Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Fpancisella

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Оноприенко, Наталья Николаевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ЛИПОПОЛИСАХАРИДЫ

ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ.

1.1. Химическая структура молекулы липополисахарида грамнегативных бактерий.

1.2. Взаимосвязь химической структуры и биологической активности ЛПС грамотрицательных бактерий.

1.2.1. Токсические свойства ЛПС.

1.2.2. Антитоксические и иммуномодулирующие свойства ЛПС

1.2.3. Иммуногенная активность ЛПС.

1.3. Липополисахариды возбудителя туляремии и других представителей рода Francisella.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы.

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы получения препаратов ЛПС и оценки их чистоты

2.4. Методы изучения структуры и углеводного состава препаратов ЛПС.

2.5. Методы исследования антигенных свойств ЛПС.

2.5.1. Серологические реакции.

2.5.2. Иммуноблоттинг препаратов ЛПС.

2.6. Методы исследования биологической активности ЛПС.

2.6.1. Изучение цитотоксических свойств ЛПС.

2.6.2. Оценка токсичности исследуемых штаммов и препаратов ЛПС для белых мышей и белых крыс.

2.6.3. Методы изучения антитоксической активности препаратов ЛПС.

2.6.4. Методы исследования иммуномодулирующих свойств препаратов ЛПС.

2.6.5. Методы изучения иммуногенных свойств препаратов ЛПС

2.7. Методы статистической обработки результатов.

ГЛАВА 3. СТРУКТУРА И АНТИГЕННЫЕ СВОЙСТВА

ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА FRANCISELLA.

3.1. Основная структура ЛПС различных представителей рода Francisella.

3.2. Иммунохимическая структура и антигенная специфичность ЛПС бактерий рода Francisella.

3.3. Углеводный состав ЛПС бактерий рода Francisella.

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ БАКТЕРИЙ РОДА FRANCISELLA.

4.1. Токсичность бактерий рода Francisella и выделенных из них препаратов ЛПС.

4.2. Антитоксические, иммуномодулирующие и иммуногенные свойства ЛПС бактерий рода Francisella.

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА АНТИГЕННЫХ

ДИАГНОСТИКУМОВ НА ОСНОВЕ ЛПС БАКТЕРИЙ РОДА FRANCISELLA И ХАРАКТЕРИСТИКА ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

И СПЕЦИФИЧНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Fpancisella"

Липополисахарид грамнегативных бактерий, являясь полифункциональным комплексом клетки, определяет многие иммунологические и патогенетические особенности течения инфекционного процесса. Широкий спектр биологических эффектов ЛПС объясняет пристальное внимание клиницистов и экспериментаторов к данному макромолекулярному компоненту микробной клетки. В первую очередь, это относится к наиболее патогенным бактериям, вызывающим опасные инфекции человека и, в частности, туляремийному микробу - возбудителю тяжелого токсико-аллергического заболевания.

Интенсивные исследования ЛПС Francisella tularensis, начавшиеся еще в 60-х годах (Knothe Н., Havemeister G., 1960), позволили выяснить существенную роль этой молекулы во взаимоотношениях паразит-хозяин. Как установлено, ЛПС туляремийного микроба является одним из основных факторов его патогенности, а процесс аттенуации бактерий коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Павлович Н.В. с соавт., 1993; Sorokin V.M. et al., 1995). Показана также токсичность бактерий F.tularensis для белых мышей и крыс (Олсуфьев Н.Г., 1975; Анисимов Г.А., Борискин В.А., 1991), которая, предположительно, реализуется при участии эндотоксина (Мещерякова И.С., 1990). Кроме того, S-ЛПС определяет резистентность вирулентных бактерий к бактерицидному действию нормальной (неиммунной) сыворотки млекопитающих, а также обеспечивает их устойчивость к фагоцитозу (Pavlovich N.V., Sorokin V.M., 1995; Sorokin V.M. et al., 1996). Получены убедительные доказательства, что ЛПС возбудителя туляремии является важнейшим иммуногеном бактериальной клетки. В частности, природные штаммы синтезируют S-ЛПС с видоспеци-фическими О-полисахаридными цепями (Хлебников B.C. с соавт., 1991, 1993; Tochtamysheva N.V. et al., 1995), на выявлении антител против эпито-пов которых базируется основной методический подход в диагностике туляремии (Мещерякова И.С., Павлова И.П., 1991; Марков Е.Ю. с соавт., 1991; Grunow R. et al., 2000). Вместе с тем, до настоящего времени остается своеобразной загадкой биологическая инертность очищенных препаратов ЛПС, выделенных даже из вирулентных штаммов возбудителя. Так, обнаружено, что они не вызывают реакцию Шварцмана, не обладают пироген-ностью и токсичностью для лабораторных животных и не способны индуцировать у них специфический иммунитет (Марков Е.Ю., 1991; Knothe Н., Havemeister G., 1960; Maclennan A. et al. 1976; Sandstrom G. et al. 1992; So-rokin V.M. et al., 1995). При этом обращает на себя внимание тот факт, что абсолютное большинство работ, посвященных ЛПС туляремийного микроба, выполнено на препаратах, полученных классической водно-фенольной экстракцией по Вестфалю. Однако, известно, что данный метод является достаточно жестким и может приводить к нарушениям в нативной структуре ЛПС (Okuda S. et al., 1975; Tsang J.C. et al., 1974; Darveau R.P., Hancock R.E., 1983; Марков Е.Ю., 1991). Поэтому представляется перспективным поиск более «щадящих» способов очистки ЛПС с последующим изучением иммунохимических и биологических свойств выделенных препаратов. Принимая во внимание нетоксичность очищенных препаратов ЛПС возбудителя туляремии, определенный интерес представляет также направление, связанное с выявлением таких известных «полезных» свойств ЛПС как иммуномодулирующая и антитоксическая (антагонистическая) активности, описанные для некоторых грамнегативных бактерий (Сибиряк С.В., Алехин

E.К., 1988; Christ W.J. et al., 1995). На момент начала нашего исследования в доступной литературе отсутствовали работы по изучению данных характеристик у ЛПС F.tularensis и других видов франциселл - F.novicida(-like) и

F.philomiragia. В отношении последних нельзя не отметить вообще крайне скудные сведения о структуре и биологических свойствах их ЛПС. Вместе с тем, возможная этиологическая роль этих видов франциселл в различных патологических процессах у человека (пневмонии, хронический лимфогрануломатоз и др.) (Мещерякова И.С. с соавт., 1995) определяет актуальность поиска общедоступных методических подходов к диагностике таких заболеваний, которая на сегодняшний день разработана весьма слабо. Более того, сравнительное исследование химической и антигенной структуры, а также других свойств ЛПС франциселл, может внести свой вклад в уточнение таксономических связей различных представителей рода Francisella.

Таким образом, анализ данных литературы демонстрирует, что, несмотря на интенсивные исследования ЛПС F.tularensis, в настоящее время многие детали патогенетического воздействия ЛПС туляремийного микроба и других франциселл на макроорганизм остаются не достаточно изученными.

Цель исследования;

Сравнительное изучение биологических свойств, иммунохимической структуры и диагностической ценности липополисахаридов бактерий рода Francisella.

Задачи исследования:

1. Получение и очистка препаратов ЛПС из бактерий природных и му-тантных штаммов туляремийного микроба и других видов рода Francisella с помощью разных методов.

2. Сравнительный анализ структуры и иммунохимических характеристик ЛПС природных и ЛПС-дефектных штаммов F. tularensis, а также других франциселл.

3. Сравнительное изучение токсических свойств живых бактерий рода Francisella и выделенных из них препаратов ЛПС для белых мышей и белых крыс.

4. Исследование иммуномодулирующих, антитоксических и иммуно-генных свойств препаратов ЛПС разных представителей рода Francisella.

5. Разработка диагностических препаратов на основе ЛПС для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

Научная новизна и теоретическая ценность работы.

В результате проведенных исследований получены новые данные о структуре и химическом составе ЛПС всех представителей рода Francisella - F. tularensis, F. novicida, F. novicida-like и F. philomiragia. Обнаружено, что все виды франциселл синтезируют S-ЛПС, однако структура ЛПС F.philomiragia имеет характерные особенности, отличающие его от ЛПС других представителей рода. Впервые установлено, что природные вирулентные штаммы возбудителя туляремии одновременно синтезируют 2 формы S-ЛПС, отличающиеся по электрофоретической подвижности и антигенной специфичности. На модели коллекции мутантов с различными дефектами в структуре ЛПС продемонстрирована прямая корреляция между токсичностью туляремийного микроба и хемотипом ЛПС. Выявлено, что очищенные препараты ЛПС всех представителей рода Francisella не токсичны для лабораторных животных, но обладают определенными иммуно-модулирующими и антитоксическиими свойствами. Продемонстрировано, что у большинства таксонов рода Francisella видоспецифические антигенные детерминанты локализованы на О-полисахариде S-ЛПС. Доказано, что очищенные образцы ЛПС перспективны для создания высокоспецифичных диагностических препаратов.

Практическая ценность работы.

