Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Возрастные особенности и механизмы активации межмембранного переноса электронов в митохондриях печени крыс

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Возрастные особенности и механизмы активации межмембранного переноса электронов в митохондриях печени крыс"

* р ^ ХАРф^ВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ШЕХ ВЕРА ЕВГЕНЬЕВНА '1 ^ '

ВОЗРАСТНЫЕ ОСОБЕННОСТИ И МЕХАНИЗМЫ АКТИВАЦИИ МЕЖМЕМБРАННОГО ПЕРЕНОСА ЭЛЕКТРОНОВ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ КРЫС

03.00.04 - Биохимия 03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации яа соискание ученой степсия кандидата биологических наук

Харьков - 1393

Диссертация выполнена в отделе биофизики мембран НИИ биологии и на кафедре общей и медицинской биофизики Харьковского государственного университета

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Демешко В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Чечеткин A.B.;

(Харьковский зооветиринарный институт)

кандидат биологических наук, Петренко А.Ю. (Институт проблем криобиологии и криомедицины АН Украины, г.Харьков)

Ведущая организация: Институт геронтологии МЗ Украины, г. Киев

Защита состоится " 1993 г.

в '■ " часов на заседании специализированного Ученого совета К 053.06.07. Харьковского государственного университета (310077, г. Харьков, пл. Свободы, 4, аудитория 3—15)

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Харьковского госуниверситета.

Автореферат разослан

Ученый секретарь

специализированного совета,

кандидат биологических наук ^ , , А.В.Некрасова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Современный этан развития экспериментальной геронтологии

характеризуется повышенным вниманием к исследованию возрастных изменений физико-химических свойств биомембран, механизмов их структурной и функциональной перестройки под влиянием факторов внешней и внутренней среды организма. Среди различных гипотез старения весьма вероятной представляется биоэнергетическая концепция старения [Runner, 1908; Harman, 1972; Лемешко, Калиман, 1978; Miquel et al, 1980; Fleming et al., 1982; Лемешко, 1982, 1992], согласно которой продолжительность жизни организмов в значительной мере определяется количеством трансформированной энергии, а сам процесс преобразования энергии, локализованный у анаэробов в митохондриях, сопровождается генерацией свободных радикало~. Свободным радикалам и продуктам перекисного окисления липидов биомембран отводится ключевая роль в повреждении генетического материала как основного фактора старения ¡слеток.

Ряд авторов связывают старение с нарушениями функций митохондрий [Harman, 1972; Hansford, 1978; Darnold et al., 1990; Sohal, Sohal, 1991 J, хотя согласно многочисленным данным эффективность трансформации энергии во внутренней мембране митохондрий существенна не изменяется с возрастом [Chía, Richardson, 1980; Лемешко и соавт., 1982; Manzelrnann, Harmon, 1907; Kim et al., 1980], а уменьшение активности дыхательной цепи специфично в отношении лишь отдельных субстратов. , Указанные функциональные изменения митохондрий с возрастом, возможно,

являются отражением состояния регуляторных систем клеток.

Влияние ' свободнорадикального перекисного окисления липидов на систему окислительного фосфорилирования при действии различных факторов может быть реализовано через повышение уровня гидроперекисей и концентрации цитоплазматического Са24, синергический эффект которых состоит в индукции высокоамплитудного набухания митохондрий. Такого рода структурные изменения, включая повреждение наружной мембраны, наблюдаются при действии ряда гормонов, химических соединений, при ишемии и т.д. [Tapley et al., 1967; Hanzlikova, Schiaffino, 1977; Мирахмедов и соавт., 1988). В отношении возрастных изменений свойств наружной мембраны митохондрий и локализованной в ней системы переноса электронен в литературе имеются единичные сообщения [Лемешко, Калиман, 1978; Лемешко, 1981,1982; Dobesova, Mourek, 1986; Corbisier, Remade, 1990J, что и определило необходимость проведения настоящего исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целыо настоящей работа явилось исследование механизмов и возрастных особенностей регуляции активности внешнего пути окисления NADH в митохондриях печени крыс.

