Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие отрицательных аэроионов на энергетические процессы, структурную организацию митохондрий печени крыс и активность супероксиддисмутазы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Действие отрицательных аэроионов на энергетические процессы, структурную организацию митохондрий печени крыс и активность супероксиддисмутазы"

на правах рукописи

Ставровская Ирина Геннадьевна

ДЕЙСТВИЕ ОТРИЦАТЕЛЬНЫХ АЭРОИОНОВ НА ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ, СТРУКТУРНУЮ ОРГАНИЗАЦИЮ МИТОХОНДРИЙ ПЕЧЕНИ КРЫС И АКТИВНОСТЬ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ

03.00.02. - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО-1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

М.Н. Кондрашова; кандидат биологических наук Е.А. Косенко

Официальные оппоненты: доктор биологичеЬких наук,

профессор

ПД.Миронова кандидат химических наук В.Л.Воейков

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им.А.Н.Белозерского, г.Москва

Защита состоится "2Р"ЛН^СусЛ, 1998 в час.З^мин. на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 г.Пущино, Московской обл., ИТЭБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН.

Автореферат разослан 1997г.

Ученый секретарь диссертационногоховета кандидат биологических наук //у

7т

П.А.Нелипович

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Отрицательно заряженные аэроионы (ОАИ) являются обязательным компонентом чистого природного воздуха и необходимы для нормальной жизнедеятельности живых организмов (Чижевский А.Л., 1933; Tchijevsky A.L., 1960; Soyka F. and Edmonds A., 1978; Charry J.M. and Kvet R., 1987). Содержание ОАИ снижается в загрязненном воздухе городов, замкнутых или кондиционированных помещений, вблизи телевизоров и мониторов компьютеров, что приводит к расстройствам здоровья у постоянно пребывающих в таких условиях людей. Вдыхание пациентами ОАИ, генерируемых искусственными ионизаторами воздуха, оказывает лечебное действие при ряде заболеваний (Чижевский А.Л., 1933; Васильев Л.Л., 1960; Soyka F. and Edmonds А., 1978; Charry J.M. and Kvet R., 1987). Несмотря на многочисленные исследования остается невыясненным первичный физико-химический механизм биологического действия ОАИ. Отсутствие общепризнанного механизма и научно обоснованных рекомендаций ограничивает практическое использование ОАИ .

Среди наиболее известных механизмов - гипотезы органического электрообмена (Чижевский А.Л., Васильев Л.Л., 1960) и серотониновая (Krueger А.Р., 1960; Zulman F.G., 1975). Однако, первая экспериментально не доказана, а вторая, по-нашему мнению, является лишь следствием иных первичных изменений.

Обнаруженный в 80-х годах эффект усиления структурной организации воды, биологических макромолекул и клеточных органелл митохондрий под действием ОАИ, генерируемых гидроаэроионизатором Микулина AM - 59.00, открыл новый этап в изучении их биологического действия (Кондрашова и др., 1987). Однако, наблюдаемые эффекты не могли быть объяснены с позиции существующих представлений о механизмах действия ОАИ.

Учитывая, что основная часть аэроионов представлена супероксидным анионом - 02* (Charry J., Kvet R., 1987; Гольдштейн, 1988), который является активной формой кислорода, мы предположили, что первичный механизм действия ОАИ связан с реакциями перекисного окисления низкой интенсивности. Благоприятное действие низких концентраций ОАИ соответствует общебиологической закономерности защитного тренирующего влияния слабых воздействий. Широко известное патогенное действие супероксид-радикала могло послужить причиной того, что эти процессы не привлекались ранее к объяснению благоприятного действия ОАИ. Другой причиной могло явиться то, что "Супероксидная Эра" началась после спада интереса к ОАИ.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ заключалась в изучении первичного биофизического механизма благоприятного биологического действия ОАИ, генерируемых электроэффлювиальным ионизатором (люстрой Чижевского), и в проверке гипотезы о ключевой роли супероксидного аниона в реализации этого механизма.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ формулировались следующим образом:

1. Исследовать влияние ОАИ, опосредованное через растворы, на структурную организацию митохондрий и связанные с этим изменения в процессах окислительного фосфорилирования.

2. Исследовать действие ОАИ, опосредованное через растворы, на выход Са2* из митохондрий и образование продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

3. Исследовать прямое действие ОАИ на выделенные митохондрии.

4. Изучить влияние ОАИ, вдыхаемых животными, на параметры энергетического обмена в митохондриях (фосфорилирующее дыхание, транспорт С а2*) печени и мозга.

5. Исследовать влияние ОАИ, опосредованное через растворы, на активность одного из главных ферментов антиоксидантной защиты организма - суперок-сиддисмутазы.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Предложено и обосновано принципиально новое представление о первичном механизме биологического действия ОАИ, состоящем в индукции супероксидным анионом образования микромолярных концентраций перекиси водорода, которые активируют, в частности, один из ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазу, а также усиливают структурную организацию и улучшают функциональные показатели митохондрий.

Впервые для исследования механизма действия ОАИ в работе в качестве чувствительной и адекватной тест:системы использованы митохондрии в гомоге-нате ткани с сохраненной нативной структурной организацией в ассоциаты, полученные разработанным ранее методом.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Получены данные, которые позволяют расширить представления о первичном механизме благоприятного биологического действия ОАИ, что может служить основой для разработки рекомендаций по индивидуальному подбору доз при применении аэроионотерапии в клинике!

Показано, что митохондрии в гомогенате ткани являются удобным объектом для исследования воздействия ОАИ как in vivo, так и in vitro, а также для использования в качестве тест-системы в клинических испытаниях, поскольку имеют ряд преимуществ:

- короткое (5-10 мин) время приготовления;

- стабильность;

- сохранение нативности;

- высокая чувствительность к воздействиям in vivo и in vitro;

- возможность использования малых количеств ткани для приготовления препарата.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 1-м съезде Украинского биофизического o6u4ecfBa в Киеве, 1994 г.; на ежегодных научных конференциях Львовского госуниверситета,- 19941995 г.г.; на 13-м Международном симпозиуме по проблемам биоэлектрохимии в Эйн Геди (Израиль), 1996 г.; на 5-й Международной конференции по проблемам геокосмоса в Санкт-Петербурге, 1996 г.; на 4-м Международном симпозиуме по корреляции биологических и физико-химических процессов с космическими и ге-лиофизическими факторами в Пущино, 1996 г.; на юбилейной сессии РАЕН к 100-летию А.Л.Чижевского в Москве, 1997 г.; на 2-й открытой городской научной конференции молодых ученых в г. Пущино, 1997 г; на 1-м Международном конгрессе "Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине" в г.Санкт-Пе'тербурге, 1997г.; на Международной конференции "Актуальные проблемы современного естествознания" в г.Калуге, 1997г.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения , обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, включая таблиц и рисунков.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, 2 работы находятся в печати.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена на белых крысах самцах линии Wistar массой 220-250 г, эритроцитах крысы, человека и утки.

С целью активации симпато-адреналовой системы животным внутрибрю-шинно вводили адреналин за 30 мин до декапитации.

В серии опытов, где действие ОАИ на митоходриальные процессы исследовалось in vitro, доза вводимого крысам адреналина составляла 25 мкг /100 г массы.

При исследовании действия ОАИ при вдыхании их животными на митохонд-риальные процессы адреналин вводили в дозе 30 мкг I 100 г массы. В этой серии опытов животные были разделены на три группы: 1-я группа - контрольная, в которой были интактные животные; 2-я - животным вводили адреналин; 3-я - животным вводили адреналин при одновременном воздействии на них ОАИ в течение 30-40 мин.

Животных, подвергавшихся аэроионизации, за 24 часа до опыта приносили из вивария в комнату, где находился аппарат "ЭЛИОН - 131 М", генерирующий ОАИ. При проведении эксперимента животных или растворы (в зависимости от задачи эксперимента) помещали на расстоянии 120 см по диагонали от центра прибора.

Инъекцию адреналина животным и декапитацию проводили в этом же помещении.

Концентрация ОАИ в месте воздействия составляла 1,2*10® отрицательных зарядов/см3. Перед проведением эксперимента помещение предварительно проветривалось, и с целью осаждения частиц пыли и грязи, находящихся в воздухе, аппарат "ЭЛИОН-131М" включался на 3-й режим работы (концентрация ОАИ - 8 • 106 зарядов/см3) в течение 50-60 мин.

Для изучения влияния различных факторов на митохондриальные процессы был использован комплекс разработанных ранее условий получения митохондрий (MX) в гомогенате ткани, позволяющий сохранить их нативную структурную организацию ( Кондрашова и др., 1997).

После декапитации животного ткань печени быстро помещали в охлажденную среду выделения (СВ), содержащую (мМ): KCI - 120 , HEPES - 10, рН 7,2, ЗГТА - 1. Этой же средой печень перфузировали, затем гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма с неплотно прилегающим тефлоно-вым пестиком. Соотношение ткани и СВ при гомогенизации составляло 1:1. Полученный гомогенат фильтровали через двойную капроновую сетку. Время приготовления гомогената составляло 7-10 мин. Гомогенат хранили на льду, толщина слоя гомогената не более 5-7 мм. Концентрация белка в полярографической ячейке составляла 6,2 ± 0,4 мг / мл. Среда инкубации содержала (мМ): KCI - 120, HEPES -10, рН 7,2, КН2РО4 - 2, t - 26°С. В качестве субстрата дыхания использовали сук-цинат в низких, близких к физиологическим концентрациях, составляющих для печени 0,35 и 1 мМ. Добавление глутамата (1мМ) устраняло скрытое торможение сукцинатдегидрогеназной реакции оксалоацетатом (Кондрашова, Григоренко, 1985). Для определения резервов активности MX использовали добавку динитро-фенола (ДНФ) в концентрации 50 цМ.

Из мозга удаляли сосуды, ткань тщательно отмывали от крови в среде выделения, измельчали ножницами и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с неплотно прилегающим тефлоновым пестиком. Состав СВ и условия гомогенизации для тканей мозга и печени аналогичны. В среду инкубации для MX мозга дополнительно добавляли 500 мкМ ЭДТА. В полярографическую ячейку вносили

100 мкл гомогената. Концентрация сукцината в ячейке составляла 3 мМ. Концентрация белка в полярографической ячейке соответствовала 4,1 ±0,1 мг/мл.

Вход и выход ионов Са2* регистрировали стеклянным электродом по противофазному изменению концентрации Н* в среде инкубации. СаСЬ добавляли порциями по 19 нмоль/ мг белка до спонтанного выброса (Fiskum and Lehninger, 1980). Инкубационная среда содержала 120 мМ KCI, 1,5 мМ КН2РО4 , 1 мМ HEPES , рН 7,2, 2,6 мМ сукцйнат, 6,2 ± 4 мг/мл белка, объем ячейки 1,5 мл, 125°С.

Ионол добавляли в концентрации 37,5 нмоль/ мг белка.

Белок определяли методом Lowry (Lowry et.al., 1951).

Продукты перекисного окисления липидов измеряли по реакции с тиобарби-туровой кислотой и выражали в нмолях малонового диальдегида (МДА) на 1 мг белка (Ohkava et.al., 1579).

Препарат СОД получали из эритроцитов при осаждении путем центрифугирования гепаринизированной крови. Эритроциты промывали дважды физиологическим раствором. 0,1 мл эритроцитарной массы ресуспензировали в 0,5 мл физиологического раствора. Лизат получали при добавлении 0,25 мл воды, 0,175 мл 50 мМ триэтаноламинового буфера, рН 7,4, и 0,075 мл 0,2 % сапонина к 0,25 мл суспензии эритроцитов. Смесь выдерживали 15 мин при 4°С. Затем нерастворимую часть осаждали центрифугированием. Из общего препарата крови готовили два образца: контрольный - на общем растворе и опытный - на растворе, обработанном потоком ОАИ. Активность СОД определяли по степени торможения восстановления нитротетразолия синего (НТС) супероксид анионами, генерируемыми системой ксантин/ксантин-оксидаза (Fridovich, 1979). Активность фермента выражали в единицах на 1 мл эритроцитов.

Концентрацию перекиси водорода в растворах, обработанных ОАИ, определяли по интенсивности хемилюминесценции в присутствии люминола и перокси-дазы хрена (Pugetand Michelson, 1976).

Полученные данные обрабатывали статистически методом парных сравнений контрольных и опытных показателей, достоверность вычисляли по парному критерию Вилкоксона (Рт) (Гублер, 1978), а также методом вариационной статистики по Стьюденту (Бейли, 1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Действие ОАИ на структурную организацию митохондрий

При получении гомогената печени в описанных условиях основная масса митохондрий представлена крупными и мелкими ассоциатами и лишь небольшая часть - отдельными гранулами (Кондрашова и др.,1997).

Изменение структурной организации органелл под действием ОАИ проявлялось исключительно на нативных МХ, т.е. МХ, сохранивших структурную организацию в ассоциаты, свойственную их состоянию в клетке в покое (Кондрашова и ДР-, 1987).

На рис.1а представлены ассоциаты МХ в гомогенате печени крысы, полученные и инкубируемые в нормальной среде в течение 5 минут при постоянном перемешивании.

Как видно из фотографии, препарат представлен ассоциатами, размеры которых находятся в пределах 20-40 мкм. Мерой сравнения может служить ядро размером 8-10 мкм. Кроме ассоциатов в препарате имеется некоторое количество очень мелких ассоциатов, а также единичных гранул МХ.

На рис. 11 представлены ассоциаты в гомогенате, полученные в обычной среде и помещенные в обработанную потоком ОАИ среду на 5 мин. При этом количество г/';лких и средних ассоциатов уменьшалось за счет их объединения в более крупнь э, размеры которых достигали 100 мкм; поле зрения визуально очищалось. ,

. * - «.-л 'тяшг * л < -

Рис. 1а Рис. 16

Хранение гомогената,. приготовленного на ионизированной среде, в течение 2-3 часов под потоком ОАИ приводило к образованию макроассоциатов или гигантских ассоциатов. Они представляли собой поля до 200 мкм и более. Рис.2а представляет часть такого макроассоциата. В середине образования виден также комплекс ядер. Макроассоциаты очень стабильны. Они не разрушались при перемешивании в течение 3 мин на магнитной мешалке. Большая часть ассоциатов, образующихся при хранении гомогената на льду под потоком ОАИ, имела настолько большие размеры, что полностью не помещапась з поле зрения при увеличении, использованном на рис.1.

На рис.2б представлены макрозссоциаты, сфотографированные при увеличен 1.1, уменьшенном в 4 раза по сравнению с предыдущими фотографиями.

Рис. 2а Рис. 26

Эго гигантские образования, напоминающие губки. Их размеры превышали размер клетки. В контрольных препаратах такого явления не наблюдалось.

2. Влияние ОАИ на фосфорилирующее дыхание МХ контрольных и инъецированных адреналином животных

Действие вводимого животным адрзналина оценивали по стимуляции фосфорилирующего дыхания и времени фосфорилироейкия добавленного АДФ. Сопоставление этих показателей в обычной и ОАИ обработенной средах

позволяло оценить влияние ОАИ на энергетические процессы в митохондриях. В митохондриях с разной степенью энергетической регуляции дыхания стимулирующее действие ОАИ проявлялось в нескольких формах, представленных на рис. 3 -4.

При умеренной скорости дыхания МХ Контрольных животных (ниже 40 нг-ат О/минхмг белка), на фоне которой наблюдалась 30 - 40 % стимуляция фосфори-лирующего дыхания адреналином в обычной среде, инкубация в ОАИ-среде приводила к повышению на 24 % скорости дыхания МХ и контрольных, и опытных животных с небольшим увеличением стимулирующего действия адреналина (рис. За). Одновременно наблюдалось и сокращение времени фосфорилирования.

нг-ат О/мин * мгбелка 60 ЗОсек 50 40 30 20 10

О

НИ*

Рис.3. Влияние ОАИ на скорость фосфорилирующего дыхания гомогената печени контрольных и инъецированных адреналином крыс.

По оси ординат - скорость дыхания в нг ат О/ мин на мг белка. Высота столбика отражает величину скорости дыхания после добавления ДДФ(фосфорилирующее дыхание или состояние 3); после завершения фосфорилирования АДФ(контролируемое дыхание или состояние 4). Тонкая линия - контрольные животные; толстая линия - инъецированные адреналином животные; субстрат -1 мМ ЯК.

В группе контрольных крыс со скоростями дыхания митохондрий на уровне 45 нг-ат О/минхмг белка стимулирующее действие адреналина не проявлялось в обычной среде инкубации (рис.Зб).

Однако, при помещении гомогената в ОАИ-среду наблюдалось снижение скорости дыхания МХ контрольного препарата и ее повышение в препарате МХ животных, инъецированных адреналином. Стимулирующее действие адреналина составляло 36%.

На рис. 4 представлены изменения скорости фосфорилирующего дыхания МХ под действием потока ОАИ после хранения гомогената печени на льду.

Стимулирующий эффект адреналина на скорость дыхания долго хранившихся МХ становился неустойчивым и реализовался в форме короткого пика, сменяющегося ингибированием. Длительное воздействие ОАИ на МХ обеспечивало стабилизацию неустойчивого стимулирующего действия адреналина на протяжении всего времени фосфорилирования и усиливало это стимулирующее действие адреналина в большей степени, чем при краткосрочном воздействии ОАИ. Наряду со снижением скорости дыхания наблюдалось и увеличение времени фосфорилирования АДФ для контрольного и опытного препаратов.

Приведенные данные показывают, что воздействие ОАИ на митохондрии как через предварительно обработанные ОАИ растворы, так и непосредственно при хранении на льду способствовало лучшему сохранению физиологических от-

линий их состояния, выражающемуся в стабилизации вариабельного эффекта стимуляции дыхания адреналином. По-вйдимому, это обусловлено сохранением тонких отличий нативной структурной организации митохондрий при выделении и инкубации, которое связано с образованием ассоциатов.

нг-ат О/мин« мг белка

30 сек.

Рис.4. Влияние ОАИ на скорость фосфорилирующего дыхания МХ при хранении гомогената печени на льду.

Условные обозначения как на рис. 3.

3.1. Действие ОАИ на высвобождение Ca2* из предварительно нагруженных

им митохондрий

Известно, что физиологический выход Ca2* из предварительно нагруженных им митохондрий осуществляется благодаря "мягкому" повышению проницаемости мембраны органелл перекисными соединениями. Такая активация освобождения митохондрий от Ca2* гораздо мягче известной грубой "поры", закрываемой циклоспорином (Bernardi and Azzone, 1982; Bernardi and Pietrobon, 1982; Novgorodov et.al., 1989;Schlegel, Schweizer and Richter, 1992). Установлено, что АДФ ингибирует пе-рекисные процессы и предотвращает высвобождение Ca2* из митохондрий (Richterand Frei, 1988; Krasinskaya et.al, 1991).

Ранее было показано, что воздействие гидроаэроионов от другого источника и в иных условиях активирует высвобождение Ca2* из митохондрий (Кондрашова и др., 1987).

На рис. 5 представлен пример регистрации входа в MX и выхода Ca2* из MX в различных условиях. Видно, что добавление АДФ в среду инкубации приводило к усиленному накоплению Ca2* , а выход Ca2* ослаблялся. Помещение митохондрий в ОАИ-среду усиливало выход Ca2* из нагруженных им MX при окислении ЯК. АДФ в этом случае не оказывал влияния на вход Ca2* в органеллы и выход катиона из них.

\ \ W

CaCI2 CaCI2

Рис.5. Влияние ОАИ на высвобождение Са2* из МХ в гомогена-те печени.

1 - 2.5 мМ ЯК;

2- 2.5 мМ ЯК + 200 цМ АДФ;

левая пара кривых - контрольная среда,

правая пара кривых - ОАИ-среда

Анализ ПОЛ в гомогенате печени при разной интенсивности выхода Са2* из нагруженных им МХ показал, что концентрация МДА в присутствии АДФ составляла 0,27 ± 0,01 нмоль/ мг белка, без АДФ - 0,38 + 0,01 нмоль/ мг белка. ■

Следует заметить, что в обоих случаях концентрация МДА примерно на порядок величины ниже концентраций, характерных для патологических состояний.

Добавление в среду инкубации антиоксиданта ионола сильно тормозило высвобождение Са2* из МХ при окислении ЯК (рис.6).

. 240 4 нг ион Н* ____

Рис.6. Влияние ионола. и АДФ на высвобождение Са2+ из МХ в гомогенате печени крыс.

1 - 2,5 мМ ЯК; . ..

2 -2,С мМ ЯК+200 цМ АДФ,

3 - 2,5 мМ ЯК+37,5 нмоль ионола/ мг белка , 4-2,5 мМ ЯК+200 цМ АДФ+ 37,5 нмолыганола

/мг белка

Совместное действие ионола и АДФ полностью устраняло высвобождение Са2* из МХ. При этом Са2* удерживался в МХ в течение 9-10 мин, что резко отличалось от быстрого высвобождения катиона во всех остальных случаях. При совместном действии ионола и АДФ было возможно дополнительное добавление Са2*.

Полученные результаты могут рассматриваться как свидетельство того, что ОАИ вызывают повышение проницаемости митохондриальной мембраны пере-кисными соединениями.

3.2. Действие ОАИ на образование продуктов ПОЛ в митохондриях при окислении различных субстратов

Исследование действия ОАИ на ПОЛ проведено на гомогенатах в растворе, предварительно выдержанном под люстрой.

Из рис. 7 видно, что при использовании разных субстратов окисления скорость фосфорилирующего дыхания гомогената снижалась з перечисленном порядке: 1 мМ ЯК, 0,35 мМ ЯК, 1 + 1 мМ пировиноградная и яблочная кислоты. В описанных условиях опытов скорость дыхания мало менялась при введении животному адреналина. Воздействие ОАИ приводило к небольшому снижению скоростей дыхания гомогената.

Скорость ПОЛ в гомогенатах контрольных и активированных адреналином животных менялась обратно пропорционально скорости дыхания. То обстоятельство, что уровень МДА был ниже при большей скорости дыхания и повышался при медленном дыхании, объясняется, по-видимому, антиоксидантным действием ЯК (ЭгаЬайовеГа!., 1987).

Как видно, скорость ПОЛ изменялась при введении адреналина значительно сильнее, чем скорость дыхания. Концентрация МДА в гомогенате печени контрольных и инъецированных адреналином животных под действием ОАИ менялась различным образом в зависимости от уровня МДА: исходно низкий уровень МДА возрастал, а исходно высокий - снижался.

Содержание и диапазон изменений концентрации МДА после введения ад-еналина в гомогенате печени животных были значительно выше в сравнении с оказателями контрольных животных.

нг-ат О/ мин« мг белка

70 60 50 40 30 20 10 0

[Ъ

н'/оль МДА/ мг белка

3.5

3

2.5

2

1.5

0.5

мь.

К 1 2 3 А 1 2 3

К 1 2 3 А 1 2 3

Рис.7. Скорость фосфорилирующего дыхания гомогената печени и концен-рация МДА в нем при окислении различных субстратов и воздействии ОАИ.

К- контрольные животные; А - животные, инъецированные адреналином в дозе 25 мкг/ кг гассы; 1 - 1 мМ ЯК; 2 - 0,35 мМ ЯК; 3-1 мМ пкруват+1 мМ малат; светлые столбики - контрольная реда; темные столбики - ОАИ - среда. МДА определяли в образцах после окончания фосфорили-ования АДФ ( 200 цМ).

Подобное двоякое изменение концентрации продукта при повышении кон-(ентрации актизатора характерно для цепных свободно-радикальных процессов Воейков, 1996). Перекисное окисление липидов относится к таким процессам. Ес-1И ОАИ действуют как активаторы этих процессов, то повышение низкого уровня фодуктов ПОЛ и снижение высокого уровня может быть проявлением таких реак-днй. В соответствии с предлагаемым объяснением воздействие ОАИ подобно ;ействию факторов, усиливающих ПОЛ. Важно отметить, что содержание продук-'ов ПОЛ после фосфорилирования АДФ и после транспорта Ca2t как в обычной, ■ак и в обработанной ОАИ средах значительно ниже, чем увеличение ПОЛ в слу-(аях патологии или патогенной индукции железом (Kappus, 1S85; Владимиров и гр., 1991).

Таким образом, выявленные изменения уровня продуктов ПОЛ под дейст-¡ием ОАИ происходят в физиологических условиях и могут рассматриваться как физиологическая активация перекисного окисления.

4.1. Влияние ОАИ во вдыхаемом воздухе на фосфорилирующее дыхание MX печени и мозга крысы

• Процесс преобразования энергии в MX язляется одним из факторов, определяющих устойчивость организма в экстремальных условиях (Кондрашова, Григо-зенко, 1985). Принимая это во внимание, мы предположили, что митохондриаль-ные процессы чувствительны к воздействию'ОАИ не только in vitro, но и на уровне делого организма.

Известно, что аэроионизация как метод терапии наиболее эффективна при <омплексном лечении заболеваний, сопровождающихся неспецифической акти-зацией симпато-адреналовой системы (бронхиальная астма, невроз сердца, гипертония, невралгия тройничного нерва, неврастения, мигрень, бессонница, пере-

о

утомление (Васильев, 1960; Минх, 1963; Зайцева, 1996). При этом ОАИ вызывают седативный эффект, состоящий в восстановлении функций организма.

Мы изучили действие ОАИ на энергетические процессы в МХ на фоне мягкого возбуждения животных, моделируемого введением физиологической дозы адреналина (АД).

Животные были разделены на 3 группы: 1-я - интактные животные, 2-я - животные, которым внутрибрюшинно вводился адреналин, 3-я - животные, которым вводился адреналин при одновременном действии на них ОАИ (см."Материалы и методы").

Интересно отметить, что животные всех групп отличались не только по биохимическим показателям, но и по поведению. В отличие от спокойных контрольных крыс и возбужденных, активированных инъекцией АД крыс, животные 3-й группы, находящиеся под люстрой Чижевского после введения АД, были расслаблены, принимали лежачее положение, закрывали глаза.

Контрольные животные (1-я группа) характеризовались низкой скоростью фосфорилирующего дыхания МХ, составляющей 27,9 ± 1,3 нг ат О / мин • мг белка (рис.8а). Внесение в пробу глутамата (рис. 86) почти не влияло ни на этот показатель, ни на время и скорость фосфорилирования , что указывало на отсутствие торможения СДГ. Введение животным адреналина (2-я группа) вызывало увеличение скорости дыхания МХ в активном метаболическом состоянии на 99% по сравнению со скоростью дыхания МХ печени крыс контрольной группы. При этом коэффициент дыхательного контроля (ДК) увеличивался на 43 % ; эффективность фосфорилирования (АДФ/О) - на 91 % ; время фосфорилирования сокращалось в 2 раза; скорость ДНФ-активированного дыхания увеличивалась в 2 раза. Добавление глутамата увеличивало скорость фосфорилирующего и ДНФ-активированного дыхания еще на 18 % и 13 % (р < 0,05) соответственно.

А

со

с

г:

о

сЗ

30 сек

ДНФ

- контроль адреналин -I -адреналин

ОАИ

ДНФ

АДФ

АДФ

а - субстрат 1мМ ЯК б - субстрат 1мМ ЯК * 1мМ глутамат

Рис. 8. Действие вводимого крысам адреналина и ОАИ на показатели дыхания гомогената печени.

Наличие небольшого торможения СДГ в данном случае выполняло защитную, ограничивающую гиперактивацию дыхания МХ функцию. Однако, высокая

а

б

го

□

жорость фосфорилирующего дыхания и небольшое торможение СДГ указывали |а пограничное между активированным и ингибированным состоянием дыхания /IX. Такое пограничное состояние состояло в том, что активирующее и сопрягаю-цее показатели энергетического обмена действие АД при увеличении нагрузки на ¡рганизм приводит к развитию торможения СДГ, ингибирующему окисление ЯК и :арактерному для низкоэнергизированного состояния МХ.

У животных, активированных АД на фоне 30 - минутной аэроионизации (3-я руппа) удалось избежать возникновения такой пограничной ситуации: скорость (эосфорилирующего дыхания МХ достоверно (р < 0,05) уменьшалась на 24 % при жислении ЯК; при добавлении глутамата этот показатель был снижен на 30 % (р < ),05) - при сравнениии с показателями препарата животных 2-й группы. Скорость 1НФ-активированного дыхания МХ печени животных 3-й группы уменьшалась на 19 /о без глутамата и на 15 % при добавлении глутамата. При этом 1ф достоверно (р : 0,05) увеличивалось на 15,7 %, ДК-на10%; отношение АДФ/О достоверно (р : 0,05) снижалось на 25 %.

Гиперактивация фосфорилирующего дыхания и сопровождающие ее изменения других показателей энергетического обмена при введении АД животным наблюдались и на МХ мозга (рис. 9а): скорость дыхания в активном метабо-пическом состоянии возрастала на 68, 4 % ; скорость ДНФ-активированного дыхания - на 67, 8 %, ДК увеличивался на 15 %, АДФ/О - в 2 раза, а 1ф сокращалось в > раза. В присутствии глутамата (рис. 96) прирост скорости фосфорилирующего ;ыхания составлял 19 % (р < 0,05). ДНФ-стимулированное дыхание в этом случае не изменялось.

<3 ва

Си то

1о

бО

г

5: 50

^

4 О

сэ

и ЭО

а

<м ЗО

X

Ю

30 сек

ДНФ

ДНФ

АЦФ

_контроль

.......адреналин + ОАИ

......адреналин

I

а - субстрат ЗмМ ЯК б - субстрат ЗмМ ЯК + 1мМ глутамат

Рис.9. Действие вводимого крысам адреналина и ОАИ на показатели дыхания гомогената мозга.

Скорость фосфорилирующего дыхания МХ мозга животных, которым вводился АД на фоне аэроионизации (3-я группа), в сравнении с этими же показателями для животных 2-й группы достоверно (р < 0,05) уменьшалась на 27 % как в этсутствие, так и в присутствии глутамата. Скорость ДНФ-активированного дыхания МХ мозга незначительно изменялась в обоих случаях. Наблюдалось также достоверное (р < 0,05) увеличение на 27,7 % и ДК на 10 %. Отношение АДФ/О в МХ мозга животных этой группы снижалось недостоверно.

Таким образом, ОАИ устраняли состояние гиперактивации окисления ЯК, снижая скорость активированного адреналином фосфорилирующего дыхания МХ

печени и мозга, и предотвращали развитие торможзчпе СДГ. что указывало на усиление энергетического контроля дыхания.

4.2. Влияние ОАИ во вдыхаемом воздухе на кальциевую емкость МХ печени крысы

Кальциевая емкость МХ печени контрольных животных составляла 116 ± 4,5 нмоль Н+ / мг белка (рис. 10). После добавления АДФ этот показатель превышал исходный уровень на 14 % (р < 0,05). Глутамат (ГЛУТ). вызывал дополнительный прирост Са2+ - емкости на 28 % (р < 0,05).

У животных, которым вводился АД (2-я группа), Са2* - емкости МХ увеличивалась на 80 % относительно контроля. Добавление АДФ вызывало недостоверное снижение Са2+ - емкости. Однако в присутствии глутамата это г показатель увеличивался еще на 50%, что свидетельствовало о наличии тормохения СДГ. Подобная реакция имеет место при патологических состояниях - инфаркте миокарда, пороке сердца - и обусловлена истощением энергетических ресурсов МХ и ослаблением их энергетической регуляции (Саакян, 1990).

а

а:

£ г

Г>ис. 10.

Действие вводимоп крысам адреналин; и ОАИ на Са2* емкость МХ печени.

кОНТрОЛЬ

адреналир+ОАИ

Са - емкость МХ печени животных, активированных АД на фоне одноразовой аэроионизации (3-я группа), почти не отличалась от контрольного показателя; восстанавливался стимулирующий эффект АДФ - он был более выражен, чем в контроле, и составлял 31 %. Добавление глутамата дополнительно увеличивало Сэ2+ - емкость на 24, 3 % (р < 0,05) .

Таким образом, усиливая энергетическую регуляцию, ослабленную, активацией сукцинатзависимого транспорта Са2' в МХ при действии АД. ОАИ нормализовали Са2+ - емкость МХ, приближая ее к контрольным показателям.

5. Влияние отрицательных аэроионов на активность супероксидцисму-тазы эритроцитов

1 Поскольку основная часть ОАИ представлена супераксйдными анионами (СИаггу X, Куе! Я., 1987; Гольдштейн, 1988), мы предположили, что первичной ми-'.иенью для действия ОАИ является один из основных ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутаза.

Результаты измерения активности СОД в эритроцитах крысы в контрольной и обработанной потоком ОАИ средах приведены в таблице 1.

Таблица1. Активность СОД эритроцитов крыс, измеренная в контрольной и обработанной ОАИ средах.

ЭСОД-К ЭСОД-ОАИ

Среда Среда

Контроль ОАИ Контроль ОАИ

СОД активность

ед/мп эритроцитов 1191 ±39 2330 ±212* 2490 ±204* 2869 + 523*

ЭСОД-К - препарат СОД. приготовленный в контрольной среде;

ЭСОД-ОАИ - препарат СОД, приготовленный в среде, предварительно обработанной ОАИ; ЭСОД-К и ЭСОД-ОАИ 10 мкл эритроцитов крыс были инкубированы в контрольной среде и среде, обработанной потоком ОАИ в течение 60 мин * Достоверность отличия показателей от контроля р<0.001.

Из таблицы 1 видно, что обработка буфера ОАИ вызывала повышение активности СОД эритроцитов в 1,5 - 2 раза в сравнении с контролем. Такое же увеличение активности СОД наблюдалось и в случае, когда эритроциты были получены в среде, обработанной ОАИ, и инкубированы в контрольной среде.

Максимальное увеличение активности СОД происходило при 60 минутной экспозиции буфера под потоком ОАИ .

Стимулирующее действие растворов, обработанных потоком ОАИ, на активность СОД было протестировано и на высокоочищенном коммерческом препарате СОД из эритроцитов быка. Была найдена концентрация СОД, обеспечивающая 50 % ингибирование восстановления нитротетразолия синего (НТС) в присутствии ксантин/ксантиноксидазы, в контрольной и обработанной ОАИ средах. Ре-

Концентрация СОД, нг/3 мп Рис.11. Влияние ОАИ на скорость восстановления НТС в присутствии коммерческой СОД в ксантин/ксантиноксидазной реакции.

Коммерческий препарат СОД добавлялся в контрольную среду (криБая 1) и ОАИ-обработанную среду (кривая 2). содержащие ксзнтин/ксантиноксидазную систему и НТС Ингибирование скорости

восстановления НТС, измеренной при 560 нм, в зависимости от концентрации СОД в %. Ошибка -0.2-1.0% и находится в пределах точки.

Оказалось, что для 50 % ингибирования восстановления НТС в контрольной среде необходимо добавить 11,6 нг/ мл очищенной СОД, тогда как в аэрированной среде - 7,7 нг /мл.

Мы предположили, что активатором СОД может быть конечный продукт реакции неферментативной дисмутации супероксидного аниона - перекись водорода.

Измерения показали, что при 60 минутном воздействии ОАИ в растворах накапливалась перекись водорода в концентрациях 0,5 - 1 цМ. С другой стороны, известно, что перекись водорода в высоких концентрациях (0,1 -10 мМ) сильно ингибирует активность СОД (Hodgson, Е.К. and Fridovich, I.,1975; Bray, R.C. et.al., 1974) .Мы исследовали влияние низких концентраций перекиси водорода на активность СОД. Для корректного проведения эксперимента нами были использованы эритроциты утки, лишенные каталазы (Aebi, Н.Е., 1984). Результаты действия ОАИ на СОД эритроцитов утки представлены в таблице 2.

Таблица 2. Активность цитозольной СОД из эритроцитов утки, измеренная в среде с различными концентрациями Н202.

Добавление в контрольную активность СОД %% к среду ед/мл клеток контролю

ЭСОД-К 1300 + 50 100

0 5 ^М Н202 1800+ 100 140

1 цМ Н202 1800 + 100 140

2 цМ Н202 2100 + 100 160

3 цМ Н202 2100130 160

6 цМ Н202 1800 140

ОАИ- среда 2000 + 50 150

Обозначения как в таблице 1

Из приведенных данных видно, что добавление Н202 в концентрации 0,5 цМ к эритроцитам увеличивало активность СОД на 40 %, однако, максимальное увеличение активности фермента наблюдалось при концентрации Н2О2, равной 2 - 3 рМ. Увеличение концентрации Н202 выше 5 рМ не вызывало дополнительного увеличения активности СОД.

Абсолютная активность СОД, измеренная в эритроцитах с использованием среды, обработанной ОАИ, была равна активности фермента, измеренной в контрольной среде в присутствии 1-2 цМ Н202.

Таким образом, представленные данные свидетельствуют о том, что перекись водорода в концентрации 0,5 - 3 цМ способна активировать СОД в эритроцитах

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Полученные нами данные представляют собой первые экспериментальные свидетельства благоприятного физико-химического действия супероксидного аниона, содержащегося в ионизированном воздухе в физиологических концентрациях. Обнаруженная активация процессов перекисного окисления может рассматриваться как первичный физико-химический механизм благотворного биологического действия супероксид-анионов. Как упоминалось ранее, отсутствие таких данных, наряду с многочисленными свидетельствами патогенного действия перекисного окисления, затормозили привлечение этих процессов к объяснению механизма действия ОАИ. Единственная предложенная гипотеза такого рода обосновывалась лишь' данными о токсическом действии супероксидного аниона (Гольдштейн, 1988).