На основе препаратов ЛПС, выделенных из бактерий F.tularensis, F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia разработаны антигенные полимерные и эритроцитарные диагностикумы для иммунологической диагностики и внутриродовой дифференциации этих микробов. Ученым Советом Ростовского НИПЧИ утверждены методические рекомендации «По использованию препаратов ЛПС бактерий рода Francisella в качестве сенситинов для антигенных диагностикумов» (протокол № 6 от 29.07.99.) и комплект научной документации: Экспериментально-производственный регламент, Фармакопейная статья предприятия, Временная фармакопейная статья и Инструкция по применению на диагностикум туляремийный антигенный полимерный сухой для выявления противотуляремийных антител и антигенов возбудителя туляремии в серологических реакциях (протокол № 4 от 20.04.2000).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Представители рода Francisella - F. novicida, F. novicida-like, также как и F. tularensis, синтезируют S-ЛПС, на О-полисахариде которого локализованы видоспецифические антигенные детерминанты. Природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно две формы S-ЛПС, характеризующиеся различной электрофоретической подвижностью и антигенной специфичностью.

2. F.philomiragia синтезирует липоолигосахарид, который по своей иммунохимической структуре и биологическим свойствам существенно отличается от ЛПС других видов франциселл, что может свидетельствовать в пользу таксономической обособленности этого микроба.

3. Живые бактерии типичных штаммов F.tularensis и F.novicida обладают выраженной токсичностью для белых крыс и мышей, утрата которой у возбудителя туляремии прямо коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС. В то же время, препараты ЛПС, выделенные из бактерий всех видов рода Francisella, не обладают токсичностью и иммуногенностью для лабораторных животных, но характеризуются определенным уровнем иммуно-модулирующей и антитоксической активности.

4. ЛПС всех франциселл содержат видовые антигенные эпитопы и могут быть использованы в качестве высокоспецифичных антигенных препаратов при разработке антигенных диагностикумов для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на научных конференциях и конкурсах молодых ученых Ростовского НИПЧИ (1997 - 2000), а также были представлены на 8 Международном Конгрессе по микробиологии (Израиль, 1996), II и III международных конференциях по туляремии (Чехия, 1997; Швеция, 2000), на научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний» (Киров, 1998), «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Екатеринбург, 1999).

Структура диссертации

Работа изложена на 141 страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Библиография включает 211 источников, в том числе 50 отечественных. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 10 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Оноприенко, Наталья Николаевна

ВЫВОДЫ

1. Представители рода Francisella - F.novicida, F.novicida-like, также как и F.tularensis, синтезируют S-ЛПС, на О-полисахариде которого локализованы видоспецифические антигенные эпитопы. Впервые установлено, что природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно две формы S-ЛПС, характеризующиеся различной электрофоретической подвижностью и антигенной специфичностью.

2. F.philomiragia синтезирует липоолигосахарид, который по своей иммунохимической структуре и биологическим свойствам существенно отличается от ЛПС других видов франциселл, что подтверждает таксономическую обособленность этого микроба.

3. Живые бактерии типичных штаммов F.tularensis и F.novicida обладают выраженной токсичностью для белых крыс и мышей, утрата которой у возбудителя туляремии прямо коррелирует с нарушениями в структуре ЛПС.

4. Препараты ЛПС, выделенные из бактерий всех видов рода Francisella, не обладают токсичностью и иммуногенностью для лабораторных животных, но характеризуются определенным уровнем иммуномодули-рующей и антитоксической активности.

5. ЛПС всех франциселл содержат видовые антигенные эпитопы и могут быть использованы в качестве высокоспецифичных антигенных препаратов при разработке антигенных диагностикумов для детекции бактерий рода Francisella и видоспецифических антител в иммунных сыворотках.

118

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Важная роль ЛПС грамнегативных бактерий во взаимоотношениях паразит-хозяин делают этот макромолекулярный комплекс микробной клетки интересным объектом для исследования. Многочисленные публикации посвящены и изучению различных аспектов действия ЛПС туляремийного микроба - факультативного внутриклеточного паразита, вызывающего тяжелый инфекционный процесс у человека. Так, в настоящее время считается четко установленной прямая корреляция между структурой ЛПС F.tularensis и его патогенностью и иммуногенностью (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Pavlovich N.V., Sorokin V.M., 1995). В качестве видоспецифиче-ского иммунодоминантного комплекса ЛПС возбудителя туляремии предложен как компонент молекулярной вакцины (Хлебников B.C. с соавт., 1991; Khlebnikov V.S. et al., 1996; Khlebnikov V.S., 2000). Моноклональные антитела против О-полисахарида ЛПС F.tularensis обладают протективными свойствами, предотвращая гибель животных от туляремийной инфекции (Хлебников B.C. с соавт., 1992). Вместе с тем, некоторые аспекты патогенетической роли ЛПС F.tularensis остаются мало понятными. В частности, своеобразной загадкой является «биологическая инертность» очищенных препаратов ЛПС, характеризующихся отсутствием токсической и иммуно-генной активностей (Марков Е.Ю. с соавт., 1991; Sandstrom G. et al., 1992; Sorokin V.M. et al., 1995). При этом на сегодняшний день нет даже рабочей гипотезы, объясняющей столь очевидный парадокс. Нельзя не отметить также крайне скудные сведения об ЛПС других представителей рода Francisella - F.novicida(-like) и F.philomiragia. Последние, как известно, могут вызывать клинически схожие с туляремией заболевания у человека (Hollis D.G. et al., 1989), что диктует необходимость не только в их углубленном изучении, но и в разработке дифференциально-диагностических подходов к их детекции и идентификации. Подобные пробелы в наших знаниях и определили цели и задачи настоящего исследования.

Учитывая тот факт, что биологическая активность ЛПС существенно зависит от метода выделения препарата (Proctor R.A., 1985), а подавляющее большинство известных работ выполнено на препаратах ЛПС F.tularensis, полученных классической водно-фенольной экстракцией по Вестфалю, мы провели сравнительное изучение некоторых параметров препаратов ЛПС, выделенных из типичных вирулентных штаммов возбудителя туляремии с помощью двух методов - стандартной процедуры по О. Westphal, К. Jann (1965) и экстракцией детергентами по методу R'. Darveau, R. Hancock (1983).

Анализ полученных образцов ЛПС в реакции иммунопреципитации и реакции нейтрализации антител показал наличие у них сопоставимой (если не идентичной) антигенной активности.

При исследовании структуры (хемотипа) ЛПС в ПААГ электрофорезе с окраской гелей серебром и иммуноблоттинге установлено, что природные, штаммы туляремийного микроба синтезируют S-тип ЛПС, представленный в виде гетерогенных полос с образованием «лестницы». Вместе с тем, в зависимости от способа выделения использованные методы позволили выявить существенные отличия в структуре и частотном распределении молекул ЛПС. Например, фенольные препараты содержали, преимущественно, высокомолекулярную фракцию длинноцепоченых молекул ЛПС, тогда как детергентные образцы имели дополнительно большое количество короткоцепочечных и R-молекул ЛПС. Более того, если препараты по Вестфалю при электрофоретическом разделении формировали «лестницу» из одинарных полос, то детергентные ЛПС изучаемых штаммов образовывали «лестницу» из двойных «дуплетных» линий. Подобный феномен описан для некоторых ЛПС грамнегативных бактерий и, предположительно, обусловлен модификацией молекул ЛПС в процессе их синтеза (Goldman R.C., Lieve L., 1980; Hitchcock P., Brown Т., 1983; Peterson A.A., McGroarty E.J., 1985). Однако, природа и причины возникновения модифицированных форм ЛПС остаются до настоящего времени не идентифицированными.

Результаты нашего исследования подтверждают опубликованные ранее для других микроорганизмов данные литературы о том, что метод Darveau и Hancock позволяет выделять из бактериальной клетки более широкий спектр молекул, включая короткоцепочечные и R-молекулы, а также модифицированные формы ЛПС (Darveau R., Hancock R., 1983; Maclntyre S. et al., 1986). Это преимущество весьма перспективно при работе с ЛПС-дефектными мутантами и культурами микробов с еще не установленной структурой ЛПС, так как дает возможность проведения корректного сравнительного изучения образцов, изолированных в одинаковых условиях. В противном случае, возникает необходимость использования, по меньшей мере, двух различных способов - по О. Westphal, К. Jann (1965) для S-хемотипа ЛПС и по С. Galanos et al. (1969) - для SR- или R-типов молекул. Поэтому для проведения дальнейшего исследования мы выделили ЛПС из авирулентных капсулодефицитных (cap") мутантов F.tularensis и новых представителей рода Francisella - F.novicida(-like) и F.philomiragia с помощью метода Darveau и Hancock.

- Все полученные образцы характеризовались высокой степенью чистоты и не содержали регистрируемых примесей белка и нуклеиновых кислот, что позволило нам расценивать изучаемые свойства препаратов как свойства, обусловленные именно молекулами ЛПС.

Сравнительный анализ структуры исследуемых ЛПС в ПААГ-электрофорезе с окраской ионами серебра показал, что, как и F.tularensis, другие таксоны рода Francisella синтезируют S-тип ЛПС. В то же время, если ЛПС F.tularensis и F.novicida(-like) формировали лестницу с двойным пиком распределения (формирование высоко- и низкомолекулярных фракций), типичным для S-ЛПС бактерий семейства Enterobacteriaceae, то препарат из F.philomiragia имел значительные отличия. Так, ЛПС этого вида был представлен двумя мажорными фракциями со средней электрофоретической подвижностью, что может свидетельствовать в пользу его липооли-госахаридной природы.

В противоположность тому, что препараты S-ЛПС природных штаммов F.tularensis формировали на электрофореграммах лестницу, все изученные авирулентные капсулодефицитные мутанты туляремийного микроба синтезировали дефектные формы ЛПС, у которых отсутствовала гетерогенность (R-тип ЛПС). Таким образом, варианты бактерий, полученные ранее как капсулодефицитные (Павлович Н.В. с соавт., 1993), являются, по сути, ЛПС-дефектными R-мутантами возбудителя туляремии. При этом их известные биологические свойства (отсутствие патогенности и им-муногенности для чувствительного хозяина) (Павлович Н.В. с соавт., 1993) доказывают прямую корреляцию между структурой ЛПС и патогенностью бактериальной клетки.

Как показано на примере многих (но не всех) грамнегативных бактерий, именно S-хемотип (О-полисахарид) определяет их видо- и группоспе-цифичность (Nghiem Н.О. et al., 1982; Kenne L., Lindberg В., 1983). Данная закономерность справедлива и в отношении возбудителя туляремии, однако, для представителей других видов франциселл подобные сведения отсутствуют. Поэтому, задачей следующего этапа нашего исследования явилось изучение иммунохимической структуры и антигенной специфичности ЛПС бактерий рода Francisella.

Для реализации поставленных целей были получены иммунные сыворотки кроликов против всех видов франциселл. Проведенное сопоставительное изучение антигенного состава микробных клеток, а также выделенных из них препаратов ЛПС и их полисахаридных фракций, продемонстрировало, что антигенные эпитопы, специфичные для видов F.tularensis, F. novicida и F.novicida-like, имеют полисахаридную природу и локализованы на О-цепи ЛПС. Так, в РИП мы наблюдали четкие линии преципитации препаратов полисахаридов ЛПС только с гомологичными иммунными сыворотками. Бактериальные клетки франциселл характеризовались наличием как видоспецифических, так и общих перекрестно-реагирующих антигенов, образующих преципитаты с гетерологичными сыворотками против таксонов рода Francisella. Тот факт, что подобные детерминанты отсутствовали в препаратах ЛПС, может свидетельствовать в пользу их белкового происхождения. Такие белковые антигены у франциселл обнаружены и описаны И.В. Родионовой с соавт. (1991, 1997) и И.С. Мещеряковой с соавт. (1995).

Антигенная композиция F.philomiragia резко отличалась от других видов, так как при наличии выраженных преципитатов с бактериями, у препарата ЛПС и его полисахаридной фракции регистрировалось в РИП лишь слабое взаимодействие с иммунной сывороткой против F.philomiragia. Последнее позволяет предположить, что ЛПС этого микроба в силу обнаруженных нами структурных особенностей (короткие О-цепи) не является иммунодоминантным компонентом клетки. Вместе с тем, с помощью другого метода - РНАт с разработанным на основе ЛПС F.philomiragia экспериментальным антигенным диагностикумом, нам удалось доказать, что ЛПС F.philomiragia содержит видоспецифические антигенные эпитопы, детекция которых может быть использована для диагностики и идентификации этого вида микроорганизмов. В частности, применение разработанного диагностикума позволило выявлять 2,5 - 5x107 м.кл./мл бактерий и 3 - б мкг ЛПС в специфической 3-х компонентной серологической реакции нейтрализации антител.

С целью более детального исследования иммунохимической структуры ЛПС франциселл и их взаимодействия со специфическими антителами мы воспользовались наглядным и чувствительным методом иммуноблот-тинга. Как и в предыдущих экспериментах, результаты иммуноблоттинга подтвердили, что ЛПС является высокоспецифичным антигеном микробной клетки, реагируя только с сыворотками своего вида. В то же время при обработке иммуноблотов кроличьей противотуляремийной сывороткой в препаратах ЛПС F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia проявлялась слабая антиген-активная зона в области липид А + кор, обусловленная, по-видимому, присутствием в коровом олигосахариде родовых перекрестных антигенных детерминант.

В связи с тем, что именно возбудитель туляремии является высоко патогенным представителем рода, более подробно были изучены препараты ЛПС, выделенные из 3-х вирулентных штаммов F.tularensis и их изогенных авирулентных ЛПС-дефектных мутантов. Для этого мы использовали как кроличью поликлональную сыворотку против F.tularensis 15/10, так и ви-доспецифичные моноклональные антитела против О-блока ЛПС F.tularensis 15/10. При изучении характера связывания препаратов ЛПС туляремийного микроба с иммунглобулинами противотуляремийной сыворотки установлено, что все S-ЛПС природных штаммов формируют лестницу из двойных «дуплетных» полос, тогда как картина взаимодействия антител с R-ЛПС зависела от исследуемого штамма. В частности, если у R-ЛПС F.tularensis 543 cap" и 261 cap" иммунологически-активные зоны выявлялись лишь в коровой области, то ЛПС штамма 503 cap" содержал эпитопы, связывающиеся с про-тивотуляремийными антителами с образованием характерной для S-хемотипа лестницы из одинарных линий. Электрофоретическая подвижность полос «одинарной» лестницы ЛПС этого авирулентного мутанта соответствовала нижним полосам дуплетов S-ЛПС родительских вирулентных штаммов.

Применение МКА и набора ЛПС мутантных авирулентных штаммов дало возможность получить прямые доказательства того, что природные штаммы возбудителя туляремии синтезируют одновременно 2 формы S-ЛПС с различной антигенной специфичностью. Так, S-ЛПС типичных штаммов при взаимодействии с МКА формировал одинарную лестницу, соответствующую верхним линиям дуплета на иммуноблотах с поликлональной сывороткой. Нижние полосы дуплетов природного S-ЛПС, как и выявленный у авнрулентного штамма 503 cap" одинарный S-ЛПС, не содержали антигенных эпитопов, связывающих О-видоспецифичные МКА. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что обнаруживаемые «дуплет-ные» линии S-ЛПС вирулентных штаммов туляремийного микроба представляют собой две самостоятельные формы S-ЛПС, отличающиеся по электрофоретической подвижности и О-антигенной специфичности. На модели ЛПС-дефектных штаммов показано, что формирование авирулентного фенотипа коррелирует с нарушениями в синтезе первой формы S-ЛПС, взаимодействующей с видовыми МКА, тогда как вторая форма S-ЛПС у некоторых мутантов может быть сохранена (например, F.tularensis 503 cap"). Биологическая целесообразность синтеза микробной клеткой второй формы S-ЛПС остается на сегодняшний день не совсем понятной, так как изученные авирулентные мутанты с R-хемотипом ЛПС или сохранением второй формы S-ЛПС не отличались друг от друга по своим основным биологическим свойствам, описанным ранее (Павлович Н.В. с соавт., 1993).

Тот факт, что все исследованные нами препараты ЛПС франциселл, включая ЛПС-дефектные формы туляремийного микроба, имеют различия, в первую очередь, по О-полисахаридному компоненту, определил наш интерес к изучению их углеводного состава. Как установлено, все образцы ЛПС природных штаммов франциселл содержали сопоставимые количества нейтральных Сахаров, но значительно отличались по аминосахаридному составу. Наиболее близкими по этому показателю были ЛПС F.tularensis и F.novicida, тогда как ЛПС F.philomiragia содержал в 3 - 4 раза меньше, а F.novicida-like - в.2,5 - 3 раза больше аминогексоз по сравнению с ЛПС возбудителя туляремии. Обнаружено также, что ЛПС родительских вирулентных штаммов F.tularensis имели достоверно более высокие количества аминосахаров, чем R-ЛПС авирулентных мутантов, что согласуется с данными N.V: Tochtamysheva et al. (1995) о наличии в О-блоке ЛПС туляремийного микроба четырех аминосахаридных остатков.

Хроматографический анализ углеводного профиля изучаемых препаратов позволил выявить и качественные отличия в ЛПС различных франциселл. В большей степени это относится к ЛПС F.philomiragia, который содержал необычный доминирующий аминосахар с низкой подвижностью, в то время как углеводный состав препаратов F.tularensis и F.novicida были близкими. Интересно, что ЛПС из бактерий F.novicida-like, которые вместе с F.novicida включены в качестве 4-го подвида в вид F.tularensis, характеризовался наличием двух высокоподвижных углеводов, отсутствующих у других видов. Полученные результаты по изучению структурно-химического строения ЛПС представителей рода Francisella свидетельствуют в пользу того, что наибольшая таксономическая близость свойственна возбудителю туляремии и F.novicida и подтверждают правомочность включения последней в вид F.tularensis. В то же время, значительные отличия, выявленные нами у ЛПС F.philomiragia, поддерживают мнение исследователей, оспаривающих включение этого вида в род Francisella (Мещерякова И.С., 1995). Вопрос о таксономической близости F.novicida и F.novicida-like нуждается в дополнительном изучении.

Сравнение хроматограмм препаратов родительских вирулентных и мутантных авирулентных вариантов F.tularensis продемонстрировало, что S-ЛПС содержит слабоподвижный углевод, отсутствующий в образцах R-ЛПС, который, по-видимому, является одним из составляющих звеньев О-полисахаридной цепи.

Общеизвестно, что структура молекулы определяет ее функциональную активность. В отношении ЛПС важное значение придается наличию в его коровой области кетодезоксиоктоновой кислоты (КДО), которая, как установлено, играет существенную роль в реализации токсичности ЛПС (Mansheim В. et al., 1979; Kasper D. et al., 1979). В то же время, согласно результатам G. Sandstrom (1992), фенольные препараты ЛПС туляремийного микроба содержат в 1000 раз меньше КДО, чем ЛПС E.coli. В представленных данных вызывает недоумение молярное несоответствие, так как в известных по химическому строению ЛПС энтеробактерий обнаружено от двух до трех молекул КДО (Proctor R.A., 1984; Книрель Ю.А., Кочетков

Н.К.).

Проведенное нами количественное и качественное (хроматография) определение КДО в препаратах ЛПС бактерий рода Francisella выявило, что большинство исследуемых образцов содержат КДО, количество которого в 2-3 раза меньше (исключение составил ЛПС F.philomiragia - в 5 раз), чем в контрольных препаратах ЛПС E.coli. Это предполагает, что в состав кора ЛПС франциселл входит, по меньшей мере, одна молекула КДО. Необходимо отметить, что используемый для обнаружения КДО тиобарбитуровый метод позволяет выявлять лишь те формы КДО, которые имеют незамещенные вицинальные группы (Определитель бактерий Берджи, 1997; Lee С.Н., Tsai С.М., 1999). Поэтому, нельзя исключить вероятность того, что ЛПС франциселл, в действительности, содержит большее число молекул КДО, которые не регистрируются общепринятым методом. Подобный феномен описан для ЛПС Bacteroides (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Тот факт, что иммунохимические характеристики полученных-нами методом Darveau и Hancock препаратов ЛПС франциселл отличались от достаточно хорошо изученных фенольных ЛПС F.tularensis, определил целесообразность изучения их биологических свойств.

Как известно, одним из классических свойств ЛПС грамнегативных бактерий является его токсичность для лабораторных животных (Proctor R.A., 1985). Токсический эффект оценивается, обычно, по количеству павших животных в сроки, не превышающие 48 ч (Езепчук Ю.В., 1985; Liide-ritz О. et al., 1981). При этом для туляремийного микроба показано, что наиболее адекватной биологической моделью для изучения именно токсичности микробов служат малочувствительные к туляремийной инфекции белые крысы (Олсуфьев Н.Г., 1975; Мещерякова И.С., 1990). Однако, как продемонстрировали Г.А. Анисимов и В.А. Борискин (1991), для оценки токсичности F.tularensis при определенных условиях могут быть использованы и высокочувствительные белые мыши.

Поэтому, используя два вида животных - белых крыс и белых мышей мы провели сравнительные эксперименты по определению токсичности живых микробов и выделенных из них препаратов ЛПС. Результаты этого изучения четко выявили, что только живые бактерии природных штаммов F.tularensis и F.novicida, синтезирующие полноценный S-ЛПС, способны вызывать гибель крыс и мышей в первые 24 - 48 часов после заражения. При тех же дозах живые культуры туляремийного микроба с дефектными формами ЛПС подобными свойствами не обладали. Очищенные препараты ЛПС, вне зависимости от хемотипа (S- или R-хемотип), характеризовались отсутствием токсичности даже при внутривенном введении в дозе 10 мг/мышь. Более того, специально выполненные эксперименты по оценке токсичности бактериальных суспензий вирулентных штаммов F.tularensis, которые были обеззаражены различными методами (прогревание, формалин, ацетон, пары хлороформа, УФО), также продемонстрировали полную нетоксичность убитых бактерий для белых крыс и мышей. Эти данные позволяют сделать вывод, что, во-первых, именно S-ЛПС вирулентных штаммов участвует (если не определяет) в феномене токсичности туляремийного микроба для макроорганизма, а, во-вторых, для реализации этого свойства ЛПС должен быть представлен только живой бактериальной клеткой.

С целью выяснения вопроса, на каком этапе in vivo происходит «сбой» токсического эффекта ЛПС, мы исследовали воздействие препаратов на макрофаги чувствительного хозяина (мышь), которые представляют собой важнейшую мишень действия эндотоксинов. Как установлено, и S-ЛПС вирулентных штаммов, и R-ЛПС авирулентных вариантов F.tularensis оказывают определенное цитотоксйческое действие на фагоциты животных, причем R-ЛПС обладает более выраженным повреждающим эффектом. В то же время дальнейшего развития эндотоксического шока с летальным исходом при введении животным ЛПС франциселл не происходит. Полученные ,нами результаты, а также известные данные о нетоксичности препаратов ЛПС по Вестфалю (Knothe Н., Havemeister G., 1960; Sorokin V.M. et al., 1995) или по Буавену (Шипицина Г.К., 1955) предполагают, что подобное свойство присуще очищенным препаратам ЛПС F.tularensis вне зависимости от метода их выделения. Более того, как показали наши эксперименты, этот признак (нетоксичность) характерен и для очищенных препаратов всех бактерий рода Francisella, включая необычный по структуре ЛПС F.philomiragia.

Важным аспектом биологического воздействия ЛПС на макроорганизм является его цитокининдуцирующая активность, которая обеспечивает выраженный иммуномодулирующий эффект этой молекулы. Однако подобное «полезное» действие ЛПС для большинства грамотрицательных бактерий нивелируется высокой токсичностью препаратов для макроорганизма. Для преодоления этого предпринимаются попытки получения имму-номодуляторов на основе нетоксичных форм ЛПС, химической детоксика-ции молекулы или синтеза нетоксичных аналогов ЛПС (Proctor R.A. et al., 1989; Takayama К. et al., 1989; Christ WJ. et al., 1995). В отношении ЛПС возбудителя туляремии данная проблема отпадает, так как доказана его нетоксичность даже для высокочуствительных животных. Вместе с тем, на момент начала нашего исследования в литературе отсутствовали сведения об иммуномодулирующей активности ЛПС F.tularensis и других франциселл. Еще одним интересным и полезным последствием взаимодействия нетоксичных молекул ЛПС с организмом хозяина представляются их антитоксические (антагонистические) свойства в отношении токсичных ЛПС. В основе такого действия лежит конкуренция атоксичных молекул за сайты связывания в макроорганизме, вследствие которой последние становятся недоступными (нечувствительными) для токсичных ЛПС. Как и в предыдущем случае, мы не встретили в литературе работ, посвященных изучению антитоксической активности ЛПС бактерий рода Francisella, что определило необходимость исследования данного феномена.

Установлено, что препараты ЛПС франциселл не являются биологически инертными молекулами, так как они обладают определенными имму-номодулирующими и антагонистическими свойствами. При этом интересно, что S-хемотип ЛПС является наиболее эффективным иммуномодулято-ром, тогда как R-ЛПС из мутантных штаммов F.tularensis - анагонистом эндотоксинов. Тот факт, что нам удалось обнаружить у очищенных препаратов ЛПС франциселл подобную биологическую активность предполагает, что они имеют общие с классическими эндотоксинами сайты связывания в макроорганизме (антитоксические свойства) и способны индуцировать ци-токиновый ответ у клеток мишеней (иммуномодулирующие свойства). Это свидетельствует в пользу того, что, по меньшей мере, на первых этапах своего действия in vivo препараты ЛПС бактерий рода Francisella ведут себя как типичные эндотоксины, однако на последующих стадиях для развития токсического эффекта им необходима функциональная поддержка живой микробной клетки. Последнее подтверждается и тем обстоятельством, что убитые бактерии, также как и изолированные препараты ЛПС, не обладают токсичностью для. лабораторных животных.

Наши попытки выявить у очищенных препаратов ЛПС туляремийного микроба обнаруженные у ЛПС других грамотрицательных бактерий антителоиндуцирующую и протективную активности, к сожалению, не увенчались успехом. Так, иммунизация белых мышей и кроликов с использованием различных схем введения препаратов не обеспечивала их защиту при последующем заражении вирулентным штаммом F.tularensis. Кроме того, в сыворотках иммунизированных препаратами ЛПС животных мы регистрировали лишь низкие титры специфических противотуляремийных антител. В противоположность этому, иммунизация лабораторных животных живыми бактериями всех видов франциселл индуцировала в макроорганизме интенсивный антительный ответ с преимущественной направленностью к видоспецифическим антигенным эпитопам ЛПС. Именно этот факт определил целесообразность выявления диагностической ценности полученных нами препаратов ЛПС. Поэтому, были разработаны антигенные диагностические препараты с использованием в качестве сенситинов ЛПС бактерий рода Francisella. Апробация данных диагностикумов показала их высокую чувствительность и специфичность как для детекции видоспецифических иммуноглобулинов (РПГА), так и для обнаружения бактерий и их антигенов (РНАт). При отсутствии на сегодняшний день диагностических препаратов для серологической диагностики инфекций, вызванных F.novicida, F.novicida-like и F.philomiragia, результаты нашего исследования показывают перспективность использования ЛПС этих микробов как высокоспецифичных антигенных препаратов. Предложенный нами антигенный полимерный туляремийный диагностикум успешно прошел комиссионные испытания и имеет учрежденченский уровень внедрения (Ученым Советом Ростовского НИПЧИ утвержден комплект научной документации: Экспериментально-производственный регламент, Фармакопейная статья предприятия, Временная фармакопейная статья и Инструкция по применению на диагностикум туляремийный антигенный полимерный сухой для выявления противотуляремийных антител и антигенов возбудителя туляремии в серологических реакциях).

Таким образом, результаты нашего исследования продемонстрировали, что препараты ЛПС всех представителей рода Francisella характеризуются отсутствием токсичности, но обладают определенными иммуномоду-лирующими и антагонистическими активностями. При этом, на модели живых1 бактериальных клеток установлено, что именно ЛПС франциселл ответственен за такие важнейшие биологические свойства как токсичность и иммуногенность. Даже незначительные нарушения в синтезе ЛПС прямо коррелируют с утратой их токсичности для белых крыс и вирулентности для белых мышей. Более того, гибель микробной клетки с полноценным S-ЛПС (природные штаммы) также приводит к утрате биологической активности этой уникальнои молекулы. В этой связи, перспективным направлением дальнейших исследований является, на наш взгляд, поиск возможных механизмов реализации токсического потенциала ЛПС франциселл in vivo. Нельзя исключить, что, попадая в организм хозяина, только живая клетка способна обеспечить доставку ЛПС к мишеням его максимального токсического действия, либо в макроорганизме происходит модификация молекулы ЛПС в токсическую форму.

•117

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Оноприенко, Наталья Николаевна, Ростов-на-Дону

1. Аверин С.Ф., Хлебников B.C., Головлев И.Р. и др. Выделение протективного антигена из состава внешних мембран возбудителя туляремии и его основные свойства // Генетика и биохимия вирулентности возбудителя ООИ: Тез. докл. - Волгоград, 1992. - С. 68.

2. Анисимов Г.А., Борискин В.А. Изучение токсичности культур Francisella tularensis различных подвидов // Актуал. пробл. проф. туляремии: Тез. докл. Всесоюзн. конф. Симферополь, 1991. - М., 1991. - с. 15 - 16.

3. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях Л.: Медгиз, 1962. - 180 с.

4. Бартенева Н.С. Взаимосвязь химической структуры и биологической активности эндотоксина грам-отрицательных бактерий // Молекулярная и клеточная регуляция инфекционного иммунитета: Сб. науч. тр. -М., 1985.-С. 62-71.

5. Белов Л.Г. Системные функциональные расстройства при эндо-токсикозе // Матер, науч.-практ. конф. посвящ., 100-лет. образов, противо-чум.'службы России. Саратов, 1997а. - т. 1., С. - 183.

6. Белов Л.Г. Токсикология бактериального липополисахарида // Там же, 1997 6.-С.- 184 185.

7. Беспалова И.А., Пустовалов В.Л., Львов В.Л, и др. Получение и некоторые свойства модифицированного производного липополисахарида Yersinia pestis // Биотехнология 1995. - № 9 - 10. - С. 31 - 34.

8. Гааль Э., Медьеши Г, Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. -М.: Мир, 1982. 448 с.

9. Гремякова Т.А., Степаншина В.Н., Степанов А.В. и др. Модуляция иммунобиологических свойств чумных вакцинных препаратов моно-фосфориллипидом А // Биотехнология 1997. -№11-12. - С. 18-31.

10. Гремякова Т.А., Фомченков В.М., Фурсова Н.К., Волковой К.И. Сравнительная характеристика физико-химических свойств липополисахаридов Yersinia pestis и R-мутантов энтеробактерий // Микробиология -1996. Т. 65, №6. - С.763 - 767.

11. Гусева Н.П., Брандзишевский Ю.В., Тараненко Т.М. и др. Про-тективиая активность модифицированных липосомами антигенов чумного микроба // Иммунол. и спец. проф. ООИ: Матер. Росс. науч. конф. Саратов, 1993.-С.144.

12. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. М.: Медицина, 1985. - 240 с.

13. Захарова И .Я., Косенко JI.B. Методы изучения микробных полисахаридов. -Киев: Наукова думка, 1982. 192 с.

14. Маслова Н.Н., Павлович Н.В., Сорокин В.М., Зурабян В.А. Характеристика структуры и антигенной активности липополисахаридов у разных видов Francisella // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. -№3. - С. 26-29.

15. Мещерякова И.С. Антигены туляремийного микроба, их серологическая характеристика и применение в реакции пассивной гемагглюти-нации: Автореф. дис. .канд. биол. наук. -М., 1968. 28 с.

16. Мещерякова И.С. Таксономия, идентификация и иммунологическая диагностика возбудителя туляремии: Автореф. дис. . д-ра биол. наук.-М., 1990.-47 с.

17. Мещерякова И.С., Кормилицына М.И., Родионова И.В., Константинова Н.Д. Характеристика новых видов патогенных микроорганизмов рода Francisella // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1995. -№5.-С. 3-8. '

18. Мещерякова И.С., Павлова И.П. Иммунологическая диагностика туляремии и пути ее совершенствования // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез.докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. -М., 1991. -С. 118- 120.

19. Олсуфьев Н.Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М.: Медицина, 1975. - 200с.

20. Определитель бактерий Берджи. М.: Мир, 1997 - Т. 1. - С. 298-299.

21. Павлович Н.В. Биологические свойства и факторы патогенно-сти Francisella tularensis: Автореф. дис. . д-ра. мед. наук. Саратов, 1993. -37 с.

22. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Прозрачная питательная среда для культивирования Francisella tularensis // Антибиотики и мед. биотехнол. 1987. - Т. 32, №2. - С. 133 - 137.

23. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н. Фосфатазная и пенициллиназ-ная активности как стабильные признаки для дифференциации расовой принадлежности Francisella tularensis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1992. - № 11 - 12. - С. 5 - 7

24. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Шиманкж Н.Я. и др. Характеристика биологических свойств бескапсульных вариантов Francisella tu-larensis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - № 3. - С. 21-27.

25. Павлович Н.В., Мишанькин Б.Н., Данилевская Г.И. и др. Получение бескапсульных вариантов Francisella tularensis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993. - №2. - С. 7 - 11.

26. Приказ № 125 МЗ РФ Об усилении мероприятий по профилактике туляремии. М, 1999. - 64 с.

27. Родионова И.В, Захаренко В.И. Антигенный состав белков наружной мембраны туляремийного микроба // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1990. -№11.- С.16 - 18.

28. Родионова И.В., Захаренко В.И., Мещерякова И.С. Анализ белковых антигенов наружной мембраны клеточных стенок Francisella // Актуальные проблемы профилактики туляремии: Тез.докл. Всесоюз. конф. -Симферополь, 1991. -М., 1991.-С. 159-160.

29. Родионова И.В., Мещерякова И.С., Кормилицына М.И. Сравнительный анализ белковых антигенов Francisella // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1997. - № 3. - С.11 - 15.

30. Семенова И.Б., Акатов А.К. Бактериальные экзотоксины и анатоксины как антигеннеспецифичес'кие иммуномодуляторы // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1991. -№ 12. - С. 69 - 73.

31. Сибиряк С.В., Алехин Е.К. Иммунотропные свойства липопо-лисахаридов грамотрицательных бактерий // Антибиотики и химиотер. -1988. -т.ЗЗ, №11. С. 871 - 877.

32. Сорокин В.М., Прозорова Л.А., Ларионова Л.В. Протективные свойства мембранных белков Francisella tularensis // Тез.докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. -М., 1991. - С. 170.

33. Стукалова Н.В., Карабак В.И., Алексахина Н.Н. и др. Выделение и изучение липополисахарида Klebsiella pneumoniae вакцинного штамма 204 // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1997. - №1. - С. 39 - 42,;

34. Сухарь В.В. Гликолипиды как возможный фактор патогенности и иммуногенности туляремийного микроба // Тез.докл. Всесоюз. конф. -Симферополь, 1991. -М., 1991.-С. 175 176.

35. Сухарь В.В., Васильева Г.И., Киселева А.К. Цитотоксины туляремийного микроба // Бактериальные токсины: Сб. науч. тр. М., 1987. -С.163 - 167.

36. Фрейдлин И.С. Система мононуклеарных фагоцитов М.: Медицина, 1984. - 272 с.

37. Хлебников B.C., Головлев И.Р., Тохтамышева Н.В. и др. Определение антигенной детерминанты превентивных моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1993.: № 1. - С.83 - 88.

38. Хлебников B.C., Ветчинин С.С., Гречко Г.К. и др. Превентивная активность моноклональных антител, специфичных к липополисахариду Francisella tularensis // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1992. -№ 9 - 10. - С. 67-70.

39. Хлебников B.C., Кулевацкий Д.П., Головлев И.Р. и др. Перспективы создания противотуляремийных вакцин нового поколения // Тез.докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. -М., 1991.- С. 188- 189.

40. Хлебников B.C., Тохтамышева Н.В., Кулевацкий Д.П. и др. Свойства основных иммуногенов (ЛПС и белка 17 кД внешней мембраны) Francisella tularensis // Тез.докл. Всесоюз. конф. Симферополь, 1991. - М., 1991.-С. 189- 190.

41. Черепахина И .Я., Козловский В.Н., Ефанова Е.А. и др. Динамика образования антител к вакцинному штамму Francisella tularensis при различных схемах иммунизации // Микробиол. журн. 1990. - Т. 52, №2. - С. 89-93.

42. Шипицина Г.К. Химический состав и биологические свойства антигенного комплекса возбудителя туляремии: Дис. канд. биол. наук. -М., 1955.

43. Яровая Л.М., Алешкин В.А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1991. - № 3. - С. 73 - 78.

44. Ahamed M.N., Mayer H., Biebl H., Weckesser J. Lipopolysaccha-rides with 2,3-diamino-2,3-dideoxyglucose containing lipid A in Rhodopseudo-monas sulfoviridis // FEMS Microbiol. Letters 1982. - Vol. 14. - P. 27 - 30.

45. Ancuta P., Pedron Т., Girard R. et al. Inability of the Francisella tularensis lipopolysaccharide to mimic or to antagonize the induction of cell activa-toin by endotoxins // Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, №6. - P. 2041 - 2046.

46. Apicella M.A., Gagliardi N.C. Antigenic heterogeneity of the non-serogroup antigen structure of Neisseria gonorrhoeae lipopolysaccharides // Infect. Immun. 1979. - Vol. 26, №3. - P. 870 - 874.

47. Bhatnagar N.B., Elkins K.L., Fortier A.H. Heat stress alters the virulence of a rifampin-resistant mutant of Francisella tularensis LVS // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № l.-P. 154- 159.

48. Boivin A., Mesrobeanu J., Mesrobeanu L. Technique pour la preparation des polysaccharides microbiens specifiques // C. R. Soc. Biol. 1933. -Vol. 113, №21.-P. 490-492.

49. Boivin A., Mesrobeanu L. Recherches sur les antigenes somatiques et sur les endotoxines des bacteries. I. Considerations generates et expose des techniques utilisees // Rev. Immunol. 1935. - Vol. 1. - P.553 - 569

50. Bone R.C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modern medicine // Clin. Microbiol. Rev. 1993. - P. 57 - 68.

51. Brade H., Galanos C. Common lipopolysaccharide specificity: new type of antigen residing in the inner core region of S- and R-form lipopolysaccharides from different families of gram-negative bacteria // Infect. Immun. 1983. -Vol. 42, № l.-P. 250-256.

52. Brade H., Galanos C., Rietschel E.Th., Brade L. Common lipopolysaccharide specificity: A new type of antigen in LPS of gram-negative bacteria // Immunobiology. 1983. - Vol. 165, № 3 - 4. - P. 245.

53. Burtseva T.I., Glebco L.J., Ovodov Yu. A method for separate quantitative determination of 2-keto-3-deoxy-octonate and 3,6-dideoxyhexoses in mixture // Anal. Biochem. 1975. - Vol. 64, № 1. - P. 1 - 4.

54. Chen D., Hanna P.J. Bacterial cell wall gives cross-protective immunity against Aeromonas salmonicida in an experimental goldfish model // Abstr. 8th Int. Cong, of Bacteriol. A. Appl. Microbiol. -Ierusalem, Israel. 1996. -P. 4.

55. Christ W.J., Asano O., Robidoux A. et al. E 5531, a pure endotoxin antagonist of high potency // Science 1995. - Vol. 268, №5207. - P. 80 - 83.

56. Cohen J., Exeley A.R., Buurman W. et al. Monoclonal antibody to TNF in severe septic shock // Lancet. 1990. - Vol. 335. - P. 1275 - 1277.

57. Conlan J.W., Krishnan L., Willick G.E. et al. Archaeosomes as self-adjuvanting delivery vehicles for acellular vaccines against intracellular bacteria // Abstr. The 3rd Int. Conf. on Tularemia. Sweden, Umea, 2000. - P. - 48.

58. Cowley S.C., Myltseva S.V., Nano E. Phase variation in Francisella tularensis affecting intracellular growth, lipopolysaccharide antigenicity and nitric oxide production // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 20, № 4. - P. 867 - 874.

59. Cryz S.J., Pitt T.L., Ftirer E., Germanier R. Role of lipopolysaccharide in virulence of Pseudomonas aeruginosa // Infect. Immun. 1984. - Vol. 44, №2.-P. 508- 513

60. Darveau R.P., Hancock R.E.W. Procedure for isolation of bacterial lipopolysaccharides from both smooth and rough Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium strains // J. Bacteriol. 1983. - Vol.155, №2. - P. 831 -838.

61. Davis W.B., Barsoum I.S., Ramwell P.W., Yeager H. Human alveolar macrophages: effects of endotoxin in vitro // Infect. Immun. 1980. - Vol. 30, № 3. - P. 753 -758.

62. Dinarello C.A. Fever 11 Interleukin-1, inflammation and disease / Eds. Bomford R., Henderson B. North-Holland Publishing Co., Amsterdam: Elseyier, 1989.-P. 175-190.

63. Dinarello C.A. Interleukin-1 // Adv. Pharmacol. 1994. - Vol. 25. -P. 21-51.

64. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K. et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28, №3.- P. 350-356.

65. Fagan M.A., Liu Y., Stutz P. et al. Acyclic analogue of lipid A stimulates TNF-a and arachidonate release via a unique LPS-signalling pathway //J.Immunol.- 1994.-Vol. 153.-P. 5230-5238.

66. Fomsgaard A. Antibodies to lipopolysaccharides: some diagnostic and protective aspects // APMIS Suppl. 1990. - Vol. 18. - P. 1 - 38.

67. Fomsgaard A., Freudenberg M., Galanos C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrilamide gels // J. of Clin. Microbiol. 1990,-V. 28, № 12.-P. 2627-2631.

68. Forsman M., Sandstrom G., Jaurin B. Identification of Francisella species and discrimination of type A and type В strains of Francisella tularensis by 16S r RNA analysis // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - Vol. 56. - P. 949 -955.

69. Fournier J. Current pandemic of cholera vaccines // Multiple drug resistance and emerging diseases / Eds. Mahajan R.C., Therwath A. Narosa Publications, Indian National Science Academy, 1999. - P. 23 - 30.

70. Freudenberg M.A., Galanos C. Lipopolysaccharide macrophage interaction: the first step in the development of endotoxin chock // Exp. Cell. Biol. 1989. - Vol. 57, № 2. - C. 95 - 100.

71. Fulop M., Manchee R., Titball R. Role of two outer membrane antigens in the induction of protective immunity against Francisella tularensis strains of different virulence // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 245-247.

72. Galanos C. Physical state and biological activity of lipopolysaccharides. Toxicity and immunogenicity of the lipid A component // Zsch. Immu-nitatsforsch. 1975. - Vol. 149, №2 -4. -P.214 - 229.

73. Galanos C., Lehman V., Luderitz O. et al. Endotoxic properties of chemically synthesized lipid A precursor and synthetic analogues with biosyn-thetic lipid A precursor and free lipid A // Eur. J. Biochem. 1984. - Vol. 140. -P. 221 -227.

74. Galanos C., Luderitz O., Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides // Eur. J. Biochem. 1969. - Vol. 9. - P.245 - 249.

75. Galanos C., Roppel J., Weckesser J. et al. Biological activities of lipopolysaccharides and lipid A from Rhodospirillaceae // Infect. Immun. 1977. -Vol. 16, №2.-P. 407-412.

76. Gallay P., Heumann D., Barras C. et al. Competition between LPS-binding protein and anti-LPS antibody in LPS-induced TNF secretion of human monocytes // Schweiz. Med. Wochenschr. 1992. - Vol. 122, № 18. - P. 40.

77. Gmeiner J. The isolation of two different lipopolysaccharide fractions from various Proteus mirabilis strains // Eur. J. Biochem. 1975. - Vol. 58. -P. 621 -626.

78. Goldman R.C., Leive L. Heterogeneity of antigenic-side-chain length in lipopolysaccharide from Escherichia coli Olll and Salmonella typhi-murium LT2 // Eur. J. Biochem. 1980. - Vol. 107. - P. 145 - 153.

79. Golenbock D.T., Leggett J.E., Rasmussen P. et al. Lipid X protects mice against fatal Escherichia coli infection // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, №4.-P. 779-784.

80. Golenbock D.T., Hampton R.Y., Qureshi N. et al. Lipid A-like molecules that antagonize the effects of endotoxins on human monocytes // J. Biol. Chem. 1991. - Vol. 266. - P. 19490 - 19498.

81. Gupta R.K., Taylor D.N., Bryla D.A. et al. Phase 1 evaluation of Vibrio cholerae 01, serotype Inaba, polysaccharide-cholera toxin conjugates in adult volunteers // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66, № 7. - P. 3095 - 3099.

82. Hartley M.G., Green M., Choules G. et al. Groel as a subunit vaccine candidate for Francisella tularensis infection in mice 11 Abstr. the 3rd Int. Conf. on Tularemia. Sweden, Umea, 2000. - P. 51.

83. Hase S., Rietschel E.Th. Isolation and analysis of the lipid A backbone. Lipid A structure of lipopolysaccharides from various bacterial groups // Eur. Biochem.- 1976.-Vol. 63, №1.-P. 101-107.

84. Henderson B. Therapeutic modulation of cytokines // Ann. Rheum. Dis.- 1995. -VoL 54. -P. 519-523.

85. Henderson В., Poole S. Modulation of cytokine function: therapeutic applications // Adv. Pharmacol. 1994. - Vol. 25. - P. 53 - 115.

86. Henderson В., Poole S., Wilson M. Bacterial modulins: a novel class of virulence factors which cause host'tissue pathology by inducing cytokine synthesis // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60, №2. - P. 316 - 341.

87. Hitchcock P.J., Brown T. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J. Bacterid. 1983. -Vol. 154, № l.-P. 269-277.

88. Hitchcock P.J., Leive L., Makela P.H. et al. Lipopolysaccharide nomenclature-past, present, and future // J. Bacteriol. 1986. - Vol. 166, №3. - P. 699-705.

89. Hoang-Oanh N., Himmelspach K., Mayer H. Immunochemical and structural analysis of the O-polysaccharides of Salmonella zuerich // J. Bacteriol. 1992. - Vol. 174, №6. - P. 1904 - 1910.

90. Hoist O., Borowiak D., Weckesser J., Mayer H. Structural studies on the phosphate-free lipid A of Rhodomicrobium vannielii ATCC 17100 // Eur. J. Biochem. 1983. - Vol. 137. - P. 325 - 332.

91. Hood A.M. Virulence factors of Francisella tularensis // J. Hyg. -1977. Vol. 79, № 1. - P. 47 - 60.

92. Hurlbert R.E., Weckesser J., Mayer H., Fromme I. Isolation and characterization of the lipopolysaccharide of Chromatium vinosum // Eur. J. Biochem. 1976. - Vol. 68.-P. 365 - 371.

93. Inzana T.J. Electrophoretic heterogeneity and interstrain variation of the lipopolysaccharide of Haemophilus influenzae // J. Infect. Dis. 1983. - Vol. 148, №3. - P.492 - 499.

94. Janeway C.A., Travers P. Immunobiology Oxford: Blackwell Scientific Publications Ltd. - 1994.

95. Jansson P.E., Lindberg В., Wollin R. Structural studies on the hex-ose region of the core in lipopolysaccharides from Enterobacteriaceae // Eur. J. Biochem.-1981.-Vol. 115.-P. 571 -577.

96. Jennings H.J., Bhattacharjee A.K., Kenne L. et al. The R-type lipopolysaccharides of Neisseria meningitidis // Can. J. Biochem. 1980. - Vol. 58. -P. 128- 136.

97. Johnson A.R. Improved method of hexosamine determination // Anal. Biochem. 1971. - Vol. 44, №2. - P.628 - 635.

98. Kasper D., Onderdonk A., Polk В., Bartlett J. Surface antigens as virulence factors in infection with Bacteroides fragilis // Rev. Infect. Dis. 1979. -Vol. 1, № 2. - P. 278-288.

99. Kauffmann F. The bacteriology of Enterobacteriaceae. Copenhagen: Munksgaard, 1966. - P. 76 - 80.

100. Kaufmann S.H.E., Inge F\E.A. Cytokines in antibacterial resistance: possible applications for immunomodulation // Lung. 1990. - Vol. 168. - P. 1025- 1032.

101. Kenne L., Lindberg B. Bacterial polysaccharides // The polysac-carides / Ed. Aspinall G.O. New York - London: Academic Press - 1983.

102. Khan S.A., Everest P., Servos S. et al. A lethal role for lipid A in Salmonella infections // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 29, №2. - P. 571-579.

103. Khlebnikov V.S., Golovliov I., Kulevatsky D.P. et al. Outer membranes of lipopolysaccharide-protein complex (LPS-17 kDa protein) as chemical tularemia vaccines // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 227-235.

104. Khlebnikov V.S. Peculiarities of subcellular tularemia vaccine development // Abstr. the 3rd Int. Conf. on Tularemia. Sweden, Umea, 2000. - P. 54.

105. Kim Y.B., Watson D.W. Biologically active endotoxins from Salmonella mutants deficient in O- and R-polysaccharides and heptose // J. Bacte-riol.- 1967.- Vol. 94.-P.1320- 1326.

106. Kitchens R.L., Munford R.S. CD-14-dependent internalization of bacterial lipopolysaccharide (LPS) is strongly influenced by LPS aggregation but not by cellular responses to LPS // J. Immunol. 1998. - Vol. 160, №4. - P. 1920 - 1928.

107. Knirel Y.A., Senchenkova S.N., Jansson P.E., Weintraub A. More on the structure of Vibrio cholerae 022 lipopolysaccharide // Carbohydr Res. -1998. Vol. 310, №1-2. -P. 117-119.

108. Knothe H., Havemeister G. Untersuchungen iiber Antigenpraparate aus Bacterium tularense // Hyg. und Intektionskrankh. 1960. - Vol. 146, № 6. -P. 527-536.

109. Kuzio J., Kropinski A.M. O-antigen conversion in Pseudomonas aeruginosa PAOl by bacteriophage D3 // J. Bacteriol. 1983. - Vol. 155, №1. -P. 203-212.

110. Kumada H., Haishima Y., Umemoto Т., Tanamoto K.I. Structural study on the free lipid A isolated from lipopolysaccharide of Porphyromonas gingival // J. Bacteriol. 1995. - Vol. 177, №8. - P. 2098 - 2106

111. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature 1970. - Vol. 227, №5259. - P. 680 -685.

112. Le Dur A., Chaby R., Szabo L. Isolation of two protein-free and chemically different lipopolysaccharides from Bordetella pertussis phenol-extracted endotoxin // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 143, №1. - P. 78 - 88.

113. Liu P.V., Matsumoto H., Kusama H., Bergan T. Servey of heat-stable, major somatic antigens of Pseudomonas aeruginosa // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. - Vol. 33. - P. 256 - 264.

114. Loppnow H., Libby P., Freudenberg M. et al. Cytokine induction by lipopolysaccaride (LPS) corresponds to lethal toxicity and is inhibited by nontoxic Rhodobacter capsulatus LPS // Infect. Immun. 1990. - Vol. 58, №11. - P. 3743-3750.

115. Loppnow H., Steltler F., Schonbeck U. et al. Endotoxin activates human vascular smooth muscle cells despite lack of expression of CD 14 mRNA or endogenous membrane CD 14 // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, № 3. - P. 1020-1026.

116. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Ferr A.L. et al. Protein mesurment with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265.

117. Luderitz О., Freudenberg M.A., Galanos Ch. et al. Lipopolysaccha-rides of gram-negative bacteria // Current topics in membranes and transport / Eds. Razin S., Rottem S. New York: Academic Press, 1982. - Vol.17. - P. 79 -151.

118. Luderitz O., Galanos C., Lehmann V. et al. Chemical structyre and biological activities of lipid A's from various bacterial families // Naturwissen-schaften. 1978. - Vol. 65. - P. 578 - 585.

119. Luderitz O., Galanos C., Rietschel E.Th. Endotoxins of gram-negative bacteria. -Pharmacol. Ther. 1981. - Vol. 15, №3. -P. 383-402.

120. Luderitz O., Westphal O., Staub A.M., Nikaido H. Isolation and immunological characterization of bacterial lipopolysaccharides // Microbial toxins / Ed. Weinbaum G., Kadis S., Ajl S. J. New York: Academic Press Inc., 1971.-P. 145-233.

121. Macela A., Stulik J., Hernychova L. et al. The immune response against Francisella tularensis live vaccine strain in Lpsn and Lpsd mice // FEMS Immunol, a. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 235 - 238.

122. Maclennan A., Hawkins D., Pearson A.D. Lipopolysaccharides of Francisella tularensis // Proc. soc. microbiol. 1976. - Vol. 3. - P. 181-182.

123. Mansheim В., Onderdonk A., Kasper D. Immunochemical characterization of surface antigens of Bacteroides melaninogenicus // Rev. Infect. Dis. 1979. - Vol. 1, № 2. - P. 263 - 275.

124. Marchal G. Tuberculosis, role of immune response // Abstr. 8th Int. Cong, of Bacteriol. A. Appl. Microbiol. -Ierusalem, Israel. 1996. - P. 10.

125. Moreno E., Pitt M., Jones L. et al. Purification and characterization of smooth and rough lipopolysaccharides from Brucella abortus // J. Bacteriol. -1979.-Vol. 138, №2.-P. 361 -369.

126. Morrison D.C. Bacterial endotoxins and pathogenesis // Rev. Infec. Dis. 1983. - Vol. 5, № 4. - P. 733 - 747.

127. Morrison D.C. Nonspecific interaction of bacterial lipopolysaccharides with membranes and membranes components // Handbook of endotoxin.

128. Vol. 3. / Ed. Berry L. J. Amsterdam: Elsevier, 1985. - P. 22 - 55.11

129. Muhlardt P., Wary V., Lehmann V. A P-nuclear magnetic resonance study of the phosphate group in lipopolysaccharide and lipid A from Salmonella // Eur. J. Biochem. 1977. - Vol. 81. - P. 193 - 203.

130. Munford R.S. Enzymatic deacylation of bacterial lipopolysaccharides by human neutrophils and murine macrophages // Bacteria-Host Cell Interaction / Ed. Liss A.R., Inc., 1988. P. 123 - 140.

131. Munford R.S., Hall C.L., Rick P.D. Size heterogeneity of Salmonella typhimurium lipopolysaccharides in outer membranes and culture supernatant membrane fragments // J. Bacteriol. 1980. - Vol. 144, №2. - P. 630 -640.

132. Munford R.S., Hall C.Li Uptake and deacylation of bacterial lipo-polysaccharides by macrophages from normal and endotoxin-hyporesponsive mice // Infect. Immun. 1985. - Vol. 48, №2. - P. 464 - 473.

133. Munford R.S., Hall C.L. Detoxification of bacterial lipopolysaccharide (endotoxin) by a human neutrophil enzyme // Science 1986. - Vol. 234, № 4773.-P. 203-205.

134. Nghiem H.O., Staub A.M., Galanos C., Liideritz O. Distribution and antigenic properties of the O-determinants of Salmonella zuerich // Eur. J. Biochem. 1982. - Vol. 125. - P. 431 - 436.

135. Niamh K., Cross A.S. Interleukin-6 is a better marker of lethality than tumor necrosis factor in endotoxin treated mice // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 89, № 6. - P. 317 - 322.

136. Palva E.T., Makela P.H. Lipopolysaccharide heterogeneity in Salmonella typhimurium analyzed by sodium dodecyl sulfate/polyacrylamide gel electrophoresis // Eur. J. Biochem. 1980. - Vol. 107. - P. 137 - 143.

137. Pavlovich N.V., Sorokin V.M. Role of Francisella tularensis lipopolysaccharide in the host-parasite interaction // Abstr. 1st Int. Conf. on tularemia. Sweden, Umea, 1995. - P. 13.

138. Peavy D.L., Baugh R.E., Musher D.M. Strain-dependent cytotoxic effects of endotoxin for mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1978. - Vql. 21.-P. 310-319.

139. Peterson A. A., Munford R.S. Dephosphorylation of the lipid A moiety of Escherichia coli lipopolysaccharide by mouse macrophages // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, № 4. - P. 974 - 978.

140. Peterson A.A., McGroarty E.J. High-molecular-weight components in lipopolysaccharides of Salmonella typhimurium, Salmonella minnesota, and Escherichia coli // J. Bacterid. 1985. - Vol. 162, № 2. - P. 738 - 745.

141. Prior J.L., Hitchen P.G., Williamson E.D. et al. Characterization of the lipopolysaccharide of Yersinia pestis // Microbial Pathogenesis 2001. - Vol. 30.-P. 49-57.

142. Proctor R.A. Handbook of endotoxin. Vol. 1. Chemistry of endotoxin / Ed. Rietschel E.Th. Amsterdam: Elsevier, 1984. - 419 p.

143. Proctor R.A. Handbook of endotoxin. Vol. 3. Cellular biology of endotoxin / Ed. Berry L. J. Amsterdam: Elsevier, 1985. - 454 p.

144. Proctor R.A., Will J.A., Burhop K.A., Raetz C.R.H. Protection of mice against lethal endotoxemia by a lipid A precursor // Infect. Immun. 1989. -Vol. 52.-P. 905-907.

145. Radziejewska-Lebrecht J., Feige U., Mayer H., Weckesser J. Structure of the heptose region of lipopolysaccharides from Rhodospirillum tenue // J. Bacteriol. 1981.-Vol. 145, № l.-P. 138- 144.

146. Raetz C.R.H. Biochemistry of endotoxins // Annu. Rev. Biochem. -1990.-Vol. 59.-P.129- 170.

147. Raetz C.R.H. Bacterial endotoxins: extraordinary lipids that activate eucaryotic signal transduction // J. Bacteriol. 1993- Vol. 175, №18. - P. 5745 -5753.

148. Ribi E., Amano К., Cantrell J. et al. Preparation and antitumor activity of nontoxic lipid A // Cancer Immunol. Immunother. 1982. - Vol. 12. - P. 91-96.

149. Rietschel E.Th., Brade H. Bacterial endotoxins // Amer. Scientist. -1984.-Vol. 267.-P. 54-61.

150. Roppel J., Mayer H., Weckesser J. Identification of a 2,3-diamino-2,3-dideoxyhexose in the lipid A component of lipopolysaccharides of Rhodop-seudomonas viridis and Rhodopseudomonas palustris // Carbohydr. Res. 1975. -Vol. 40.-P. 31 -40.

151. Sadlack В., Merz H., Schorle H. et al. Ulcerative colitis-like disease in mice with a disrupted interleukin-2 gene // Cell 1993. - Vol.75. - P. 253 -261.

152. Sandstrom G., Sjostedt A., Johansson T. et al. Immunogenesity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS // FEMS Microbiol. Immunol. 1992. - Vol. 105. - P. 201 - 210.

153. Schneider H., Hale T.L., Zollinger W.D. et al. Heterogeneity of molecular size and antigenic expression within lipopolysaccharides of individualstrains of Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis 11 Infect. Immun. -1984.- Vol. 45.-P.544-549.

154. Shnyra A., Lindberg A.A. Scavenger receptor pathway for lipopolysaccharide binding to kupffer and endothelial liver cells in vitro // Infect. Immun. 1995.-Vol. 63, №3.-P. 865-873.

155. Sorokin V.M., Pavlovich N.V., Prozorova L.A. Biological properties of the capsule substance and lipopolysaccharide of Francisella tularensis // Abstr. 1st Int. Conf. on tularemia. Sweden, Umea, 1995. - P. 11.

156. Sorokin V.M., Pavlovich N.V., Prozorova L.A. Francisella tularensis resistance to bactericidal action of normal human serum // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1996. -Vol. 13.-P. 249-252.

157. Sorokin V.M., Prozorova L.A., Pavlovich N.V. Lipopolysaccharide structure of Francisella tularensis mutant strains // Abstr. the 2nd Int. Conf. on Tularemia. Hradec Kralove, Czech Republic, 1997. - P. 19.

158. Sorokin V.M., Prozorova L.A., Pavlovich N.V. Chemical composition and structure of Francisella tularensis lipopolysaccharide // Abstr. 3rd Int. Conf. on Tularemia. Sweden, Umea, 2000. - P. 34.

159. Staub A.M. Bacterial lipido-proteino-polysaccharides (O-somatic anigens). Extraction with trichloroacetic acid // Methods Carbohydr. Chem. -1965.-Vol. 5.-P. 92-93.

160. Stenmark S., Lindgren H., Sjostedt A. T-cell-dependent and independent host protection to the facultative intracellular bacterium Francisella tu-larerisis // Abstr. the 3rd Int. Conf. оц Tularemia. Sweden, Umea, 2000 a. - P. 66.

161. Strittmatter W., Weckesser J., Salimath P.V., Galanos C. Nontoxic lipopolysaccharide from the Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023 // J. Bacteriol.- 1983.-Vol. 155, №1.-P. 153 158.

162. Takayama K., Qureshi N., Beutler В., Kirkland T.N. Diphosphoryl lipid A from Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023 blocks induction of cachectin in macrophages by lipopolysaccharide // Infect. Immun. 1989. - Vol. 57, №4.-P. 1336- 1338.

163. Tarnvik A. Nature of protective immunity to Francisella tularensis // Rev. Infec. Dis. 1989. - Vol. 11, № 3. p. 440 - 451.

164. Tarnvik A., Ericsson M., Golovliov I. et al. Orchestratoin of the protective immune response to intracellular bacteria: Francisella tularensis as a model organism // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 221 -225.

165. Taylor P.W. Bactericidal and bacteriolytic activity of serum against gram-negative bacteria // Microbiol. Rev. 1983. - Vol. 47, № 1. - P. 46 - 83.

166. Tochtamysheva N.V., Khlebnikov V.S., Vetchinin S.S. Monoclonal antibody analysis of LPS from Francisella tularensis // Abstr. the 2nd Int. Conf. on Tularemia. Hradec Kralove, Czech Republic, 1997. - P. 20 - 21.

167. Tochtamysheva N.V., Khlebnikov V.S., Vinogradov E.V., Knirel Yu.A. Comparative studies of O-antigen chain of LPS of Francisella tularensis virulent and avirulent strains // Abstr. 1st Int. Conf. on tularemia. Sweden, Umea, 1995.-P. 4.

168. Towbin H., Gordon J. Immunoblotting and dot immunobinding -Current status and outlook // J. Immunol. Methods 1984. - Vol. 72. - P. 313 -340.

169. Tsang J.C., Wang C.S., Alaupovic P. Degradative effect of phenol on endotoxin and lipopolysaccharide preparations from Serratia marcescens // J. Bacteriol. 1974. - Vol. 117, №2. - P. 786 - 795.

170. Villeneuve S., Boutonnier A., Mulard L.A., Fournier J. Immunochemical characterization of an Ogava-Inaba common antigenic determinant of Vibrio cholerae 01 // Microbiology. 1999. - Vol. 145, №9. - P. 2477 - 2484.

171. Waag D.M., Sandstrom G., England M.J., Williams J.C. Immunoge-necity of a new lot of Francisella tularensis live vaccine strain in human volon-teers // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 13. - P. 205 - 209.

172. Warren H.S., Danner R.L., Munford R.S. Anti-endotoxin monoclonal antibodies // N. Engl. J. Med. 1992. - Vol. 326. - P. 1153 - 1157.

173. Warren L. Tiobarbituric acid spray reagent for deoxy sugars and sialic acids //Nature. 1960. - Vol. 186, № 47420. - P. 237.

174. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides. Extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods Carbohydr. Chem. 1965. - Vol. 5. - P. 83 - 91.

175. Westphal O., Luderitz O. Chemische Erforschung von Lipopolysaccharide gram-negative Bacterien // En. Anger. Chem. 1954. - Vol. 66. - P. 407 -417.

176. Westphal O., Luderitz O., Bister F. Uber die Extraktion von Bak-terien mit Phenol/Wasser // Z. Naturforsch. Teil B. 1952. - Vol. 7. - p. 148 -155.

177. Westphal O., Westphal U., Sommer T. The history of pyrogen re-serch // Ed. Schiessinger D., Microbiology, American Society for microbiology, Washington, D.C. 1977. - P. 221 - 238.

178. Wright S.D. Multiple receptors for endotoxin // Curr. Opin. Immunol.-1991.-Vol. 3.-P. 83-90.

179. Wright S.D., Ramos R.A., Patel M., Miller D.S. Septin: a factor in plasma that opsonizes lipopolysaccharide-bearing particles for recognition by CD 14 on phagocytes // J. Exp. Med. 1992. - Vol. 176. - P. 719 - 727.

180. Wuorela M., Jalkanen S., Toivanen P., Granfors K. Yersinia lipopolysaccharide is modified by human monocytes // Infect. Immun. 1993. - Vol. 61, № 12.-P. 5261 -5270.

181. Zhang H., Peterson J.W., Niesel D.W., Klimpel G.R. Bacterial lipoprotein and lipopolisaccharide act synergistically to induce lethal shock and proinflammatory cytokine production // J. Immunol. 1997. - Vol. 159. - P. 4868 -4878.