- стандарты Sigma.

PAL в мембранных системах неизбежно сопровождается большим количеством липид-липидных кросс-сшивок, которые захватываются денатурированными белками при делигшдизировамии и даже в условиях SDS-PAGE продолжают ими удерживаться. После дополнительной экстракции (СНСЬ-МеОН, 1:3) стало очевидным, что уровень PAL, в области 18 кДа при 5-мин-инкубации с клетками - наибольший (Рис. 116, профиль /). Избыток амино-глюцита не подавлял PAL 18 кДа-белка (Рис. I 1 a,3,3A~, ср. Рис. \0а,1А,2А,ЗА).

Уловить момент образования л и ганд-рецепторного комплекса в условиях стационарного (steady-state) фотолиза невозможно, что приводит к усиле-

Рис, 11. PAL белков клеток МЗ Aíti-.чипоссмам.и (зонд 38). 13.5% SDS-PAGE после двухкратного дели пидизиревания; а - электрофоре граммы (слева) и авторадиограммы: I н JA -инкубация клеток с липосомами 5 мин, 2 и 2А - то же 30 мин, 3 и ЗА — то же 5 мин в присутствии 500 эк в аминоглюшзга; ЦМ~ злек-трофореграмма белков фракции цито плазматических мембран клеток МЗ; б — профили радиоактивности электрофоре грамм, соответствующие а.

ниго веспецифического PAL. Его проверяли с помошью зонда 41, Кроме зоны 14-15 кДа, основные гтики --28 и 34 кДа (профиль 1, Рис. 12). Следовательно, PAL в этих зонах Atri-зондом 38 (Рис. 10 и 11) является ^специфическим.

Рис. 12. PAL белков клеток МЗ липосомами с контрольным зондом 41: 1 - инкубация 10 мин; 2-после фотолиза липосом с зондом 41 в отсутствие клеток, с последующим совместным делипиди-зированием с разрушенными SDS клетками: 13,5% SBS-PAGE.

«» 45 56 25 14 к®1

Для контроля фоновой радиоактивности дисперсии липосом облучали, разрушали 5135, а затем смешивали с разрушенными клетками и дважды делипидизироваяи. Распределение радиоактивности после Р.ЧОЕ (Рис. 12, профиль 2) свидетельствует, что пик в зоне —15 кДа действительно объясняется трудностью отделения белков от липофильных молекул.

На Рис. 13 и 14 представлены профили радиоактивности белков после PAL клеток МЗ S i a Le* - л и п о с ом ами и клеток IIL-60 Su Le А-л ипосомами, соответственно. По сравнению с Atri-л ипосомами (Рис. 10 и 11), картины мече ни я усложнились, и основные лики смещены в сторону более высоких масс. Однако ряд пиков можно вычесть: область фона - 14-15 кДа; пики неспецифического мечения -28 и 34 кДадля клеток МЗ (Рис. 12) и -19, 21, 28 и 31 кДа клеток HL-60 (данные не приведены). Для клеток МЗ и Atn-зонда 38 главным меченным оказался минорный белок с массой —18 кДа, в случае SiaLcx-30Hfla 39 - белки -43, -60, -64 и -80 кДа, а для клеток HL-60 и зонда SuLeA 40 -белки ~36, -43, -48, -54. -66 и область 75-35 кДа. Так как возрастающие концентрации свободных углеводов подавляю-] PAL (Рис. 10 и 13, профили 2,3: Рис. 14, профиль 2), мы полагаем, что оно отражает специфические взаимо-

Рис. 13. PAL клеток МЗ SiaLe -липосомами (зонд 39): 1 — инкубация 10 мин; 2 - то же в присутствии 10 экв. свободного SiaLex; 3 - то же в присутствии 100 экв.; 4 — инкубация 30 мин; 13.5% SDS-PAGE.

действия. Более длительные инкубации во всех случаях (Рис. 11 «,2.4; Рис. 1 1 б профиль 2: Рис. 13, профиль 4: Ряс. 14, профиль 3) изменяют профили мечения, поскольку зонды уже взаимодействуют с внутриклеточными белками.

Белки, связывающие зонды, обнаруживаются в плазматических мембра-

I.J

-Сит -4J

-г 4(М

1-15(Ю г ¡KlOO

f-iww

j- IñCW -L i non --4ÍXK1

- Зйда

■2511(1

-дао

- I 5LKI

--1Ш

t I t M 1

У 7 45

м «rta

нах клеток при 508-РА0Е (для МЗ Рис. I 1а,ЦМ). Их можно соотнести с известными лектинами млекопитающих. Найденный на клетках МЗ рецептор Ат-липосом с массой -18 кДа может относиться к семейству галектинов -

Рис. 14. PAL клеток HL-60 SuLeА-липосомами (зонд 40): I - инкубация 10 мин; 2 - то же в присутствии 10 экв. свободного SuLeA; 3 инкубация 30 мин; 13.5% SDS-PAGE.

ГТТХ1 t

47 fifi Í5 4Í 36 2Í

14 «Да

пектинов з к с трап е л л ю парного матрикса, специфически связывающих ß-галак-тозиды; идентифицировано 14 галектинов с массами от 14 до 36 кДа (Gabms И.-J., 2004). Вероятно, что пик зоны -75-85 кДа в профиле PAL SuLeA-.iHnoco-мами белков клеток лейкоза HL-60, сохраняющий свою интенсивность при разных временах инкубации (Рис. 14, профили 1 и .?), относится к семейству селекшнов. Эти пектины специфичны к фукозшшрованным/сульфзтирован-ным эпитопам и после связывания с л и ганда ми не подвергаются эндоцитозу (Gabius И.-J., 1997). Масса L-селектина лимфоцитов - 74 кДа,

Отметим, что публикаций о применении фотоаффинных углеводных зондов пока мало. Например, с помощью PAL авторы (Hashimoto М., 2001) искали транспортер глюкозы на поверхности клетки и перед детектированием выделяли его из сложной смеси клеточных белков с помощью иммунопрецигти-тации, то есть было излестно, какой именно рецептор надо искать.

Наши результаты позволяют сделать вывод, что на поверхности опухолевых клеток экспонированы рецепторы, которые опосредуют взаимодействие С липосомами, оснащенными углеводными детерминантами.

выводы

1 Впервые детально исследованы фотохимические свойства диазоциклопен-тадиен-2-илкарбонильной (Оср) группы Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, компактности и реакционной способности при возбуждении актиничным светом, известные и широко применяемые фотофоры Существенно, что фотолиз этой группы проходит в мягких условиях, не повреждающих белки и нуклеиновые кислоты Высокая реакционная способность особенно важна при зондировании мембранных систем, обогащенных неактивированными СН-связями.

2 Обнаружена способность Бср-группы подвергаться прямому иодированию в условиях окислительного процесса, при этом фотохимические свойства сохраняются Указанное качество превращает Бср-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, поскольку позволяет проводить синтез холодных зондов с последующим введением высокоактивного радиоизотопа 1251 в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением в биологической системе Положение изотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов фотомечения. Эффективность применения радиоиодированного Бср-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена с помощью фосфатидилхолинового зонда на хорошо изученной биологической модели - вирионе гриппа

3 Предложен новый основный катализатор - 4-аминопиридин - для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей Применение 4-аминопиридина особенно эффективно в синтезах фосфо- и гликолипидов и позволяет существенно увеличить выход при ацилировании вторичного гидроксила глицеридного остатка, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых или дорогостоящих соединений

4 Разработаны синтезы новых 14С-меченых фосфатидилхолиновых зондов, содержащих Вср-группу при концевом атоме углерода ацильных остатков в 5й-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы Зонды предназначены для мембранных исследований на различной глубине погружения в липидный бислой

5 Разработан синтез нового фосфатидилхолинового зонда, несущего в 5й-2 положении алифатическую кислоту, содержащую при ©-углероде Бср-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, лабильную в щелочной среде, что облегчает анализ продуктов фотомечения Кислота служит син-тоном при получении различных липидных зондов, предназначенных для изучения неполярной области мембран

6 Разработаны синтезы новых ганглиозидных зондов на основе лизоганглио-зида ОМ1, несущих Бср-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, в церамидном остатке на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы. Синтез оптимизирован для субмикромолярных количеств

7 С помощью 14С-меченых фосфолипидных зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране Результаты хорошо коррелируют с данными расчетов конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями других исследователей, применивших независимые методы

8 С помощью 1251-меченых ганглиозидных зондов исследовано взаимодействие субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом вМ1 в активированных Т-лимфоцитах (клетки линии СТ1Х-2) Полученные данные важны для понимания механизма сборки рецепторов и проведения сигнала

9 В рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглио-зидами, определены сайты связывания интерлейкина-4 с 1251-меченым ОМ1-зондом - новым аналогом ОМ1, несущим Вср-фотофор вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты Показано, что ганглиозид взаимодействует с фрагментами 19-25 (дКТЬСТЕ) и 103-113 (А^ЗТЬЕШЬЕ)

10 С помощью фосфатидилхолинового зонда идентифицированы субъединицы субкомплекса Б0 митохондриальной ЕГ-АТР-азы, контактирующие с липи-дами мембраны Впервые для многосубъединичного интегрального белка применен масс-спектрометрический метод анализа продуктов фотомечения липидным зондом

11 С целью изучения механизма взаимодействия липосом, оснащенных углеводными детерминантами (адресных липосом), с опухолевыми клетками разработан метод синтеза фотоаффинных неогликолипидных зондов, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом

12 Фотоаффинное зондирование показало, что взаимодействие адресных ли-посом с опухолевыми клетками опосредовано рецепторами, экспонированными на поверхности исследованных клеток, некоторые из этих рецепторов могут быть отнесены к известным лектинам клеток млекопитающих

Список работ, опубликованных по материалам диссертации17

Обзрр

1 Водовозова Е Л Метод фотоаффинного мечения и его применение в структурно-биологических исследованиях Биохимия 2007,72 (1), 5-26

Статьи

2 Водовозова Е Л, Молотковский Юл Г , Бергельсон Л Д Синтез фотореакгавных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов с различным расстоянием между меткой и полярной группировкой Биоорган химия 1984,10 (12), 1688-1694

3 Водовозова Е Л, Шевченко В П, Молотковский Юл Г , Бергельсон Л Д Синтез фотореактивных фосфолипидов с высоким уровнем тритиевой метки Биоорган химия 1984,10 (12), 1698-1699

4 Молотковский Юл Г, Маневич Е M, Водовозова Е Л, Букринская А Г, Бергельсон Л Д Изучение молекулярной организации мембраны вируса гриппа с помощью фотореактивных и флуоресцентных фосфолипидных зондов Биол мембраны 1985,2 (6), 566-574

5 Buîcrmskaya A G , Molotkovsky J G, Vodovozova E L , Manevich Y M, Bergclson LD The molecular organization of the influenza virus surface Studies using photore-active and fluorescent labeled phospholipids probes Biochim Biophys Acta 1987, 897,285-292

6 Slepushkm V A, Starov AI, Buknnskaya A G, Imbs А В , Martynova M A , Kogtev L S , Vodovozova E L , Timofeeva N G, Molotkovsky J G, Bergelson L D Interaction of influenza virus with gangliosides and liposomes containing gangliosides Eur J Biochem 1988,173, 599-605

7 Мартынова M A, Маневич E M, Водовозова E Л, Музя Г И, Безуглов В В , Молотковский Юл Г, Бергельсон Л Д Взаимодействие простагландинов с липо-протеинами низкой плотности крови человека Биохимия 1988, 53 (5), 721-727

8 Martynova M A, Manevich Ye M, Vodovozova E L , Muzya GI, Molotkovsky Jul G , Bergelson L D The interaction of prostaglandins with human plasma low-density lipoproteins Biochim Biophys Acta 1988,963,302-310

9 Uvarov V Yu, Sotnichenko AI, Vodovozova E L, Kolesanova E F , Stier A, Krueger V, Archakov AI Determination of membrane-bound fragments of cytochrome P-450 2B4 Eur J Biochem 1994,222,483-489

10 Vodovozova E L , Molotkovsky J G A novel catalyst for O-acylation m lipid chemistry Tetrahedron Lett 1994,35 (12), 1933-1936, ibid Correction, 35 (44), 8062

11 Павлова Ю Б , Водовозова E Л, Молотковский Юл Г Синтез фотореактивного диглицерида - лиганда протеинкиназы С Биоорган химия 1994, 20 (6), 691-696

12 Водовозова Е Л, Михалев И И, Ржанинова А А, Гараев M M, Молотковский Юл Г Новый оксааналог миристиновой кислоты, подавляющий репликацию вируса иммунодефицита человека Биоорган химия 1995, 21 (9), 691-696

17 В журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации, опубликовано 27 статей

Водовозова Е JI, Павлова Ю Б, Полушкина M А, Ржанинова А А, Гараев M M, Молотковский Юл Г Новые фосфолипиды - ингибиторы вируса иммунодефицита человека Синтез и антивирусная активность Биоорган химия 1996,22(6), 451-457

Водовозова Е Л, Никольский П Ю , Михалев И И, Молотковский Юл Г Ли-пидные производные сарколизина, метотрексата и рубомицина Биоорган химия 1996,22 (7), 548-556

Козлов A M, Корчагина Е Ю, Водовозова Е Л, Бовин H В , Молотковский Юл Г , Сыркин А Б Усиление противоопухолевой активности сарколизина путем превращения его в липидное производное и включения в мембрану липосом, содержащих углеводный вектор Бюлл экспер биол мед 1997,123 (4), 439-441 Moiseeva Е V, Vodovozova Е L, Mikhalyov 11, Molotkovsky J G Testing of liposomal formulations of DL-melphalan and rubomycm lipid derivatives on new breast cancer mouse model Mouse Genome 1997,95, 895-897

Водовозова E Л , Цибизова E В , Молотковский Юл Г Иодирование диазоцик-лопентадиен-2-карбонильной группы Биоорган химия 1998,24 (4), 316-318 Водовозова Е Л, Хайдуков С В , Гаенко Г П, Бондарчук Т И, Михалев И И, Гречишникова И В , Молотковский Юл Г Транспортировка цитотоксических липосом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант Биоорган химия 1998, 24 (10), 760-767

Vodovozova E L , Gayenko G Р , Razmkov VI, Korchagma E Y , Bovin N V , Molotkovsky J G Sacchande-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells Biochem Mol Biol Int 1998,44 (3), 543-553

Vodovozova E L, Moiseeva E V, Grechko G К , Gayenko G P , Nifant'ev N E, Bovin NV Molotkovsky J G Antitumour activity of cytotoxic liposomes equipped with selectm ligand SiaLeX, m a mouse mammary adenocarcinoma model Eur J Cancer 2000,36 (7), 942-949

Зайцева Л Г, Овчинникова Т В , Водовозова Е Л, Молотковский Юл Г, Поляков H Б, Есипов С Е, Гринкевич В А Изучение строения протон-транслоциру-ющей части АТР-синтазы в матриксе митохондрий Вестник МГУ, Серия 2, Химия 2000, 41 (6), 370-374

Vodovozova E L, Tsibizova E V, Molotkovsky J G One-step îodmation of the diazo-cyclopentadien-2-ylcarbonyl group - a new and convenient preparation of effective radiolabelled photoaffmity probes J Chem Soc, Perkm Trans 1 (Org Biomol Chem from 2003) 2001, No. 18,2221-2228

Цибизова E В , Водовозова E Л, Михалев И И, Молотковский Юл Г Синтез фотореактивных зондов на основе ганглиозида GM1 Биоорган химия 2002,28 (2), 173-179

Зайцева Л Г , Овчинникова Т В , Водовозова Е Л, Молотковский Юл Г, Поляков H Б , Титов M И , Есипов С Е , Гринкевич В А ЕГ-АТР-аза митохондрий идентификация субъединиц субкомплекса Fo, контактирующих с липидами мембраны Биоорган химия 2002, 28 (5), 411-425

Водовозова Е Л, Пазынина Г В , Тузиков А Б , Гречишникова И В , Молотковский Юл Г Синтез фотореактивных неогликолипидных зондов - инструментов для изучения мембранных лектинов, Биоорган химия, 2004,30 (2), 174-181 Водовозова Е Л, Назарова А И, Феофанов А В , Холоденко Р В , Пазынина Г В, Гаенко Г П, Бовин H В , Молотковский Юл Г Взаимодействие липосом, несу-

щих углеводные детерминанты, с клетками меланомы Биол мембраны 2004,21 (1), 53-64

27 Водовозова Е JI, Евдокимов Д В , Молотковский Юл Г Синтез липидного производного противоопухолевого препарата метотрексата Биоорган химия 2004, 30 (6), 663-665