Приложение закономерностей развития разветвленных цепных свободно-радикальных процессов к пониманию действия ОАИ дает основу для ответа на труднообъяснимые вопросы в этой области: сильное влияние сверхнизких концентраций, передача эффекта через водные среды, сохранение действия растворов в течение десятков минут и более, и даже усиление действия при стоянии растворов (Ставровская и др., 1997), а также фазность действия. Эти явления могут объясняться "размножением" активных форм кислорода в водных средах, приводящим к обогащению растворов свободными радикалами и перекисью водорода. Эти процессы могут стабилизироваться и упорядочением структуры воды, показанным нами ранее при действии ОАИ (Кондрашова и др., 1987). Одним из механизмов изменений свойств воды под влиянием различных воздействий может являться перегруппировка больших кластеров, "информационных ячеек" (Зенин, Тяглов,

1994). Характерная для цепных радикальных процессов ярко выраженная двухфазная кинетика развития хорошо объясняет разнозначность конечного эффекта ОАИ, проявляющуюся в некоторых случаях. Как показано в клинических исследованиях на пациентах, конечный эффект определяется соотношением уровня свободно-радикальных процессов в тканях и дозой воздействия (Григорьев и др.,

1995).

Предложенный первичный механизм благоприятного биологического действия ОАИ - индукция физиологическими концентрациями супероксидного радикала свободнорадикальных процессов и перекисного окисления - обоснован приведенными в этой работе экспериментальными данными и открывает новые возможности для изучения природы действия ОАИ.

ВЫВОДЫ:

1. Воздействие ОАИ на выделенные митохондрии обеспечивает сохранение нативной структурной организации органелл в виде ассоциатов.

2. Сохранение нативности митохондрий под действием ОАИ функционально проявляется в стабилизации влияния адреналина на фосфорилирующее дыхание митохондрий. ОАИ способствуют энергизации митохондрий, что выражается в усилении энергетического контроля и ослаблении гиперактивации дыхания.

3. ОАИ активируют выход Са2+ из нагруженных им митохондрий и интенсивность ПОЛ, что указывает на синергичность действия ОАИ и индукторов ПОЛ. Выявленные изменения активности ПОЛ под действием ОАИ не выходят за пределы физиологической нормы.

4. Действие ОАИ на животных, активированных физиологической дозой адреналина, усиливает энергетический контроль дыхания митохондрий, что проявляется, с одной стороны, в устранении избыточного оксалоацетатного торможения

СДГ, а с другой - в ограничении гиперактивации окисления ЯК и чрезмерного накопления Са2+ митохондриями. Это указывает на чувствительность митохондри-альных процессов к ОЛИ и участие митохондрий в реализации их эффектов на уровне организма.

5. ОАИ опосредованно через растворы активируют супероксиддисмутазу в эритроцитах. Активация фермента связана с накоплением в растворе в концентрации 0.5 -1 цМ перекиси водорода в результате неферментативной дисмутации супероксидного аниона.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Темное А.В., Сирота Т.В., Ставровская И.Г., Фойгель А.Г., Кондрашова М.Н. Влияние супероксида воздуха на структурную организацию и фосфорили-рующее дыхание митохондрий II Биохимия. 1997. Т. 62. Вып.10. С. 1072 - 1079.

2. Kosenko Е.А., Kaminsky Yu.G., Stavrovskaya I.G., Sirota T.V., Kondrashova M.N. The Stimulatory Effect of Negative Air Ions and Hydrogen Peroxide on the Activity of Superoxide Dismutase//FEBS Lett. 1997. V.410. P. 309-312.

3. Ставровская И.Г., Сирота Т.В., Саакян И.Р., Кондрашова М.Н. Усиление энергетического контроля дыхания митохондрий печени и мозга крыс под действием аэроионов, генерируемых люстрой Чижевского // Биофизика (в печати).

4. Саакян И.Р., Гогвадзе В.Г., Сирота Т.В., Ставровская И.Г., Кондрашова М.Н. Физиологическая активация перекисных процессов как вероятный первичный механизм действия отрицательных аэроионов // Биофизика ( в печати).

5.Ставровская И.Г., Бабский A.M. Возможные механизмы терапевтического действия легких отрицательнозаряженных аэроионов // Эксперим. и клинич. физиология. Сб. научн. трудов к 100-летию каф.физиологии . 1995. С.301 - 303.

6. Stavrovska I., Babsky A., Shostakovska I. Possible Physiological Mechanisms of Light Negative Hydroairions Action in Cells and Organism II Abstr. of the First FEPS Congress, 9-12 September 1995. Maastricht. P. 107.

7. Sirota T.V., Temnov A.V., Saakjan I.R., Stavrovskaja I.G., Babsky A.M. et.al. The Effect of Negative Air Ions on Isolated Mitichondria and Neutrophils // Abstr. of the 13-th BES Symposium, 7-12 January, 1996. Ein Gedi, Israel. P.50.

8. Ставровская И.Г., Сирота Т.В., Саакян И.Р., Кондрашова М.Н. Энергетические реакции митохондрий как мишень действия отрицательных аэроионов // Тез. док. Межд. Симп. "Корреляции биологических и физико-химических процессов с космическими и гелиофизическими факторами", 23-28 сентября 1996. Пущино. С. 85-86.

9. Ставровская И.Г., Косенко Е.А., Каминский Ю.Г., Шноль С.Э., Кондрашова М.Н. Влияние отрицательных аэроионов, генерируемых люстрой Чижевского, на активность супероксидцисмутазы и образование перекиси водорода в растворах // Тез. Межд.конф. "Актуальные проблемы современного естествознания". 24-27 июня 1997. Калуга. С. 134.

Работа поддержана грантами РФФИ № 96-15-97854 и № 96-04-49053.