Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирующее и свободное окисление в митохондриях печени при старении крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирующее и свободное окисление в митохондриях печени при старении крыс"

харьковски?! государственный университет

На правах рукописи

белостоцкая людмила игоревна

оюсфорилирующее И свободное окисление в митохондриях печени при старении крыс

03.03.04 — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическим наук

Харьков - 1992

(

Диссертация выполнена'е отделе биофизики онтогенеза мембран НИИ биологии Харьковского государственного университета

Научный руководитель!

доктор миологических наук, профессор В.В.Лемешко

Официальные оппоненты!

доктор медицинских наук, член-корр АН Украины« профессор А.М.Белоус (Институт проблем криобиологии и криомедицины АН Украины, г.Харьков

доктор медицинских наук -В.И.Губекий (НИИ медицинской радиологии, г. Харьков)

Ведущая организация!

Институт геронтологии ИЗ Украины, г. Киев

1992 г. в

Защита состоится "/У."__1992 г. в .часов

на заседании специализированного совета К 0S3.B6.O7. Харьковскогс государственного университета <310077, г. Харьков, пл. Свободы, 4, аудитория 3-15)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотека Харьковского госуниверситета.

Автореферат разослан

1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

А.В.Некрасова

^-'»л общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Механизмы, определяющие скорость старения и продолжительность жизни животных и человеке, составляют одну из неразрешенных общебиологических проблей. Вместе с тем, к настоящему еремени установлены некоторые закономерности, которые могут служить основой для более глубокого анализа процессов и явлений, лежащих в основе старения.

Одним из органов, наиболее подверженных старению, является печень CKokkonen et al., 19S63, хотя'характер и причины возрастных изменений клеточных функций до конца не выяснриы. В частности, несмотря на довольно большой объем исследований по изучению возрастных изменений мембранной энергетики печени CLatruffe et al., 1778) Berdanier et al., 198Q| Абляееа и др.,'1981| Vorbeck et al., 1982; Яемешко и др., 1982| Лемешко, 1983| Miyahara et al., 1984> Литошенко, 1986} Kim et al., 198flj Mori et al., 19883, нет единства данным в отношении системы окислительного фосфорили— роэания как на тканевой уровне, так и на уровне изолированных митохондрий.

Существуют представления о более или менее постоянном количества энергии« трансформируемой единицей массы живой материи за осю продолжительность жизни млекопитающих ECultrr, 19843, и, уменьшая интенсивность метаболизма, например, путем ограничения калорийности питания, можно увеличить продолжительность жизни CSacher, 19773. Хотя, по некоторым данным, прплонгирЬвание жизни путем ограничения питания не сопровождается уменьшением интенсивности метаболизма CMcCarter et al.,. 19823.

Печень в целом и система ее энергообеспечения являются одной из мишеней для тиреоидных гормоноо, которые, как и ограничение питания СНо1ehan et al., 1986) Малого, 19873, существенно влияют на продолжительность жизни COoka et al•, 19863 и интенсиомость метаболизма животным ЕТеппермен и соает., 19893 и могут выступать е качества фактора, модулирующего процессы« лежащие в основе старения. Вопрос о том, о Какой мере воорастныв изменения системы окислительного фосфорилирования являются отражением гормональной ситуации и фактора питания, изучен недостаточно.

Цели и задачи исследования. Целью работы явилось изучение возрастных закономерностей изменения функционального состояния митохондрий печени крыс при нормальном старении и ппи »»пчл**йстпм—

- 3 -

ях, изменяющих продолжительность жизни - введении тироксина и ограничении калорийности питания.

Исходя из целИ| были определены следующие задачт

1. Изучить биоэнергетические характеристики митохондрий печени (изолированных и в составе гомогенатов) в широком возрастном диапазоне.

2. Изучить возрастные особенности тиреоидной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс.

3. Исследовать влияние гипокалорийного питания на фосфзрилирующее и мефосфорилирующее окисление в митококдрияк печени крыс разного возраста.

Научная новизна. Исследована система окислительного фосфорилирования митохондрий печени крыс в широком возрастном диапазона и установлено, что после достижения половой зрелости эффективность трансформации энергии окисления субстратов в энергию АТР не подвергается существенным возрастным изменениям. В то же время, в ■начальном периоде постнатальнаго развития обнаружены значительны« изменения интенсивности дыхания и степени энергетического сопряжения митохондрий, обусловленные действием жирорастворимого разобщающего фактора.

Выявлено, что наибольшую чувствительность к малым дозам тироксина имеют животные среднего возраста, причем наружнад мембрана митохондрий, внешний путь окисления NADH, проявляет гораздо большую чувствительность к тиреоидным гормонам по сравнению с системой окислительного фосфорилирования внутренней мембраны. При совместном введении с тироксином фенобарбитала последний усиливает активацию гормоном дыхания митохондрий молодым крыс.