28 Водовозова Е Л , Гордиенко А В , Гаенко Г П, Пазынина Г В , Бовин Н В , Молотковский Юл Г Обнаружение лектинов опухолевых клеток с помощью фотоаффинного мечения Биол мембраны 2005, 22 (4), 308-321

29 Холоденко И В , Водовозова Е Л, Молотковский Юл Г, Холоденко Р В , Василенко Р Н, Михалев И И, Молотковская И М Взаимодействие различных субъединиц рецептора к интерлейкинам-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах Биол мембраны 2006,23 (1), 27-33

30 Водовозова Е Л , Кузнецова Н Р, Гаенко Г П, Молотковский Юл Г Липосомы с диглицеридным конъюгатом метотрексата активность в культуре метотрексат-резистентных клеток лейкемии Биоорган химия, 2007,33 (4), 470-473

31 Водовозова Е Л., Гаенко Г П, Бобрикова Е С , Пазынина Г В , Молотковский Юл Г Диглицеридное производное метотрексата синтез и цитотоксическая активность в составе адресных липосом Хим -Фарм журн 2007,41 (6), 10-14

Опубликованные тезисы докладов и стендовых сообщений на конференциях

32 Uvarov V Yu, Degtyarenko К N, Sotnichenko AI, Vodovozova E L, Molotkovsky J G , Bergelson L D, Archakov AI, Sber A, Kruger V The spatial organization of cytochrome P-450LM2 m membrane Cytochrome P-450 biochemistry and biophysics 7th International Conference, Moscow 28 Jul -2 Aug 1991, Proceedings, INCO - TNC, Joint Stock Company, 1992, P 739-743

33 Vodovozova E L , Pavlova Yu В , Polushkma M N, Rzhaninova A A, Garaev M M, Molotkovsky J G New antiviral phospholipids synthesis and anti-HIV activity Third Int Symp on Bioorg Chem Dagomys, Russia 17-23 Sept 1995,Abstr P 125

34 Водовозова E Л, Хайдуков С В , Гаенко Г П, Михалев И И, Гречишникова

И В , Молотковский Ю Г Направленная доставка липидных противоопухолевых препаратов VI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, СПб, 23-29 мая 1998, Сб рефер №4 С 26-27

35 Водовозова Е Л, Цибизова Е В , Молотковский Ю Г Новый метод получения фотореактивных зондов введение диазоциклопентадиен-2-карбонильной группировки с последующим иодированием IV Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, Москва-Пущино, 2-12 ноября 1998, Тезисы докладов С 11

36 Vodovozova Е L, Moiseeva Е V, Grechko G К, Gayenko G Р , Bovin N V, Molotkovsky J G Antitumor effect of cytotoxic liposomes equipped with carbohydrate ligand m mouse mammary adenocarcinoma Symposium on Lipid and Surfactant Dispersion Systems, Moscow, 26-29 Sept 1999, Proceedings P 269-270

37 Zaitseva L G , Ovchmmkova T V, Vodovozova E L , Molotkovsky J G, Polyakov N В , Esipov S E, Gnnkevich V A The investigation of the structure of the proton-translocating portion of mitochondrial ATP synthase Int Conference "Biocatalysis-2000 fundamentals and applications", Moscow, 10-15 June 2000, Abstr P 94

38 Zaitseva L G, Ovchmmkova T V, Vodovozova E L, Molotkovsky J G , Polyakov

N В , Esipov S E , Gnnkevich V A Structural studies on the proton-translocating por-

tion of mitochondrial ATP synthase 18th Int Congress of Biochemistry and Molecular Biology, Birmingham, UK, 16-20 July 2000, Abstr P 179

39 Водовозова E Л, Моисеева E В, Гаенко Г П, Бовин Н В, Молотковский Ю Г Противоопухолевая активность цитотоксических липосом, несущих специфические углеводные детерминанты V Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова «Биоорганика-2000», Москва-Пущино, 13-20 ноября 2000, Тезисы докладов С 46-47

40 Водовозова Е Л, Моисеева Е В , Гаенко Г П, Бовин Н В , Молотковский Ю Г Адресная доставка противоопухолевых препаратов с помощью липосом, несущих специфические углеводные детерминанты I Международный Конгресс Новые медицинские технологии, СПб, 8-12 июля 2001, Тезисы докладов С 165166

41 Цибизова Е В , Водовозова Е Л, Михалев И И, Молотковский Ю Г Диазоцик-лопентадиен-2-карбонильная группа - фотореажтивная метка для получения высокоэффективных фотоаффинных зондов XIV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 11-15 февраля 2002, Тезисы докладов и стендовых сообщений С 12

42 Водовозова Е Л , Козлов А М, Гаенко Г П, Сапрыкина Н С , Моисеева Е В , Бовин Н В , Молотковский Ю Г Новая система адресной доставки противоопухолевых препаратов - цитотоксические липосомы, несущие специфические углеводные детерминанты Всеросс научно-практ конф «Отечеств противоопухол препараты» М 20-22 марта 2003 г Росс Биотерапевт Ж 2003 Т 2 С 18

43 Vodovozova Е L, Nazarova АI, Feofanov А V, Kholodenko R V, Pazynma G V, Gaenko G P , Bovin N V, Molotkovsky J G Interaction of liposomes bearing carbohydrate determinants with melanoma cells 1st EUFEPS Conf On Optimising Drug Delivery and Formulation New Challenges m Drug Delivery Versailles, France, Sep 29-Oct 1,2003 Abstr PO-69,P 159

44 Холоденко И В , Водовозова Е Л, Холоденко Р В , Молотковская И М Взаимодействие ганглиозида GM2 с субъединицами рецептора IL-2 VII Чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, М 4-7 октября 2004 г Тезисы докладов и стендовых сообщений С 50

45 Molotkovsky J, Molotkovskaya I, Vodovozova E Photoaffine glycolipid analogues bearing diazocyclopentadien-2-ylcarbonyl group, and their application m biological studies Lecture at the XVIII Int Symposium on Glycoconjugates, Sep 4-9,2005, Florence, Italy Glycoconjugate J 2005,22, N 4-6, L052, P 178

46 Molotkovskaya I, Oleynikov V, Kholodenko I, Vodovozova E Ganglioside binding sites m interleukm-4 molecule a photoaffimty study Poster at the XVIII Int Symposium on Glycoconjugates, Sept 4-9,2005, Florence, Italy Glycoconjugate J 2005, 22, N4-6, P124, P 281

47 Vodovozova E, Gordienko A, Gaenko G, Tuzikov A, Bovin N, Molotkovsky J The search for the tumor cell lectins with the help of photoaffimty neoglycolipid probes Poster at the XVIII Int Symposium on Glycoconjugates, Sept 4-9,2005, Florence, Italy Glycoconjugate J 2005,22, N4-6, PI25, P 282

48 Moiseeva E, Vodovozova E, Chaadaeva A , Tuzikov A, Bovin N, Den Otter W, Molotkovsky J Liposomal formulations of merphalan lipophilic prodrug equipped with SiaLex-determmant cause prolong therapeutic effect on spontaneous mammary cancer Session lecture at the 2nd EUFEPS/APGI Conference on Optimising Drug De-

livery and Formulation Evaluation of Drug Delivery Systems Issues and Perspectives Versailles, France, Nov 20-23,2005 Abstr P 42-43

49 Водовозова E Л., Моисеева E В , Гаенко Г П, Бовин Н В , Молотковский Юл Г Противоопухолевые адресные липосомы на основе липофильных производных лекарств и углеводов Медбиотек-2 2-яМеждунар научно-практ конф «Перспективы развития биотехнологии в России» Пущино, 1-2 дек 2005 г Мат конф С 12-13

50 Водовозова Е Л, Бовин Н В, Моисеева Е В, Гаенко Г П, Молотковский Ю Г Противоопухолевые липосомы на основе липофильных производных лекарств и углеводов VIII чтения, посвященные памяти академика Ю А Овчинникова, М 25-27 окт 2006 г Тезисы докладов и стендовых сообщений С 27-28

51 Кузнецова Н Р, Кандыба А Г, Гаенко Г П, Водовозова Е Л Изучение стабильности липосом, содержащих диглицеридное производное противоопухолевого препарата метотрексата XIX зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» М 7-10 февраля 2007 г Тезисы докладов и стендовых сообщений С 49

52 Водовозова Е Л, Кузнецова Н Р, Гаенко Г П, Молотковский Юл Г Липосомы с липидным конъюгатом метотрексата стабильность при хранении и активность в культуре метотрексат-резистентных клеток лейкемии человека VI Всеросс на-учно-практ конф «Отечеств противоопухол препараты» М 24-26 марта 2007 г Росс Биотерапевт Ж 2007 Т 6 С 72-73

Подписано в печать 29 08 2007 г Исполнено 30 08 2007 г Печать трафаретная

Заказ №648 Тираж ЮОэкз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское щ, 36 (495) 975-78-56 жшда агЦо^ега! ги

Содержание диссертации, доктора химических наук, Водовозова, Елена Львовна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. Метод фотоаффинного мечения и его примение в структурно-биологических исследованиях (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

2.1. Основные принципы метода фотоаффинного зондирования

2.2. Схема проведения экспериментов по фотоаффинному мечению

2.3. Применение фотореактивных лигандов для разработки лекарственных средств

2.3.1. Поиск потенциальных мишеней лекарств

2.3.2. Транспортные процессы

2.3.3. Стереохимия взаимодействия G-белок-сопряженных рецепторов с лигандами

2.3.4. Исследования структуры ацетилхолинового рецептора никотинового типа

2.4. Применение фотоаффинных липидных зондов для изучения липид-белковых взаимодействий

2.4.1. Фотоаффинные ганглиозидные зонды

2.4.2. Фотоаффинные фосфолипидные зонды

2.4.3. Фотоаффинные нуклеотидные зонды

2.4.4. Фотоаффинные гликоконъюгаты

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

3.2. Синтез 14С-меченых фосфолипидных зондов, содержащих диазоциклопентадиен-2-илкарбонильную группу • 63 3.2.1. Новый основный катализатор О-ацилирования

3.3. Изучение топографии цитохрома Р-450 2В4 в мембране с помощью фотоаффинных 14С-меченых фосфолипидных зондов

3.4. Иодирование диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

3.5. Синтез фосфатидилхолинового и ганглиозидных зондов, содержащих диазоциклопентадиен-2-илкарбонильную группу

3.6. Фотоаффинное зондирование белков мембраны вируса гриппа

3.7. Взаимодействие различных субъединиц рецепторов интерлейкинови -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах

3.8. Определение фрагментов молекулы IL-4, участвующих во взаимодействии с ганглиозидом GM

3.9. Идентификация субъединиц субкомплекса F0 митохондриальной Н+-АТР-азы, контактирующих с липидами мембраны

3.10. Поиск лектинов опухолевых клеток с помощью фотоаффинного мечения

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Синтезы зондов

К разделу 3.3.

К разделу 3.6.

К разделам 3.7. и 3.8.

К разделу 3.9.

К разделу 3.10.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях"

В связи с важной ролью биологических мембран и липид-белковых комплексов в функционировании клетки и процессах метаболизма в организме, продолжается разработка оптимальных методов исследования молекулярной организации этих объектов. Наряду с такими физическими методами изучения строения мембран как электронная микроскопия, спектроскопия ЯМР, ЭПР, флуоресцентная спектроскопия, а также химическими методами с использованием различных моно-и бифункциональных реагентов, разработаны методы исследования мембран с помощью липофильных фотоаффинных зондов. Главной отличительной чертой фотоаффинных (фотореактивных, фотоактивируемых) зондов является то, что они при освещении способны к образованию ковалентной связи с находящимися рядом молекулами или частями макромолекул. В результате анализа продуктов сшивки можно однозначно определить, с какими молекулами мембраны находился в контакте зонд в момент фотолиза.

Особенности фотоаффинного мечения белков липидными зондами в мембранных системах состоят в том, что зонды расходуются большей частью на сшивки с молекулами липидов, формирующими матрицу этих систем. Очевидно, что домены интегральных и периферических мембранных белков, а также участки апо-белков в липид-белковых комплексах, непосредственно контактирующие с гидрофобными зонами, обогащены аминокислотными остатками с неполярными боковыми цепями. Поэтому эффективное мечение этих областей возможно лишь при использовании фотоаффинных группировок (фотофоров), обладающих чрезвычайно высокой реакционной способностью, обеспечивающей взаимодействие даже с неактивированными СН-связями. С другой стороны, гидрофобные зоны липид-белковых систем обогащены СН-связями жирнокислотных остатков липидов. Как следствие, образуются множественные липид-липидные сшивки, а также полимерные продукты (смолы) за счет побочных вторичных радикальных реакций, что существенно осложняет выделение и анализ целевых продуктов фотохимической реакции. Тем не менее, фотоаффинное зондирование в мембранологии является весьма ценным методом исследования, поскольку позволяет получать прямую информацию о непосредственных контактах молекулярных компонентов в нативных системах. Основные принципы метода фотоаффинного мечения, некоторые зако-номерости фотохимических реакций и характеристики наиболее широко применяемых фотореактивных группировок изложены в Обзоре литературы.

Пионерами в исследовании мембран с помощью фотоаффинных липофиль-ных зондов были Клип и Житлер, применившие для этой цели 1-азидо-4-иодбензол и 1-азидонафталин [1]. Однако эти и им подобные аполярные нелипидные зонды имеют существенный недостаток: их расположение в мембране неопределенно1, кроме того, они могут нарушать упаковку бислоя, особенно при локализации вблизи полярной части мембраны. На ранних этапах применения фотоаффинных зондов в мембранологии, когда строение биологических мембран было известно лишь в общих чертах, некоторое распространение получил биосинтетический метод (например, [3]): в среду для выращивания микроорганизмов или культуры ткани добавляли фотореактивномеченую жирную кислоту, которая вступала в метаболизм и входила в состав клеточных липидов. Фотолиз и анализ продуктов сшивок позволял судить о характере липид-белковых взаимодействий в мембране. Однако такой метод применим лишь к ограниченному числу объектов, и с его помощью можно получить информацию, касающуюся только общей картины липид-белковых взаимодействий в мембране. Поэтому применение в мембранных исследованиях нашел другой подход — синтез индивидуальных фотореактивномеченых липидов с последующим введением их в изучаемую систему (мембрану). Такой подход позволяет изучать взаимодействие зондов с отдельными компонентами мембран, причем точно определять участок взаимодействия в цепи макромолекулы (например, конкретный аминокислотный остаток в белке). Закрепление фотореактивной группировки в определенном положении молекулы мембранного липида позволяет изучать участки мембраны на различной глубине липидного бислоя. Метод был предложен и развит Кораной, Штоффелем, Бруннером и др.

Корана с сотр. [4,5] первыми разработали вариант синтеза фосфатидилхоли-новых зондов, содержащих в определенном положении ацильного остатка при sn-2 положении глицерина фотореактивные (карбен- и нитрен-генерирующие) группировки - трифторметилдиазоацетильную, диазиринофенильную, азидофенильную

1 Для флуоресцентных нелипидных гидрофобных зондов, локализация которых в мембране изучена подробно, показано, что они могут находиться в различных областях бислоя. Например, пирен в фосфатидилхо-линовом бислое находится как в его средней зоне (плоскость молекулы параллельна поверхности мембраны), так и между жирнокислотными цепями, перпендикулярно поверхности мембраны [2]. или азидную. Масс-спектрометрический анализ продуктов сшивки указанных зондов (после переэтерификации в Ме-эфиры) в модельной мембране показал, что максимальное связывание приходится на метилен углеводородной цепи, сдвинутый примерно на 3 С-атома в сторону полярной головки фосфолипида по сравнению с позицией фотофора [6]. Это согласуется с представлениями об упаковке фосфолипидов в бислое выше температуры фазового перехода.

Для детектирования продуктов фотохимической реакции зонд должен содержать репортерную группу (радиоактивную или иную метку). Даже при использовании современных масс-спектрометрических методов исследования, наличие такой группы существенно облегчает предварительную подготовку и анализ образцов. Штоффель с сотр. [7,8] разработали методы получения фосфатидилхолинов, сфингомиелинов и эфиров холестерина, несущих азидо-группу в различных положениях [ Н]меченых насыщенных, моноеновых или диеновых углеводородных цепей (для введения трития в схеме синтеза использовали ацетиленовые производные). С помощью этих зондов авторы исследовали организацию частиц липопро-теинов высокой плотности плазмы крови человека [9,10]. В своих ранних работах Бруннер с сотр. [12] использовали твердофазный метод выделения низкомолекулярных фрагментов фотолиза нерадиоактивных фосфатидилхолиновых зондов в мембранах. Для этого авторы разработали синтезы фотоаффинных зондов, содержащих л-(3-трифторметилдиазирино)фенильную или я-азидофенильную группировки, присоединенные через S-S-связь к жирнокислотной цепи. После фотолиза следовало восстановление дисульфидной связи в продуктах пришивки и последующее присоединение тиолсодержащих веществ к твердой матрице, представляющей собой пористые стеклянные шарики, содержащие N-замещенный малеи-мид. В исследованиях мембран такой метод не получил дальнейшего развития. Наиболее рациональным с точки зрения уменьшения вероятности получения артефактов и внесения существенных нарушений в упаковку мембраны, а также увеличения чувствительности является использование радиоизотопных меток.

