Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фосфатазная активность бактерий рода Francisella

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фосфатазная активность бактерий рода Francisella"

С. '

На правах рукописи

ЦИМБАЛИСТОВА МАРИНА ВИКТОРОВНА

ФОСФАТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА РКАКСКЕЬЬА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

б

Ростов-на-Дону -1998 г.

Работа выполнена в Росговском-на-Дону государственном научно-исследовательском противочумном институте

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Павлович Н.В.

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, доцент

Терновская Л.Н.

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Водопьянов С.О.

научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи

Защита состоится «¿3 » 1998 г. в час, на

заседании диссертационного совета Д 084 53 01 при Ростовском государственном медицинском университете

(344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного медицинского университета

Автореферат разослан ¿¿^Рор^Яс^Р

1998

Ученый секретарь

диссертационного совета, доцент Н.Я. Корганов

Актуальность проблемы.

Как известно, вирулентность туляремийного микроба для животных и человека является основным критерием для разделения вида Francisella tularensis на три подвида - неарктический, среднеазиатский и голарктический (Олсуфьев Н.Г., 1975). Однако до настоящего времени не идентифицированы факторы, определяющие различный уровень патогенносги таксонов возбудителя туляремии. Одним из возможных подходов к решению этой проблемы может служить поиск и изучение биологических признаков микроба, отличающихся у разных подвидов, и выяснение их роли в реализации патогенных свойств. В частности, установлено, что штаммы F. tularensis неарктического и среднеазиатского подвида синтезируют фермент цитруллинуреидазу, а неарктические и голарктические штаммы - пенициллиназу, которые отсутствуют у клеток других подвидов (Родионова И.В., 1970; Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., 1992). Однако неоднократные попытки выявить прямую коррелятивную связь между наличием этих ферментов и вирулентностью возбудителя успеха не имели.

Перспективным, на наш взгляд, в этом отношении может быть изучение ферментов, играющих ключевую роль в метаболизме и регуляции жизнедеятельности бактериальной клетки. К таким энзимам можно отнести фосфатазы. Так, на модели многих микроорганизмов показана важная роль этой группы ферментов в обмене углеводов, нуклеотвдов и фосфолшшдов (Диксон М., Уэбб Э., 1982). Установлена также значимость фосфатаз в регуляции активности других энзимов микробной клетки, важных для обеспечения механизмов ее саморегуляции (Диксон М., Уэбб Э., 1982; Moran А. et al., 1989). Кроме того, у некоторых патогенных бактерий эта ферментативная система участвует в реализации их вирулентных свойств (Barber M., Kupper S.W.A., 1951; Wolf P.L. et al., 1972;Chhatwal G.S. et al., 1997).

Приступая к настоящему исследованию мы не смогли обнаружить в литературе сведений о наличии и свойствах фосфатаз у различных представителей рода Francisella. Уже в процессе выполнения работы появились данные T.J. Reilly et al. (1996), посвященные характеристике кислой фосфатазы туляремийного мих-

роба. Авторами было убедительно показано, что в отличие от других микроорганизмов, у туляремийного микроба выявляется единственный белок, обладающий фосфатазной активностью. Этот фермент выполняет важную биологическую функцию, заключающуюся в его способности подавлять окислительный взрыв фагоцитов и обеспечивать внутриклеточное выживание бактерий. К сожалению, результаты исследования не дают возможности сделать заключение об общих закономерностях функционирования этой ферментативной системы у возбудителя туляремии. Так, не умаляя достоинств данной работы, необходимо отметить, что она выполнена на весьма ограниченном наборе штаммов - 2 штамма туляремийного микроба и 1 - Б. поушба. При этом в работе отсутствует характеристика использованных авторами штаммов по основным биологическим свойствам, включая их вирулентность и подвидо-вую принадлежность, что, в свою очередь, затрудняет интерпретацию полученных результатов.

В литературе отсутствуют сведения по сравнительному изучению фосфатазной активности у широкого набора штаммов туляремийного микроба, включая культуры разной "подвидовой принадлежности и вирулентности. Кроме того, нет данных о наличии и функционировании этой ферментативной системы у новых представителей рода РгапсюеЦа - И. гкта<1а-Цке и И. рЬШмтга^а. Учитывая дискуссию о правомочности включения последних в род РгапгоеПа, изучение у них новых биохимических признаков позволит расширить знания о биологии и внугриродствсшгых связях у представителей этого рода.