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи работы: 1.Исследование механизмов регуляции скорости межмембранного переноса электронов при ротеноннечувствиТелыюм окислении экзогенного NADH митохондриями.

2.Разработка простого метода оценки степени повреждения наружной мембраны митохондрий на основе окисления НАБН.

3.Исследование возрастных и пологых различий гипотонической повреждаемости наружной мембраны митохондрий и активации внешнего пути окисления ЫАБН.

4,Исследование роли неорганического фосфата и высокоамплитудного набухания митохондрий в активации межмембранного переноса электронов при окислении экзогенного МАОН.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Основные результаты работы получены впервые. Обнаружено, что ионы Мд2+ в физиологаческ!1х концентрациях могут на порядок активировать внешний путь окисления ЫАОН при условии повреждения наружной мембраны митохондрий и низкой ионной силы среды. Установлено, что механизм активации состоит в повышении сродства центров связывания цнтолрома с с низким сродством, локализованных на внутренней мембране. Подобный эффект Мд2+ проявляется и в отношении центров связывания с высоким сродством.

Установлено, что основным фактором активации внешнего пути п умеренно гипотонических средах, содержащих неорганический фосфат и используемых обычно для оценки состояния внешнего пути, является разрыв наружной мембраны, обусловленный дополнительным энерго —фосфат—зависимым набуханием митохондрий. Эффект фосфата полностью снимается предварительной деэНерГНзацией митохондрий.

Разработай простой фЛуориметрический метод оценки степени повреждения наружной мембраны митохондрий — по скьростй Мд2+ —, цитохром — с — зависимого ротеИоннечувствИтельного окисления ИАБН.

С помощью указанного метода продемонстрировано уменьшение гипотонической прочности наружной мембраны митохондрий печени при старении крыс — самцов и Половые различия свойств наружной мембраны старых животных, что было обнаружено ранее • с использованием более трудоемкого метода, основанного на выходе аденилаткиназы из межмембранного пространства [Лемешко, 19821-

основные положения выносимые на защиту

1. Обнаружен эффект многократной активации ионами Мд2+ межмембранного переноса электронов в митоходриях печени с поврежденной наружной мембраной, объясняющийся повышением сродства ротеноннечувствительной ЫАОН — оксидазной системы к эндог енному цитохрому с.

2. Разработан метод оценки прочности и степени повреждения наружной мембраны митохондрий.

3. Выявлены возрастные особенности активации внеп'него пути окисления МАОН митохондриями печени крыс, обусловленные увеличением гипотонической повреждаемости наружной мембраны.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ

ЗНАЧИМОСТЬ. Практическая значимость работы состоит в том, что, разработанный метод определения степени повреждения наружной мембраны может быть использован для оценки характера повреждения митохондрий при действии на организм, клетки или изолированные органеллы различных факторов среды. В работе выявлены возрастные и половые особенности повреждения митохондрий на модели тотальной ишемии печени.

Материалы работы используются в лекционном курсе "Общая биофизика", читаемого на кафедре общей

и медицинской биофизики факультета фундаментальной медицины ХГУ.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях радиофизического факультета ХГУ (1990,1991); Всесоюзном совещании "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (Пущнно, июль 1990); Всесоюзном совещании "Проблемы мембранной биоэнергетики" (Пущино, май 1991); научной конференции "Ускоренное старение, связь с возрастной патологией" (Киев, октябрь 1992); научной конференции молодых ученых биологического факультета, НИИ биологии н ботанического сада ХГУ (февраль, 1993).

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЬЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, Главы "Обзор литературы", главы "Материалы и методы", трех глав раздела "Результаты и обсуждений", заключения, выводов, списка литературы, включающего 145 наименований. Работа изложена на 135 стр., включает 26 рисунков и 17 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали крыс липни Вистар 1 —, 3 —, 12 —и 24 —месячного возраста.

Тотальную ишемию печени моделировали, помещая навеску ткани в бюкс при температуре 37° С на 20 минут инкубации.

Митохондрии получали методом

дифференциального центрифугирования с одной промывкой [Jonson et al., 1967].