Практически одновременно двумя группами авторов были разработаны синтезы радиомеченых фосфолипидных зондов с 2-нитро-4-азидофенильным (Nap) фотофором: Молотковский с сотр. [13] синтезировали фосфатидилхолин и фосфа-тидилэтаноламин с остатком N-Nap-11-амино[С-3Н]ундекановой кислоты в sn-2 положении глицерина, а Монтекукко с сотр. [14] - 14С- и 3Н-меченые по кватерни-зованному азоту холина фосфатидилхолины, несущие остаток N-Nap-12-аминодо-декановой кислоты или 2-нитро-4-азидобензоил. Nap-rpynna при фотолизе дает нитрен, который лишь с незначительным выходом образует сшивки с насыщенными углеводородными цепями [13], но довольно энергично сшивается с молекулами окружающих белков, такими как цитохром Ь5, цитохром с оксидаза, митохондри-альная и (На++К+)-активированная АТРазы (обзор [15]). Достоинство метода синтеза [14] заключается в том, что радиоактивность вводится на последней стадии схемы с помощью 14С- или 3Н-метилиодида. Кроме того, введение 3-х нуклидов 14С <1 или 9-ти Н позволило получить высокие уровни радиоактивности зондов (до 177 и 3900 Ки/моль, соответственно). Однако для изучения продуктов фотоаффинного мечения важно, чтобы радиометка располагалась в молекуле зонда по-возможности близко к фотофору и оставалась в исследуемых фрагментах межмолекулярных сшивок на большей части этапов анализа. Поэтому для зондирования гидрофобных областей мембран, в основном, используются фосфолипиды, несущие фотофор и радиометку в одной ацильной цепи.

Ранее мы синтезировали ,4С-меченые фосфатидилхолины и сфингомиелины - наиболее распространенные фосфолипиды животных тканей, - несущие Nap-группу на различном расстоянии от полярной головки [16]. Зонды получены на основе Н-№р-12-амино-[12-14С]додекановой кислоты и N-Nap-[l-14C]nnmHHa. С помощью спектроскопии 'Н-ЯМР показано, что в фосфолипидном бислое Nap-фотофор, закрепленный в со-положении ацильной цепи, не всплывает на поверхность мембраны, а располагается в неполярной зоне, вблизи жирнокислотных углеводородных остатков [16]. Уровень удельной радиоактивности зондов при введении ,4С химическим синтезом определялся уровнем исходного [,4C]KCN (48 Ки/моль), который мог оказаться недостаточным для получения достоверных результатов при исследовании биологических систем. В связи с этим нами также был разработан новый путь получения третированных фотореактивных фосфатидилхо-лина и сфингомиелина с высоким уровнем радиоактивности (0.9 Ки/ммоль и более), основанный на восстановлении 11-цианундекановой кислоты чистым тритием над катализатором [17]., Ранее метод термической активации позволил получить N-Нар-11-амино[С-3Н]ундекановую кислоту с активностью ~300 Ки/моль [13], но попытка повысить уровень введенной метки путем более длительного облучения исходной 11-аминоундекановой кислоты приводила к значительной изомеризации ее углеводородного скелета.

Синтезированные нами 14С- и 3Н-меченые Nap-содержащие фосфолипиды и жирные кислоты были с успехом применены для изучения доменной организации липидов и липид-белковых взаимодействий в мембране вируса гриппа [18,19]. В частности, показано, что малая субъединица гемагглютинина и нейраминидаза погружены в неполярную область вирусной мембраны, тогда как М-белок контактирует лишь с внутренней поверхностью липидного бислоя; большая субъединица гемагглютинина ремантадинустойчивого штамма в отличие от дикого типа обладает гидрофобным участком, погруженным в мембрану. Тритиймеченые фосфолипиды с Nap-группой на конце длинной цепи использованы также, в комплексе с флуоресцентномечеными фосфолипидами, для исследования взаимодействия вируса гриппа с ганглиозидами [20]. Показано, что ганглиозид GTlb, в отличие от GM1, при связывании с гемагглютинином вызывает перестройки в липидном бислое, которые существенно увеличивают его жидкостность, что, в свою очередь, способствует слиянию с клеткой-мишенью. Наконец, фотомечение длинноцепными Nap-зондами позволило выявить специфические перегруппировки липидов на поверхности глобул липопротеинов низкой плотности плазмы крови человека, индуцируемые взаимодействием антиатерогенного простагландинаПГЕ1 с аполипопро-теином В [21] (липопротеины низкой плотности осуществляют перенос холестерина из плазмы к периферическим клеткам).

В качестве фотофоров в мембранных исследованиях чаще всего применялись ароматические азиды и фенилдиазирины. Арилазиды относительно легко синтезировать, и они фотолизуются в довольно мягких условиях [15], однако, генерируемые при этом нитрены имеют лишь невысокую реакционную способность [22]. Фенилдиазириновая и «-(З-трифторметилдиазирино)фенильная группы при фотолизе образуют более реакционноспособные карбены, однако синтезы соединений, меченных этими группировками, трудны ([23] и [24], соответственно). Поэтому поиск новых фотореактивных группировок и синтез на их основе фотоаффинных липидов является актуальной задачей мембранологии. В этой связи наше внимание привлекла диазоциклопентадиен-2-илкарбонильная (Dcp) группа. Исходное соединение для ее введения - 2-диазоциклопентадиенкарбоновая кислота - описано давно [25], однако до наших исследований Dcp-rpynna лишь однажды применялась для создания фотореактивных зондов, причем нелипидной природы [26]. Эта фотореактивная метка, имея значительное поглощение в ближней УФ-области (А,макс 313 нм, б 16000), легко подвергается фотолизу в мягких условиях, образуя карбен, обладающий значительной активностью - он способен эффективно внедряться в простые СН-связи [26]. Еще одно достоинство Dcp-группы - ее компактность. Получение 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты не представляет большой трудности [25]. В отсутствие актиничного света вещество устойчиво к действию разнообразных физико-химических факторов, таких как нагревание (>150 С), мягкие основания и кислоты [25]. Впервые синтез фосфатидилхолинов и сфингомиелинов, несущих остаток 12-(диазоциклопентадиен-2-илкарбониламино)додекановой ки-. слоты, имеющей также радиоактивную метку (14С или 3Н) был осуществлен Карю-хиной и сотр. [27] с использованием разработанных ранее подходов [16,17]. Сравнительное исследование реакционной способности фосфатидилхолиновых зондов, несущих в sn-2 положении остатки N-Nap-аминоундекановой или N-Dcp-аминодо-декановой кислот, в везикулах из димиристоилфосфатидилхолина, содержащих [14С]дипальмитоилфосфатидилхолин или [14С]холестерин, показало, что при фотолизе Dcp-rpynna генерирует карбен, отличающийся значительно большей по сравнению с ароматическими нитренами активностью [27].

Целью настоящей работы явились дальнейшее исследование фотохимических свойств Dcp-группы, разработка и усовершенствование методов синтеза разнообразных липидных зондов на ее основе, разработка метода получения зондов,

125 содержащих высокоактивный радионуклид I, применение полученных зондов для исследования ряда мембранных биологических систем.

Обзор литературы посвящен краткому рассмотрению основных теоретических аспектов метода фотоаффинного мечения и примерам его применения в самых разных областях структурной биологии, не только в мембранных исследованиях, за последние 5-10 лет. Мы постарались охватить все основные современные методологические тенденции и подходы, использующиеся при фотоафинном зондировании, и показать актуальность дальнейшего развития данного метода.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Водовозова, Елена Львовна

5. ВЫВОДЫ

1. Впервые детально исследованы фотохимические свойства диазоциклопента-диен-2-илкарбонильной (Dcp) группы. Показано, что она является высокоэффективной карбен-генерирующей меткой, превосходящей по ряду параметров, в том числе, компактности и реакционной способности при возбуждении акгиничным светом, известные и широко применяемые фотофоры. Существенно, что фотолиз этой группы проходит в мягких условиях, не повреждающих белки и нуклеиновые кислоты. Высокая реакционная способность особенно важна при зондировании мембранных систем, обогащенных неактивированными СН-связями.

2. Обнаружена способность Dcp-группы подвергаться прямому иодированию в условиях окислительного процесса, при этом фотохимические свойства сохраняются. Указанное качество превращает Dcp-метку в высокоэффективный и удобный в применении фотофор, поскольку позволяет проводить синтез холодных зондов с последующим введением высокоактивного радиоизотопа 1251 в готовую молекулу зонда непосредственно перед применением в биологической системе. Положение изотопа в фотофоре делает более надежным анализ продуктов фотомечения. Эффективность применения радиоиодированного Dcp-фотофора для зондирования мембранных систем подтверждена с помощью фосфатидилхолинового зонда на хорошо изученной биологической модели - вирионе гриппа.

3. Предложен новый основный катализатор - 4-аминопиридин - для проведения реакции О-ацилирования в условиях карбодиимидного синтеза в среде органических растворителей. Применение 4-аминопиридина особенно эффективно в синтезах фосфо- и гликолипидов и позволяет существенно увеличить выход при аци-лировании вторичного гидроксила глицеридного остатка, что имеет принципиальное значение при получении микромолярных количеств радиоактивномеченых или дорогостоящих соединений.

4. Разработаны синтезы новых 14С-меченых фосфатидилхолиновых зондов, содержащих Dcp-rpynny при концевом атоме углерода ацильных остатков в sn-2 положении на различном расстоянии от полярной головной группы. Зонды предназначены для мембранных исследований на различной глубине погружения в ли-пидный бислой.

5. Разработан синтез нового фосфатидилхолинового зонда, несущего в sn-2 положении алифатическую кислоту, содержащую при ш-углероде Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, лабильную в щелочной среде, что облегчает анализ продуктов фотомечения. Кислота служит синтопом при получении различных липидных зондов, предназначенных для изучения неполярной области мембран.

6. Разработаны синтезы новых ганглиозидных зондов на основе лизоганглио-зида GM1, несущих Dcp-фотофор, присоединенный через сложноэфирную связь, в церамидном остатке на различном расстоянии от олигосахаридной части молекулы. Синтез оптимизирован для субмикромолярных количеств.

7. С помощью 14С-меченых фосфолипидных зондов исследована топография цитохрома Р450 2В4 в мембране. Результаты хорошо коррелируют с данными расчетов конформационного анализа, а также подтверждаются более поздними публикациями других исследователей, применивших независимые методы.

8. С помощью 1251-меченых ганглиозидных зондов исследовано взаимодействие субъединиц рецепторов интерлейкинов-2 и -4 с ганглиозидом GM1 в активированных Т-лимфоцитах (клетки линии CTLL-2). Полученные данные важны для понимания механизма сборки рецепторов и проведения сигнала.

9. В рамках изучения молекулярных механизмов иммуносупрессии ганглиози-дами, определены сайты связывания иитерлейкина-4 с 1251-меченым GMl-зондом -новым аналогом GM1, несущим Dcp-фотофор вместо ацетила в остатке сиаловой кислоты. Показано, что ганглиозид взаимодействует с фрагментами 19-25 (QKTLCTE) и 103-113 (ANQSTLENFLE).

10. С помощью фосфатидилхолинового зонда идентифицированы субъединицы субкомплекса F0 митохондриалыюй Н+-АТР-азы, контактирующие с липидами мембраны.

11. С целью изучения механизма взаимодействия липосом, оснащенных углеводными детерминантами (адресных липосом), с опухолевыми клетками разработан метод синтеза фотоаффинных неогликолипидных зондов, предназначенных для встраивания в липидный бислой липосом.

12. Фотоаффинное зондирование показало, что взаимодействие адресных липо-сом с опухолевыми клетками опосредовано рецепторами, экспонированными на поверхности исследованных клеток; некоторые из этих рецепторов могут быть отнесены к известным лектинам клеток млекопитающих.

Заключение

Здесь дан представительный набор примеров использования метода фотоаффинного зондирования для исследования самых разнообразных биологических систем. Если в конце 90-х и в самом начале 2000-х годов наблюдался некоторый спад в публикациях на эту тему, то за последние 3-4 года можно видеть увеличение количества работ. Очевидно, что применение PAL в сочетании с новыми мощными методами инструментального анализа и компьютерного моделирования остается важнейшим и перспективным подходом в структурной биологии.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Изучение фотохимических свойств диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной группы

Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты (DcpOH) 1 осуществляли по методу, описанному Мартином с сотр. [25], из изомерной дициклопентадиенди-карбоновой кислоты, которую получали карбоксилированием циклопентадиенилл натрия при пониженной температуре [194,195] (Схема 1).

Na / iPrOH

1. С02/ -20 -30°С

2. Н

COOSiMe

СООН

SiMe3CI / Ру П

COOSiMe, Д

COOSiMe,

COOSiMe.

COOSiMe, N,

СООН

-1.7:1

Схема 1. Синтез 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислоты.

Димерные триметилсилильные эфиры расщепляли до мономера термической обработкой (165°С, с последующей очисткой перегонкой в вакууме), вводили в реакцию с тозилазидом и получали смесь TMS-эфиров диазоциклопентадиенкарбо

2 При низких температурах карбоксилирования повышается выход эюо-изомера дициклопентадиендикарбо-новой кислоты [194], производные которого легче расщепляются с образованием мономеров. Дициклопен-тадиендикарбоновая кислота применяется в качестве пластификатора для улучшения свойств традиционных термопластичных материалов, а также для создания новых терморегенерируемых полимеров (например, [196]), где для образования термически обратимых ковалентных связей используется обратимая димериза-ция циклопентадиенов циклоприсоединением по реакции Дильса-Альдера. новых кислот. Последние легко гидролизуются с образованием DcpOH (1) и 3-диазоциклопентадиенкарбоной кислоты, которые разделяются хроматографией на силикагеле.

По нашим данным, в отсутствие УФ-облучения кислота 1 может годами сохраняться в низкотемпературном холодильнике без разложения. Как оказалось, вещество не только устойчиво к действию мягких кислот и щелочей [25], но и выдерживает действие надуксусной кислоты и других окислителей (см. далее в разделе о введении I-метки). Нильсен с сотр. [26] первыми показали фотохимическую эффективность Dcp-группы на примере мечения бычьего сывороточного альбумина (БСА), гистонов в составе хроматина, гРНК и ДНК, в сравнительном исследовании с применением производных 9-аминоакридина (флуоресцентная метка), несущих различные диазо- и арилазидные фотофоры, присоединенные через гексаме-тиленовый линкер. В ряду меток-, Nap, Dcp, диазоциклопентадиен-З-илкарбонил3, этилдиазомалонил - первые три были наиболее эффективными: они метили БСА с выходами 22,9 и 9%, соответственно, с относительными скоростями 0.25:0.06:1. Очевидно, самый высокий уровень PAL в случае 4-азидобензоилыюй метки объясняется перегруппировкой незамещенного фенилазида в более долгоживущие элек-трофильные интермедиаты (Обзор литературы, с. 18). Карбен-генерирующая группа Dcp была особенно рекомендована для зондирования гидрофобных объектов, обогащенных неактивированными СН-связями [26]. Молотковский с сотр. исследовали способность Dcp-фотофора, связанного с со-положением жирнокислотной цепи, связываться с циклогексаном и изопропанолом, а также внедряться в СН-связи в модельных мембранах [27]. Наличие продуктов пришивки регистрировалось наличием соответствующих молекулярных пиков в масс-спектрах, либо радиоактивностью на пластинках ТСХ. При фотолизе в изопропаноле, кроме смолы, детектировались (ТСХ и ВЭЖХ) множественные продукты реакции, которые являлись, очевидно, изомерами внедрения карбена в ОН и СН-связи изопропанольного остатка [27]; фотолиз в циклогексане давал индивидуальное вещество (ВЭЖХ) -продукт пришивки к циклогексану (MS).

Мы поставили задачу определить структуру аддукта Dcp-еодержащей моле

3 Эффективность диазоциклопентадиен-3-илкарбонильной группы как фотофора существенно ниже, чем Dcp-группы [26]. кулы и циклогексана и получить количественные характеристики реакции фотолиза в циклогексане, поскольку именно способность к внедрению в неактивированные СН-связи является показателем максимальной реакционной способности и, следовательно, неизбирательности фотоаффинной группировки. Для изучения фотохимических свойств Dcp-метки был получен зонд минимального размера, несущий эту группу - метиловый эфир кислоты 1 (DcpOMe 2). Эфир 2 получали метилированием DcpOH диазометаном.