Обнаружено, что гипокалорийное питание вызывает значительное снижение скорости синтеза АТР и скорости потребления кислорода изолированными митохондриями, наряду с повышением активности внешнего пути окисления NADH и, в то же время, не приводит к изменении интенсивности дыхания гомогенатов печени.

Основные положения, выносимые на защиту» 1. На раннем этапе раввития крыс значительно повышается активность дыхательной цепи и степень энергетического сопряжения в митохондриям печени. После 1—3-месячного возраста существенных изменений функционального состояния митохондрий не происходит. Разобщение окислительного фосфорилирования я ранний период постна-тального онтогенеза и, в некоторой мере, у старым крыс, об у с лае -

- 4 -

лоалено наличием жирорастворимого цитоплазматического фактора, раэобшакл>мй эффект которого предотвращается обезжиренным ССА.

2. Система окислительного фосфорилирования животным среднего возраста проявляет высокую чувствительность к длительному введении» небольших доз тироксина. При дальнейшем старении чувствительность к тиреоидным гормонам заметно снижается, но остается выше* чем у молодых половозрелых.

3. Калсрийно-огргниченное, сдерживающее рост питание вызывает снижение скорости дыхания, уменьшение скорости синтеза ATР и увеличение и»ггенсизнасти нефегфорилирукицега окисления в митохондриям печени.

Теоретическая и практическая оиачимость. Результаты прове-

денных исследований Свидетельствует о выраженным изменениях функционального состояния митохондрий печени в первый месяц жиэни крыс и относительном постоянстве после достижения половой зрелее— ти, что пооволяет существенно уточнить представления о возрастных и с» к а нениях биоэнергетическим процессов.

Выявленная большая чувствительность к малым дозам тироксина внешнего, нефосфорилирующего пути окисления ЫАГН митохондриями по сравнению с системЯ окислительного фосфорилирования дает основание рассматривать ого активность как один из возможных маркероз игзмен«?иия тиреоидного статуса организма. Высокая чувствительность кияетным среднего возраста к малым, соизмеримым с физиологически— ии, дозам тироксина представляет практический интерес при растра— Сотке г'зропротектороо.

Впервые • широком еоорастном диапавонэ изучено веяние калорийно-ограниченной, сдерживаний рост диеты на Йиаэнергетичхснгм» характеристики митохондрий печени и ейнгружено снижение скорости

• фосфсрилируодэго окисления наряду с выражт-^ым повышением активности внешнего, калсриг»иного пути окисления.

Полученные результаты могут С^гги испольseaсны при разработке способов й средств увеличения продолжительности яизни. Яатегмалы ре боты испог*.«?у«тсж » лекционным курсам "Биофизика". и "Биоэнергетика*.

Апробация работы, Г!лтериалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзном симпозиум* "НеЛрогужсральныз ко х в низ мы старения" (Киэт, 1936), симпозиуме *ГЪлекулгрны» и функциональные м®-маниедны онтогенеза" (Р.^рькое, 1937) v V Всесоюзно«« съезде г§рокто-логеа и гкриатро.* (Тбилиси, 1*?23) , gcpcowoHOH симпозиум« "Гериат-

- 3 -

ричвские средства! экспериментальный поиск и клиническое использование" <Киев, 1990), Всесоюзной конференции "Продолжительность жизни; механизмы, прогнозы, пути увеличения" (Кисо, 1991)•

Публикации. Основные положения работы изложены в 12 печатных работах»

Структура и' объем диссертации. Диссертация состоит из введения, списка сокращений, главы "Литературный обзор", главы "Мате— рилы и методы", трех глав "Результаты и обсуждение", заключения, выводов, списка литературы, включающего 212 наименозаний. Работа изложена на 157 стр., включает 19 рисунков и 22 таблицы.

материалы и методы исследования Экспериментальна материал по изучению изменений функционального состояния митохондрий печени в процессе онтогенеза был получен при использовании крыс—самцов линии Вистар 1-2—дневного, 0.5—, 1—, 2—, 3—* 4—, 12— и 24-месячного возраста.

Серии опытов при изучении различных воздействий: а) введение 1—, 12— и 24—месячным крысам енутрибрюшинно L—тироксина (Т^) в дозах 2.5, 5, 10 и 50 мкг на 103 г массы тела ежедневно в течение 9 дней; б) введение 3— и 24—месячным крысам енутрибрюшинно Т^, фенобарбитала <ф£) или Тц+фб, дозы введения: Т^ — 50 мкг, об — 4 мг на ICQ г массы тела ежедневно в течение 3 дней; в) введение 12-месячным крысам внутрибрюшинно Тц или Сс1С1д , доза введения — S3 мкг на 100 г м гссы тела ежедневно в течение 3 дней. Во всея случаях контрольным жиоотным вбодили также внутрибрюшинно физраствор; г) крысы, переведенные с 1-месячного возраста (60-70 г) на экспериментальную периодическую калорийно-ограниченную, сдерживающую рост диету CMcCay et al., 1934? Ставицкая, 19633, контрольные группы — 1-2 дня, 0.5, 1, 2, 3, 4, 12 и 24 мое., экспе- • риментальные группы - 2, 3, 4, 24, 35 и 45 мес.