В этой связи актуальность изучения фосфатазной активности у возбудителя туляремии была продиктована как значимостью этого энзима в физиологии бактериальной клепси и его возможным участием в реализации патогенности Р. Шкгепзв, так и пробелами в наших знаниях по этим вопросам.

Вышеперечисленный круг проблем и определил цель настоящего исследования.

Цель исследования.

Характеристика фосфатазной активности у бактерий рода РгапазеИа.

Задачи исследования:

1. Определение оптимальных параметров выявления и сравнительный анализ фосфатазной активности у различных видов франциселл. Изучение особенностей проявления фосфатазной активности у штаммов Р. ЦЛагетюю голарктического подвида.

2. Поиск и изучение белков у бактерий рода ргапс^еЛа, обладающих фосфатазной активностью с помощью изофермент-ного анализа.

3. Изучение возможной роли фосфатазной активности в экспрессии вирулентности туляремийного микроба.

4. Разработка дополнительных новых методов для идентификации Р. Ш1агешю т уйго по выявлению у них фосфатазной активности.

Научная новизна и теоретическая ценность работы. Впервые получены сравнительные данные о фосфатазной активности у различных видов франциселл и определены оптимальные параметры ее выявления. Проведенный с помощью изофер-ментного анализа поиск белков у бактерий рода РгапсиеПа, обладающих способностью гндролизовать фосфорилированные соединения, показал, что все изученные штаммы продуцируют единственную каталически активную кислую фосфатазу с широкой субстратной специфичностью. При наличии общих свойств фермент у разных таксонов отличается по электрофорегической подвижности, чувствительности к детергентам и субстратной специфичности. Установлено, что, неарктические и среднеазиатские штаммы Р. Ш1аге1шз имеют мембрано-связанную и периплазматическую формы фермента. В то же время слабопатогенные штаммы голарктического подвида туляремийного микроба синтезируют только мем-брано-связанный энзим с минимальной ферментативной активностью.

Сравнительный анализ фосфатазной активности у изогенных вирулентных и авирулентных штаммов И. и^агетшв показал, что авнрулентные культуры характеризуются достоверно большей активностью фермента.

Разработаны новые быстрые методы подвидовой дифференциации возбудителя туляремии, основанные на избирательной ин-гибиции фосфатазной активности голарктических штаммов доде-цилсульфатом натрия. Метод4определения подвидовой принадлежности F. tularensis в бактериальных суспензиях защищен авторским свидетельством на изобретение (№ 1655989, БИ № 22, 1991 г.), оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 8 от 27.05.92 г.).

По усовершенствованному быстрому методу внутривидовой дифференциации туляремийного микроба с помощью дисков оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 6 от 16.06.98 г.).

Предложен новый быстрый метод оценки вирулентности туляремийного микроба in vitro, основанный на детекции высвобождающейся фосфатазы при культивировании бактерий разной степени вирулентности в нормальной сыворотке человека. По последнему методу оформлены и утверждены Ученым Советом РПЧИ методические рекомендации (протокол № 6 от 16.07.97 г.).

Разработанные методы могут найти применение при идентификации возбудителя туляремии.

Выявлено, что приобретение бактериями голарктического подвида резистентности к индоксилфосфату - субстрату дня фос-фатаз, сопровождается быстрой потерей вирулентного фенотипа, что может быть использовано экспериментаторами для получения коллекции изогенных авирулентных штаммов туляремийного микроба голарктического подвида.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Все представители рода Francisella синтезируют кислую фос-фатазу с широкой субстратной специфичностью. При наличии общих свойств фермент у разных представителей

рода отличается по электрофоретической подвижности, чувствительности к детергентам и субстратной специфичности.

3L Штаммы голарктического подвида туляремийного микроба продуцируют мембрано-связанную форму фосфатазы с минимальной каталитической активностью, тогда как штаммы двух других подвидов - неарктического и среднеазиатского обладают мембрано-связанной и периплазматической формами фермента.