Химические свойства циклопентадиенилидена, карбена, генерируемого при фотоактивации диазоциклопентадиена, хорошо изучены. Его основным состоянием является триплетное, однако химические реакции в растворах протекают на базе синглетного состояния, причем внедрение в СН-связи происходит очень эффективно [197,198]. Ход реакции фотолиза Dcp-rpynnbi представлен на Рис. 1. Раствор эфира 2 в циклогексане (6 мМ) облучали в течение 3 мин светом ртутной лампы среднего давления мощности 30 Вт (А.макс 365 нм) на расстоянии 7 см, используя в качестве светофильтра пробирку из стекла Пирекс, которое отсекает излучение с А>300 нм. Время полужизни диазогруппы в этих условиях составило менее 30 сек. После фотолиза раствор не подвергали концентрированию, поскольку летучесть

314 нм

200

260

320

X/ям

380

Рис. 1. Фотолиз DcpOMe в циклогексане (6 мМ); А>300 нм. продуктов могла привести к непропорциональным потерям. К раствору добавляли дейтероциклогексан (C6D12,10 % объемных) и регистрировали 'Н-ЯМР-спектр, который анализировали с помощью двойного резонанса (Рис. 2). По данным ТСХ, с максимальным выходом образовался самый неполярный продукт, кроме того, Л

Заб

Я.

Заб Заб

Заб I I I I | I I I I | I I I I I I I I I IIII I[I I I I II III I I II \I I I II II ) I I I I I I I I I II [ I I I I | I I М I I I III I I I II I I I I I I И I I I I I И IIII I I I III I I I II IIIIII I II

6.80 6.70 6.60 6.00 5.90 3.70 3.60 3.50 3.10 3.00 S (ррт)

Рис. 2. Спектры 'Н-ЯМР (C6Di2) DcpOMe 2 до (верхний) и после (нижний) фотолиза в циклогексане; фотолиз проводился до 80%-ной конверсии. наблюдались менее полярные минорные компоненты реакционной смеси, соотношение которых варьировало в зависимости от процедур упаривания и разделения; на старте обнаруживалось небольшое количество смолы. Спектр 'Н-ЯМР фотоли-зованного раствора оставался неизменным при хранении в течение нескольких дней при 4 С. Это позволило нам интерпретировать единственный основной продукт фотолиза, кроме смолы, как структуры За или 36 (Схема 2). То, что сигнал циклогексилыюго протона HI действительно находится в очень слабом поле (химический сдвиг 3.55 м.д.), полностью подтвердилось с помощью двойного резонанса на соседних циклогексильных протонах в сильном поле (1.53 м.д.) при изучении спектров в сЦ-метаноле.

О существовании изомеров по эндоциклическим двойным связям замещенных циклопентадиенов сообщается в цикле работ наших соотечественников (например, [199]). Такие изомеры находятся в термодинамическом равновесии; пере

СООМе а

СООМе

СООМе 2

За

Схема 2. a) h ц Л > 300 нм, 3 мин, циклогексан. ходы осуществляются путем переноса протона от С-5 к соседнему С-атому, при этом вероятными промежуточными состояниями являются комплексы протон -циклопентадиениланион. Структуры и соотношения изомеров зависят, главным образом, от характера заместителя(ей) [199], например, метилциклопентадиенкар-боксилат представлен исключительно или в основном 1,3-диеном (в нашем случае структура 36) [200].

Визуальная оценка после разделения продуктов фотолиза DcpOMe в цикло-гексане на пластинках ТСХ показала очень незначительное количество смолы. Однако при соотнесении интегральных интенсивностей резонансных сигналов в спектрах 'Н-ЯМР эфира 2 до и после фотолиза 6 мМ-раствора в циклогексане продукт внедрения в СН-связь составил 42%. Для сравнения, при фотолизе Tfd-производно-го в циклогексане наблюдалось образование нескольких соединений, среди которых продукт внедрения в СН-связь составлял 58% при исходной концентрации фотофора 2 мМ и 28% - при 30 мМ, как показал ГЖХ-анализ [158]. Таким образом, можно отметить, что способность карбена, генерированного Dcp-группой, внедряться в простые СН-связи вполне сравнима с таковой Tfd-метки, которая на сегодня фактически признана лучшим фотофором (см. Обзор литературы). Важно также и то, что молярная экстинкция актиничного света Dcp-метки (8-16000 при Х=314 нм) существенно выше, чем в случае Tfd-группы (е~300 при Я,=353 нм; время полужизни диазирина при фотолизе ~3 мМ раствора в циклогексане облучением ртутной лампой мощностью 450 Вт на расстоянии 4 см - 25 сек [24]). Это обстоятельство делает Dcp-rpynny еще более привлекательной в качестве эффективной фотоаффинной метки для исследования динамических систем. И наконец, еще раз отметим, что Dcp-метка гораздо более доступна с точки зрения простоты ее получения.

3.2. Сиитез 14С-меченых фосфолипидных зондов, содержащих диазоциклопен-тадиеп-2-илкарбо11илы1ую группу

Как уже отмечалось, Dcp-метка представляет особый интерес для зондирования гидрофобной области биологических мембран. За 25 лет было синтезировано множество фотореактивных фосфолипидов, которые использовались для структурных и функциональных исследований [4-21,23,30,36,156,158-161,165,166,169,201208]. Большинство этих липидов - фосфатидилхолины и сфинголипиды, содержащие фотореакгивные группы (трифторметилдиазоацетильную [4-6], азидофениль-ную [4-6,202,165], диазиринофенильную [4-6,23,203], азидную [4-10], Nap [1321,204,205], Tfd [30,31,158-161,169,205,206], азидоформильную [207], бензофено-новую [208], диазоциклогексадиеноновую [156]), соединенные амидной, сложно-эфирной или простой эфирной связями с ш-положением жирнокислотной цепи. Фосфатидилхолины и сфингомиелины, меченные Dcp-rpynnoft путем присоединения к NH2-rpynne 12-аминододекановой кислоты, имеющей также радиоактивную метку (14С или 3Н), впервые синтезировали авторы [27] по схеме, использованной ранее для синтеза Nap-меченых зондов [16,17] (Схема 3).

3Н]12-Аминододекановая кислота 4 была синтезирована из доступной 11-йодундекановой кислоты конденсацией с KCN и последующим каталитическим тритиированием образовавшейся 11-цианундекановой кислоты [16,17]. Ацилиро-вание кислоты 4 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислотой приводило к фотореактивной кислоте 5, которая, в свою очередь, вводилась в реакции ацилирования лизофосфатидилхолина и сфингозин-1-фосфохолина с образованием фосфатидил-холинового 6 и сфингомиелинового 7 зондов. Выходы целевых продуктов на стадиях (<)) и (е) были весьма низкими (20% и 30%, соответственно, при избытке кислоты 5 10-20%), что обусловлено, в том числе, необратимой адсорбцией Dcp-содержащих соединений на силикагеле в ходе хроматографического разделения (темновая реакция пришивки). Подобная сорбция наблюдалась нами ранее и для Nap-содержащих веществ, но в меньшей степени [16]. Кроме того, при проведении синтезов с микромолярными количествами реагентов, что характерно для работы с h2n PHI PH] соон а,б,в,г

N2 О рн] рн]

СООН 4 5 е п = 1 (-78%) п = 3 (-22%) рН] рН] О N2 6 о-р-о

I. о о

II но, „н 7 рн] РН] о N2

Схема 3. а) МеОН/НС1; б) DcpOH/DCC/DMAP; в) КОН, iPr0H-H20; г) НС1; д) ли-зофосфатидилхолин, DCC/DMAP; ё) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP. радиоактивномечеными соединениями, выходы продуктов, как правило, уменьшаются. В случае многостадийного синтеза одним из вариантов увеличения выхода конечного продукта является введение фотофора на последней стадии [16], что было применено авторами [27] при получении [14С]фосфатидилхолинового зонда 9 по Схеме 4. Фосфатидилхолин 8 был синтезирован ацилированием лизофосфатидил-холина 11-[14С]цианундекановой кислотой [16]. После каталитического гидрирования [14C]H2NH2-rpynny ацилировали 2-диазоциклопентадиенкарбоновой кислотой, что приводило к зонду 9 с выходом 29% [27]. Очевидно, что такой путь синтеза обеспечивал лишь небольшое увеличение выхода целевого продукта, кроме того, он не пригоден для получения Dcp-сфингомиелина.

В связи с изложенным, нами была поставлена задача оптимизации всех стадий схемы синтеза Dcp-фоефолипидов. В качестве радионуклида мы остановились на 14С, низкоэнергетичном р-излучателе, поскольку содержащие его соединения

0 N2 9

Схема 4. a) H2/Pt; б) DcpOH/DCC/DMAP. мало подвержены радиолизу, а эффективность жидкостно-сцинтилляционного счета радиоактивности проб очень высока (96-98%). Последнее обстоятельство позволяет избежать артефактов при анализе в ходе проведения синтеза или биохимического эксперимента. Удельная радиоактивность нуклида 3Н существенно выше, чем 14С, ср.: 29 Ки/ммоль, период полураспада, 12.43 года, против 62 Ки/моль, Т]/2 5730 лет. Однако 3Н-меченые соединения довольно быстро, менее, чем за 1 год, деградируют из-за радиолиза. Кроме того, энергия Р-излучения трития настолько невелика, что надежные результаты счета радиоактивности можно получить только для истинного раствора пробы в жидкостном сцинтилляторе (т.н. «гомогенный счет»); даже в этом случае эффективность счета не превышает 40-60%. Таким образом, более высокая чувствительность PAL Н-мечеными зондами нивелируется необходимостью частых повторных синтезов и низкой эффективностью детектирования радиоактивности.

Для синтеза «длинноцепных» фосфолипидных зондов мы использовали разработанную ранее схему синтеза [16,27] (Схема 5), заменив лишь способ получения Ме-эфира N-Dcp-12-аминододекановой кислоты (Схема 3, стадия б).

При получении N-Dcp- 12-амино[ 12-иС]додекановой кислоты мы вводили радиоактивную метку реакцией [14С]цианистого калия с кальциевой солью 11-иодундекановой кислоты 10 в водном изопропаноле. (Такой вариант обеспечивает больший выход (79%) для немеченой кислоты 11 против 40-50% после реакции калиевой соли 11-иодундекановой кислоты с KCN в водном этаноле или метаноле [16]). Гидрирование кислоты 11 приводит к 12-аминододекановой кислоте, кото

Схема 5. a) K[HC]N; 6) НС1; в) H2/Pt; г) МеОН/НС1; д) S02Cl/Na2C03; е) DcpCl + 12/ТЕА; ж) КОН, /Рг0Н-Н20; з) НС1; и) лизофосфатидилхолин, DCC/DMAP; к) сфингозин-1-фосфохолин, DCC/DMAP. рая переводится в метиловый эфир 12 и подвергается ацилированию хлорангидри-дом Dcp-киелоты (DcpCl) 13. Надо отметить, что ацилирование по аминофункции эквивалентным количеством DcpCl протекает очень быстро с полной конверсией, в отличие от конденсации с DcpOH в течение суток в присутствии дициклогексил-карбодиимида (DCC) [27]; однако потери в ходе хроматографического разделения на силикагеле (темповая реакция пришивки) реакционной смеси привели к 60%-ному выходу Ме-эфира N-Dcp-12-амино[ 12- 14С]додекановой кислоты, как и в работе [27]. Последующее омыление эфира в мягких условиях приводит к кислоте 14.

На заключительной стадии фотореактивная кислота 14 вводится в реакцию ацилирования лизофосфатидилхолина или сфингозин-1-фосфохолина путем конденсации в присутствии DCC и основного катализатора (4-диметиламинопиридина, DMAP; 4-пиперидинопиридина; 4-пирролидинопиридина). Механизм реакции заключается в том, что сначала происходит быстрое ацилирование DCC карбоксильной компонентой с образованием О-ацилизомочевины, интермедиата, обладающего высокой ацилирующей реакционной способностью, а далее следует стадия ацилирования спиртовой или амино-компоненты. Скорость протекания второй стадии зависит от реакционной способности гидроксила или аминогруппы и от активности катализатора. Если кинетика этой стадии медленная, то О-ацилизомочевина необратимо перегруппировывается в N-ацилмочевину, которая является практически неизбежным побочным продуктом реакции ацилирования. В случае сфингоидной аминогруппы реакция ацилирования в присутствии DMAP протекает достаточно эффективно, с невысоким образованием N-ацилмочевины (данные ТСХ). А замена хроматографии на силикагеле разделением на обращенной фазе после предварительной гель-фильтрации на липофильном сефадексе позволила получить фотоаффинный сфингомиелин 15 с выходом около 60% при эквимольных количествах кислоты 14 и сфингозин-1-фосфохолина.

3.2.1. Новый основный катализатор О-ацнлнрованнп

Очевидно, что ацилирование ОН-группы, и особенно малореакционноспо-собной вторичной, в условиях, описанных для ацилирования сфингоидной аминогруппы, протекает гораздо медленнее. Поэтому при синтезе фосфатидилхолина 9 из лизофосфатидилхолина наблюдалось активное образование N-ацилмочевины, и максимальные выходы продукта, даже при использовании тех же условий выделения, что для сфингомиелина 15, не превышали 25-30%. Ранее при ацилировании лизофосфатидилхолина со-цианундекановой кислотой в присутствии DCC и DMAP мы получили фосфатидилхолин с выходом 48% [16] (нерадиоактивный аналог PC 8, Схема 4), однако в этом синтезе использовался избыток ацилирующей компоненты (1.6 экв). В случае маломасштабных синтезов с применением дорогостоящих радиоактивных синтонов желательно минимизировать их потери. В связи с этим мы исследовали влияние замены катализатора на эффективность реакции ацилиро-вания лизофосфатидилхолина (лизо-РС) фотореактивной кислотой 14.

Вообще, оптимизации метода ацилирования 2-ОН-группы лизо-РС или гли-церофосфохолина модифицированными жирными кислотами является важной задачей в липидной химии и биохимии, так как различные модифицированные фос-фолипиды (фосфатидилэтаноламин, фосфатидилинозит и т.д.) обычно получают именно из синтезированных фосфатидилхолинов путем ферментативной переэте-рификации. В качестве ацилирующих по вторичному гидроксилу агентов было предложено множество производных жирных кислот: ацилхлориды [209], ангидриды [210], имидазолиды [211,212], ангидриды трифторуксусной кислоты [213], 2-тиопиридиловые эфиры [214]. Все эти методы не лишены недостатков, таких как образование побочных продуктов [209], использование повышенной температуры [209,211] и сильных оснований [212], необходимость избытка производных жирных кислот, а также низкие выходы [209,213].

Ранее Корана с сотр. [5] предложили решать задачу получения сложных эфиров глицерофосфолипидов ацилированием ангидридами кислот в присутствии DMAP (свойства DMAP, как эффективного катализатора в реакциях ацилирования были показаны ранее [219]); при введении 1.2-1.5 эквивалентов ангидрида на ОН-группу авторы получили 75-90% выходы целевых фосфолипидов. Однако данный путь требует проведения отдельной стадии получения ангидрида (с помощью DCC), а избыток самой фотореактивной кислоты, в пересчете с ангидрида, составляет уже 2.4-3 эквивалента на ОН-группу. Метод получил дальнейшее развитие, и был предложен ряд его усовершенствований, в том числе использование 4-пирро-лидинопиридина (РРу) в качестве катализатора [215,216] (РРу является еще более сильным основанием, чем DMAP), а также ультразвуковой обработки для ускорения реакции [217]. Тем не менее, и в этих случаях необходим небольшой избыток ангидрида жирной кислоты. Детальное исследование кинетики реакции показало, что наилучший результат при ацилировании лизо-РС 1.5 эквивалентом ангидрида (5 мин, выход 90%) достигается при использовании 200-кратного избытка РРу [218]. Реакция очень чувствительна к следовым количествам воды, а в случае маломасштабного синтеза обеспечить такие безводные условия весьма затруднительно. И наконец, ацилирование ангидридами ведет к теоретической потере половины исходной жирной кислоты. Был предложен вариант ацилирования без выделения промежуточных продуктов, где лизо-РС, жирная кислота, DCC и катализатор реагируют в одну стадию [220,221]4; с небольшими избытками жирной кислоты такой способ обеспечивает приемлемые (20-50%) но не всегда воспроизводимые выходы конечного продукта. Для уменьшения образования N-ацилмочевины было предложено использовать л-толуолсульфокислоту [224]. Однако в случае синтеза фотоаффинного PC присутствие такого кислого катализатора нежелательно, так как он вызывает частичную деградацию Dcp-группы (собственные результаты).