Гипотонические митопласты, дефицитные по цитохрому с, получали, промывая митохондрии один раз в сильно гипотонической и трижды в изотонической среде с KCl, осаждая их центрифугированием [Jacobs, Sanadi, 19601.

Ротенониечувствительную NADH — оксидазную, аскорбатоксидаэную и сукцинатоксидазную активности определяли с помощью закрытого платинового электрода Кларка полярографическим методом.

NADH— оксидазную активность митохондрий определяли флуориметрически [Лемсшко, 1981J.

Набухание митохондрий контролировали по Изменению оптической плотности суспензии при длине волны 610 — 620 нм на фотоэлектроколориметре KF — 77 с термостатируемой шриетой, магнитной мешалкой, дополнительным логарифмическим усилителем и самопишущим потенциометром.

Стационарный уровень иосстаповлетюсти цитохрома с измеряли с помощью двухлучевого, двухголнового спектрофотометра "Hitachi—365" (Япония), регистрируя разность оптической плотности при длинах волн 540 и 550 нм.

Ротенониечувствительную NADH — цитохром — с — редуктазнуто активность определяли по изменению уровня воссгановленности цитохрома с, регистрируемого на двухлучевом, двухволновом спектрофотометре "Hitachi —356" при длинах волн 540 — 550 нм.

Содержание белка митохондрий и гипотонических митопластов в суспензиях определяли биуретовым методом [Gornall et al., 1949] с добавлением 0.2% холата Na . Статистическую обработку результатов проводили методом Фишера —Стыодента [Терентьев и соавт., 1977] с помощью микро-ЭВМ "Электроника" MC 0585 и специально разработанных программ на языке Бейсик.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ВЛИЯНИЕ ИОНОВ Мд2+ НА АКТИВНОСТЬ ВНЕШНЕГО ПУТИ ОКИСЛЕНИЯ МОН. Хорошо известно, что экзогенный Г^АОН очень медленно окисляется митохондриями по ротеноннечувст— вительиому пути, а большая скорость окисления может быть достигнута лишь при добавлении экзогенного цитохрома с и повреждении наружной мембраны [Крипицкене, 1938; Ясайтис, 1989]. В наших опытах показано, что в сильно гипотонической среде без экзогенного цитохрома с ионы'Мд3+ в физиологических концентрациях повышают скорость

ротеионнечувствигельного окисления ЫАОН почти на порядок. Терминальным звеном цепи переноса электронов при этом является цитохромоксидаза, поскольку окисление почти полностью ингибировалось цианидом.

Следует отмети"1, явную Б —образность зависимости от концентрации ионов магния ЫАОН —оксидазной активное™ митохондрий (коэффициент Хилла = 2.3) при малых концентрациях цитохрома с, некоторую Б — образность зависимости активности от концентрации цитохрома с в среде без Мд2+ и синзргический эффект от совместного применения цитохрома с и Мд2+ , что может указывать на кооперативность их взаимодействия с мембраной и на аллостерический характер регуляция ионами магния внешнего пути окисления ЫАОН в силыш гипотонической среде инкубации митохондрий.

Активация внешнего пути ионами Мд2+ не является результатом просто увеличения ионной силы среды. Полученные данные свидетельствуют, что в среде с МдБ04 максимум активности достигается при ионной силе вчетверо меньшей, чем п средах с КС1 или КгБО,).

Характер 'зависимости аскорбатоксидазндй активности митонластов от концентрации ионов Мд2+ в гипотонической среде при разных концентрациях цитохрома с оказался качественно сходным с таковым для ротеноннечувствительной ЫАБН — оксндазной активности митохондрий. Это позволило предположить, что активирующее действие Мд2+ локализовано на цитохромоксидазном участке.

Измерение стационарного уровня

восстановленности цитохрома с при

ротеноннечувствительном окислении ЫАОН показало, что добавление Мд2+ в среду вызывает четко выраженное уменьшение уровня восстановленности цитохрома с. Таким образом, причиной активации ротеноннечувсгвительного окислений NADH ' под влиянием ионов Мд2+. является ускорение окисления цитохрома с. Этот вывод подтверждается также тем фактом, что на величину ЫАБН — цитохром — с — редуктазной активности митохондрий ионы магния в тех же условиях практически не оказывют влияния.

Весьма существенным является тот факт, что ионы Мд2+ уже в области сравнительно малых, физиологических концентраций повышают сродство ИАОН—оксидазной ротеноннечувствительной системы к цитохрому с и, в некоторой мере, увеличивают Утах. Исследование влияния Катиона на сукцинатоксидазную активность гипотонических митопластов показало, что добавление 2 мМ Мд2+ приводит к резкому повышению сродства системы к цитохрому с как в гипотонической, так и в изотонической средах инкубации. При концентрациях цитохрома с, достаточных для обеспечения максимальных значений сукцинат— оксидазной активности, ротенонечувствительная ЫАОН —оксидазная активность гипотонических митопластов практически не проявлялась и достигала

максимума лишь при концентрациях 8—12 мкМ цитохрома с, как и в случае митохондрий. Отсюда следует, что внешний путь окисления ЫАБН включает в себя взаимодействие цитохрома с с центрами связывания с низким сродством.

Исследование активности внешнего пути окисления ЫАОН п зависимости от осмотического давления, изменяемого с помощью КС1 иди сахарозы, в среде, содержащей 5 мМ МдЗС^ и 4 мкМ цитохром с, показало, что скорость окисления ЫАОН максимальна в сильно гипоннческнх условиях. Однако б отсугстшш ионов Мд2+ на характер зависимости существенно влияет способ изменения осмотического давления среды. В случае использования неэлектролита сахарозы скорость окисления ЫАОН монотонно уменьшается по мере повышения осмотического давления среды, а в солевой среде максимум активности наблюдается при 25 мМ КС1. При дальнейшем увеличении ионной силы среды, решающее значение приобратает другой, более.мощный фактор —степень лопрээдешш наружной мембраны митохондрий.

Исследование скорости ротеноннечувствительного окисления ЫАОН в разных условиях инкубации митохондрий (с экзогенным цитохромом с, Мд2+" или с обоими компонентами вместе) в зависимости от осмотического давлений среды, позволило выявить прямую корреляцию меясду Мд2+ —зависимой активностью внешнего пути окисления ЫАОН, измеряемого с экзогенным цитохромом с и без него. Однако, высокие скорости ротеноннечувствительного окисления ИАОН, обеспечиваемые экзогенным цитохромом с, Позволяют оценивать степень повреждения наружной мембраны митохондрий с большей точностью.

Таким образом, измерение скорости Мд2+—, цитохром—с —зависимого окисления ЫАБН может служить очень простым экспресс —методом оценки степени повреждения наружной мембраны митохондрий, а осмотическая зависимость скорости окисления ЫАОН характеризовать прочность мембраны.

ВЛИЯНИЕ ОСМОТИЧЕСКОГО ДАВЛЕНИЯ СРЕДЫ НА АКТИВНОСТЬ ВНЕШНЕГО ПУТИ ОКИСЛЕНИЯ ЫАБН И СТЕПЕНЬ ПОВРЕЖДЕНИЯ НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС РАЗНОГО ВОЗРАСТА И ПОЛА. При помощи разработанного нами метода определения степени повреждения наружной мембраны митохондрий проведены исследования возрастных изменений свойств наружной мембраны и внешнего пути окисления ИАОН. При этом скорость окисления ЫАБН определяли в следующих четырех вариантах условий инкубации митохондрий: вариант 1 — с экзогенным цитохромом с и Мд2"1-, вариант 2 — только с цитохромом с, вариант 3 — только с Мд2 + , вариант 4 — без цитохрома с и без Мд2+.

Скорость Мд2+ —, цитохром —с —зависимого окисления ЫАОН (вариант 1) митохондриями печени всех возрастных групп была наиболее низкой в изотонической среде с КС1 и максимальной в среде без КС1 (табл. 1). В среде, содержащей 37.5 мМ КС1, скорость окисления ИАОН уменьшалась по сравнению со средой без КС1 на 69.1%, 59.1%, 29.3% и 29.8% соответственно в митохондриях 1—, 3 — , 12— и 74— месячных крыс — самцов. Эти данные свидетельствуют о более значительной гипотонической повреждаемости наружной мембраны митохондрий печени старых крыс —самцов по сравнению с молодыми, что согласуется с полученными ранее данными по выходу аденилаткиназы из межмембранного пространства митохондрий [Лемешко,

' 1982). При использовании неэлектролита сахарозы для изменения осмотического давления среды получены такие же результаты как и с КС].

Таблица 1

Влияние различных концентраций КС1 в среде инкубация основного состава, дополнительно содержащей 5 мМ МдБ04 и 4 мкМ цнтохром с, на скорость рогеноннечувстшггельиого окисления NADЫ (нмоль №А1)Н/мни мг белка) в митохондриях печени крыс-самцов разного возраста, (п~5-0)

Концентрация Возраст, мес.

KCl, мМ 1 3 12 24

0.0 170±7 153±7 152*7 140±10

12.5 139±i- 133+5 150± 7 142±9

25.0 95±7 10Э±7 140±10*('*) 130± 0*

37.5 52±4 62±1 103t С*(") 104±9*(")

50.0 27±3 33±5 б5± 1V) 71±10*(")

75.0 21 ±2 1С±3 22± 3 19± 4

150.0 11±1 12±2 12± 1 13± 2

Примечание: * — Р<0.05 по отношению к 1 мес., ** — по отношению к 3 мес.

Снижение ЫАГ>Н —оксидазной активности в среде, содержащей 75 мМ сахарозу, составляло 62.8%, 58.8%, 35.5% и 34.5% в митохондриях 1-, 3-, 12- и 2413

месячных крыс— самцов соответственна. Отсюда можно сделать вывод о том, что возрастные различия повреждаемости наружной мембраны митохондрий не связаны, по-видимому, с особенностями электростатического взаимодействия компонентов мембран, поскольку проявляются, главным образом, в зависимости от величины осмотического давления среды, а не от величины ионной силы.

Сравнение указанной Мд2+—, цитохром —с — зависимой МАОН — оксидазной активности в изотонической и в сильно гипотонической средах может , характеризовать исходную степень повреждения наружной мембраны выделенных митохондрий, которая составляла 6.5%, 7.2%, 8.8% и 8.9% соответственно для 1 — , 3—, 12 — и 24 —месячных крыс-самцов.

Скорость цитохром —с —зависимого окисления ЫАОН (вариант 2) в среде без КС1 была значительно ниже, чем скорость Мд2+—, цитохром —с—зависимого окисления. Однако, при увеличении концентрации КС1 до 15 — 20 мМ и более эти два типа ЫАОН — оксидазной активности мало различались. В обоих вариантах при измерении цитохром—с —зависимого окисления NADH проявлялись возрастные различия прочности наружной мембраны митохондрий печени крыс —самцов.

Без экзогенного цитохрома с скорость окисления ЫАОН была отностительно низкой доже в сильно гипотонических средах, содержащих Мд2+ (вариант 3). Вместе с тем, и в этих условиях сравнение осмотической зависимости скорости Мд2+—активируемого окисления ЫАБН также позволяет сделать вывод об уменьшении прочности наружной мембраны митохондрий печени взрослых и старых крыс —самцов По сравнению с ' молодыми (табл.2).

В отсутствии Mg24" и экзогенного цитохрома с (вариант 4) заметная скорость окисления NADH наблюдалась при изменении осмотического давления среды только с помощью KCl, но не сахарозы. Скорость была максимальной при 25 мМ KCl для митохондрий 1 — и 3— месячных крыс и при 37.5 мМ KCl — для 12— и 24-месячных.

Таблица 2

Влияние различных концентраций KCl в среде инкубации основного состава, дополнительно содержащей 5 мМ MgSOi, на скорость ротенонне-чупстптггелыгого окисления NADH (нмоль NADH/mhh мг белка) в митохондриях печени крыс-самцов разного позраста, (п=5-6)

Концентрация Возраст, мес.