% Выявлена обратная корреляция между фосфатазной активностью бактерий и их вирулентностью.

fy, Фосфатазная активность является стабильным маркером, удобным для создания методов быстрой дифференциации подвидов туляремийного микроба и оценки его вирулентности in vitro. Апробация работы. 4

Материалы диссертации доложены на научных конференциях РПЧИ и конкурсах молодых ученых РПЧИ; а также представлены на 8 Международном конгрессе по микробиологии (Израиль, 1996) и 2-ой Международной конференции по туляремии (Чехия, 1997). Структура диссертации.

Работа изложена на 103 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения и выводов и списка литературы. Библиография включает 91 источник, в том числе 43 отечественных. Диссертация иллюстрирована 7 рисунками и 18 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы.

В работе использовали 21 вирулентный (сар+) штамм туляре-мийного микроба трех подвидов, а также изогенные авируленгные мутанты, полученные ранее из вирулентных штаммов F.tularensis и обозначенные как капсулодефицитные (cap-) (Павлович Н.В. и др., 1993). Другие представители рода Francisella - F. novicida Utah 112, F. novicida - like D-9876, F. philomiragia F-9693 были любезно предоставлены для исследования зав. лабораторией туляремии НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи д.б.н. И.С. Мещеряковой. 188 природных штаммов получены из музея живых культур РПЧИ, где они хранились в лиофилизированном состоянии. Авирулентные cap- мутанты получены из авторской коллекции д.м.н. Н.В. Павлович.

Бактерии рода Francisella выращивали на плотных питательных средах Т и модифицированном варианте агара LB (Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., 1987; Павлович Н.В., 1993). Кроме того, для поддержания жизнеспособности микробов использовали желточную среду Мак-Коя.

Для качественной оценки фосфатазной активности франци-селл были использованы соответствующие субстраты, дефосфори-лирование которых приводило к образованию цветного продукта реакции. При стандартных экспериментах (если не отмечены другие условия) петлю агаровой культуры или 0,1 мл из взвеси бактерий F.tularensis 5 х 1010 м. кл./мл по стандарту оптической плотности суспендировали в подкисленной дистиллированной воде (рН 6,0), после чего в пробу вносили субстрат - фенолфталсинфосфат (или фенолфталеиндифосфат) до конечной концентрации 1 мг/мл. После инкубации в течение 30-60 минут при 37° С для остановки реакции и обнаружения ее конечного продукта фенолфталеина, который при щелочном рН приобретает малиновое окрашивание,

в пробу добавляли 1 каплю (0,05 мл) 1 н ШОК Учет результатов проводили по наличию («+») или отсутствию («-») малинового окрашивания в исследуемых образцах.

Фосфатазную активность микробов, суспендированных в дистиллированной воде или в 0,5% додецилсульфате натрия (ДСН), оценивали количественным методом, основанным на измерении образовавшегося фенолфталеина после инкубации клеток (5 х 109 м. кл. /мл) с фенолфталеиндифосфатом (1 мг/мл) в течении 1 часа при 37° С. В качестве контроля использовали образец с микробами, убитыми кипячением (15 мин). Продукт реакции выявляли после добавления 0,1 мл 1 н КаОН на фотоэлектрокалориметре «гаБшр КР-77» (Польша) при Х-560 нм. Количество образовавшегося конечного продукта вычисляли по стандартной калибровочной кривой, построенной по фенолфталеину. За условную единицу принимали активность фосфатазы, способной за 1 час при 37° С расщеплять фенолфталеиндифосфат с образованием 10 мкг фенолфталеина.

В зависимости от целей эксперимента фосфатазную активность бактерий оценивали также по количеству отщепившегося в процессе ферментативной реакции фосфата, которое определяли по методу М.Н. Кондрашовой с соавт. (1965). В основу метода положен принцип выявления цветного продукта - фосфомолибдено-вой кислоты, образовавшейся в результате взаимодействия молиб-дата аммония с отщепившимся фосфатом. Количество образовавшегося продукта регистрировали на спектрофотометре Ломо СФ-26 при X - 390 нм. Количество неорганического фосфата вычисляли по стандартной калибровочной кривой, построенной по КН2РО4. О фосфатазной активности франциселл судили по отношению отщепившегося фосфата к внесенному в пробу, который принимали за 100%.