В ходе оптимизации маломасштабного процесса ацилирования лизо-РС [14С]пальмитиновой кислотой мы нашли, что эквимольные количества РРу не приводят к увеличению выхода целевого продукта по сравнению с DMAP. Однако обнаружилось, что введение больших избытков РРу (5 и более эквивалентов) существенно ускоряет ход реакции и увеличивает выход [14С]РС. Для DMAP подобного эффекта не наблюдалось. Более того, улучшение ацилирования обеспечивало именно применение препарата РРу фирмы Fluka, содержащего до 12 % примесей, но не хроматографически чистого вещества. Дальнейшие исследования показали, что эффект обусловлен присутствующим в коммерческом препарате веществом, которое после выделения и спектрального анализа (!Н-ЯМР и MS) было идентифицировано нами как 4-гидрокси-пиридин (4РуОН). Еще одним доводом в пользу 4РуОН было то, что именно из него производят РРу [225]. Однако отсутствие аутентичного вещества привело к ложному выводу. Когда препарат 4РуОН фирмы Fluka был получен, между ним и «нашим» катализатором выявились различия в

4 Этот вариант представляет собой применение в химии липидов ранее предложенного метода ацилирования [222,223]. хроматографической подвижности (ТСХ высокого разрешения), основных свойствах и каталитической активности. В то же время, наблюдались полное совпадение масс-спектров (m/z: 95 (М*), 67, 54) и сходные характеристики спектров 'Н-ЯМР: в D6-DMSO, б, м.д.: 5.1 (ушир., Н, ОН), 6.22 (дд, 2Н, 3-Н и 5-Н), 7.74 (дц, 2Н, 2-Н и 6-Н) для 4РуОН, и, соответственно, 6.01, 6.46,7.97 для нашего катализатора. УФ-спектры также были похожи (Н20, Хмакс, нм (е): 200 (14000), 254 (15500) для 4РуОН и 206 (20100), 262 (22200) для катализатора). Поскольку наш катализатор был более сильным основанием, чем 4РуОН, мы предположили, что это 4-аминопиридин (4PyNH2), который также является побочным продуктом синтеза 4РРу. Прямое сравнение с аутентичным 4PyNH2 (Fluka) подтвердило предположение: вещества были идентичны по своим хроматографическим свойствам, температурам плавления (155-157°С), УФ-, 'Н-ЯМР и масс-спектрам (m/z: 95 [М+Н]+).

Сложно представить, чтобы соединение с первичной NH2-rpynnofi катализировало реакцию ацилирования по ОН-группе. Однако ранее показано, что ацилиро-вание 4PyNH2 проходит через стадию образования высокореакционноспособного интермедиата по эндоциклическому атому N [226]:

I I

R—С=0 R—С=0

Поэтому мы полагаем, что в результате быстрого l-N-ацилирования 4PyNH2 О-ацилизомочевиной образуется высокореакционноспособный енамид (*) (Схема 6), который, в свою очередь, ацилирует гидроксил соответствующего субстрата.

Косвенно такой механизм реакции подтверждается следующими данными. При введении в эквивалентных количествах, 4PyNH2 не катализировал ацилирова-ние (Табл. 1). Очевидно, это объясняется снижением скорости образования промежуточного енамида (*), и соответственно, ростом образования N-ацилмочевины. С другой стороны, умеренный избыток 4PyNH2 (2.5 экв.) в присутствии того же количества более сильного основания РРу приводит к значительному росту скорости ацилирования. Это может объясняться ускорением образования енамида в присутствии основания. В случае 5-кратного избытка, 4PyNH2 служит и субстратом, и основанием для быстрого образования промежуточного енамида. Побочным продуктом при использовании большого избытка (более 4-5 экв.) 4PyNH2 является продукт его ацилирования по экзоциклическому атому N (**), который, возможно, образуется также в результате необратимой перегруппировки енамида (*) в амид. Это вещество было выделено из реакционной смеси препаративной ТСХ (FAB-MS: 334 [М]+).

СН3(СН2)1414СООН +

DCC п = 1 (-72%) пОС П = 3 (-28%)

СН3(СН2)^

РРу или 4PyNH2

С=0

14С]РС N

CH3(CH2)f4

С)

4PyNH2 NH14CO(CH2)14CH3

Г)

Схема 6. Вероятный механизм катализа 4-аминопиридином реакции ацилирования лизо-РС жирной кислотой в присутствии DCC.

Объяснением ускорения катализа в присутствии 4PyNH2 может быть как большая реакционная способность интермедиата (*) по сравнению с О-ацилизо-мочевиной, так и меньшие стерические затруднения, которые он испытывает при ацилировании вторичного гидроксила. Кроме того, предположительно, О-ацили-рование енамидом не требует дополнительного основного катализа и, следовательно, образования промежуточного объемистого комплекса с РРу, в отличие от ацилирования О-ацилизомочевиной [222]. Ацилирование 1,2-диглицерида по первичному гидроксилу в присутствии 4PyNH2 резко ускоряется (несколько мин), по сравнению с катализом РРу [227].

Библиография Диссертация по биологии, доктора химических наук, Водовозова, Елена Львовна, Москва

1. Klip A., Gitler С. Photoactive covalent labeling of membrane components from within the lipid core. Biochim. Biophys Res. Commun. 1974, 60,1155-1162.

2. Podo F., Blasie J.K. Nuclear magnetic resonance studies of lecithin bimolecular leaflets with incorporated fluorescent probes. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1977, 74, 10321036.

3. Greenberg G.R., Chakrabarti P., Khorana H.G. Incorporation of fatty acids containing photosensitive groups into phospholipids of Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 1976, 73, 86-90.

4. Chakrabarti P., Khorana H.G. A new approach to the study of phospholipid-protein interactions in biological membranes. Synthesis of fatty acids and phospholipids containing photosensitive groups. Biochemistry, 1975,14, 5021-5033.

5. Gupta C.M., Radhakrishnan R., Khorana H.G. Glycerophospholipid synthesis: improve general method and new analogs containing photoactivable groups. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74,4315-4319.

6. Gupta C.M., Costello C.E., Khorana H.G. Sites of intermolecular crosslinking of fatty acyl chains in phospholipids carrying a photoactivable carbene precursor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1979, 76,3139-3143.

7. Stoffel W., Schtreiber C., Scheefers H. Lipids with photosensitive groups as chemical probes for the structural analysis of biological membranes. Hoppe-Seyler^s Z. Physiol. Chem. 1978,359, 923-931.

8. Stoffel W., Salm K.P., Muller M. Syntheses of phosphatidylcholines, sphingomyelins and cholesterol substituted with azido fatty acids. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982,363,1-18.

9. Stoffel W., Metz P. Covalent cross-linking of photosensitive phospholipids to human serum high density apolipoproteins (apo HDL). Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1979, 360, 197-206.

10. Stoffel W., Metz P. Chemical studies on the structure of human serum high-density lipoprotein (HDL). Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 1982,363,19-31.

11. Richards F.M., Brunner J. General labeling of membrane proteins. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1980, 346, 144-163.

12. Молотковский Юл.Г., Лазуркина Т.Ю., Фаерман В.Н., Смоляков B.C., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина. Биоорган, химия 1980,6, 594-599.

13. Bisson R., Montecucco С. Photolabeling of membrane proteins with photoactive phospholipids. Biochemistry J. 1981,193,757-763.

14. Brunner J. Labelling the hydrophobic core of membranes. Trends Biochem. Sci. 1981, 6,44-46.

15. Водовозова Е.Л., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфатидилхолинов и сфингомиелинов с различным расстоянием между меткой и полярной группировкой. Биоорган, химия 1984,10, 1688-1694.

16. Водовозова Е.Л., Шевченко В.П., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Синтез фотореактивных фосфолипидов с высоким уровнем тритиевой метки. Биоорган, химия 1984,10, 1698-1699.

17. Молотковский Юл.Г., Маневич Е.М., Водовозова Е.Л., Букринская А.Г., Бергельсон Л.Д. Изучение молекулярной организации мембраны вируса гриппа с помощью фотореактивных и флуоресцентных фосфолипидных зондов. Биол. мембраны 1985, 2, 566-574.

18. Мартынова M.A., Маневич E.M., Водовозова Е.Л., Музя Г.И., Безуглов В.В., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Взаимодействие простагландинов с липо-протеинами низкой плотности крови человека. Биохимия 1988,53,721-727.

19. Bayley Н., Knowles J.R. Photogenerated reagents for membrane labeling. 1. Phenyl-nitrene formed within the lipid bilayer. Biochemistry 1978,17,2414-2419.

20. Khorana H.G. Chemical studies of biological membranes. Bioorg. Chem. 1980,9, 363-405.

21. Brunner J., Senn H., Richards F.M. 3-Trifluoromethyl-3-phenyldiazirine. A new car-bene generating group for photolabeling reagents. J. Biol. Chem. 1980, 255, 3313-3318.

22. Martin J.C., Bloch D.R. The dehydrocyclopentadienyl anion. A new arm. J. Amer. Chem. Soc. 1971,93,451-459.

23. Nielsen P.E., Hansen J.B., Thomsen Т., Burhardt 0. Reagents for photoaffinity labeling. Photobinding efficiency of arylazido-, diazocyclopentadienyl- and ethyldiazomalo-nyl-derivatives of 9-aminoacridine. Experientia 1983,39, 1063-1072.

24. Карюхина M.O., Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Фотореактивные фос-фолипиды. Синтез и свойства фосфатидилхолина и сфингомиелина, меченных 2-диазоциклопентадиенкарбонильной группой. Биоорган, химия 1988,14,1256-1261.

25. Knowles J.K. Photogenerated reagents for biological receptor site labeling. Acc. Chem. Res. 1972, 5, 150-160.

26. Bayley H. Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology. In Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology, vol. 10; Work T.S., Burdon R.H. Eds.; Elsevier: Amsterdam/New York/ Oxford, 1983.

27. Brunner J. Photochemical labeling of apolar phase of membranes. Methods Enzymol. 1989,172, 628-687.

28. Brunner J. New photolabeling and crosslinking methods. Annu. Rev. Biochem. 1993, 62,483-514.

29. Kotzyba-Hibert F., Kapfer I., Goeldner M. Recent trends in photoaffinity labeling. Angew. Chem., Int. Ed. 1995,34, 1296-1312.

30. Fleming S.A. Chemical reagents in photoaffinity labeling. Tetrahedron 1995,51, 12479-12520.

31. Hatanaka Y., Nakayama H., Kanaoka Y. Diazirine-based photoaffinity labeling: chemical approach to biological interfaces. Rev. Heteroatom Chem. 1996,14,213-243.

32. Dorman G., Prestwich G.D. Benzophenone photophores in biochemistry. Biochemistry \m, 33, 5661-5673.

33. F. Knoll, T. Kolter, Sandhoff K. The sphingolipid photoaffinity labels. Methods Enzymol. 2000,311,568.

34. Dorman G., Prestwich G.D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends Biotechnol. 2000,18, 64-77.

35. Hatanaka Y., Sadakane Y. Photoaffmity labeling in drug discovery and development: chemical gateway for entering proteomic frontier. Curr. Top. Med. Chem. 2002, 2,271288.

36. Singh A., Thornton E.R., Westheimer F.H. The photolysis of diazo-acetylchymotrypsin. J. Biol .Chem. 1962, 237, PC3006-PC3008.

37. Jahn 0., Eckart K., Tezval H., Spiess J. Characterization of peptide-protein interactions using photoaffmity labeling and LC/MS. Anal. Bioanal. Chem. 2004,378, 10311036.

38. Shacham S., Marantz Y., Bar-Haim S., Kalid O., Warshaviak D., Avisar N., Inbal В., Heifetz A., Fichman M., Topf M., Naor Z., Noiman S., Becker O.M. PREDICT modeling and in silico screening for G-protein coupled receptors. Proteins 2004,57, 51-86.

39. Zhang H., Karlin A. Identification of acetylcholine receptor channel-lining residues in the Ml segment of the beta-submit. Biochemistry 1997,36, 15856-15864.

40. Foucaud В., Perret P., Grutter Т., Goeldner M. Cystein mutants as chemical sensors for ligand-receptor interactions. Trends Pharmacol. Sci. 2001, 22, 170-173.

41. Fleet G.W.J., Porter R.R., Knowles J.R. The antibody binding site. Labeling of a specific antibody against the photo-precursor of an aryl nitrene. Nature 1969, 224, 511-512.

42. Smith R.A.G., Knowles J.R. Letter: Aryldiazirines. Potential reagents for photolabel-ing of biological receptor sites. J. Am. Chem. Soc. 1973, 95, 5072-5073.

43. Galardy R.E., Craig L.C., Printz M.P. Benzophenone triplet: a new photochemical probe of biological ligand-receptor interactions. Nature New Biol. 1973, 242,127-128.

44. Chowdhry V., Vaughan R., Westheimer F.H. 2-diazo-3,3,3-trifluoropropionyl chloride: reagent for photoaffmity labeling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1976,73,1406-1408.

45. Goeldner M., Hirth C. Specific photoaffmity labeling induced by energy transfer: application to irreversible inhibition of acetylcholinesterase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77, 6439-6442.

46. Young M.J.T., Platz M.S. Polyfluorinated aryl azides as photoaffmity labelling reagents; the room temperature CH insertion reactions of singlet pentafluorophenyl nitrene with alkanes. Tetrahedron Lett. 1989,30,2199-2202.

47. Goeldner M., Hawkinson J.E., Casida J.E. Diazocyclohexadienones as photoaffmity ligands: synthesis of trioxabicyclooctane probes for the convulsant binding site of the GABAa receptor. Tetrahedron Lett. 1989,30, 823-826.

48. Колпащиков Д.М., Захаренко A.JL, Дежуров С.В., Речкунова Н.И., Ходырева С.Н., Дегтярев С.Х., Литвак В.В., Лаврик О.И. Новые реагенты для аффинной модификации биополимеров. Фотоаффинная модификация Tte-ДНК-полимеразы. Биоорган, химия 1999,25, 129-136.

49. Turro N.J. Structure and dynamics of important reactive intermediates involved in photobiological systems. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980,346, 1-17.

50. Gritsan N.P., Yuzawa Т., Platz M.S. Direct observation of singlet phenylnitrene and measurement of its rate of rearrangement. J. Am. Chem. Soc. 1997,119, 5059-5060.

51. Lwowski W. Nitrenes in the photochemistry labeling: speculation of an organic chemist. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1980,346,491-500.

52. Borden W.T., Gritsan N.P., Hadad C.M., Karney W.L., Kemnitz C.R., Platz M.S. The interplay of theory and experiment in the study of phenylnitrene. Acc. Chem. Res. 2000, 33,765-771.

53. Gritsan N.P., Zhai H.B., Yazawa Т., Karweik D., Brooke J., Platz M.S. Spectroscopy and kinetics of singlet perfluoro-4-biphenylnitrene and singlet perfluorophenylnitrene. J. Phys. Chem. A 1997,107,2833-2840.

54. Ruhmann A., Wentrup C. Synthesis of a photoactivatable 9-Z-oleic acid for protein kinase С labeling. Tetrahedron 1994,50, 3785-3796.

55. Nassal M. 4'-(l-Azi-2,2,2-trifluoroethyl)phenylalanine, aphotolabile carbene-generating analog of phenylalanine. J. Am. Chem. Soc. 1984,106,7540-7545.

56. Platz M., Admasu A.S., Kwiatkowski S., Crocker P.J., Imai N., Watt D.S. Photolysis of 3-aryl-3-(trifluoromethyl)diazirines: a caveat regarding their use in photoaffinity probes. Bioconjugate chem. 1991, 2, 337-341.

57. Jahn O., Hofmann B.A., Brauns O., Spiess J., Eckart K. The use of multiple ion chromatograms in on-line HPLC-MS for the characterization of post-translational and chemical modifications of proteins. Int. J. Mass. Spectrom. 2002, 214, 37-51.

58. Hino N., Okazaki Y., Kobayashi Т., Hayashi A., Sakamoto K., Yokoyama S. Protein photo-cross-linking in mammalian cells by site-specific incorporation of a photoreactive amino acid. Nature Methods 2005,2, 201-206.

59. Farrelli I.S., Toroney R., Hazen J.L., Mehl R.A., Chin J.W. Photo-cross-linking interacting proteins with a genetically encoded benzophenone. Nature Methods 2005, 2, 377384.

60. Weber P.J.A., Becksickinger A.G. Comparison of the photochemical behavior of four different photoactivatable probes. J. Peptide Res. 1997, 49, 375-383.

61. Bisello A., Adams A.E., Mierke D.F., Pellegrini M., Rosenblatt M., Suva L.J., Chorev M. Parathyroid hormone-receptor interactions identified directly by photocross-linking and molecular modeling studies. J. Biol Chem. 1998, 273,22498-22505.