КС), мМ 1 3 12 24

0.0 19.6*0.5 19,0*0.6 19.5*0.5 20.5*0.3

12.5 18.4*0.5 15.9*1.0 18.3*0.7*1") 20.5*0.9*(")

25.0 9.5*1.0 9.9*1.0 15.0*0.6*1*') 17.2*1.0*1*')

37.5 3.3*0.4 3.9*0.2 10.0*1.2 < > 9.5*0.6*1*')

50.0 2.3*0.1 1.5*0.3 3.7*0.4*!*") 5.2*0.6*'' >

75.0 1.2*0.2 1.0*0.4 1.7*0.2 1.9*0.2*

150.0 0.5*0.1 0.7*0.2 0.0*0.1 1.2*0.2*

Примечание: * Р<0.05 по отношению к 1 мес., " — по отношению к 3 мес.

Как было показано ранее, прочность наружной мембраны очень сильно зависит от пола старых крыс [Лемешко, 1982). В настоящей работе проведено более детальное изучение этого вопроса. Полученные данные подтверждают это наблюдение и свидетельствуют о том, что в митохондриях печени крыс —самок возрастные различия Мд24" —, цитохром —с—зависимой скорости окисления К'АОН в средах с различным осмотическим давлением незначительны. Зависимость скорости окисления ЫАОН от осмотического давления среды, содержащей экзогенный цитохром с без Мд2+ , также не проявляет существенных возрастных различий как в сахарозных, так и в солевых средах. Совокупность этих данных свидетельствует о том, что у старых самок Прочность наружной мембраны митохондрий гораздо выше, чем у старых самцов и мало отличается от прочности мембраны у молодых неполовозрелых животных.

Другим важным следствием половой дифференцировки функций печени является более высокая активность внешнего пути окисления ЫАОН в митохондриях печени крыс—самок в сильно

гипотонических средах по ставнению с самцами. Как следует из полученных результатов, скорость ротеноннечувствительного окисления ЫАОН,

активируемого экзогенным цитохромом с с Мд2+ или без Мд2+ , на 50 — 70% выше в митохондриях печени 24 — месячных крыс —самок по сравнению со старыми самцами. У молодых животных указанные половые различий выражены более слабо.

Принимая во внймание данные о повышении активности внешнего пути окисления ЫАОН в митохондриях печени при экспериментальном ■увеличении продолжительности жизни 'крыс путем ограничения калорийности питания [ЬешеаНко,

- Belostotskaya, 1991], можно предположить наличие некоторой связи между половыми различиями ротеноннечувствительной NADH — оксидазной

активности, прочности наружной мембраны митохондрий и продолжительностью жизни животных.

НАБУХАНИЕ МИТОХОНДРИЙ КАК ФАКТОР АКТИВАЦИИ ВНЕШНЕГО ПУТИ ОКИСЛЕНИЯ NADH.

Наиболее существенным фактором активации межмембранного переноса электронов при окислении NADH митохондриями печени в сиситемах, содержащих цитохром с, как отмечалось ранее, является нарушение струхтурной целостности наружной мембраны. Зместе с тем, почти во всех работах, посвященны исследованию активности внешнего пути в различных условиях in vitro или при изменении физиологического состояния организма, авторы используют, умеренно гипотонические среды [Жигачева и соавт., 1976; Агуреев, Мохова, 1979; Абляева и соавт., 1984; Кривицкене, 1988 и др.). В таких средах наружная мембрана основной части митохондрий находится в состоянии на грани разрыва [Лемешко, 1982] и, следовательно, может быть повреждена под влиянием какого-либо дестабилизирующего фактора или дополнительного набухания органелл. Непременным компонентом таких сред является неорганический фосфат, хота задача исследования функции окислительного ф о сф о р или р о вап и я при этом обычно не ставилась, а роль • фосфата в механизме активации внешнего пути анализировалась недостаточно глубоко.

Данные, приведенные на рис.1 свидетельствуют, что для сахарозной умеренно гипотонической Среды скорость ротеноннечувительного окисления NADH В значительной мере зависит от наличия неорганического фосфата или последовательности его внесения й среду по отношению к Добавке разобщителя в суспензию митохондрий.

Окисление ЫАВИ митохондриями цечсцц 1 -месячных крыс о сахарозной умеренно гипотонической среде

Среда инкубации содержит: 150 мМ сахарозу, 5 иМ трпс — НС1, 5 мМ НЕРП5, 1 мг белка митохондрий в 1 мл.

Добавки: 2 мкМ ИССР, 1 мкМ ротенон (Рт), 10 мМ КН2РО4 (Р|), 50 мкМ ЫАОН, 6 мкМ цитохром с. Цифрами указана скорость окисления — нмоль ЫАОН/шш мг белка.

Р1Х. 1

Минимальная скорость окисления КАОН митохондриями наблюдалась в среде без,фосфата (рис. 1, а). Внесение фосфата в суспензию митохондрий до разобщителя вызывало 6 —кратное повышение скорости окисления . ЫАОН с экзогенным цитохромом с (рис. 1, Ь) по

1 сравнению со средой без фосфата (рис. 1, а). Добавление фосфата в среду до митохондрий, a FCCP после, вызывало такую же степень активации (рис. 1, d). Вместе с тем, добавка фосфата в среду с митохондриями после FCCP (рис. 1, с), после FCCP и ротепона (рис. 1, е) или после FCCP, ротенопа и NADH (рис. 1, Í) практически не оказывала активирующего действия. Подобные результаты получены и в солевой умеренно гипотонической среде.

Таким образом, уже незначительная по времени (15 — 20 с) инкубация недеэнергнзованных митохондрий с фосфатом, до внесения разобщителя — протонофора, приводит к многократной активации внешнего пути. Степень выраженности эффекта возрастала при повышении концентрации фосфата в среде. Более длительная чем 15—20 с инкубация недеэнергнзованных митохондрий, например, в течение 5 минут с 2, 4 или 6 мМ фосфатом вызывала дополнительное увеличение скорости окисления NADH на 45—77% в сахарозной среде.

Измерение набухания митохондрий при разной последовательности внесения фосфата и FCCP показало, что при добавлении фосфата после FCCP готическая плотность суспензии составляла 0.94 единицы, тогда как при обратной последовательности — 0.70. Эти данные доказывают, что причиной активации

ротеноннечувствительного окисления NADH в фосфат— содержащих средах является энсрго—фосфат-зависимое набухание митохондрий. Причем, для наблюдаемого эффекта достаточно энершзации мембраны даже за счет окисления эндогенных субстратов и гидролиза эндогенного АТР.

Известно, что одним из . факторов, способных вызывать набухание митохондрий in vivo является ишемия [Hanzlikova, Schiaífino, 1977; Rouslin, 1983; Skeivys

г •

е! а1., 1987; Nishida с1 а1., 1989], в результате которой происходит ингибирование ферментативных комплексов дыхательной цепи митохондрий, особенно, ЫАЕ)Н— СоО —редуктазы; активация фосфолипазы Аг и процессов перекисного окисления липидов; увеличбние неспецифической проницаемости внутренней мембраны . и набухание митохондрий; а также нарушение структуры Наружной и внутренней мембран.

Измерение Мд2+ —, цитохром—с —зависимой скорости окисления ЫАЭН митохондриями печени крыс разного возраста и пола в средах с различным осмотическим давлением позволило установить степень Повреждения наружной мембраны митохондрий после 20 Минутной тотальной ишемии органа. Экспериментальные данные свидетельствуют о том, . что в сильно гипотонической среде инкубации, содержащей только буфер, скорость окисления ЫАИН митохондриями ишемизированной печени 1 — месячных крыс незначительно снижалась по сравнению с контрольными животными. Однако, при увеличении содержания сахарозы в среде инкубации, активность ротеноннечувствительно окисления МАЭН была ниже в митохондриях интактной печени. После 20—минутной ишемии печени 24 —Месячных крыс—самцов активность внешнего пути в сильно ЬшотоИИЧеской среде снижалась в большей степени, ' а й изотонических средах повышалась в больШей мере, чем у молодых животных.