Животных лиша/in корма за 12—14 часс>в до декапитации. Митохондрии печени выделяли как описано CJonson et al., 19873.

Скорость дыхания и окислительного фосфорилироваНия в гомо— генатах и митохондриях печени определяли полярографическим метолом* По кривым потребления кислорода рассчитывали скорости дыхания ы состояниях 3 и 4 по Чансу <Vj и V^), в разобщенном состоянии tVjp ), коэффициент АДР/0 и дыхательный контроль (V^/V^j ДК>. Скорость синтеза АТР митохондриями измеряли флуориметрически по уровню NADPH, используя сопряженную гексокиназо-глюкозо—6—фос— фатдегидрогеназну» ферментивну» систему. В качестве субстратов

- 6 -

при измерении скоростей дыхания и синтеза АТР использовали сук— цинат, глутамат+малат, (А-глицерофосфат и у^-оксибутират

(у^-ОБ).

Содержание цитрхромое определяли спектрофстометричееки в суспензии митохондрий, замороженных в жидком ¿зоте сразу же поел« окончания процедуры выделения и размороженных при 37°С на еодпной бане. Содержание цитохромов рассчитывали по СКосексча и /тр. , 19743» Скорость окисления NADH и цитохромоксидазнум (Ц0> активность регистрировали а гипотонической среде полорографически или флуориметрически.

Все измерения проводили в термостатируемых ячейках при +30°С.

Содержание ¿елка определяли по методу Лоури и соавт. в модификации Миллера CMiller, 19593. Данные обрабатывали по методу Стьюдекта-фишера СТерентьев и соавт., 19773 с использованием ЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изменение митохондриальней системы окисления печени в процессе развития и старения крыс

Изучение интенсивности окисления FAD+ —зависимого субстрата сукцината гомогенатами печени крыс при нормальном старении показало, что о присутствии БСЛ Vj и V^ повышаются от 1-2-дневного— 3.5—месячного возраста к 1—месячному и затем несколько снижаются в прс-цессе онтогенеза. При этем степень сопряжения дыхания и окислительного фосфорилированмя (судя по коэффициенту AftP/Q и ДЮ существенно не меняется. При окислении этого жа субстрата изолированными митохондриями о среде с БСА вываляно аналогичное изменение Vj и Vij в раннем периоде жизни (1-2 дмэт-1 нэс.>, Однако впоследствии скорость потребления кислорода в активном Фосфарилиру гощем состоянии не меняется, a V^ снижается к 2-3-месячному возрасту, посла чего такяо не претерпевает изменений. Параллельно с этим, ДК и коэффициент АДР/О, как и при использовании гомогената, практически не изменяются при развитии и,старении.

Скорость потребления кислорода при окислении изолированными митохондриями NAD^-оависимык субстратов глутаматв+малата в среде с ЕСЛ повышается от 1—2—дневного к 1—месячному возрасту на 67Х для Vj и на 37% для Vi|. С увеличением возраст« животных до А месяцев происходит некоторое снижение Vj , а то время как Vxj Ht м-»-метется. К*к и при окислении сукиимата, коэффициент АДР/О практически не изменяется при старении! ДК остается постоя*«чин пос лаг 2- 7 -

недельного возраста, характеризуясь низкой величиной у новорожденных крыс ят.

Более раннее возрастное повышение У^ и Уу в среде с БСА - у О.5-месячных крыс — обнаружено при окислении в дыхательной цепи митохондрий ^-0Е>. В процессе дальнейшего онтогенеза у^ не меняется, а у^, в отличив от окисления других субстратов, дооольно значительно снижается после 4-месячного возраста. Аналогично изменяется и ДК, в то время как коэффициент АДР/О остается практически неизменным во всем изученном возрастном диапазоне.