62. Behar V., Bisello A., Rosenblatt M., Chorev M. Direct identification of two contact sites for parathyroid hormone (PTH) in the novel PTH-2 receptor using photoaffinity cross-linking. Endocrinology 1999,140,4251-4261.

63. Tate J. J., Persinger J., Bartholomew B. Survey of four different photoreactive moieties for DNA photoaffinity labeling of yeast RNA polymerase III transcription complexes. Nucleic Acids Res. 1998,26, 1421-1426.

64. Gilbert B.A., Rando R.R. Modular design of biotinylated photoaffinity probes: synthesis and utilization of a biotinylated pepstatin photoprobe. J. Am. Chem. Soc. 1995, 117,8061-8066.

65. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kanaoka Y. A rapid and efficient method for identifying photoaffinity biotinylated sites within proteins. J. Am. Chem. Soc. 1998,120,453-454.

66. Jahn O., Tezval H., Spiess J., Eckart K. Tandem mass spectrometric characterization of branched peptides derived from photoaffinity labeling. Int. J. Mass Spectrom. 2003, 228, 527-540.

67. Li C., Xu W., Vadivel S.K., Fan P., Makriyannis A. High affinity electrophilic and photoactivatable covalent endocannabinoid probes for the CB1 receptor. J. Med. Chem. 2005,48, 6423-6429.

68. Paul-Pletzer K., Yamamoto Т., Ikemoto N., Jimenez L.S., Morimoto H., Williams P.G., Ma J., Parness J. Probing a putative dantrolene-binding site on the cardiac ryanodine receptor. Biochem. J. 2005,387,905-909.

69. Kramer W., Corsiero D., Girbig F., Jahne G. Rabbit small intestine does not contain an annexin II/caveolin 1 complex as a target for 2-azetidinone cholesterol absorption inhibitors. Biochim. Biophys. Acta Biomembranes 2006,1758,45-54.

70. Lee H.K., Zheng Y.F., Xiao X.-Y., Bai M., Sakakibara J., Ono Т., Prestwich G.D. Photoaffinity labeling identifies the substrate-binding site of mammalian squalene epoxi-daxe. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004, 315, 1-9.

71. Ohgami N., Ко C.D., Thomas M„ Scott P.M., Chang C.C.Y., Chang T.-Y. Binding between the Niemann-Pick CI protein and a photoactivatable cholesterol analog requires a functional sterol-sensing domain. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2004,101,12473-12478.

72. Wu Z., Hasan A., Liu Т., Teller D.C., Crabb J.W. Identification of CRALBP ligand interactions by photoaffinity labeling, hydrogen/deuterium exchange, and structural modeling. J. Biol. Chem. 2004,279,27357-27364.

73. Borhan В., Souto M. L., Imai H., Shichida Y., Nakanishi K. Movement of retinal along the visual transduction path. Science 2000, 288,2209-2212.

74. Demers A., Mcnicoll N., Febbraio M., Servant M., Marleau S, Silverstein R., Ong H. Identification of the growth hormone-releasing peptide binding site in CD36: a photoaffinity cross-linking study. Biochem. J. 2004,382,417-424.

75. Alqwai О., Poelarends G., Konings W.N., Georges E. Photoaffmity labeling under non-energized conditions of a specific drug-binding site of the ABC multidrug transporter LmrA from Lactococcus lactis. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003,311, 696701.

76. Vaughan R.A., Parnas M.L., Gaffaney J.D., Lowe M.J., Wirtz S., Pham A., Reed В., Dutta S.M., Murray K.K., Justice B.J. Affinity labeling the dopamine transporter ligand binding site. J. Neurosci. Meth. 2005,143, 33-40.

77. Vaughan R.A., Gaffaney J.D., Lever J.R., Reith M.E.A., Dutta A.K. Dual incorporation of photoaffmity ligands on dopamine transporters implicates proximity of labeled domains. Mol. Pharmacol. 2001, 59,1157-1164.

78. Dohlman H.G., Caron M.G., Strader C.D., Amlaiky N., Lefkowitz R.J. Identification and sequence of a binding site peptide of the beta 2-adrenergic receptor. Biochemistry 1988,27,1813-1817.

79. Janovick J. A., Haviv F., Fitzpatrick T.D., Conn P.M. Differential orientation of a GnRH agonist and antagonist in the pituitary GnRH receptor. Endocrinology 1993,133, 942-945.

80. Kennedy A.P., Mangum K.C., Linden J., Wells J.N. Covalent modification of trans^ membrane span III of the A1 adenosine receptor with an antagonist photoaffmity probe. Mol. Pharmacol. 1996, 50,789-798.

81. Li Y.M., Marnerakis M., Stimson E.R., Maggio J.E. Mapping peptide-binding domains of the substance P (NK-1) receptor from P388D1 cells with photolabile agonists. J. Biol. Chem. 1995, 270, 1213-1220.

82. Boucard A.A., Sauve S.S., Guillemette G., Escher E., Leduc R. Photolabelling the rat urotensin II/GPR14 receptor identifies a ligand-binding site in the fourth transmembrane domain, Biochem. J. 2003,370, 829-838.

83. Hein L., Barsh G.S., Pratt R.E., Dzau V.J., Kobilka B.K. Behavioural and cardiovascular effects of disrupting the angiotensin II type-2 receptor gene in mice. Nature 1995,377,744-747.

84. Hjorth S.A., Schambye H.T., Greenlee W.J., Schwartz T.W. Identification of peptide binding residues in the extracellular domains of the ATI receptor. J. Biol. Chem. 1994, 269, 30953-30959.

85. Nikiforovich G.V., Marshall G.R. 3D Model for TM Region of the AT-1 receptor in complex with angiotensin II independently validated by site-directed mutagenesis data. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001,286,1204-1211.

86. Yamano Y., Ohyama K., Kikyo M., Sano Т., Nakagomi Y., Inoue Y., Nakamura N., Morishima I., Guo K.-F., Hamakubo Т., Inagami T. Mutagenesis and the molecular modeling of the rat angiotensin II receptor (ATj). J. Biol. Chem. 1995, 270,14024-14030.

87. Behar V., Bisello A., Rosenblatt M., Chorev M. Direct identification of two contact sites for parathyroid hormone (PTH) in the novel PTH-2 receptor using photoaffinity crosslinking. Endocrinology 1999,140,4251-4261.

88. Dong M., Pinon D.I., Cox R.F., Miller L.J. Molecular approximation between a residue in the amino-terminal region of calcitonin and the third extracellular loop of the class В G protein-coupled calcitonin receptor. J. Biol. Chem. 2004,279,31177-31182.

89. Tan Y.V., Couvineau A., Van Rampelbergh J., Laburthe M. Photoaffinity labeling demonstrates physical contact between vasoactive intestinal peptide and the N-terminal ectodomain of the human VP AC 1 receptor. J. Biol. Chem. 2003, 278, 36531-36536.

90. Pham V.I., Sexton P.M. Photoaffinity scanning in the mapping of the peptide receptor interface of class II G protein coupled receptors. J. Pept. Sci. 2004,10,179-203.

91. Assil I.Q., Qi L.J., Arai M., Shomali M., Abou-Samra A.B. Juxtamembrane region of the amino terminus of the corticotropin releasing factor receptor type 1 is important for ligand interaction. Biochemistry 2001,40, 1187-1195.

92. Klose J., Fechner K., Beyermann M., Krause E., Wendt N., Bienert M., Rudolph R., Rothemund S. Impact of N-terminal domains for corticotropin-releasing factor (CRF) receptor-ligand interactions. Biochemistry 2005,44,1614-1623.

93. Kraetke O., Holeran В., Berger H., Escher E., Bienert M., Beyermann M. Photoaffinity cross-linking of the corticotropin-releasing factor receptor type 1 with photoreac-tive urocortin analogues. Biochemistry 2005,44,15569-15577.

94. Bonk I., Ruhmann A. Development of a selective photoactivatable antagonist for corticotrophin-releasing factor receptor, type 2 (CRF2). Eur. J. Biochem. 2002,269, 5288-5294.

95. Grutter Т., Changeux J.P. Nicotinic receptors in wonderland. Trends Biochem. Sci. 2001,26,459-463.

96. Mourot A., Grutter Т., Goeldner M., Kotzyba-Hibert F. Dynamic structural investigations on the Torpedo nicotinic acetylcholine receptor by time-resolved photoaffinity labeling. ChemBioChem 2006, 7, 570-583.

97. Changeux J.P., Edelstein S.J. Allosteric receptors after 30 years. Neuron 1998,21, 959-980.

98. Hucho F., Tsetlin V.I., Machold J. The emerging three-dimensional structure of a receptor. The nicotinic acetylcholine receptor. Eur. J. Biochem. 1996, 239, 539-557.

99. Brejc K., van Dijk W.J., Klaassen R.V., Schuurmans M., van der Oost J., Smit A.B., Sixma Т.К. Crystal structure of an ACh-binding protein reveals the ligand-binding domain of nicotinic receptors. Nature 2001, 411, 269-276.

100. Unwin N. Refined structure of the nicotinic acetylcholine receptor at 4A° resolution. J. Mol. Biol. 2005,346, 967-989.

101. Middleton R.E., Cohen J.B. Mapping of the acetylcholine binding site of the nicotinic acetylcholine receptor: 3H.nicotine as an agonist photoaffinity label. Biochemistry 1991,30,6987-6997.

102. Kotzyba-Hibert F., Grutter Т., Goeldner M. Molecular investigations on the nicotinic acetylcholine receptor: conformational mapping and dynamic exploration using photoaffinity labeling. Mol. Neurobiol. 1999, 20,45-59.

103. Addona G.H., Kloczewiak M.A., Miller K.W. Time-resolved photolabeling of membrane proteins: application to the nicotinic acetylcholine receptor. Anal. Biochem. 1999,267,135-140.

104. Galzi J., Revah F., Bouet F., Menez A., Goeldner M., Hirth C., Changeux J. Allos-teric transitions of the acetylcholine receptor probed at the amino acid level with a photo-labile cholinergic ligand. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991,88, 5051-5055.

105. Grutter Т., Bertrand S., Kotzyba-Hibert F., Bertrand D., Goeldner M. Structural reorganization of the acetylcholine binding site of the Torpedo nicotinic receptor as revealed by dynamic photoaffinity labeling. ChemBioChem 2002,3, 652-658.

106. Ziebell M.R., Nirthanan S., Husain S.S., Miller K.W., Cohen J.B. Identification of• • • 4 •binding sites in the nicotinic acetylcholine receptor for H.azietomidate, a photoactivatable general anesthetic. J. Biol. Chem. 2004,279,17640-17649.

107. Wiegandt H., in: Neuberger A., Van Deenen L.L.M. (Eds.). Gangliosides. New Comprechensive Biochemistry, vol. 10. Elsevier, Amsterdam, 1985, pp. 199-260.

108. Hakomori S.-I. Bifunctional role of glycosphingolipids. Modulators for transmembrane signaling and mediators for cellular interactions. J. Biol. Chem. 1990, 265,1871318716.

109. Yates A.J., Rampersaud A. Sphingolipids as receptor modulators. An overview. Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1998, 845, 57-71.

110. Vanmeer G., Lisman Q. Sphingolipid transport: Rafts and translocators. J. Biol. Chem., 2002,277,25855-25858.

111. Bektas M., Spiegel S. Glycosphingolipids and cell death. Glycoconjugate J. 2003, 20,39-47.

112. Neuenhofer S., Schwarzmann G., Egge H., Sandhoff K. Synthesis of lysogan-gliosides. Biochemistry 1985,24, 525-532.

113. Anderson R.G.W. The caveolae membrane systems. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 199-225.

114. Helms J.B., Zurzolo C. Lipids as targeting signals: lipid rafts and intracellular trafficking. Traffic 2004,5,247-254.

115. Fra M.A., Masserini M., Palestini P., Sonnino S., Simons K. A photo-reactive derivative of ganglioside GM1 specifically cross-links VIP21-caveolin on the cell surface. FEBSLett. 1995,375,11-14.

116. Mauri L., Prioni S., Loberto N., Chigorno V., Prinetti A., Sonnino S. Synthesis of radioactive and photoactivable ganglioside derivatives for the study of ganglioside-protein interactions. Glycoconjugate J. 2004,20,11-23.

117. Loberto N., Prioni S., Prinetti A., Ottico E., Chigorno V., Karagogeos D., Sonnino S. The adhesion protein TAG-1 has a ganglioside environment in the sphingolipidenriched membrane domains of neuronal cells in culture. J. Neurochem. 2003, 85,224233.

118. Palestini P., Pitto M., Tedeschi G., Ferraretto A., Parenti M., Brunner J., Masserini M. Tubulin anchoring to glycolipid-enriched, detergent-resistant domains of the neuronal plasma membrane. J. Biol. Chem. 2000, 275,9978-9985.

119. Wendeler M., Hoernschemeyer J., Hoffmann D., Kolter Т., Schwarzmann G., Sand-hoff K. Photoaffinity labelling of the human GM2-activator protein (mechanistic insight into ganglioside GM2 degradation). Eur. J. Biochem. 2004,271, 614-627.

120. Shapiro R.E., Specht C.D., Collins B.E., Woods A.S., Cotter R.J., Schpaar R.L. Identification of a ganglioside recognition domain of Tetanus Toxin using a novel ganglioside photoaffinity ligand. J. Biol. Chem. 1997, 272, 30380-30386.

121. Alcaraz M.-L., Peng L., Klotz P., Goeldner M. Synthesis and properties of photoac-tivatable phospholipid derivatives designed to probe the membrane associated domains of proteins. J. Org. Chem. 1996, 61,192-201.

122. Arnold B.R., Scaiano J.C., Bucher G.F., Sander W.W. Laser flash photolysis studies on 4-oxocyclohexa-2,5-dienylidenes. J. Org. Chem. 1992, 57, 6469-6474.

123. Weber Т., Brunner J. 2-(tributylstannyl)-4-3-(trifluoromethyl)-3tf-diazirin-3-yl.benzyl alcogol: a building reagents of very high specific radioactivity. J. Am. Chem. Soc. 1995,117,3084-3095.

124. Durrer P., Gaudin Y., Ruigrok R.W.H., Graf R., Brunner J. Photolabeling identifies a putative fusion domain in the envelope glycoprotein of rabies and esicular stomatitis viruses. J. Biol. Chem. 1995, 270, 17575-17581.

125. Peng Q., Xia Y., Qu F., Wu X., Campese D., Peng L. Synthesis of a photoactivat-able phospholipidic probe containing tetrafluorophenylazide. Tetrahedron Lett. 2005, 46, 5893-5897.

126. Delfino J.M., Schtreiber S.L., Richards M.F. Design, synthesis and properties of a photoactivatable membrane-spanning phospholipidic probe. J. Am. Chem. Soc. 1993, 115,3458-3474.

127. Zegers M.M.P., Kok J.W., Hoekstra D. Use of photoactivatable sphingolipid analogues to monitor lipid transport in mammalian cells. Biochem. J. 1997,328,489-498.

128. Prestwich G.D., in: Bruzik K.S. (Ed.). Phosphoinositides: Chemistry, Biochemistry and Biomedical Applications, vol. 818. Probing phosphoinositide polyphosphate binding to proteins, American Chemical Society, 1999, pp. 24-37.

129. Chaudhary A., Chen J., Gu Q.-M., Witke W., Kwiatkowski D.J., Prestwich G.D. Probing the phosphoinositide 4,5-bwphosphate binding site of human profilin I. Chem. Biol. 1998, 5,273-281.

130. Giraldo A.M.V., Castello P.R., Flechaa F.L.G., Moeller J.V., Delfino J.M., Rossi J.P.F.C. Stoichiometry of lipid-protein interaction assessed by hydrophobic photolabeling. FEBSLett. 2006, 580,607-612.

131. Persinger J., Bartholomew B. Mapping the contacts of yeast TFIIIB and RNA polymerase III at various distances from the major groove of DNA by DNA photoaffmity labeling./. Biol. Chem. 1996, 271, 33039-33046.

132. Кнорре Д.Г., Кудряшова Н.В., Лаврик О.И. Химические подходы к изучению матричного биосинтеза: исследование репликации и обратной транскрипции. Успехи химии 1998, 67, 486-502.

133. Lavrik O.I., Nasheuer Н.Р., Weisshart К., Wold M.S., Prasad R., Beard W.A., Wilson S.H., Favre A. Subunits of human replication protein A are crosslinked by photoreac-tive primers synthesized by DNA polymerases. Nucl. Acids Res. 1998,26, 602-607.