Изоферментный анализ после электрофоретического разделения ферментативно-активных экстрактов, полученных с помощью растирания бактерий с песком или озвучивания, проводили с использованием реакции одновременного азосочетания (Гааль А. и др., 1982). Электрофорез в 1,5 % агарозном геле или в 7,5 % поли-акриламидном геле в трис-глициновом буфере (рН 6,8-7,0) проводили при 10 мА в неденатурирующих условиях (без ДСН). Исследуемые пробы, вносимые в лунки, содержали 25-100 мкг белка/лунку. После 3- кратной отмывки геля в подкисленной воде (рН 5,0) или ацетатном буфере (рН 5,6) его инкубировали при 37° С в растворе субстрата (а-нафтилфосфат, 500 мкт/мл и соль прочного синего Б, 500 мкг/мл). Результаты учитывали по появлению окрашенных полос в зоне локализации фермента.

Для изучения диссеминации и пролиферации авирулентных бактерий в организме хозяина белых мышей заражали внутри-брюшинно или внутривенно 10е mjgi. исследуемого пггамма. Дис-семинацию и пролиферацию cap- клеток оценивали по наличию и количеству выросших из мазков-отпечатков органов животных колоний, а также по длительности высеваемости микробов.

Мутанты F. tularensis, устойчивые к индоксилфосфату, получали методом последовательных пересевов бактерий на питательной среде Т, содержащей возрастающие концентрации субстрата.

Чувствительность бактерий к бактерицидному действию нормальной (неиммунной) сыворотки человека (НЧС) оценивали по росту микробов после их инкубации в сыворотке при 37° С в течение 24 часов, как описано ранее (Павлович Н.В. и др., 1996).

Вирулентность полученных мутантов по сравнению с исходными родительскими штаммами оценивали по значениям DCL.

Наличие у бактерий туляремийного микроба цитруллинуреи-дазной активности изучали по методу, предложенному И.В. Ро-дионовой (1970).

и

Способность бактерий F.tularensis ферментировать глюкозу и мальтозу оценивали на среде Downs согласно рекомендациям Н.Г. Олсуфьева (1975).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как известно, для большинства бактериальных фосфатаз характерна внутриклеточная Локализация фермента. Наши эксперименты показали, что фосфатаза туляремийного микроба по этому признаку не является исключением: нам не удалось зарегистрировать ферментативную активность в бактериальных суспензиях, приготовленных в физиологическом растворе. В то же время при условии частичного лизиса клеток в дистиллированной воде обнаружена способность бактерий в той или иной степени дефосфори-лировать фосфатсодержащие соединения.

Как установлено, активность фермента зависела от вида и подвида возбудителя. Например, если штаммы туляремийного микроба среднеазиатского подвида характеризовались наибольшей фосфатазной активностью (8-34 усл. ед.), то голарктические штаммы либо не проявляли, либо продуцировали наименее активную фосфатазу (0-1,5 усл. ед.). Культуры неарктического подвида возбудителя туляремии и другие представители рода Francisella, имеющие общий ареал циркуляции, обладали средней ферментативной активностью (3-6 усл. ед.). Специально выполненные эксперименты продемонстрировали сопоставимые показатели лизиса бактерий различных штаммов в дистиллированной воде (1 ч). Это свидетельствует в пользу корректности интерпретации полученных данных как истинной фосфатазной активности представителей рода Francisella.

Следующий этап исследования включал изучение ферментативной активности при более полном лизисе микробов с помощью додецилсульфата натрия. Как оказалось, этот методический

прием значительно увеличивал показатели ферментативной активности ДСН - лизатов неарктических и среднеазиатских штаммов Р. йИаге!^, подтверждает внутриклеточную локализацию ферментов. В отличие от этих таксонов, ДСН избирательно ингибировал активность фосфатазы голарктических штаммов туляремийного микроба и других видов франциселл. Интересно отметить, что клетки франциселл были в 100 раз более устойчивы к лизису ДСН по сравнению с туляремийным микробом. Результаты этих опытов продемонстрировали наличие индивидуальных особенностей у фосфатаз разных представителей рода РгагклзеПа.

Учитывая своеобразие ферментативной активности бактерий Р. шкгеп^з голарктического подвида, мы исследовали возможность обнаружения у них фосфатазы с помощью обработки клеток широким спектром детергентов (табл. 1). Как видно из данных таблицы 1, фосфатазная активность штаммов Р. МагегшБ зиЬБр. пеагсйса и тесНаа51аиса четко регистрировалась вне зависимости от исполь-. зованных детергентов. В то' же время ферментативная активность у голарктических культур не выявлялась при лизисе клеток большинством из изученных препаратов. Тем не менее, нам удалось показать наличие функционально активной фосфатазной активности у этих штаммов при воздействии на микробы неионогенных детергентов - твинов 20, 40, 60, 80.

Дальнейшее более детальное изучение продемонстрировало, что обработка клеток твином-80 приводит к проявлению максимальной ферментативной активности у бактерий всех трех подвидов. Для выяснения вопроса о том, с чем связано усиление фосфатазной активности при действии твина на бактериальную клетку были проведены специальные эксперименты по определению ферментативной активности в осажденных центрифугированием клетках и бесклеточных супернатантах после инкубации микробов в различных растворах (табл.2).

Таблица 1

Фосфатазная активность штаыиов Р. Ыагегтз трех подвидов при обработке клеток различными детергентаыи

Детергенты Контроль Фосфатазная активность с ФФФ

Количество исследованных планнов

6 штаннов 5оЬзр.Ьо1аг сйса 4 пгтаиыа зиЬгр. пеагсйса 4 штампа етЛвр. тпе&а-аз1аиса

Ашкжные: додецнлсульфах натрия - - + +

дезокснхолат натрия - - + +

сулъфанап - - + +

Катнонкые:

катан нн АБ - - + +

катапин Б-300 - - + +

полиынкснн Невинные: 1 - +

тритон Х-100 - + +

тайн 20 - + + +

твин 40 - + + +

твнн 60 - + + +

твнн 80 - + + +

спая 20 - - + +

слан 40 - - + +

слан 60 - - + +

Дистишшро-вагаиа вода (контроль) + +

Прннечание: эксперименты проводнлнсь с использованием в качестве субстрата фенолфталеннднфосфата н результаты учитывали по наличию в пробе ярко-налннового окрашивания (+) штн его отсутствию

О-

Таблица 2

Фосфатазная активность францнсепл в клеточной и бес-

Штаммы Исследуемая фракция Фосфатазная активность (усл. ед./5x109 мхл./мл)

условия инкубации

фнзнопо-гичеоснй раствор физиологический рас твор + твнн-80 ацетатный буфер

Р. Ыаг-№15 АЕ -261 сар~ гиЬгр. пеагсИса клешей суперна-тант 22,4 0 27,0 2,2 25,5 18,0

Р. Ыаг- еюк543 сар здЬвр. те&а- аг^а^са клетки су-периа-тант 27 0 28,5 3,0 30,0 16,5

Р. Ыаг- вГШБ 503сар~ БиЬБр. Ьо1агс11са клетки суперна- тант 9,9 0 10,9 0 ,7,5 0

Р. П0"У1-а(к клетки суперна- тант 16,5 0 19,5 0 22,5 1,2 (спецы)

Р. пст-(¿¿а — Шее клепси суперна- тант 22,5 0 25,5 0 ш 0

Р. рЫ1о-пига-деа клетки суперна- тант 25,5 0 27,5 0 24,0 1,2 (следы)

Как оказалось, изученные бактерии принципиально отличаются по способности высвобождать фосфатазу. Так, при суспенди-ровании клеток в физиологическом растворе с 1% твином 80 или ацетатном буфере, только бактерии неарктического и среднеазиатского подвидов характеризуются внеклеточной фосфатазной активностью, регистрируемой в супернатантах. В то же время бактерии туляремийного микроба голарктического подвида и все другие исследуемые франциселлы обладают фосфатазной активностью, прочно связанной с бактериальной клеткой.

Принимая во внимание сопоставимые показатели лизиса бактерий в исследуемых растворах, полученные данные могут быть интерпретированы следующим образом. Штаммы F. tularensis subsp. mediaasiatica и nearctica содержат две формы фосфатазы -мембрано-связанную и периллазматическую. При использовании твина или ацетатного буфера последняя может высвобождаться из клетки, что подтверждается наличием ферментативной активности в супернатантах. В противоположность этому, голарктические культуры F. tularensis и другие виды франциселл (F. novicida, F. novicida - like и F. philomiragia) содержат одну форму фермента -мембрано-связанную, которая прочно связана с бактериальной клеткой. В случае воздействия на клетки твина 80 он, увеличивая проницаемость клеточной стенки бактерий (Пирузян ЛЛ., 1974), способствует как выходу периплазматической формы фермента, так и облегчает доступ субстрата к мембрано-связанной фосфатазе микробов.

Существование у голарктических штаммов одной формы фермента подтверждают и следующие наши наблюдения. Так, при определении ферментативной активности в бактериальных суспензиях только в пробах с голарктическими штаммами в процессе их хранения цветная фракция оседает на дно пробирки вместе с клетками, тогда как надосадочная жидкость остается бесцветной. Подобный феномен, но менее выраженный регистрируется и для

других франциселл, однако их надосадочная жидкость сохраняет слабо розовое окрашивание (при использовании фенолфталеин-фосфата). Суспензии неарктических и среднеазиатских штаммов долго сохраняют равномерную ярко-малиновую окраску в надоса-дочной жидкости. Сохранение у других франциселл слабо розового окрашивания в пробах при максимальной окраске на осевших клетках, а также тот факт, что в супернатантах выявляется очень слабая (следовая) активность, предполагает наличие у них незначительного количества периплазматического фермента при преимущественном содержании мембрано-связанной формы.

В этой связи интересным представляется аспект избирательной инактивации додецилсульфатом натрия только прочно связанных с клепкой фосфатаз.

В частности, при солюбилизации мембран ДСН инактивации подвергается только прочно связанная с клеткой форма фермента (голарктические штаммы и другие франциселлы). Периплазмати-ческая фосфатаза американских и среднеазиатских штаммов сохраняла свою каталитическую активность.

Факт выявления фосфатазной активности у франциселл поставил перед нами вопрос: является ли регистрируемая ферментативная активность бактерий суммарным результатом действия нескольких ферментов клетки или туляремийный микроб продуцирует один энзим, расщепляющий соответствующие субстраты. Для выяснения этого мы провели изоферментный анализ фермента-тивно - активных экстрактов бактерий рода РгапаБеИа. Обнаружено, что у всех исследованных штаммов (кроме голарктического) выявлялось по одной ферментативно - активной зоне с разной электрофоретической подвижностью у разных штаммов. Следует отметить, что при окраске гелей другими субстрата ми - индоксил-фосфатом, фенолфталеиндифосфатом, умбеллиферилфосфатом также регистрировалась только одна ферментативно - активная зона с постоянной локализацией для каждого штамма. Ре-

зультаты этих экспериментов позволяют предположить наличие у возбудителя туляремии и других франциселл одной неспецифической фосфатазы.

Исследование некоторых физико - химических характеристик фосфатаз представителей рода Frencisella позволило выявить ряд общих и отличительных свойств. В частности, все изученные фосфатазы проявляли максимальную активность при pH 6,0 и температуре 42° С. Все ферменты обладали широкой субстратной специфичностью, дефосфорилируя различные фосфатсодержащие соединения. В то же время фосфатазы различных штаммов имели свои предпочтительные субстраты. Наиболее ярко это продемонстрировано на примере фермента из F. philomiragia, для которого преимущественным субстратом служил АТФ. В отличие от фосфатаз ту-ляремийного микроба, ферменты других представителей рода эффективно гидролизовали умбеллиферилфосфат (100-208%) и цАМФ (64-85%). В то же время фосфатазы туляремийного микроба гидролизовали УФФ менее эффективно (не более 80%) и были не способны использовать в1 качестве субстрата цАМФ (F. tularensis subsp. nearctica и mediaasiatica).