Несколько иные результаты получены при использовнии среды, не содеращей БСА. К отсутствии» в реакционной среде БСА наиболее чувствительны /3—ОБ— и сукцинат-оксидазные активности. В обоих случаях, по сравнению со значениями, полученными в среде с БСА, у веек возрастных групп животных наблюдаются более высокие значения Чц, более низкие — ДК, а у 1—2—дневных-0.5-месячных, кроме того, — сниженные величины и коэффициента АДР/О. Отсутствие БСА влияет сходным образом и на параметры дыхания при окислении сукцината гомогенатами, однако, в отличие от изолированных митохондрий, снижение ДК и увеличение Чц имеет место гишь в раннем периоде развития (1-2 дня-0.5 мес.) и у старых <24 мес.) крыс. Смеете с тем, скорость потребления кислорода в активном фосфори— лирующем состоянии при окислении митохондриями глутамата:малата нечувствительна к БСА, а изменения Чц и ДК носят такой же характер, что и при окислении сукцината или ОБ, но проявляются лишь на ранних этапах онтогенеза (новорожденные—2 мес.). Коэффициент АДР/О при окислении глутамата+малата в среде без БСА имеет более низкую величину, чем в присутствии БСА, только у новорожденных крысят. Чувствительность к БСА при окислении всех изучен" • ных субстратов гомогенатами и изолированными митохондриями максимальна у 1—2—дневных животных и снижается уже в раннем онтогенезе, что позволяет предположить наличие в гепатоцитах некоторого гидрофобного разобщающего факторе. Вероятно, это связано с терморегуляцией, поскольку в возрастной период 15-30 дней жизни происходит переход от полной зависимости организма от температуры окружающей среды к становлению постоянства температуры тела [Баба-шее и др., 19913.

Известно,'что ^(-Гф-оксидазнай активность с возрастом уменьшатся, что обусловлено снижением с^-ГФ-дегидрагемаэной активности Сс1е бгоо! шt а1., 1977$ Петренко, 19833« Сходные результаты были

- в -

получены и в наших исследованиях. С другой стороны, с(-Уф-дегид-рогенаэная активность стимулируется ионами Са CWernette et al., 19в11. Нами было показано, что способность ионов Са активировать окисления —Гф в дыхательной цепи митохондрий, имеющая сиг-моидальную зависимость в диапазоне концентраций свободных ионов

X* А + -У -6

Са (Са* ) 10 -5*10 М, сохраняется у старых крыс, хотя и сни-

f J+

жается с возрастом. Наличие ионов Са в среде приаодит к снижению Кл к для субстрата. Так, обнаружено, что для митомонлрий пе—

-9 Л*-

чени 1-месячным крыс Кп с составляет при 2.2*10 М Са* 17 мМ

, -с Ъ . +

Ы-ГФ и при 2.06*10 М Са^ 1 мМ с*-ГФ. Ионы Са регулирует и сукцинатоксидаэнуи» активность, но при более высоких концентраци—

У ■ -f

ях, чем окисление с*-Гф. При Са^ <3*2*10 М еаде не наблюдается

изменений Vjp и Viy при окислении сукцината митохондриями печени

1—месячных крыс, тогда как дальнейшее повышение содержания ионов

Са в инкубационной среде вызывает снижение Vj- и увеличение V^, •Л* -tf

а при Са^ 2.flA*10 М наступает разобщение дыхания и окислительного фосфорилирования.

Исследование скорости синтеза АТР митохондриями в процессе онтогенеза показало (табл.1), что при окислении эндогенных субстратов и сукцината происходит снижение этого показателя у крыс среднего и старого возраста по сравнению с 1— и 3-месячными. При использовании в качестве субстрата глутамата+малата скорость синтеза АТР несколько повышается у 3-месячных животных относительно молодых неполовозрелых и тоже снижается при старении« Скорость синтеза АТР при окислении с/-Г© резко уменьшается в процессе он— тогенеэа, прнчем в среде без ионов Са ьмнимального значения она достигает уже к 3-месячному, а в Са. —содержащей среде — к 12—месячному возрасту.

Активность Ц0—кого участка дыхательной цепи митохондрий, из-1 мг»ряемая как ТМРД-оксидазная активность, повышается у 0.3-2-месячных крыс по сравнению с новорожденными и снижается в некоторой Степени у животных среднего и старого возраста. С изменением Ц0-ной активности коррелирует содержание цитокромов а(а^), но при дальнейшем старении оно остается постоянным. Аналогично изменяется с возрастом и содержание цитохрома с. Параллельно с этим, концентрация цитохрома с^ о процессе онтогенеза не меняется. Суммарное содержание цитохромээ b+b^ повышается к 1-месячному возрасту, снижается у 3-месячных крыс и далее остается неизменным.

Установлено, что ротеноннвчувствительная NADH-оксилвпная и - ? -

Таблица 1 '

Скорость синтеза АТР митохондриями печени крыс разного возраста (нмоль АТР/мг белка«мин; п-5-7)

Возраст

Субстрат

12 нес.

сукцинат 116 +5 124 +12 92 +6 а,б 94 + 7 а

глутамат+

малат 140 +9 164 +15 121 +3 б . 122 +10 б

Ы -ГФ , 8.2+0.9 2.8+ 0.3 а 2.3+0.1 2,3+0.4 а

Ы-Гф+Са 17.0+2.4 7.6* 1.0 а 3.4+0.6 а,б 4.8+0.2 а,б

эндоген. 9.2+В.6 10.7+ 1.7 6.5+1.3 6.4+1.1

а — достоверно по отношению к 1 мес. б — достоверно по отношению к 3 мес. NADH-цитохром с—редуктазная активности митохондрий имеют наиболее низкие значения.у новорожденных крысят, заметно увеличиваются к 1-месячному возрасту и, в некоторой степени, при гальнейшем старении организма.

Таким образом, на ранней этапе онтогенеза <1-2 дня-1 мес.) происходят значительные изменения интенсивности дыхания гомогена-тов и митохондрий печени, что, вероятна, связано с созреванием митохондрий CKanamura, 1984] и увеличением их количества в гепа— тоцитах CBarletta et al., 1980; Vicinanza et al., 19813. Вместе с тем, после достижения животными половой зрелости не наблюдается существенного нарушения функции трансформации энергии при окислении в дыхательной цепи сукцината и глутамата+малата, а также Ц0- . ной активности и содержания цитохромое а(а^), с и с^. Однако, окисление ^-0Б и ct-ГФ характеризуется четко выраженным возрастным снижением скорости потребления кислорода и скорости синтеза АТР, связанным, по-видимому, с уменьшением количества фермента.

Влияние тироксина на возрастные изменения фосфорилирующего и свободного окисления митохондрий печени крыс Известно, что тиреоидные гормоны (ТГ) являются регуляторами многих метаболических процессов и изменение тиреоидного статуса оказывает влияние на продолжительность жизни (ПЖ) лабораторных животных COoka et al., 19863. С другой стороны, имеются сведения

- 10 -

24 мес

о наличии возрастных особенностей в действии биологически-активных веществ СГудошников, 19863, 8 том числе и ТГ СВержиковская, 17663. Однако влияние М1лых доз ТГ в возрастном аспекте изучено недостаточно. Как показали наши исследования, наибольшую чувствительность к хроническому воздействии! сравнимыми с физиологическими дозами Ту проявляют митохондрии печени 12-месячных крыс. Введение животным этого возраста столь малой дозы как 2,5 мкг Ту/ 100 г йассы тела вызывает увеличение У/^ , Уц и снижение ДК при окислении митохондриями сукцината, повышение Уц при окислении с(~ Гф* а также значительное уменьшение МАЕН-цитохром с-редуктазной активности (табл.2). С увеличением возраста животных до 24 месяцев чувствительность к Т^ несколько снижается, оставаясь а то же время значительно выше характерной для молодых неполовозрелых (1

Таблица 2

Влияние введения различных доз тироксина на сукцинат—оксидазну» СУ^ ) и МАБН-цитохром с-редуктазную активности митохондрий печени 1—, 12— и 24—месячных крыс (натам О/мг белка«мин; п-4-3)

Воздействие : Возраст

<мкг Т^ /100 :-------------------------------------------

г массы тела) г 1 мес. I 12 мес. > 24 мес.

У^ при окислении сукцината

контроль 241 + в 204 + 4 а 203 + а а

2.5 мкг Тц 255 + 7 Г 247 + 10 6,г 220 10 г

5 мкг Тц 240 + 14 г 257 + 12 6, г 267 + 12 б, .в

10 мкг Т^ 247 + 1Г г 267 +116 264 + 17 6, 1 в

50 мкг Тч 318 4- 7 6 307 + 14 в 271 + 3 6, |В

МАГН-цитохром (;—редуктаза

контроль . 147 + 3 123 + 7 130 + 17

2.5 мкг Т^ 126 + 7 74 + 10 в 73 + 7

5 мкг Тц 134 + 4 70 + 4 6 92 + 5 6

10 мкг 7// 131 + 5 69 + 3 6 77 4 6

50 мкг Ту 147 + 4 74 + 8 6 69 + 12 6

а — достоверно по отношению к 1 мес. б — достоверна по отношению к контролю в — достоверно по отношению к 2.5 мкг г — достоверно по отношению к 53 мкг Т^ - 11 -

мес.) крыс. Так:, у старых животных аналогичные изменения интенсивности окисления изученных субстратов и активности внешнего пути окисления NADH происходят при введении 5-10 мкг Ту/100 г массы тела. У 1—месячных крыс сходные изменения параметров дыхания при окислении субстратов в основной дыхательной цепи наблюдаются при введении 50 мкг Ту/100 г массы тела, а NADH-цитохром с-р«дуктаз— ная активность не подвергается изменению и при этой дозе. Следует отметить, что введение.2.5-50 мкг Ту/100 г массы тела не оказывает 'влияния на коэффициент АДР/О при окисл&нии сукцината и на ЦО— ную активность митохондрий печени изученных возрастных групп животных •