134. Kolpashchikov D.V., Khodyreva S.N., Khlimankov D.Y., Wold M.S., Favre A., Lavrik O.I. Polarity of human replication protein A binding to DNA. Nucl. Acids Res. 2001,29,373-379.

135. Лебедева H.A., Речкунова Н.И., Дежуров C.B., Дегтярев С.Х., Лаврик О.И. Фотоактивные аналоги dTTP как субстраты термостабильной ДНК-полимеразы из Thermus thermophilus В35. Биоорган, химия 2004,30, 369-374.

136. Dezhurov S.V., Khodyreva S.N., Plekhanova E.S., Lavrik O.I. A new highly efficient photoreactive analogue of dCTP. Synthesis, characterization, and application in photoaffinity modification of DNA binding proteins. Bioconjug. Chem. 2005,16,215222.

137. Свердлов Е.Д., Царев С.А. Субъединицы РНК-полимеразы Е. coli, контактирующие с 5'-концом РНК на разных стадиях транскрипции. Биоорган, химия 1980, 6, 1110-1113.

138. Годовикова Т.С., Березовский М.В., Кнорре Д.Г. Фотоаффинная модификация аминокислотных производных олигонуклеотидов в комплементарном комплексе. Биоорган, химия 1995, 21, 858-867.

139. Godovikova T.S., Knorre V.D., Maksakova G.A., Sil'nikov V.N. Synthesis of azi-doaniline derivatives of oligonucleotides and investigation of their photochemical behavior. Bioconjugate Chem. 1996, 7, 343-348.

140. Gabius H.-J., Siebert Н.-С., Andre S., Jimenez-Barbero J., Rudiger H. Chemical biology of the sugar code. ChemBioChem 2004, 5, 740-764.

141. Lauc G., Barisic K., Zanic T. The photoreactive carbohydrate probe: a novel method for detection of lectins. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1995,33, 933-937.

142. Lauc G., Lee R.T., Dumic J., Lee Y.C. Photoaffinity glycoprobes a new tool for the identification of lectins. Glycobiology 2000,10,357-364.

143. Hatanaka Y., Kempin U., Jongjip P. One-step synthesis of biotinyl photoprobes from unprotected carbohydrates. J. Org. Chem. 2000, 65, 5639-5643.

144. Hashimoto M., Yang J., Holman G.D. Cell-surface recognition of biotinylated membrane proteins requires very long spacer arms: an example from glucose-transporter probes. Chembiochem. 2001, 2, 52-59.

145. Hashimoto M., Okamoto S., Nabeta K., Hatanaka Y. Enzyme cleavable and biotinylated photoaffinity ligand with diazirine. Bioorgan. Med. Chem. Lett. 2004,14,24472450.

146. Ballell L., Alink K.J., Slijper M., Versluis C., Liskamp R.M.J., Pieters R.J. A new chemical probe for proteomics of carbohydrate-binding proteins. Chembiochem 2005, 6, 291-295.

147. Wiese K.H. Exoisomer of dicyclopentadiene dicarboxylic acid. U.S. Patent 2781395 (Feb. 1957).

148. Franklin W.E., Mack C.H., Rowland S.P. Dissociation and Diels-Alder reactions of dicyclopentadienedicarboxylic esters. J. Org. Chem. 1968,33, 626-632.

149. Chen X., Ruckenstein E. Thermally reversible covalently bonded linear polymers prepared from a dihalide monomer and a salt of dicyclopentadiene dicarboxylic acid. J. Polym. Sci., Part A, Polym. Chem. 2000,38,1662-1672.

150. Ando W., Sakai Y., Migita T. Photolysis of diazocyclopentadiene. Reactivity of cyclopentadienylidene in sulfides and ethers. Tetrahedron 1973, 29, 3511-3519.

151. Kassaee M.Z., Nimlos M.R., Downie K.E., Waali E.E. A mndo study of 3-, 5-, 7-and 9-membered carbocyclic, completely conjugated, planar carbenes and their nonplanar isomers. Tetrahedron 1985,41,1579-1586.

152. Mironov V.A., Sobolev E.V., Elizarova A.N. Some general characteristic properties of substituted cyclopentadienes. Tetrahedron 1963, 19, 1939-1958.

153. Peters D. Cyclopentadienecarboxylic acid. The structure of the monomer and the dimers. J. Chem. Soc. 1959,1761-1765.

154. Brunner J., Richards F.M. Analysis of membranes photolabeled with lipid analogues. Reaction of phospholipids containing a disulfide group and a nitrene or carbene precursor with lipids and with gramicidin A. J. Biol. Chem. 1980,255,3319-3329.

155. Schroit A.J., Madsen J., Ruoho A.E. Radioiodinated, photoactivatable phosphatidylcholine and phosphatidylserine: transfer properties and differential photoreactive interaction with human erythrocyte membrane proteins. Biochemistry 1987, 26,1812-1819.

156. Ross A.H., Radhakrishnan R., Robson R.J., Khorana H.G. The transmembrane domain of glycophorin A as studied by cross-linking using photoactivatable phospholipids. J. Biol. Chem. 1982, 257,4152-4161.

157. Bisson R., Steffens G.C.M., Buse G. Localization of lipid binding domains on sub-unit II of beef heart cytochrome с oxidase. J. Biol. Chem. 1982, 257, 6716-6720.

158. Montecucco C., Schiavo G., Brunner J., Duflot E., Boquet P., Roa M. Tetanus toxin is labeled with photoactivatable phospholipids at low pH. Biochemistry 1986, 25,919924.

159. Brunner J., Spiess M., Aggeler R., Huber F., Semenza G. Hydrophobic labeling of a single leaflet of the human erythrocyte membrane. Biochemistry 1983, 22,3812-3820.

160. Montecucco С., Schiavo G. l-Palmitoyl-2-(P-benzoyl)benzoyl phosphatidylcholine, a photoactive phospholipid for the labeling of membrane components. Biochem. J. 1986, 237,309-312.

161. Baer E., Buchnea D. Synthesis of saturated and unsaturated L-a-lecithins. Acylation of the cadmium chloride compound of L-a-glycerylphosphorylcholine. Can. J. Biochem. Physiol. 1959,37, 953-959.

162. Robles C.E., Van Den Berg D. Synthesis of lecithins by acylation of 0-(s«-glycero-3-phosphoryl)choline with fatty acid anhydrides. Biochim. Biophys. Acta. 1969,187, 520-526.

163. Boss W.F., Kelley C.J., Landsberger F.R. A novel synthesis of spin label derivatives of phosphatidylcholine. Anal. Biochem. 1975, 64,289-292.

164. Warner T.G., Benson A.A. An improved method for the preparation of unsaturated phosphatidylcholines: acylation of 5«-glycero-3-phosphorylcholine in the presence of sodium methylsulfinylmethide. J. Lipid Res. 1977,18, 548-552.

165. Pugh E.L., Kates M. A simplified procedure for synthesis of di-14C.acyl-labeled lecithins. J. Lipid Res. 1975,16, 392-394.

166. Nicholas A.W., Khouri L.G., Ellington J.C., Porter N.A. Synthesis of mixed-acid phosphatidylcholines and high pressure liquid chromatographic analysis of isomeric lysophosphatidylcholines. Lipids 1983,18, 434-438.

167. Patel K.M., Morrisett J.D., Sparrow J.T. A convenient synthesis of phosphatidylcholines: acylation of sn-glycero-3-phosphocholine with fatty acid anhydride and 4-pyrrolidinopyri-dine. J. Lipid Res. 1979, 20, 674-677.

168. Mason J.T., Broccoli A.V., Huang C. A method for the synthesis of isomerically pure saturated mixed-chain phosphatidylcholines. Anal. Biochem. 1981,113, 96-101.

169. Mena P.L., Djerassi C. Synthesis of 5,9-hexacosadienoic acid phospholipids. 11. Phospholipid studies of marine organisms. Chem. Phys. Lipids 1985, 37,257-270.

170. Mangroo D., Gerber G.E. Phospholipid synthesis: effects of solvents and catalysts on acylation. Chem. Phys. Lipids 1988,48,99-108.

171. Steglich W., Hoefle G. A^-DimethyM-pyridinamine, a very effective acylation catalyst. Angew. Chem., Int. Ed. Eng. 1969, 8,981.

172. Молотковский Юл.Г., Бергельсон Л.Д. Периленоилмеченые липид-специфические флуоресцентные зонды. Биоорган, химия 1982, 8,1256-1262.

173. Orlando P., Giordano С., Binaglia L., De Sanctis G. The synthesis of 1,2-dioleoyl-sn-2- H.glycero-3-phosphoserine. J. Labelled Сотр. Radiopharm. 1984, 21,497-505.

174. Hassner A., Alexanian V. Direct room temperature esterification of carboxylic acids. Tetrahedron Lett. 1978,19, 4475-4478.

175. Neises В., Steglich W. Simple method for the esterification of carboxylic acids. Angew. Chem., Int. Ed. Eng. 1978,17, 522-524.

176. Salari H., Eigendorf G.K. Detection of lyso-platelet-activating factor by high-performance liquid chromatography after derivatisation with fluorescent fatty acids. J. Chromatogr. A 1990, 527,303-314.

177. Fieser M., Fieser L.F., in: Reagents for Organic Synthesis, vol. 4. A Wiley-Interscience Publication, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1974, p. 416.

178. Joule J.A., Smith G.F., in: Heterocyclic Chemistry, Chapter 3. Van Nostrand Rei-hold Co., London, 1972.

179. Водовозова E.JI., Евдокимов Д.В., Молотковский Юл.Г. Синтез липидного производного противоопухолевого препарата метотрексата. Биоорган, химия 2004, 30, 663-665.

180. Tretiakov V.E., Degtyarenko K.N., Uvarov V.Yu., Archakov A.I. Secondary structure and membrane topology of cytochrome P450s. Arch. Biochem. Biophys. 1989,275, 429-439.

181. Nelson D.R., Strobel H.W. On the membrane topology of vertebrate cytochrome P-450 proteins. J. Biol. Chem. 1988, 263, 6038-6050.

182. Vergeres G., Winterhalter K.H., Richter C. Identification of the membrane anchor of microsomal rat liver cytochrome P-450. Biochemistry 1989,28, 3650-3656.

183. Vergeres G., Winterhalter K.H., Richter C. Localization of the N-terminal methionine of rat liver cytochrome P-450 in the lumen of the endoplasmic reticulum. Biochim. Biophys. Acta 1991,1063,235-241.

184. Black S.D., Martin S.T., Smith C.A. Membrane topology of liver microsomal cytochrome P450 2B4 determined via monoclonal antibodies directed to the halt-transfer signal. Biochemistry 1994,33, 6945-6951.

185. Das М.К., Lindstrom J. Epitope mapping of antibodies to acetylcholine receptor alpha subunits using peptides synthesized on polypropylene pegs. Biochemistry 1991,30, 2470-2477.

186. Frey A.B., Waxman D.J., Kreibich G. The structure of phenobarbital-inducible rat liver cytochrome P-450 isoenzyme PB-4. Production and characterization of site-specific antibodies. J. Biol. Chem. 1985,260, 15253-15265.

187. Miller J.P., Herbette L.G., White R.E. X-ray diffraction analysis of cytochrome P450 2B4 reconstituted into liposomes. Biochemistry 1996,35, 1466-1474.

188. Shank-Retzlaff M.L., Raner G.M., Coon M.J., Sligar S.G. Membrane topology of cytochrome P450 2B4 in Langmuir-Blodgett monolayers. Arch. Biochem. Biophys. 1998, 359, 82-88.

189. Wu J., So S.-P., Ruan K.-H. Determination of the membrane contact residues and solution structure of the helix F/G loop of prostaglandin 12 synthase. Arch. Biochem. Biophys. 2003,411,27-35.

190. Deng H., Wu J., So S.-P., Ruan K.-H. Identification of the residues in the helix F/G loop important to catalytic function of membrane-bound prostacyclin synthase. Biochemistry 2003; 42, 5609-5617

191. Greenwood F.C., Hunter W.M., Glover J.S. The preparation of I-131-labelled human growth hormone of high specific radioactivity. Biochem. J. 1963, 89, 114-123.

192. Bayse G.S., Morrison M. Peroxidase catalyzed reactions of iodide at low pH. Arch. Biochem. Biophys. 1971,145,143-148.

193. Moerlein S.M., Beyer W, Stocklin G. No-carrier-added radiobromination and ra-dioiodination of aromatic rings using in situ generated peracetic acid. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I 1988, 779-786.

194. Bolton A.E., Hunter W.M. The labelling of proteins to high specific radioactivity by conjugation to a 125I-containing acylating agent. Biochem. J. 1973,133, 529-539.

195. Macdonald S.G., Dumas J.J., Norman D.B. Chemical cross-linking of substance P (NK-1) receptor to the alpha subunits of the G proteins Gq and Gil. Biochemistry 1996, 35,2909-2916.

196. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kurihara H., Nakayama H., Kanaoka Y. A novel family of aromatic diazirines for photoaffinity labeling. J. Org. Chem. 1994,59,383-387.

197. Li G.; Bittman R. Synthesis of novel phenoxy-linked diazirine glycero- and sphin-golipid probes via trialkylaryltin intermediates. Tetrahedron Lett. 2000,41, 6737-6741.

198. Hatanaka Y., Hashimoto M., Kurihara H., Nakayama H., Kanaoka Y. Versatile synthesis of phenoxydiazirine based fatty acid analogues and photoreactive galactosylcera-midc.J. Org. Chem. 1994,59,383-387.

199. Hashimoto M., Kato Y., Hatanaka Y. Simple method for the introduction of iodo-label on (3-trifluoromethyl) phenyldiazirine for photoaffinity labeling. Tetrahedron Lett. 2006,47,3391-3394.

200. Merkushev E.B., Simakhina N.D., Koveshnikova G.M. A new, convenient iodina-tion method of aromatic compounds. Synthesis 1980,486.

201. Farah K., Farouk N. Electrophilic radioiodination of tyrosine derivatives. J. Labelled Compd. Radiopharm. 1998, XL1,255-259.

202. Cram D.J., Partos R.D. Electrophilic substitution and other reactions of diazo-cyclopentadiene. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 1273-1277.

203. Markwell M.A.K. A new solid-state reagents to iodinate proteins: conditions for the efficient labelling of antiserum. Anal. Bochem. 1982,125,427-432.

204. Turro N.J. Modern Molecular Photochemistry, Benjamin/Cummings, New York, 1978, pp. 125,126,192.

205. Watt D.S., Kawada K., Leyva E., Platz M.S. Exploratory photochemistry of iodi-nated aromatic azides. Tetrahedron Lett. 1989,30, 899-902.

206. Бюлер К., Пирсон Д. Органические синтезы: Пер. с англ. М.: Мир, 1973, Т. 1, С. 201. (Buehler С.А., Pearson D.E. Survey of Organic Syntheses. A division of John Wiley and Sons, Inc., New York, London, Sydney, Toronto, 1970).

207. Wilson J. A., Skehel J. J., Wiley D.C. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at ЗА resolution. Nature 1981, 289, 366-378.

208. Keil W., Niemann H., Schwarz R.T., Klenk H.-D. Carbohydrates of influenza virus. V. Oligosaccharides attached to individual glycosylation sites of the hemagglutinin of fowl plague virus. Virology 1984,133, 77-91.

209. Weber Т., Paesold G., Galli C., Mischler R., Semenza G., Brunner J. Evidence for H(+)-induced insertion of influenza hemagglutinin HA2 N-terminal segment into viral membrane. J. Biol. Chem. 1994, 269,18353-18358.

210. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophag T4. Nature 1970, 227, 680-685.

211. Masserini M., Palestini P., Pitto M. Glycolipid-enriched caveolae-like domains in the nervous system./. Neurochem. 1999, 73,1-11.

212. Hakomori S. Tumor malignancy defined by aberrant glycosylation and sphingo(glyco)lipid metabolism. Cancer Res. 1996, 56, 5309-5318.

213. Olshefski R., Ladisch S. Intercellular transfer of shed tumor cell gangliosides. FEBS Lett. 1996,386, 11-14.

214. Jackson K.M., Yates A.J., Orosz C.G., Whitacre C.C. Gangliosides suppress the proliferation of autoreactive cells in experimental allergic encephalomyelitis: ganglioside effects on IL-2 activity. Cell Immunol 1987,104,169-181.

215. Chu J.W., Sharom F.J, Gangliosides interact with interleukin-4 and inhibit inter-leukin-4-stimulated helper T-cell proliferation. Immunology 1995,84, 396-403.

216. Ярилин A.A. Основы иммунологии. M.: Медицина, 1999, С. 247-259.

217. Mott H.R., Driscoll Р.С., Boyd J., Cooke R.M., Weir M.P., Campbell I.D. Secondary structure of human interleukin 2 from 3D heteronuclear NMR experiments. Biochemistry 1992,31,7741-1744.