Способность исследуемых фосфатаз дефосфорилировать широкий набор соединений, включающий возможные субстраты микроорганизма, позволила нам предположить участие энзимов в реализации патогенных свойств,туляремийного микроба. Сравнительный анализ ферм^гта гивной активности изогенных штаммов туляремийного микроба разной степени вирулентности показал, что все авирулентные варианты F. tularensis обладали достоверно большей фосфатазной активностью по сравнению с вирулентными родительскими штаммами. Статистическая обработка полученных данных по непараметрическому критерию знаков (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962) показала достоверность различий для вероятности 95%.

Тем не менее, наличие у более патогенных американских и среднеазиатских штаммов возбудителя туляремии периплазматиче-ской формы фосфатазы с наибольшей активность, менее прочно по сравнению с ферментом голарктических бактерий связанной с клеткой, может иметь биологический смысл при инфекционном процессе, вызванном штаммами этих подвидов. В пользу этого говорит и то обстоятельство, что другие слабопатогенные представители рода РгапазеНа, имеющие с неарктическими штаммами общий ареал циркуляции, обладают также как слабопатогенные голарктические штаммы туляремийного микроба преимущественно одной формой фермента - мембрано - связанной.

Таким образом, проведенное исследование показало, что имея некоторые общие физико-химические свойства (оптимум 1°, рН, широкая субстратная специфичность), фосфатазы из.различных видов РгапазеНа обладают индивидуальными особенностями, такими как локализация в микробной клетке, субстратный профиль, чувствительность к ДСН и другим детергентам и электрофоретиче-ская подвижность ферментов.

Обобщая полученные результаты мы предложили схему выявленных биологических признаков, отличающихся у разных таксонов (табл. 3).

Эта схема может быть полезна при проведении внутривидовой и внутриродовой дифференциации бактерии рода РгапскеНа.

На основании полученных данных нам удалось разработать новый быстрый метод внутривидовой дифференциации Б. Ш1а-гег^. Принцип метода заключается в избирательной инактивации ДСН фосфатазы только голарктических штаммов. Метод

Таблица 3

Дифференциация представителей рода БгавазеПа по биологическим свойствам

Биологические свойства Представители рола ЕгапазеИа

Е Шагав» Е ШМС1- <!а Е ПОУ1М- <1а-!1ке Е рЫ1опи-гя^а

ЯзЬБр. зеагс-Ьса гиЬгр. теЛа- аяайса гиЬгр. ю1агс- Ьса

Фосфатазная активность: ыембраяо-связанная форма фермента + + + + + +

перинлаэна-тнческая форма фермента + + а

чувствительность фосфа-тазыхДСН + + + +

чувствительность бактерий х лизису 1% твинон 80 * + + +

чувствительность бактерий к лизису 0.5% ДСН ♦♦ + + +

Примечание:чувствительность юлетох х лнзнсу оценивали по отсутствию (+) или наличию (-) роста бактерий (5x109 млел./ ил) после их 1ч инкубации в растворе 1% твина из разведения 10-5.

** - чувствительность клеток * лнэису оценивали по отсутствию (+) или наличию (-) роста Валерий (5x109 илсл./ мл) после их 1ч инкубации в растворе 0,5% ДСН из разведения 101

может быть использован в двух модификациях - по оценке фосфа-тазной активности в бактериальных ДСН - лизатов или с помощью дисков, содержащих соответствующие концентрации субстрата (а-нафтилфосфата с солью прочного синего Б по 30 мкг каждого вещества на диск или 5-бром-4-хлор-3-индоксилфосфат толуидино-вой соли - 75-100 мкг на диск) и детергента (цодецилсульфата натрия - 2000 мкг на диск). Так, диски наложенные на культуры F. tularensis среднеазиатского и американского подвидов в течение 30 мин приобретают темно-фиолетовое окрашивание, тогда как фос-фатазы голарктических штаммов, инактивированные ДСН, не способны дефосфорилировать субстрат и диски остаются бесцветными.

Наши знания о внутриклеточной локализации фосфатазы ту-ляремийного микроба позволяли надеяться на то, что в случае разрушения только авируленгаых бактерий по детекции внеклеточного фермента, можно разработать тест оценки вирулентности F. tularensis in vitro. Для этого мы воспользовались ранее установленным фактом, что именно авирулентные штаммы возбудителя туляремии . высоко чувствительны к комплемент - опосредованной гибели в * нормальной сыворотке человека, тогда как вирулентные бактерии устойчивы к действию НЧС (Павлович Н.В. с соавт., 1996). В результате проведенного исследования нами предложен быстрый метод оценки вирулентности F. tularensis in vitro. Метод основан на том, что при выдерживании бактерий разной степени вирулентности в НЧС (1ч) высвобождение фосфатазы происходит только у авирулентных микробов вследствие внедрения мембрано-атакующего комплекса комплемента в их клеточную стенку. При добавлении в пробы субстрата (фенолфталеиндифосфата до конечной концентрации 1000-1500 мкг/мл) ферментативная реакция происходит только в образцах с авирулентными культурами, что регистрируется по появлению цветного продукта реакции. В случае вирулентных штаммов пробы остаются бесцветными.

Разработанные способы внутривидовой дифференциации возбудителя туляремии и оценки вирулентности F. tularensis in vitro могут быть использованы три идентификации культур возбудите-

ля, а так же в лабораторной практике работы с туляремийным микробом.

Предлагаемые способы защищены авторским свидетельством на изобретение (№1655989, БИ №22, 1991 г.) и оформлены в виде трех методических рекомендаций, утвержденных Ученым Советом РПЧИ.

ВЫВОДЫ

1. Все бактерии рода Francisella - F. tularensis, F. novicida (-like), F. philorairagia синтезируют кислую фосфатазу, которая характеризуется широкой субстратной специфичностью и проявляет максимальную активность в присутствии твинов при рН-6,0 и температуре 42°С.

2. Фосфатазы у различных представителей рода Francisella отличаются по чувствительности к детергентам, предпочтительному гидролизу разных субстратов и электрофоретической подвижности.

3. Штаммы F. tularensis subsp. nearctica и mediaasiatica характеризуются наличием двух форм фермента - мембрано - связанной и периплазматической, что определяет резистентность фермента к додецилсульфату натрия.

4. F. tularensis subsp. holarctica продуцирует одну мембрано -связанную форму фермента, которой присуща высокая чувствительность к инактивации додецилсульфатом натрия. Другие представители рода Francisella имеют также преимущественно мембрано - связанную форму фосфатазы, но в отличие от голарктических штаммов F. tularensis, обладают незначительным количеством периплазматической формы фермента.

5. Установлена обратная корреляция между фосфатазной активностью и вирулентностью возбудителя туляремии.

6. Разработан новый быстрый метод внутривидовой дифференциации F. tularensis, основанный на различной чувствительности фосфатаз бактерий различных подвидов к додецилсульфату натрия.

Разработан новый быстрый метод оценки вирулентности туляремийного микроба in vitro по детекции высвобождающейся из авирулентных бактерий фосфотазы при их инкубации в нормальной сыворотке человека.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Способ дифференциации географических рас F. tular-ensis - А.с. №1655989 (Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Рыж-ко И.В. и др.). - // Бюл. изобретений. -1991. - №22.

2. Получение бескапсульных вариантов Francisella tular-ensis (Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Данилевская Г.И. и др.). - // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1993. - №2. - С.7-10. ; л

3. Способность авирулентных форм Francisella tularensis к ¿щссеминации и пролиферации в организме хозяина (Шшлович Н.В., Сорокин В.М., Тынкевич Н.К.). - //Журн. мЬкробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1996'. - №2. - С.10-13.

4. Сравнительная иммунохимическая и биологическая характеристика капсульного вещества и ЛПС Francisella tular-enlis (Сорокин В.М., Павлович Н.В., Прозорова JI.A.). -

микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1996. - №6. -

СМ-63.

* 5. Обнаружение фосфатазной активности у возбудителя туляремии голарктического подвида (Павлович Н.В.). -//Гомеостаз и инфекционный процесс: Тез. докл. междунар. конф. - Саратов, 1996. - С.285.

6. New fast methods for estimation of virulence of Francisella tularensis in vitro (Pavlovich N.V., Maslova N.N.).

-//Abstr. 8th Int.

Cong, of Bacterid, a. Appl. Microbiol. - Ierusalem, Israel. - 1996. -P. 147.

7. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro (Павлович H.B., Маслова H.H.). - //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1997. - №2. - С. 17-20.