Ранее в нашей лаборатории было показано, что ФБ предотвращав , вт снижение активности монооксигеназной системы и уровня цитохро-ма Р-450 под влиянием Тtf СЛемешко и др., 19373. Существуют данные о том, что ФБ активирует превращение Ту в T¿ COppenheímer et al., 19713 и сам по себе не влияет на энергетические показатели печени [Соловьев и др., 19833 и активность ряда ферментов дыхательной цепи [Голоеенко и др., 19763; Наши исследования показали, что введение $3 не вызывает изменений Vj, Vy и степени сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования при окислении митохондриями печени 24-месячнык крыс сукцината, усиливая в то же время индуцирующий эффект Ту на интенсивность окисления этого субстрата у 3-месячных животных. На интенсивность окисления о^-ГФ и на величину Ту-стимулированной с^-Гф-оксидазмоЙ активности фБ не ока— аывает влияния как у 3-, так и у 24-месячных крьас. Данные о предотвращении фенобарбиталом влияния Ту на монооксигеназную систему СЛемешко и др., 19873 аналогичны результатам, свидетельствующим о снятии ФБ »-< эффектов, вызываемых ионами Cti [Mgbodile, 19833, которые оказывают на эту систему действие, сходное с дейс-' твием Ту CKadllska et al., 19853. Наряду с этим, нечестно, что воздействие ионами Cd in vivo и in vitro приводит к изменению интенсивности окисления субстратов в дыхательной цепи митохондрий СГонский, 1980| Cameron et al., 19863. При сравнительном изучении влияния введения Ту и CdClj на функциональное состояние дыхательной цели митохондрий печени 12-месячных крыс выявлено, что Cd ,

в отличие от Tu , не еыэь.'ваггг изменений окисления как FAZ) —, так и +

NAD -зависимых субстратов (сукцинат, о^-Гф, глутамат+малат). Вместе с тем, на уровне наружной мембраны наблюдается сходное действие Тц и ионов Cd — уменьшение ротеноннечувствкгельноЯ

- 12 -

NADH-цитохром с-редуктазной активности.

Таким образом, результаты исследований показывают, что максимальную чувствительность к вв«?л"нии) малых доз 7ц имеют животные среднего возраста. Внешний путь окисления NAPH в гораздо большей степени, чем основная дыхательная цппь, зависит от тиреоидного

статуса организма. Сходную чувстритвльность внешний путь проявля— А +

ет и к ионам Cd

Влияние калорийно—ограниченного питания на метаболическое состояние митохондрий печени крыс ратного роэраста В настоящее время приэндно, что наиболее удачной моделью увеличения ПЖ лабораторных животных является гипокалсрийное питание tDulin, 1935: Kokkonen et al., 1986; Choi et al. , 19391, однако механизм такого рода замедления старения неизвестен. Как показали наши исследования, при содержании жипотных с 1—месячного возраста на калорийно—ограниченной, сдергивающей рост диете, интенсивность дыхения гомогенатов при окислении сукиината <V^ (табл.3), V^, ДК и коэффициент АДР/О) сохраняется на уровне контрольных крыс и лищь у очень старых (35—45 мес.) наблюдается некоторое снижение коэффициента АДР/О. В то же время, сксрость потребления кислорода в фосфорилирующем состоянии при окислении этого же субстрата изолированными митохондриями значительно уменьшается уже через месяц после перевода животных на экспериментальную диету и остается сниженной на протяжении всей жизни (табл,3)| в несколько меньшей степени снижается и Vfy. Степень сопряжения дыхания и окислительного фосфорилирования (судя по ДК и коэффициенту АДР/О) у опытных крыс не отличается от контрольных. Почти в такой же мере, как и при окислении митохондриями сукцината, уменьшается и Vj при окислении NAD^-зависимых субстратов глутамата+малата, в то время как снижается относительно контрольных животных незначительно. В результате этого величины ДК для 2-3-4—месячных опытных крыс на 17-21 У. ниже, чем в соответствующем контроле, хотя изменений коэффициента АДР/О не происходит. Перевод животных на калорийно-ограниченную диету приводит к резкому снижению уже у 2—месячных крыс скорости дыхания в состоянии 3 при окислении 00 (табл.3), в отличие от V^, до уровня новорожденных животных, следствием чего является уменьшение ДК у гипокалорийных 2-3-4—месячных крыс. У опытных животных коэффициент АДР/О, как и в случае окисления глутамата+малата, не изменяется. Наблюдавшиеся при ка- 13 -

Таблица 3

Влияние калорийно-ограниченной диеты на при окислении сукцината гомогенатом и митохондриями и на ^ при окислении ^—аксмбутмрата митохондриями печени крыс разного возраста е присутствии БСА '(натом О/мг белка«мин| пвЗ-9)

Воз— «к - контраст I роль, (мес.)1 о — опыт

Гомогенат '«

Митохондрии

I сукцинат I сукцинат I оксиСутират

1-2 дн* к 44 3 161 В 40 + 2

0.3 к 47 2 154 + 5 В4 + 6 .