218. Kashima N., Nishi-Takaoka C., Fujita Т., Taki S., Yamada G., Hamuro J., Tanigu-chi T. Unique structure of murine interleukin-2 as deduced from cloned cDNAs. Nature 1985,313, 402-404.

219. Zurawski S.M., Mosmann T.R., Benedik G., Zurawski G. Alterations in the amino-terminal third of mouse interleukin 2: effects on biological activity and immunoreactiv-ity. J. Immunol. 1986,137, 3354-3360.

220. Leonard W.J., Depper J.M., Crabtree G.R., Rudikoff S., Pumphrey J., Robb R.J., Kronke M., Svetlik P.B., Peffer N.J., Waldmann T.A. Molecular cloning and expression of cDNAs for the human interleukin-2 receptor. Nature 1984,311,626-631.

221. Willerford D.M., Chen J., Ferry J.A., Davidson L., Ma A., Alt F.W. Interleukin-2 receptor alpha chain regulates the size and content of the peripheral lymphoid compartment. Immunity 1995,3, 521-530.

222. Bazan J.F. A novel family of growth factor receptors: a common binding domain in the growth hormone, prolactin, erythropoietin and IL-6 receptors, and the p75 IL-2 receptor beta-chain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1989,164, 788-795.

223. Takeshita Т., Asao H., Ohtani K., Ishii N., Kumaki S., Tanaka N., Munakata H., Nakamura M., Sugamura K. Cloning of the gamma chain of the human IL-2 receptor. Science 1992,257, 379-382.

224. Waldmann T.A. The multi-subunit interleukin-2 receptor. Annu. Rev. Biochem. 1989, 58, 875-911.

225. Rickert M., Boulanger M.J., Goriatcheva N., Garcia K.C. Compensatory energetic mechanisms mediating the assembly of signaling complexes between interleukin-2 and its a, p, and yc receptors. J. Mol. Biol. 2004,339,1115-1128.

226. Тапака Т., Hu-Li J., Seder R.A., Fazekas de St Groth В., Paul W.E. IL-4 suppresses IL-2 and interferon-y production by naive T cells stimulated by accessory cell-dependent receptor engagement. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1993,90, 5914-5918.

227. Powers R., Garrett D.S., March C.J., Frieden E.A., Gronenborn A.M., Clore G.M. Three-dimensional solution structure of human interleukin-4 by multidimensional het- ; eronuclear magnetic resonance spectroscopy. Science 1992,256,1673-1677.

228. Murata Т., Obiri N.I., Puri R.K. Structure of and signal transduction through interleukin-4 and interleukin-13 receptors. Int. J. Mol Med. 1998,1,551-557.

229. Kawakami K., Leland P., Puri R.K. Structure, function, and targeting of interleukin 4 receptors on human head and neck cancer cells. Cancer Res. 2000, 60, 2981-2987.

230. Zhang J.L., Simeonowa I., Wang Y., Sebald W. The high-affinity interaction of human IL-4 and the receptor alpha chain is constituted by two independent binding clusters. J. Mol Biol 2002,315,399-407.

231. Wang Y., Shen B.J., Sebald W. A mixed-charge pair in human interleukin 4 dominates high-affinity interaction with the receptor alpha chain. Proc. Natl Acad Sci. USA 1997,94,1657-1662.

232. Hage Т., Sebald W., Reinemer P. Crystal structure of the interleukin-4/receptor alpha chain complex reveals a mosaic binding interface. Cell 1999,97,271-281.

233. Sugamura K., Asao H., Kondo M., Tanaka N., Ishii N., Nakamura M., Takeshita T. The common gamma-chain for multiple cytokine receptors. Adv. Immunol. 1995, 59, 225-277.

234. Zhang J.L., Buehner M., Sebald W. Functional epitope of common gamma chain for interleukin-4 binding. Eur. J. Biochem. 2002, 269, 1490-1499.

235. Hemar A., Subtil A., Lieb M., Morelon E., Hellio R., Dautry-Varsat A. Endocytosis of interleukin 2 receptors in human T lymphocytes: distinct intracellular localization and fate of receptor a, p, and у chains. J. Cell Biol. 1995,129,55-64.

236. Friedrich K., Kammer W., Erhardt I., Brandlein S., Arnold S., Sebald W. The two subunits of the interleukin-4 receptor mediate independent and distinct patterns of ligand endocytosis. Eur. J. Biochem. 1999,265,457-465.

237. Холоденко И.В. Влияние опухолевых ганглиозидов на пролиферацию Т-лимфоцитов. Определение последовательностей IL-4, способных связывать ганглиозиды. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва-2006.

238. Goebel J., Forrest К., Morford L., Roszman T.L. Differential localization of IL-2 and -15 receptor chains in membrane rafts of human T cells. J. Leuk. Biol. 2002, 72, 199206.

239. Marmor M., Julius M. Role for lipid rafts in regulating interleukin-2 receptor signaling. Blood 2001,98, 1489-1497.

240. Lauer S., Goldstein В., Nolan R.L., Nolan J.P. Analysis of cholera toxin-ganglioside interactions by flow cytometry. Biochemistry 2002,41, 1742-1751.

241. Muller Т., Oehlenschlager F., Buehner M. Human interleukin-4 and variant R88Q: phasing X-ray diffraction data by molecular replacement using X-ray and nuclear magnetic resonance models. J. Mol. Biol. 1995,247,360-372.

242. Boyer P.D. The ATP synthase a splendid molecular machine. Annu. Rev. Biochem. 1997, 66, 717-749.

243. Abrahams J.P., Leslie A.G., Lutter R., Walker J.E. Structure at 2.8 A resolution of FrATPase from bovine heart mitochondria. Nature 1994,370, 621-628.

244. Engelbrecht S., Junge W. ATP synthase: a tentative structural model. FEBSLett. 1997,414,485-491.

245. Зайцева JI.Г. FiFo-ATP-аза: строение мембранного сектора и импорт некоторых субъединиц в митохондриальный матрикс. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. Москва-2000.

246. Serrano R., Kanner B.J., Raker E.J. Purification and properties of the proton-translocating adenosine triphosphatase complex of bovine heart mitochondria. J. Biol. Chem. 1976,251,2453-2461.

247. Katz M.L., Gao C.L., Tompinks J.A., Bronson R.T., Chin D.T. Mitochondrial ATP synthase subunit с stored in hereditary ceroid-lipofuscinosis contains trimethyl-lysine. Biochem. J. 1995,310, 887-892.

248. Griffiths D.E., Buzy A., Jennings K.R., Millar A.L., Ryan E.M. Electrospray ionisa-tion studies of the interaction of N,N'-dicyclohexylcarbodiimide with ceroid lipofuscinosis protein (subunit c). Eur. J. Mass Spectrom. 1997,3, 81-88.

249. Walker J.E., Lutter R., Dupuis A., Runswick M.J. Identification of the subunits of FjFo-ATPase from bovine heart mitochondria. Biochemistry 1991,30, 5369-5378.

250. Walker J.E., Fearnley I.M., Gay N.J., Gibson B.W., Northrop F.D., Powell S.J., Runswick M.J., Saraste M., Tybulewicz V.L.J. Primary structure and subunit stoichiome-try of FrATPase from bovine mitochondria. J. Mol. Biol. 1985,184, 677-701.

251. Ernster L., Hundal Т., Norling В., Sandri G., Wojtszak L., Grinkevich V.A., Modyanov N.N., Ovchinnikov Yu.A. Structural, functional and evolutionary aspects of proton-translocating ATPase. Chemica Scripta 1986,26,273-279.

252. Walker J.E., Runswick M.J., Poulter L. ATP synthase from bovine mitochondria. The characterization and sequence analysis of two membrane-associated sub-units and of the corresponding cDNAs. J. Mol. Biol. 1987,197, 89-100.

253. Fearnley I.M., Walker J.E. Two overlapping genes in bovine mitochondrial DNA encode membrane components of ATP synthase. EMBO J. 1986, 5,2003-2008.

254. Groth G., Walker J.E. Model of the c-subunit oligomer in the membrane domain of F-ATPases. FEBSLett. 1997,410,117-123.

255. Gabius H.-J. Tumor lectinology: at the intersection of carbohydrate chemistry, biochemistry, cell biology and oncology. Angew. Chem. Int. Ed. Eng. 1988, 27,1267-1276.

256. Goldstein I.J., Hugues R.C., Monsigny M. What should be called a lectin? Nature 1980,285, 66.

257. Monsigny M., Roche A.C., Midoux P. Endogenous lectins and drug targeting. Ann. NY Acad. Sci. 1988,551,399-414.

258. Monsigny M., Roche A.-C., Midoux P. Glycoconjugates as carriers for specific delivery of therapeutic drugs and genes. Adv. DrugDeliv. Rev. 1994,14, 1-24.

259. Yamazaki N., Kojima S., Bovin N.V., Andre S., Gabius S., Gabius H.-J. Endogenous lectins as targets for drug delivery. Adv. Drug Deliv. Rev. 2000, 43,225-244.

260. Bies C., Lehr C.-M., Woodley J.F. Lectin-mediated drug targeting: history and applications. Adv. Drug Deliv. Rev. 2004,56,425-435.

261. DeFrees S.A., Phillips L., Guo L., Zalipsky S. Sialyl Lewis X liposomes as a multivalent ligand and inhibitor of E-selectin mediated cellular adhesion. J. Am. Chem. Soc. 1996,118, 6101-6104.

262. Vodovozova E.L., Gayenko G.P., Razinkov V.I., Korchagina E.Y., Bovin N.V., Molotkovsky J.G. Saccharide-assisted delivery of cytotoxic liposomes to human malignant cells. Biochem. Mol Biol. Int. 1998,44, 543-553.

263. Водовозова Е.Л., Хайдуков C.B., Гаенко Г.П., Бондарчук Т.И., Михалев И.И., Гречишникова И.В., Молотковский Юл.Г. Транспортировка цитотоксических ли-посом к злокачественным клеткам с помощью углеводных детерминант. Биоорган, химия 1998,24,760-767.

264. Водовозова Е.Л., Назарова А.И., Феофанов А.В., Холоденко Р.В., Пазынина Г.В., Гаенко Г.П., Бовин Н.В., Молотковский Юл.Г. Взаимодействие липосом, несущих углеводные детерминанты, с клетками меланомы. Биол. мембраны 2004,21, 53-64.

265. Moiseeva E., Vodovozova E., Chaadaeva A., Tuzikov A., Bovin N., Den Otter W., Molotkovsky J. Liposomal formulations of merphalan lipophilic prodrug equipped with1. X *

266. Bovin N.V., Korchagina E.Y., Zemlyanukhina T.V., Byramova N.E., Galanina O.E., Zemlyakov A.E., Ivanov A.E., Zubov V.P., Mochalova L.S. Synthesis of polymeric neoglycoconjugates based on N-substituted polyacrylamide. Glycoconjugate J. 1993,10, 142-151.

267. Бовин Н.В. Гликоконъюгаты на основе полиакриламида инструменты для изучения лектинов, антител, гликозилтрансфераз в гликобиологии, цитохимии и гистохимии. Биоорган, химия 1996,22,643-663.

268. Dodd R.B., Drickamer К. Lectin-like proteins in model organisms: implications for evolution of carbohydrate-binding activity. Glycobiology 2001,11,71R-79R.

269. In: Kishimoto Т., Kikutani H. (Eds.). Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Garland Publishing, N.-Y. & London, 1997, pp. И 58-1159.

270. Bevilacqua M.P., Pober J.S., Mendrick D.L., Cotran R.S., Gimbrown M.A. Identification of an inducible endothelial-leukocyte adhesion molecule. Proc. Natl Acad. Sci. USA 1987, 84,9238.

271. Lasky L.A. Selectins: interpreters of cell-specific carbohydrate information during inflammation. Science 1992,258,964-969.

272. Rice K.G., in: Gabius H.-J., Gabius S. (Eds.). Glycosciences. Glycoconjugate-mediated drug targeting. Chapman and Hall, Weinheim, 1997, pp. 471-483.

273. Zeisig R., Stahn R., Wenzel K., Behrens D., Fichtner I. Effect of sialyl Lewis X-glycoliposomes on the inhibition of E-selectin-mediated tumour cell adhesion in vitro. Biochim. Biophys. Acta 2004,1660,31 -40.

274. Gabius H.-J. Animal lectins. Eur. J. Biochem. 1997,243,543-548.

275. Drickamer K. Ca+-dependant carbohydrate-recognition domains in animal proteins. Curr. Opinion Struct. Biol 1993,3,393-400.

276. Kawakami S., Munakata C., Fumoto S., Yamashita F., Hashida M. Novel galactosy-lated liposomes for hepatocyte-selective targeting of lipophilic drugs. J. Pharm. Sci. 2001,90,105-113.

277. Engel A., Chatteijee. S.K., Alarifi A., Riemann D,, Langner J., Nuhn P. Influence of spacer length on interaction of mannosylated liposomes with human phagocytic cells. Pharm. Res. 2003,20, 51-57.

278. Nifant'ev N.E., Tsvetkov Y.E., Shashkov A.S., Kononov L.O., Menshov V.M., Tuzikov A.B., Bovin N.V. Selectin receptors 4: synthesis of tetrasaccharides sialyl Lewis A and sialyl Lewis X containing a spacer group. J. Carbohydr. Chem. 1996,15, 939-953.

279. Vaskovsky V.E., Kostetsky V.Y., Vasendin I.M. A universal reagent for phospholipid analysis. J. Chromatogr. 1975,114, 129-141.

280. Hanahan D.J., Rodell M., Turner L.D. Enzymatic formation ofmonopalmitoylleci-thin (lysolecithins). J. Biol Chem. 1954, 206, 431-441.

281. Hanahan D.J. Sphingomyelin. Biochemical preparations. J. Biol Chem. 1954, 206, 121-124.

282. Молотковский Юл.Г., Никулина Л.Ф., Бергельсон Л.Д. Синтез оптически активных а,Р-диглицеридов. Химия природ, соед. 1969, № 4, 210-214.

283. Sakakibara S., Inukai N. A new reagent for the/?-nitrophenylation of carboxylic acid. Bull Chem. Soc. Japan 1964,37, 1231-1232.

284. Корчагина Е.Ю., Бовин H.B. Синтез спейсерированных трисахаридов с групповой специфичностью крови А и В, их фрагментов и структурных аналогов. Биоорган. Химия 1992,18,283-298.

285. Likhosherstov L.M., Novikova O.S., Derevitskaja V.A., Kochetkov NX A new simple synthesis of amino sugar p-D-glycosylamines. Carbohydr. Res. 1986,146, Cl-C5.

286. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein mesurment with the Folin phenol reagent. J. Biol Chem. 1951,193, 265-275.

287. Merril C.R., Dunau M.L. Goldman D. A rapid sensitive silver stain for polypeptides in polyacrylamid gels. Anal Biochem. 1981,110,201-207.

288. Peters D. Cyclopentadienecarboxylic acid. The structure of the monomer and the dimers. J. Chem. Soc. 1959,1761-1765.

289. In: Buckingham J., Donaghy S.M. (Eds.) Dictionary of organic compounds. Chapman and Hall, New York, 1982, vol. 3, p. 3262.

290. Bartlett G.R. Phosphorus assay in column chromatography. J. Biol. Chem. 1959, 234,466-468.

291. Poulos T.L., Finzel B.C., Howard A.J. High-resolution crystal structure of cytochrome P450cam. J. Mol. Biol. 1987,195, 687-700.

292. Hu-Li J., Ohara J., Watson C., Tsang W., Paul W.E. Derivation of a T cell line that is highly responsive to IL-4 and IL-2 (CT.4R) and of an IL-2 hyporesponsive mutant of that line (CT.4S). J. Immunology 1989,142, 800-807.

293. Brunette D.M;, Till J.E. A rapid method for the isolation of L-cell surface membranes using an aqueous two phase polymer system. J. Membrane Biol. 1971, 5,215-224.

294. Gruber M.Y., Cheng K.-H., Lepock J.R., Thompson J.E. Improved yield of plasma membrane from mammalian cells through modifications of the two-phase polymer isolation procedure. Anal. Biochem. 1984,138,112-118.

295. Heukeshoven J., Dernick R. Improved silver staining procedure for fast staining in PhastSystem Development Unit. I. Staining of sodium dodecyl sulfate gels. Electrophoresis 1988,9,28-32.

296. Friedl P., Schairer H.U. Preparation and reconstitution of FiF0 and ¥0from Escherichia coli. Methods Enzymol. 1986,126, 579-588.

Информация о работе

Водовозова, Елена Львовна
доктора химических наук
Москва, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Фотоаффинные липидные зонды с диазоциклопентадиен-2-илкарбонильной меткой: синтез и применение в мембранных исследованиях - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы