Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфорилирование аденозина клетками пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis - основы технологии аденозинфосфатов

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Фосфорилирование аденозина клетками пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis - основы технологии аденозинфосфатов"

на правах рукописи

АДЕЕВА ВЕНЕРА ИБРАГИМОВНА

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ АДЕНОЗИНА КЛЕТКАМИ ПИВНЫХ ДРОЖЖЕЙ БАССНАГЮМУСЕБ САКЬЗВЕКСЕЫ313 - ОСНОВЫ ТЕХНОЛОГИИ АДЕНОЗИНФОСФАТОВ.

03.00.23. - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА - 1998 г.

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева.

Научный руководитель: кандидат химических наук,

доцент Крылов Игорь Алексеевич

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, заведующий сектором РосНИИ природного и культурного наследия Минкультуры и РАН Безруков Михаил Георгиевич;

Кандидат химических наук, заведующая лабораторией нуклеотидного синтеза центра «Биоинженерия» РАН Позмогова Галина Евгеньевна.

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (г.Москва, Б.Коммунистическая, 27).

Защита состоится ^ ¡998 г. в часов на заседании дис-

сертационного совета Д 053.34.13 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И.Менделеева, 125190, Москва, Миусская пл., д.9.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться в Научно-информационном центре РХТУ им. Д.И.Менделеева.

Автореферат разослан

1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 053.34.13, к.б.н.

И.И.Гусева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы: Аденозинфосфаты, в частности АТР, применяются в медицине для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и имеют большое значение для мышечной деятельности. В последние годы более перспективным препаратом признан AMP, используемый для тех же и других целей. До сих пор АТР получают экстракцией из мышц животных (телят), что требует переработки большого количества дорогостоящего сырья. Помимо традиционной технологии, разрабатываются чисто химические способы синтеза аденозинфосфатов, например, AMP.

Из всех известных подходов к получению аденозинфосфатов наиболее перспективными могут оказаться различные биотехнологические приемы, использующие ферментные системы микроорганизмов, фосфорилирующие Ado в среде, содержащей неорганический фосфат.

Известно (С.А.Ансберга), что для фосфорилирования Ado наиболее подходят ферментные системы дрожжей рода Saccharomyces, вырабатываемые пищевой промышленностью. Как показали исследования (А.И.Зинченко), разные штаммы таких дрожжей позволяют получать аденозинфосфаты с различным выходом и соотношением. Наиболее интересным, по нашему мнению, являются случаи, когда из Ado, изменяя условия трансформации, молено получать с высокими выходами АТР, АДР и AMP при низком содержании побочных аденозинфосфатов и других продуктов. Несмотря на достаточно большое число публикаций в части получения АТР, нельзя считать до конца выясненными возможности фосфорилирования Ado до AMP и АДР с технологически приемлемыми выходами данных продуктов. Кроме того, остаются до сих пор невыясненными и пути «серхсинтеза» аденозинфосфатов.

Целью настоящей работы явилось изучение основных закономерностей процесса фосфорилирования Ado в АТР, AMP и АДР. Решение данной задачи мы проводили в два этапа: сначала исследовали основные закономерности образования АТР, а потом, используя полученные данные, - AMP и АДР.

В задачу работы входило разработать основные стадии технологического процесса:

1) Фосфорилирования Ado в среде, содержащей неорганический фосфат и источник углерода, под действием ферментных систем клеток пивных дрожжей.

2) Выделения, очистки аденозинфосфатов и получения их кристаллических препаратов.

Научная новизна. На основе гликолиза (спиртового брожения) исследован процесс фосфорилирования Ado до AMP, АДР, АТР в среде, содержащей неорганический фосфат, источник углерода и ферментные системы клеток пивных дрожжей. Установлено, что образование аденозинфосфатов из Ado возможно при наличии в клетках дрожжей активных пируваткиназ, использующих Ado и AMP в качестве субстратов и обеспечивающих «сверхсинтез» АТР.

На основе полученных экспериметальных данных предложена схема последовательных ферментативных превращений: АТР -» AMP -> АДР и подобраны оптимальные условия проведения процесса фосфорилирования, обеспечивающие высокий выход каждого из аденозинфосфатов.

Практическая значимость. Разработаны основные стадии технологического процесса получения очищенных препаратов АТР, АДР, AMP фосфорили-рованием Ado в среде, содержащей неорганический фосфат и сахарозу, после-

довательного разделения аденозинфосфатов с применением вместо дефицитного сорбента АРА-5П промышленного анионита АВ-17-2 и их кристаллизации из водно-спиртовых растворов.

Проведены расчеты технико-экономических показателей предложенной технологии этих препаратов в условиях производства и комплексной переработки кормовых дрожжей с получением препаратов нуклеотидной и белковой природы.

Апробация работы: отдельные материалы работы были представлены на конференциях - 1. «Химия и технология лекарственных средств» (С.Пб. 28-30 июня 1994 г.).

Публикации: По материалам работы опубликованы 2 статьи и одни тезисы и докладов.

Объем и структура диссертации: Работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения экспериментальных результатов и их обсужедния, заключения, выводов и приложений. Работа изложена на^/.стр. машинописного текста, проиллюстрирована таблицами и рисунками. Библиография включает /^наименований работ, из них на иностранных языках.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

1. Материалы и методы.

В работе использовали промышленные пивные дрожжи Saccharomyces carlsbergensis S-Львовская со степенью доминирования основного штамма не ниже 85% в виде интактных клеток, предварительно обработанных толуолом, или в виде сухого »ацетонового порошка».

Спектрофотометрические измерения выполняли на спектрофотометре марки «SPECORD М-40».

При проведении анализов использовали отечественные химреактивы квалификации не ниже «чда», Ado, ATP, AMP, АДР производства фирмы «MERCK» (Германия). Эксперименты проводили в лабораторных условиях в оборудовании из стекла. При разработке отдельных стадий получения аденозинфосфатов изучали процессы: фосфорилирования Ado в среде, содержащей клетки дрожжей, неорганический фосфат, сахарозу и компоненты минерального питания, ионообменного разделения продуктов фосфорилирования в колонках, заполненных сорбентами АРА-5П или АВ-17-2, отделения пигментов на ультрафильтрационной установке с мембранами из полых волокон марки ВПУ-15 ПА, кристаллизации и перекристаллизации аденозинфосфатов из водно-спиртовых растворов.

Ado и продукты его превращения анализировали в бесклеточном растворе методом ТСХ на пластинках марки силуфол UV-254 (Чехия), используя для определения субстрата и Ino систему изопропанол-аммиак-вода в соотношении 70:15:15 : об., а для аденозинфосфатов - 1,4-диоксан-изопропанол-аммиак в соотношении 60:40:10 % об. Количественный анализ каждого из соединений проводили с помощью УФ-спектроскопии в растворах при pH 2,0. Достоверность полученных экспериментальных данных оценивали по результатам трех параллельных опытов, используя критерий' Сгьюдента для уровня значимости 0,05. Величина доверительного интервала в определении концентраций субстрата и продуктов фосфорилирования составила не более ±15%отн.

-з-

2. Результаты и их обсуждение.

2.1. Фосфоршшрование Ado в АТР ферментными системами клеток пивных дрожжей.

Анализ литературных данных показал, что Ado с выходом не ниже 85% может быть превращен в АТР в среде, содержащей неорганический фосфат, глюкозу или сахарозу, соли калия и магния под действием ферментных систем пивных дрожжей. Установлено, что на трансформацию Ado в аденозинфосфаты оказывает влияние прежде всего содержание в среде неорганического фосфата, источника углерода, ионов калия и магния, а также температура и pH среды. С.А.Ансберга приводит следующие оптимальные условия фосфорилирования: температура-37 С, pH 6,9-7,0, начальные концентрации неорганического фосфата, Ado, клеток дрожжей (АСВ), сахарозы, солей калия и магния, значения которых составили соответственно: 0,22М, 10, 110, 20, по 0,8 гл"1.

Данные условия были проверены нами для получения АТР из Ado при использовании ферментных систем выбранного штамма пивных дрожжей.

На рис.1 представлены результаты фосфорилирования Ado. Полученные зависимости подтверждают возможность получения АТР с высоким выходом (82-85%), однако наблюдается некоторое различие в работе ферментов по-разному подготовленных клеток. В случае «ацетонового порошка» для достижения вышеуказанного выхода АТР, требуется примерно вдвое большее количество клеточного материала, что указывает на 50%-ную потерю активности дрожжевых клеток от воздействия на них ацетона и последующего высушивания. Независимо от способа подготовки ферментных систем дрожжей в ходе фосфорилирования наблюдается наличие индукционного периода на кривых образования АТР, причем время достижения его максимума в случае интактных клеток по сравнению с «ацетоновым порошком» на 1 час короче. Помимо этого, отмечается различие в составе продуктов фосфорилирования: у интактных клеток в отличие от «ацетонового порошка» присутствует дезаминазная активность, приводящая к образованию Ino из Ado, и для них наиболее типичен более узкий максимум на кривой образования АТР, что можно объяснить более высокой активностью внутриклеточных фосфатаз. Относительно других продуктов фосфорилирования (AMP и АДР) можно утверждать, что в обоих случаях их выходы монотонно нарастают.

Дальнейшее изучение данного процесса при других условиях его проведения позволило установить еще одну общую закономерность, которую наблюдали, но не объясняли другие исследователи. Это, изначально более низкая концентрация субстрата (Ado) по сравнению с внесенным в среду Ado, что не позволяет составить материальный баланс процесса. Чтобы найти его, мы предположили, что в ходе процесса Ado вовлекается внутрь клетки, где происходит его обратимое связывание с внутриклеточными структурами дрожжей, причем число таких «точек связывания» должно быть пропорционально содержанию клеток в среде. Тогда, располагая начальными значениями истинной концентрации Ado и наблюдаемой в эксперименте в начальный момент времени, можно для каждого опыта с точностью до постоянной величины рассчитать значение равновесной константы и в дальнейшем с её помощью найти истинный вид кривой расходуемого Ado. Результаты таких расчетов приведены на том же рис.1. Анализ полученных значений константы равновесия показал, что независимо от условий предварительной подготовки клеток дрожжей и проведения процесса фосфорилирования её значение можно считать постоянным,

2 3 4

время, часы

Рис.1. Кривые изменения во времени расходования Ado и образования продуктов его фосфорилирования неорганическим фосфатом под действием ферментных систем пивных дрожжей в виде нативных клеток (а) и "ацетонового порошка" (б). i

Условные обозначения: «-Ado, О-АТР, А-АДР, x-AMP, O-Ino, 1-кривая расчетных концентраций Ado. '

Условия процесса: t=37°C, pH 7,0, Ado-10, сахароза-20, хлоридов калия и магния по 0,8 гл', неорга!шческого фосфата-0,2М, АСД-10 (а) и 15% мае. (б) I

время, часы

время, часы

Рис.2. Влияние на гидролиз АТР концентраций солей хлоридов калия и магния на активность фосфатаз клеток дрожжей в процессе фосфорилирования Ado.

Условия процесса: t=37°C, рН 7,0, Ado-10, сахароза-5, неорганического фосфата-0,2М, АСД-10 %мас. Условные обозначения: а) К, гл-': 1-0,5; 2-0,8; 3-1,2; 4-1,4; б) Mg, гл-': 1-0; 2-0,4; 3-0,8:4-1,5.

-г 5-

изменяющимся в относительно узком интервале значений от 0,41 до 0,69 лг"1. Типичным для всех экспериментально полученных кривых оказалось положение максимума образующегося АТР, который практически совпадает с моментом полного расходования Ado.

При изучении влияния других факторов на выход АТР установлено отсутствие в нашем случае зависимости от концентрации ионов магния и калия. Как видно из рис.2, внесение различных добавок этих солей только изменяет ширину пика образующегося АТР. Если считать концентрации хлоридов калия и магния по 0,8 гл"1 оптимальными, то пик максимума у АТР имеет ширину минимальную. Любое отклонение от данной концентрации в ту или другую не изменяет времени образования максимума у АТР, но приводит к появлению индукционного периода у реакций, протекающих под действием фосфатаз. При этом выход АТР сохраняется высоким до 3,5 ч. Наблюдаемую закономерность можно объяснить тем, что ионы калия и магния могут играть роль активаторов внутриклеточных фосфатаз (АТР-азы), т.е. вызывают конформационное изменение данных ферментов, сопровождающееся образованием наиболее активной формы при оптимальной концентрации вышеуказанных солей.

Более сложный вид зависимостей выхода АТР наблюдается при изменении концентрации неорганического фосфата и сахарозы. На рис.3 и 4 показано влияние содержания этих компонентов в среде на выход АТР. Из представленных зависимостей видно, что увеличение концентраций неорганического фосфата и сахарозы до значений 0,2М и 15 гл"1 соответственно ведет к повышению выхода АТР до постоянной величины, которая в дальнейшем не изменяется. Для различных концентраций неорганического фосфата при одной и той же активности ферментных систем по-разному подготовленных клеток дрожжей полученные зависимости совпадают. Более сложный вид имеют кривые выхода АТР от концентрации сахарозы (рис.4): здесь данный показатель для ферментных систем интактных клеток по сравнению с «ацетоновым порошком» уже достигает 35% в отсутствие сахарозы. По мере увеличения её концентрации можно считать, что кривые нарастают по одному и тому же закону и единственное отличие состоит в их сдвиге по оси абциссе на некую постоянную величину. Наличие такого сдвига можно объяснить тем, что нативные клетки дрожжей сами по себе уже содержат дополнительный источник Сахаров, которые наряду с вносимой извне сахарозой участвуют в процессе фосфорилирования Ado. Источником таких Сахаров в дрожжах могут быть их клеточные стенки, состоящие из глюкан-маннанового полисахарида. Последний в условиях фосфорилирования может гидролизоваться ферментативными системами самой клетки и в дальнейшем играть ту же роль, что и сахароза. При этом очевидно, что активность таких ферментов у нативных клеток может оказаться выше, чем в «ацетоновом порошке».

Традиционно механизм фосфорилирования Ado или AMP связывают с действием ферментов гликолиза дрожжей. При их участии углеводный субстрат последовательно превращается в высокоэнергетические фосфаты, например, фосфоенолпируват, который под действием пируваткиназы взаимодействует с АДР, превращая его в АТР.

Величина изменения стандартной свободной энергии (AG 01) для разбавленных водных растворов при температуре 25°С и pH 7,0 для этой реакции составляет -31,4 КДж моль"1.

Реакция превращения АДР в АТР считается доказанной для всех клеток, в

.1

[Н.мольл

Рис.3. Зависимость выхода АТР от начальной концентрации неорганического фосфата в процессе фосфорилирования Ado ферментными системами нативных клеток. Условия процесса: те же, что и на рис.1, пивные дрожжи'(о) и "ацетоновый порошок" (•)

t° С

Рис.5. Влияние температуры фосфорилирования на выход АТР. Условия процесса: те же, что и на рис. 1 Обозначения те же, что и на рис.3.

[сахароза], гп '

Рис.4. Зависимость выхода АТР от начального содержания сахарозы в среде при фосфорилировании Ado неорганическим фосфатом.

Условия процесса: те же, что и на рис. 1 ,

Обозначения те же, что и на рис.3.

О"

Г

1

к

о 0,8

4

IQS | Q4 о

5 q2

4 6 8

рН

Рис.6. Влияние рН фосфорилирования на выход АТР.

Условия процесса: те же, что и на рис.1 Обозначения те же, что и на рис.3.

- ?-

том числе дрожжевых. Однако в нашем случае субстратом является Ado, а не АДР. Анализ значений AG 01 для уравнений, где в качестве фосфорилируемого субстрата могут быть Ado и AMP, показывает, что протекание таких реакций возможно. Изменение стандартной свободной энергии для них составляет соответственно -47,8 и -31,4 КДж моль"1. Однако, как показывают литературные данные, клетки дрожжей, отличные от рода Saccharomyces, практически не фосфорилируют Ado в избыточных концентрациях. Это означает, что, в отличие от рода Saccharomyces, в них отсутствуют активные пируваткиназы, использующие Ado и AMP как субстраты.

В широко известных реакциях гликолиза активность большинства ферментов связывают с наличием в среде оптимальных концентраций ионов калия и магния. Однако, как показали наши исследования, изменение их концентраций в два раза и более практически не отражается на выходе АТР. Видимо, это связано с тем, что количество этих катионов в клетках дрожжей оказывается вполне достаточным для поддержания активности ферментов гликолиза. Отсюда можно сделать вывод: внесение этих солей в ферментационную среду нецелесообразно и фактически из всех компонентов в нашем случае имеют значение только концентрации сахарозы и неорганического фосфата.

Среди других параметров, способных оказать влияние на выход АТР, было исследовано влияние температуры и pH среды.

На рис.5 и 6 приведены зависимости максимума выхода АТР от температуры и pH среды. Установленный вид кривых вполне типичен для ферментативных реакций. Каждая из них имеет свой максимум и области оптимальных значений температур и pH среды. Они находятся соответственно в интервалах 32-39°С, 6,5-7,2. Последние, как показали наши исследования, не зависят от условий предварительной подготовки клеток дрожжей.

Вполне типичной для ферментативных процессов оказалась зависимость выхода АТР от содержания клеток дрожжей в суспензии. Максимум образования АТР сначала линейно растет с увеличением концентрации последних, а затем скорость его изменения монотонно падает практически до нуля. Технологически приемлемые значения выходов АТР (85%) наблюдаются при содержании в суспензии дрожжей 10% мае. в случае интактных клеток и 15% мае. в случае «ацетонового порошка».

Исследование влияния начальной концентрации субстрата (Ado) на выход АТР показало, что и в данном случае также наблюдается типичная зависимость. В оптимальных условиях с увеличением его концентоации доля АТР в составе продуктов фосфорилирования снижается с 98% (5 гл" Ado) до 82% (15 гл"1 Ado) за счет пропорционального увеличения выходов AMP и АДР. Относительно перспективы получения этих продуктов с технологически приемлемым выходом мы, по результатам наших исследований, можем утверждать следующее: любые попытки изменить условия и концентрации реагентов не приводят к заметному увеличению выходов AMP и АДР. Основным продуктом всегда остается АТР. Снижение концентраций сахарозы или неорганического фосфата ведет к уменьшению скорости фосфорилирования и конверсии Ado вплоть до возвращения его в ферментационную среду вследствие нарастания активности АМР-азы, а при использовании интактных клеток - дезаминазы. Это, на первый взгляд, кажется странным, поскольку АТР должен образовываться из Ado по схеме последовательных превращений, где AMP и АДР являются промежуточными продуктами. Однако данный факт нельзя считать противоречием. С точки

зрения термодинамики анализ значений AG01 для реакций, протекающих с участием фосфоенолпирувата, показывает, что термодинамически наиболее выгодно превращение Ado в ATP (AG01=-110,6 КДж моль"1). Для промежуточных продуктов фосфорилирования значения AG01 по абсолютной величине в 2,3-3,5 раза ниже.

Поэтому возможность получения технологически приемлемых выходов AMP и АДР следует искать по пути подбора условий для активации внутриклеточных фосфатаз. Насколько такой подход может оказаться перспективным, видно из результатов дальнейших исследований.

2.2. Фосфорилирование Ado в AMP и АДР ферментными системами клеток пивных дрожжей.

Фосфорилирование Ado в АТР под действием ферментных систем интакт-ных клеток дрожжей показало, что при оптимальных концентрациях солей магния и калия наблюдается максимальная активность фосфатаз и АТР с относительно высокой скоростью гидролизуется с образованием АДР и AMP. При этом в случае высоких концентраций сахарозы и неорганического фосфата не отмечается тенденция к «сверхсинтезу» одного из этих продуктов. В то же время, если АТР рассматривать в качестве основного источника образования других аденозинфосфатов, то максимум их выхода возможен при наибольшей конверсии Ado в АТР. Поэтому единственное направление поиска условий «сверхсинтеза» AMP и АДР - это путь снижения концентраций неорганического фосфата или сахарозы. Результаты этих экспериментов на средах с различным содержанием данных компонентов показали:

1) снижение концентрации фосфата увеличивает активность фосфатаз, однако при этом значительно снижается выход АТР;

2) снижение концентрации сахарозы ведет к незначительному падению выхода АТР и сопровождается увеличением соотношения образующихся AMP и АДР.

По результатам этих опытов была установлена оптимальная концентрация сахарозы 5 гл"1, при которой Ado на 86% превращается в АТР, который в дальнейшем гидролизуется с преимущественным образованием AMP. Активность фосфатаз в данном случае оказывается настолько высокой, что AMP при этом частично дефосфорилируется в Ado. На рис.7 приведены кривые изменения концентраций всех веществ, наблюдаемых при данных условиях. Для них характерно наличие в среде по 0,8 гл"1 солей калия и магния, которые, как показано выше, в наших условиях не влияют на выход АТР, однако их следует признать оптимальными для условий «сверхсинтеза» AMP.

Как видно из того же рисунка, кривая накопления АДР проходит через максимум. Наблюдаемый вид кривых AMP и АДР позволяет считать, что гидролиз АТР протекает по схеме последовательных ферментативных реакций: +Н20

АТР ДДР + Рн (ÄGol=-30, б КДж моль"1) (1)

+Н20

АДР AMP + Р„ (AG01=-30, б КДж моль"1) (2)

или суммарно: +2Н20

АТР AMP + 2РН (AG01=-61,2 КДж моль"1) (2)

причем с точки зрения термодинамики более выгодно превращение АТР в

АМР.

Наблюдаемые при более высоком содержании в среде сахарозы сопоставимые концентрации образующихся AMP и АДР свидетельствуют о том, что наряду с гидролизом АТР и АДР под действием ферментов гликолиза протекают реакции фосфорилирования AMP и АДР.

Высокая активность фосфатаз в среде с пониженным содержанием сахарозы может приводить к дефосфорилировашпо AMP до Ado: +Н20

АМР^=-> Ado + Р„ (AG01=-14,2 КДж моль1) (3), ко-

торое с точки зрения термодинамики менее выгодно, чем (1) и (2), однако оно возможно, как видно из рис.7, наблюдается в нашем случае и отмечается другими авторами.

С позиции термодинамики нельзя исключить путь образования AMP по реакции:

+Н20

АТР ^¡^ AMP + Р„~РН (AG01=-27,6 КДж моль1) (4),

которая протекает при участии пирофосфатаз. Однако, такой путь представляется маловероятным, поскольку, по данным ряда авторов, активности пирофосфатаз в клетках дрожжей обнаружено не было.

Условия проведения процесса фосфорилирования Ado до AMP, приведенные на рис.7, можно считать оптимальными. Макимальный выход AMP при исходной концентрации Ado в суспензии 10 гл"1 по истечении 8 ч достигает 74%, и в дальнейшем сохраняется на том же уровне, но варьирует в интервале 7078% при изменении содержания субстрата в среде от 15 до 5 гл"1.

Как показали последующие эксперименты, на выход аденозинфосфатов оказывает влияние температура и рН среды. Они фактически повторяют вид кривых, ранее установленный для АТР (рис 3,4), но отличаются более низкими значениями выхода целевого продукта.

В таблице 1 приведены выходы продуктов фосфорилирования в зависимости от рН среды. Из неё следует, что максимум выхода AMP (70%) наблюдается при рН 7,0, однако степень превращения АТР в интервале рН 7,0-8,0 сохраняется неизменной (92%). Это свидетельствует о наличии оптимума в слабощелочной области активности ферментов, обеспечивающих «сверхсинтез» AMP из АТР. В нашем случае это фосфатазы, для которых максимум активности, как известно, лежит в вышеуказанной области.

Таблица 1.

Влияние рН среды на выход AMP*.

pH Максимальный выход AMP, % Выход АДР, % Выход побочных продуктов, % Конверсия ATP в AMP, О. о

5,0 0 0 40 (1по) -

7,0 78 4 7 (Ino) . 12 (Ado) 92

8,0 70 8 0 (Ino) 0 (Ado) 92

*) исходная концентрация субстрата (Ado) - 5 гл'1, время фосфорилирования - 8ч.

Наиболее интересными оказались зависимости выходов продуктов в экспериментах по длительному фосфорилированию Ado в суспензиях с повыше-ным содержанием клеток дрожжей. Как видно из рис.8, наблюдаются экстремальные зависимости не только для образующегося АТР, но и для AMP. Процесс фосфоршшрования сдвигается в сторону преимущественного образования АДР. Концентрация последнего в среде после полного расходования AMP приближается к стационарным значениям и выход АДР составляет 85%.

Наблюдаемые закономерности можно объяснить протеканием тех же реакций гликолиза, превращающих AMP в АДР в результате взаимодействия его с сахарофосфатами под действием пируваткиназы. Источником таких Сахаров вполне могут быть продукты ферментативного гидролиза клеточных стенок дрожжей, концентрация которых нарастает пропорционально количеству вносимых в среду дрожжей. Данная гипотеза согласуется с литературными данными, в которых приводится описание процесса фосфоршшрования Ado клетками пивных дрожжей в условиях, когда после четвертого часа в среду вносили дополнительное количество глюкозы. Результатом явилось заметное увеличение выхода АДР.

Возможность фосфорилирования AMP и АДР ферментными системами дрожжей была проверена нами непосредственно в опытах, где данные нуклео-тиды использовали как субстраты в средах, обеспечивающих «сверхсинтез» АТР. На рис.9 приведены результаты таких опытов. Они показывают, что AMP с выходом 98% превращается в АТР, причем АДР играет роль промежуточного продукта, исчезающего в течение времени. В случае субстрата АДР с таким же выходом образуется АТР, однако накоплению последнего предшествует образование AMP. Появление последнего в ходе фосфорилирования АДР можно объяснить известной реакцией диспропорционирования, протекающей под действием двух ферментов - миокиназы и аденилаткиназы, наличие которых в клетках дрожжей доказано: миокиназа

2АДР _ AMP + АТР (AG01 —> 0 КДж моль"1) (5)

аденилаткиназа

Среди других гипотез, объясняющих механизм «сверхсинтеза» АТР из Ado в процессе фосфоршшрования, наиболее часто ряд авторов предлагают рассматривать реакцию взаимодействия Ado с АТР при участии фермента адено-зинкиназы:

аденозинкиназа

Ado + АТР , -»- AMP + АДР (ДОс"=-16,3 КДж моль4) (6).

Образующийся при этом АДР в дальнейшем по реакциям гликолиза превращается в АТР.

Мы не исключаем возсможность протекания реакции (6) в исследуемом процессе. И как видно из рис.1, образование AMP и АДР в начале процесса действительно наблюдается, скорее всего, в результате такого взаимодействия. Однако эту реакцию нельзя рассматривать как основной путь «сверхсинтеза» АТР, поскольку количества внутриклеточного АТР много меньше, чем внесенного в среду фосфорилирования Ado. Более вероятным нам представляется механизм «сверхсинтеза» АТР, обусловленный участием в нем ферментов гликолиза - пируваткиназ, использующих в качестве субстратов не только АДР, но и AMP, и Ado.

Как показали результаты наших исследований, процесс фосфорилирования

время, часы время, часы

Рис.8. Кривые изменения во времени расходования Ado и образования продуктов его фосфорилирования неорганическим фосфатом под действием ферментных систем пивных дрожжей в виде нативиых клеток. Обозначения те же, что и на рис.7.

Условия процесса: t=37°C, Ado-10, сахароза-5, хлоридов калия и магния по 0,8 гл"', неорганического фосфата-0,2М, АСД-14% (а) и 18% (б).

I

время, часы время, часы

Рис.9. Кривые изменения во времени продуктов фосфорилирования (а) AMP, (б) АДР неорганическим фосфатом под действием ферментных систем пивных дрожжей в виде нативных клеток. Обозначения те же, что и на рис.7.

Условия процесса: t=37°C, рН 7,0, сахароза-20, АМР-10 (а), АДР-10 (б), хлоридов калия и магния по 0,8 гл", неорганического фосфата-0,2М, АСД-10% мае.

Ado не приводит к образованию только одного из нуклеотидов, и наряду с целевым продуктом в реакционной смеси присутствуют и другие, причем не только близкие по своим физико-химическим свойствам аденозинфосфаты, но и нуклеозиды в виде Ino и Ado.

Поскольку конечными продуктами производства являются индивидуальные аденозинфосфаты, свободные прежде всего от примесных аналогов, то были поставлены задачи разработать стадии разделения многокомпонентной смеси.

Среди возможных технологических приемов разделения мононуклеотидов чаще всего используют ионный обмен с применением сильноосновных аниони-тов. Ниже мы рассмотрим особенности проведения стадий подготовки натив-ных растворов и разделения аденозинфосфатов на ионитовых фильтрах.

3. Разделение продуктов фосфорилирования (АТР, АДР и AMP) ионным обменом.

Полученные при фосфорилировании растворы аденозинфосфатов содержат суспендированные клетки дрожжей, которые перед ионным обменом должны быть отделены. Среди возможных приемов получения осветленных растворов мы выбрали метод центрифугирования, который, как показали предварительные исследования, при факторе разделения Fr=2850 позволяет наиболее полно отделить отработанные клетки дрожжей, сгущая их до 18-20% СВ. Образующийся при этом осадок с целью повышения выхода целевого продукта трижды промывали горячей водой, взятой по объему осадка. После объединения супернатанта с промывными водами получаемые растворы все-таки оставались мутными и окрашенными в желтый цвет. Выход на стадии составил 9395%.

На первоначальном этапе исследования такие растворы без дополнительной очистки от взвешенных и пигментов направляли на колонки, заполненные сильноосновными анионитами АРА-5П или АВ-17-2 в СГ-форме. Из числа сорбентов АРА-5П был выбран нами согласно литературным данным, а АВ-17-2 -по результатам наших предварительных исследований с промышленными сорбентами типа АВ-17 различных модификаций: среди них этот анионит по своей способности разделять аденозинфосфаты оказался наиболее близким к АРА-5П. Согласно тем же литературным данным были выбраны и условия динамической сорбции-десорбции аденозинфосфатов с применением элюирующих растворов №1 (0,02н NaCl в 0,01 н HCl - для отделения смеси AMP и АДР) и №2 (0,5н NaCl в 0,02н HCl - для десорбции АТР).

На рис.10 приведены результаты опытов по сорбции и десорбции аденозинфосфатов из нативных растворов на вышеуказанных сорбентах. Представленные на рис.10 зависимости оптической плотности растворов (D260) от объема растворов, пропущенных через колонку, и данные анализа растворов, полученных после сорбции и десорбции аденозинфосфатов, свидетельствуют о возможности использования сорбента АВ-17-2 для выделения АТР и его очистки от других продуктов фосфорилирования Ado. При этом элюент №1 вытесняет с каждого сорбента AMP совместно с АДР, что в дальнейшем позволяет получать практические чистые элюаты, содержащие только АТР. Таким образом предложенный вариант разделения аденозинфосфатов ионным обменом решает проблему только выделения и очистки АТР из вышеуказанных нативных растворов. В дальнейшем требуется найти условия для выделения AMP и АДР.

Однако последующее изучение работы ионитовых фильтров в режиме

Условные обозначения для моментов подачв растворов: 1-воды на промывку сорбента, П-элюента №1, Ш-элюента №2. Ионятовьш фильто-колонка из стекла с вахней подачей растворов; НМ—Ю: X, рабочий объем 6,7 см3 сорбента, объемная скорость подачи нативных растворов и элюенгов -3,7 ч .

- 1h-

многократно проводимых циклов сорбции-десорбции показало, что емкость сорбентов падает за счет необратимой сорбции пигментов на активных центрах анионитов. И если для сорбента АРА-5П проблема удаления пигментов удовлетворительно решается согласно литературным данным, путем промывки анио-нита раствором 0,004н HCl, то для сорбента АВ-17-2 этот прием не дал положительных результатов.

Из литературы известно, что очистить нативные растворы от пигментов можно вполне эффективно, используя методы мембранной технологии. Такой подход, по нашему мнению, является достаточно обоснованным, поскольку ввиду низких молекулярных масс аденозинфосфатов, последние могут быть переведены в пермеат, а большая часть высокомолекулярных пигментов может быть оставлена в ретанте. Для этой цели мы использовали наиболее часто применяемые в промышленности мембраны в виде полых волокон марки ВПУ-15 ПА отечественного производства. Как показали результаты опытов по очистке нативных растворов аденозинфосфатов от пигментов на этих фильтрах в режиме глубокого ультраконцентрирования (в 30 раз) с последующей диафильтра-цией разбавленного в 7 раз ретанта, оптическая плотность раствора (D 50) снижается в 4,5-6,5 раз, а степень очистки от пигментов достигает 73-87%. Потерь продуктов фосфорилирования не происходит, образующиеся пермеаты слегка окрашены в желтый цвет и представляют собой прозрачные растворы. В ходе последующих исследований было установлено, что присутствующие в пермеате низкомолекулярные пигменты не изменяют ионообменной емкости вышеуказанных сорбентов, поскольку адсорбированные пигменты легко удаляются с фильтров при их регенерации. Результаты этих исследований позволяют рекомендовать проведение стадий мембранной очистки в качестве предварительной перед проведением ионообменного разделения аденозинфосфатов. Они позволяют отказаться не только от применения анионита АРА-5П как более дефицитного по сравнению с АВ-17-2, но и надеяться на увеличение выхода аденозинфосфатов на последующих стадиях их кристаллизации из осветленных растворов.

Если в качестве конечных продуктов разрабатываемой технологии рассматривать не только АТР, но и AMP ,и АДР, то, как показали наши исследования, взятая из литературы норма расхода сорбента оказалась явно недостаточной, поскольку на стадии сорбции эти соединения сорбируются соответственно на 80 и 94%. Для снижения процента потерь аденозинфосфатов были поставлены опыты, в которых варьировали количество анионита АВ-17-2 в колонке, и объемную скорость пропускания нативного раствора, содержащего преимущественно AMP. В результате этих исследований было установлено, что норма расхода анионита должна быть увеличена в 2,4-2,5 раза, а объемная скорость подаваемых растворов снижена вдвое.

Необходимость получения очищенных препаратов AMP и АДР поставила задачу подбора условий для их разделения ионным обменом.

Очевидно, что поиск таких условий необходимо было проводить по пути снижения, прежде всего, концентрации соли в элюенте №1, который десорби-рует AMP совместно с АДР. Чтобы найти состав элюирующих растворов для разделения данных аденозинфосфатов при минимальных объемах, подаваемых на колонку, были поставлены соответствующие серии экспериментов, в которых варьировали только концентрацию хлорида натрия. В ходе этих исследований были установлены составы элюентов: 0,008н NaCl в 0,01 н HCl и 0,05н NaCl

Объем пропущенного раствора, мл

Рис.11. Зависимость оптических плотностей растворов, пропущенных через колонку с анионитом АВ-17-2, при ионобменном разделении аденозинфосфатов от выходящих объемов нативного раствора и элюатов на стадиях:

а) сорбции аденозинфосфатов;

б) десорбции AMP элюгнгом 0,008н NaCl в 0,01 н НС1 (элюент № 1);

в) десорбция АДР элюентом 0,05н NaCl в 0,01н НС1 (элюент №3).

Условные обозначения для моментов подачи растворов: I-воды на промывку сорбента, П-элгоента №1, Щ-элюента №3. Ионитовый фильтр-колонка из стекла с верхней подачей растворов; H/d=10:1, рабочий объем 24 см3 сорбента, объемная скорость подачи нативных растворов и эдюентов - 1,9 ч"\

в 0,01 н HCl, первый из которых на 100%, а второй на 96-98% десорбируют соответственно AMP и АДР в отсутствии примесных аналогов.

На рис.11 в тех координатах, что и на рис.10, приведены данные по ионно-обменному разделению отдельных компонентов нативного раствора, содержащего преимущественно AMP на фоне примеси АДР. Представленные на нем зависимости показывают, что при вытеснении AMP с колонки около половины образующегося элюата не содержит продуктов фосфорилирования. Это означает, что в технологическом процессе данная часть фактически чистого элюента должна собираться в отдельный сборник и использоваться в последующих циклах работы колонны на стадии десорбции AMP.

Для того чтобы оценить возможность хроматографического разделения аденозинфосфатов при использовании элюентов вышеуказанного состава, нами был поставлен опыт по переработке на ионитовом фильтре нативного раствора, содержащего АТР, AMP и АДР в сопоставимых количествах, с анализом всех фракций, выходящих с колонки. Анализ этих фракций показал, что на стадии ионообменного разделения и очистки аденозинфосфатов использование элюи-рующих растворов вышеуказанного состава потери AMP не происходит, ¿еря-ются только 2% АДР и 1 %АТР на этапе отбора фракций при переходе от элюента, десорбирующего АДР, на элюент для десорбции АТР.

Это позволяет рекомендовать к использованию в технологии выбранные режимы сорбции и десорбции аденозинфосфатов и состав элюирующих растворов для переработки соответствующих элюатов в кристаллические препараты.

4. Выделение и очистка аденозинфосфатов, получение кристаллических препаратов АТР, АДР и AMP.

В литературе описан способ переработки элюата №2, содержащего АТР, путем кристаллизации последнего из водно-спиртовых растворов. Он основывается на различной растворимости нуклеотида и соли в водно-спиртовой среде. Полученные при этом кристаллы технического продукта предусматривается очищать перекристаллизацией из 50% этанола. Готовый препарат содержит не менее 98% основного вещества.

Прежде чем приступить к проверке этого способа для получения кристаллических препаратов аденозинфосфатов, нами были исследованы зависимости растворимостей АТР, AMP и хлорида натрия в водно-спиртовых растворах с различным содержанием этанола. В результате этих опытов были получены кривые растворимостей этих веществ в водно-спиртовом растворе, вид которых приведен на рис.12. Представленные на нем зависимости показывают, что растворимость хлорида натрия всегда выше растворимостей аденозинфосфатов.

На основе полученных данных легко рассчитать значение гидромодуля этанола, необходимого для наиболее полного осаждения АТР из элюата №2. Его значение должно быть не ниже 10, что совпадает с литературными данными.

Проверка этих рекомендаций в опытах по переработке АТР-содержащего элюата №2 показала, что из 88%-ного этанола АТР кристаллизуется на 97%. В полученном кристаллическом препарате содержалось 30% хлорида натрия. Как следует из рис.12, проводить очистку технических кристаллов АТР перекристаллизацией из 50%-ного этанола нецелесообразно, поскольку значительная доля АТР останется в маточнике. Удовлетворительный эффект очистки АТР от соли следует ожидать при проведении стадии перекристаллизации из 77% раствора этанола. Последующая экспериментальная проверка подтвердила необ-

ходимость повышения концентрации спирта до этого значения.

Среди других параметров проведения кристаллизации было исследовано влияние температуры и времени на степень осаждения АТР. Были установлены следующие значения оптимальной температуры растворов и времени образования осадков: 4-6°С, 8-12 часов. Для этих параметров степень осаждения АТР составила 88-92%.

Для удаления из очищенных кристаллов АТР кислых продуктов и остатков хлорида натрия осадок промывали этанолом, а для понижения влагосодержания - ацетоном. Промытые кристаллы высушивали в течение 4-х часов в вакуум-сушильном шкафу при температуре не выше 25°С. Готовый препарат представляет собой порошок белого цвета, содержит не менее 98% основного вещества и не более 5% влаги. Ниже в табл.2 приведены результаты спектрофотометри-ческого анализа его качества. Там же для сравнения приведены данные коммерческого препарата АТР, выпускаемого фирмой «MERCK» (Германия). Из табл.2 видно, что все характерные для него показатели между собой совпадают.

В дальнейшем аналогичные исследования были проведены в отношении выделения и очистки AMP и АДР.

Изучение процесса ионообменного разделения этих аденозинфосфатов показало, что в элюатах концентрации AMP и АДР в отличие от АТР оказываются значительно ниже и составляют соответственно 0,8-1,0 и 2,7-3,0 гл"1. Полагая, что их физико-химические свойства мало отличаются от АТР, мы попытались сохранить неизменными условия их выделения и очистки.

Из рис.12 следует, что технологически приемлемый выход этих препаратов на стадиях кристаллизации возможно достичь при переработке растворов, содержащих не менее 20 гл'1 целевого продукта. Это означает, что вышеуказанные элюаты предварительно должны быть сконцентрированы. Из всех возможных технологических приемов мы выбрали вакуум-выпаривание, в ходе которого АМР-содержащий элюат концентрировали в два этапа в 30-35 раз, а АДР-содержащий элюат-в 6,5-7,5 раз. При выполнении этой стадии в каждом случае наблюдалось образование осадков на внутренней поверхности обогреваемого куба. Их анализ показал, что осадки содержат около 20% основного вещества, остальное в них - соль. При этом наибольший процент потерь (до 27%) наблюдается для AMP. Его удается снизить (до 5%) после промывки стенок куба этанолом с последующим объединением образующейся суспензии с концентратом.

В дальнейшем полученные концентраты каждого из продуктов подвергали той же переработке, что и АТР-содержащие элюаты. В ходе её проведения было установлено, что AMP и АДР на 97-98% кристаллизуются из водно-спиртовой среды. Однако, как оказалось, кристаллы технического полупродукта по сравнению с АТР содержали вдвое меньше (33-35%) основного вещества за счет увеличения содержания в них соли: Это потребовало поиска новых условий проведения стадии перекристаллизации. На основе зависимостей, приведенных на рис.12, удается найти величину гидромодуля спирта, достаточную для достижения очистки кристаллов аденозинфосфатов от соли. Он должен быть не менее 12. Однако, как показала проверка этого режима осаждения и перекристаллизации, в готовых препаратах AMP и АДР содержание основного вещества не превышало 95-96%, что требует проведения еще одной стадии перекристаллизации. Более того, при перекристаллизации AMP и АДР отмечается увеличение в 2 раза концентрации этих соединений, остающихся в маточнике, что также снижает эффективность проведения стадий химической очистки.

13 4 6 время, часы

Ч0Г 80

Содержание этанола, в водно-спиртовом растворе, % о

Рис.7 Кривые изменения во времени расходо-доваиия Ado и образования продуктов его фосфорилирования неорганическим фосфатом под действием ферментных систем пивных дрожжей в виде нативиых клеток. Обозначения те же, что и на рис.1. Условия процесса; t=37"C, pH 7,0, Ado-10, сахароэа-5, хлоридов калия и магния по 0,Х гл неорганического фосфата-0,2М, АСД-10% мае.

Рис.12. Зависимость растворимостей аденозинфосфатов (1-АТР, 2-АМР) и солей (3-NaCl, 4-NHjCl) в водноегшр-JOBOM ран ворс от содержания в нем этанола.

-1д~

Для преодоления вышеуказанных недостатков мы предприняли попытку заменить в растворах, элюирующих AMP и АДР с ионитового фильтра, хлорид натрия на хлорид аммония, имеющий более высокую растворимость в водно-спиртовой среде, без изменения в них концентрации соли.

На том же рис.12 приведена зависимость растворимости хлорида аммония от содержания этанола в растворе. Анализ данных растворимости этой соли в водно-спиртовом растворе позволяет использовать схему переработки концентратов AMP и АДР, что и в случае АТР.

Результаты последующих опытов по выделению и очистке AMP и АДР из растворов, содержащих хлорид аммония вместо хлорида натрия, показали, что на стадиях выделения и очистки выходы AMP и АДР составляют соответственно 78 и 85%, а содержание основного вещества в готовом препарате не менее 98%. Ниже в табл.2 приведены результаты спектрофотометрического анализа их качества. Там же для сравнения приведены данные коммерческих препаратов AMP и АТР фирмы «MERCK» (Германия).

По результам работы была разработана технологическая схема получения аденозинфосфатов применительно к заводу по производству кормового белка мощностью 60000 т и на примере производства AMP рассчитаны технико-экономические показатели процесса. Используемые в качестве субстрата Ado, наряду с другими нуклеозидами рассматривался как полупродукт, образующийся при гидролизе РНК, предварительно выделенной из дрожжей.

Таблица.2.

Результаты спектрального анализа кристаллических препаратов AMP, АДР и АТР.

Соотношение оптичес D 25O/D 260 D 28O/D 260 D 29O/D 260

^■кшс плотное тей (pH 7,0)

Препараты

Кристаллические препараты, полученные в работе AMP 0,8 0,16 0,004

АДР 0,79 0,15 0,010

АТР 0,79 0,16 0,014

Кристаллические препараты фирмы «MERCK» (Германия) AMP 0,80±0,02 0,15±0,02 <0,02

АДР 0,78±0,02 0,16±0,01 <0,02

АТР 0,78±0,02 0,15+0,01 <0,02

Данные расчетов показывают, что при комплексной переработке одной

-го-

трети годового выпуска кормовых дрожжей на этаноле с получением препаратов белковой и нуклеотидной природы в условиях полной утилизации жидких и твердых отходов в основном производстве, мощность установки по получению AMP составит 38 т при себестоимости кристаллического препарата 1051 тыс. деномин. руб (171 тыс.у.е.) за 1 т.

ВЫВОДЫ.

1. Разработаны стадии фосфорилирования аденозина неорганическим фосфатом в аденозинфосфаты (АТР, АДР и AMP) ферментными системами пивных дрожжей, обеспечивающих в определенных условиях «сверхсинтез» каждого из нуклеотидов с выходом 85-98%. Показано, что в ходе фосфорилирования из аденозина сначала образуется АТР, который в зависимости от условий проведения процесса может быть превращен с выходом 77-85% в AMP или АДР.

2. Установлено, что выход каждого из аденозинфосфатов зависит от температуры, pH среды и концентрации в среде источника углерода, неорганического фосфата и клеток дрожжей. На основе современных биохимических моделей предложены схемы образования: АТР по известным уравнениям гликолиза или спиртового брожения и его«сверхсинтеза» из аденозина и фосфоенол-пирувата под действием пируваткиназ дрожжей; AMP - в результате гидролиза АТР под действием фосфатаз дрожжей, протекающего при пониженном содержании в среде источника углерода и оптимальных концентрациях солей магния и калия, и АДР как продукта фосфорилирования AMP в условиях повышенного содержания в среде клеток дрожжей.

3. Разработаны стадии ионообменного разделения продуктов фосфорилирования аденозина на сильноосновном промышленном анионите АВ-17-2, обеспечивающие полное разделение аденозинфосфатов в динамическом режиме. Показано, что устойчивая работа ионитового фильтра возможна только при условии предварительной очистки нативных растворов от пигментов на ультрафильтрах, удерживающих молекулярные массы свыше 15 кЕ>а.

4. Разработаны стадии получения очищенных препаратов АТР, АДР и AMP, отвечающих современным требованиям, предъявляемым к биохимреак-тивам и субстанциям для производства лекарственных форм.

5. Приведены расчеты технико-экономических показателей возможного производства AMP из аденозина как продукта гидролиза РНК из дрожжей при комплексной переработке последних в условиях завода БВК. Показано, что такая технология AMP представляется оптимальной, поскольку позволяет утилизировать твердые и жидкие отходы в производстве кормовых дрожжей.

Условные обозначения.

Ado - аденозин, Ino - инозин

AMP - аденозин-б'-монофосфат

АДР - аденозин-5' -дифосфат

АТР - аденозин-5'-трифосфат

Список публикаций по теме диссертации.

1. АдееваВ.И., Крылов И.А., Манаков М.Н. - Фосфорилирование аденозина клетками пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Сообщение1. Биосинтез аденозинтрифосфата. - Биотехнология, 1998, №3, сXS-Z9

2. Манаков М.Н., Адеева В.И., Крылов И.А. - Фосфорилирование аденозина клетками пивных дрожжей Saccharomyces carlsbergensis. Сообщение2. Биосинтез аденозинмонофосфата и аденозиндифосфата. - Биотехнология, 1998, №3, с30-33.