Измерение Мд2+ —, Цитохром С—зависимого окисления ыаом в изотонических и гипотонических средах свидетельствуют о том, что доля Поврежденных в результате ишемии наружных мембран выше в митохондриях 24 —меЫЧйых крыс —самцов, тогда Как у 24 —Месячных самьк и 1—месячных самцов степень ' повреждения гораздо меньше.

Полученные данные позволяют предполагать, что любые условия, касающиеся состава среды инкубации или изменения физиологического состояния организма, влияющие так или иначе на прочность наружной мембраны или набухание митохондрий, будут сказываться на степени повреждения наружной мембраны и скорости рогеноннечувствптелыюго окисления ИАБН.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что повреждение наружной мембраны является необходимым условием активации внешнего пути окисления ЫЛОН с участием как эндогенного, так и экзогенного цитохрома с.

2. Показано, что в митохондриях с поврежденной наружной мембраной ионы Мд2+ в физиолопгческих концентрациях повышают почти на порядок скорость ротеноннечувствительного окисления ЫАОН в средах с низкой ионной силой. Действие Мд2+ более специфично, чем обусловленное повышением ионной силы среды.

3. Установлено, что активирующее действие ионов Мд2+ обусловлено ускорением окисления цитохр зма с В результате повышения к нему аффинности митохондриалъных центров связывания.

4. Разработан способ оценки степени повреждения наружной мембраны на основе окисления ЫАОН, и с его помощью обнаружено. значительное^ увеличение с возрастом степени гипотонической повреждаемости наружной мембраны митохондрий печени у крыс — самцов и менее выраженные у самок.

5. Установлено, что максимальная активность Мд1 ь —, цитохром—с —зависимого окисления ЫАОН, наблюдаемая в сильно гипотонической среде инкубации,

I

гораздо выше в митохондриях старых крыс—самок, чем самцов.

6. Показано, что причиной активации ротеноиечувствигольного окисления ЫАОН в умеренно Гипотонических фосфат —содержащих средах является энерго—фосфат—зависимое набухание митохондрий, для проявления которого достаточно окисления эндогенных субстратов.

7, Установлено, что при тотальной ишемии печени более выраженное ловреждение наружной мембраны митохондрии наблюдается в случае 24 —месячных крыс — самцов по сравнению со старыми самками и молодыми самцами.

ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ-ДИССЕРТАЦИИ Щех В.Е., Лемешко ВВ. Многократная активация

• ионами Мд2+ переноса электронов между наружной и внутренней мембранами митохондрий // Докл. АН УССР. Сер.Б. -1991,- N2. -С. 46 - 48.

2. Шех В.Е. Половые и возрастные различия скорости окисления экзогенного ЫАОН митохондриями печени крыс в - гипотонических средах // Сборник научных работ аспирантов ХГУ (естественные и физико-математические науки). —Харьков: Основа, — 1992. —С. 72-76.

3. Шех В.Е. Прочность наружной мембраны митохондрий печени крыс как маркер старения организма // Тез. докл. "Ускоренное старение, связь с возрастной Патологией". — Киев, —1992. — С. 190.

4 Шех В.Е. Увеличение с возрастом повреждаемости наружной мембраны и йктйвация внешнего пути окисления ЫАОН при гипотоническом набухании митохондрий // Тез. докл. научи, конф. мол. уч. биол.

• ф-та и НИИ биол. ХГУ. - Харьков, -1993. - С. 29.

5. Lemeshko V.V., Shekh V.E. Hypotonic fragility of outer membrane and activation of external pathway of NADH oxidation in rat liver mitochondria are increased with age // Mech. Ageing Dev. - 1993. - V. 68, N 1-3. - P. 221233.

.V///«:.<

Подп. к печ. IJ oi /^'. . Формат 60x84'/,,, Буиаг» тип. Печать офсетная! Усл. печ. л. / t? Уч.-нэд. л. г.-'' Тираж «у экз. Зак. № X J¡¡9. Бесплатно.

Харькооское межвузовское арендное полиграфическое предприятие. 3IÖ093, Харьков, ул. Свердлова, 116.