1 к '79 + 2 216 + 13 83 + 5

2 к 67 + 3 196 + 6 77 * 5

о 67 + 4 152 + в * 50 3 *

3 к • 66 + 3 197 + 12 72 + 3

О' 73 + 5 • 153 11 * 42 + 4 »

4 к 60 + 4 193 + 13 79 + 6

а 67 + 4 147 + 6 * 44 + 3 «

12 к 66 5 197 + 16 58 + 4

24 к 37 + 3 204 + 12 42 + 2

о 66 + 6 154 14 « 36 + В

33 о 61 + 3 176 20 53 + 7

43 о 61 + 2 166 13 33 +■ 6

* — достоверна по отношению к контролю лорийно-ограниченном питании изменения интенсивности окисления глутамата+малата и у^НЭБ не противоречат данным других исследователей СЫе1пс1гисЬ с^ а1., 19803. Следует подчеркнуть, что на характер и величину этих изменений практически не влияет присутствие или отсутствие в реакционной среде БСА.

Изучение окисления с^—ГО митохондриями печени содержащихся на гипокалорийнсй диетв крыс выявило снижение с/-Г©-оксидазноЙ активности у З-мосячных животных относительно контрольных, в то время как для более взрослых существенных различий не обнаружено, что согласуется с данными СМалеев, 19873. ЦО-ная активность 2-34-месячных опытным животных ниже по срлвнъни» с контрольными, но у болев старых различия невелики (табл.4). Содержание цитохромай и отношение цитохромо» (с+с^)/а(а^) в контрольных и опытных груп-

-14 -

пах практически одинаково, что согласуется с данными СБапиийсИп е! а1., 19843- Наряду с этим, у гипокалорийных крыс значительно увеличена скорость ротенониечувствительного окисления МАЕН (табл. 4> .

Таблица 4

Влияние? калорийно—ограниченной диеты на цитохромоксидазную (измеренную как ТМРД-оксидазная) и ротеноннечувстоительную ИАГН-оксидазную активности (натом О/мг €3елка»мин; п=3-7>

Возраст <мес.)

цитохроноксидаза

NAPH-оксидаэа

контроль :

1-2 дня 0.5 1 2

3

4 12 24 35 45

463 + 33 641 + 26 730 + 53

673 + 24

674 + 2в 674 + 52 561 + 28 60S + 50

516 + 13 * 504 + 41 * 480 + 23 *

1.97 + 0.49 3.62 + 0.73 4.33 + 0.93

4.23 + 0.36 4.76 + В.04 4.66 + 0.97 6.64 + В.97

7.24 + 2.03

14.50 + 1.42 * 13.96 + 2.66 * 13.87 + 2.91 »

12.11 + 0.34 » 9.74 + 2.67 6.29 + 0.55

510 + 46 587 +52 433 + 8

* — достоверно по отношению к контролю

При исследовании скорости синтеза ATР митохондриями гечени обнаружено, что у животных, получавших калорийно—ограниченную диету, этот показатель при окислении сукцината и глутамата+малата ниже, чем при питании ad libitum, и не подвергается возрастным изменениям. Вместе с тем, у 35—месячных опытных крыс выявлено значительное Сна 54 X) снижение ATF-синтетазной активности на эндогенных . субстратах относительно 3—месячных опытных, вероятно, вызванное субстратным истощением.

Анализ полученных данных по применению гипакалорийной диети свидетельствует о снижении скорости синтеза АТР, рассчитанной на митохондриальнй белок. В то же время, интенсивность дыхания гомо-генатов и содержание цитохромов в митохондриальных фракциях практически не отличаются от контроля, из чего следует, что ограничение калорийности приводит к уменьшению плотности потока энергии

- 15 -

на одну дыхательную цепь. С другой стороны, в этих условник происходит активация теплопродукции митохондриями оа счет свободного окисления ЫА1)Н.

ВЫВОДЫ

1. Установлена, что возрастные изменения в системе окислительного фосфорилирования печени проявляются!

— в повышении ряда оксидаэны^ активностей митохондрий, содержание цитсхромов и степени энергетического сопряжения -на раннем этапе постнатального онтогенеза. Действие фактора, разобщающего окислительное фосфорилирование митохондрий в первые 2 недели пЬсле рождения крыс« предотвращается обезжиренным БСА)

— в субстратоспсцифичном снижении (субстраты (^-глицерофосфат и $ —оксибутират) или сохранении активности дыхательной цепи, высокой степени энергетического сопряжения и скорости синтеза АТР (субстраты сукцинат и глутамат+малат) при половом развитии и дальнейшем старении организма.

/

2. Регуляция ионами Са скорости окисления ел-глицерососфата | проявляющаяся в изменении сродства Фермента к субстрату, более выражена у молодых крыс, тогда как регу^яторный диапазон концентраций Са существенно на изменяется с возрастом. Концентра-

г. Л

ция Са , вызывающая м?чгимальное повышение о<—глицерофос©ат-ок—

сидазной активности, е^е не является разобщающей окислительное

фосфорилироеание.

3. Показано, что возрастные особенности тиреоидной регуляции дыхания митохондрий проявляются в наиболее высокой чувствительности животных среднего возраста к малым дозам тироксина и в сни-жвнии под влиянием гормон« активности внешнего пути окисления МАБН у взрослых и старых животних, но не у молодых 1—месячных. Эффект тироксин* на внешний путь окисления сходен с действи-

. ям ионов СсЗ • Повышение гормоном активности дыхательной цепи митохондрий потенцируется у молодых крыс фенобарбиталом.

4. Калорийно-ограниченное, сдеркивающее рост питание приводит к снижению интенсивности окислительного фосфорилирояания и скорости синтеза АТР изолированными митохондриями, но влияя существенно на дыхание гомогенатов печени, и вызывает резкую актива ц^м нефосфорилирумщего окисления НАХ>Н.

ПУБЛИК£Ч"*1 ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1« Лемевко В.В., Бабенка НА., Попова Л.Я., Белостоцхая Л.И., Козлова Е.8., Култавва Е.В, Бровкоаич О.Н., Цымбал Л.О. Струк-

- 16 -

турное состояние мембран митохондрий и микросом печени крыс при старении и под действием тироксина // Укр. биохим. журн. - 1936. - T.58,N1. - С.63-68.

2. Лемешко В.В., Белостоцкая Л.И. Длительное хранение "проч-мосопряженных"- митохондрий в жидком азоте // Укр. биохим. журн. — 1906 - Т.53,N3. - С.07-90.

3. Лемешко B.D., Белостоцкая Л.И., Космина H.H. Влияние ти-

г. А+ /

роксина на Ca —зависимое окисление с<—глицерофосфата в митохондриях печени крыс разного возраста // Нейрогуморальные механизмы старения» Материалы симп. - К., 1936. — С.60-61.

4. Лемешко В.В., Белостоцкая Л.И. Трансформация энергии в митохондриях печени крыс при старении // Механизмы онтогенеза и их регуляция. - К.t Наукова думка, 1937. - С.207-212.

5. Белостпцкая Л.И. Доэочая зависимость влияния тироксина на дыхание митохондрий печени крыс разнога возраста // Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза! Benс■ симп.i Тезисы докладам. - Харьков, 1987. — С.27.

6. Лемешко В.В., Козлова Е.В., Белостоцкая Л.И., Листопад A.D., Баскина С.М. Влияние тироксина и фенобарбитала на некоторые свойства микросом и митохондрий печени молодых и старых крыс // Молекулярные и функциональные механизмы онтогенеза! Всес. симп.I Тезисы докладов. — Харьков, 1987. — С.103-109.

7. Белостоцкая Л.И., Козлова Е.В., Миронова ИГ., Левченко A.A., Новикова О.А, Листопад А.П, Лемешко В.В. Структурно-Функциональные изменения свойств митохондрий печени крыс при старении // V Всес. съезд геронтологов и гериатров. Тбилиси» Тезисы и рефераты докладов. -К., 1903. - Т.1. — С.66.

8. Лемешко В.В. , Белостоцкая Л.И, Никитченко 19.В., ПаДал-ко В.И., Козлова Е.В. Митохондриальная платность потока электронов и мембранные окислительные процессы как возможный критерий геропротекции // Гериатрические средства! экспериментальный поиск . и клиническое использование! Всес. симп.s Тезисы докладов. -К., 1993. - С.180.

9. Лемешко В.В., Никитченко И).В. , Падалко В.И. , Белостоцкая Л.И., Козлова Е.В. Мембранные окислительные процессы при экспериментальном продлении жизни путем ограничения калорийности питания // Продолжительность жизни! механизмы, прогнозы, пути увеличения» Всес. комф. -К., 1991 - С.77-78.

10. Белостоцкая Л.I., Лемешко B.D. Дихання та окиелмвальне

- 17 -

фосфорилк,вання м1тонандр1Й печ!нки щургв при екслериментальному подовженнх життя // fionoaifli АН УРСР. - 1991. - N1. - С.135-137.

11« Лемешко Б.О., Никитченко Ю.Б., Падалко В.И., Боластонка я Л.И. Трансформация энергии в митохондриях, монооксигенаэнан система и перекисное окисление липидов в печени крыс в условиях пролонгирования жизни калорийно-ограниченной диетой // Проблемы старения и долголетия. — 1791« — T.1*N1. — С.11-17.

12. Lemeshko V.V., Belostotskaya L.I. Decrease of phosphory— lating oxidation, and increase of heat producing NADH oxidation in rat 1 iver mitochondria ouriид 1 ife—span prolongation of rate by

calorie-restricted diet // hechan. Aging and Develop. — 1992. -V.63,N1. - P.79-91.