Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Флуоресцентные и кальцийсвязывающив характеристики индс при взаимодействии с протонами и белковыми молекулами

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Флуоресцентные и кальцийсвязывающив характеристики индс при взаимодействии с протонами и белковыми молекулами"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК У К Р А I Н И 1НСТИТУТ Ф1 3 10 Л ОПТ 1М. О. О. БОГОМОЛЬЦЯ

РГ5 ОД

' 2 МАР 1393 удк 577. з

Дячок Олег Михайлович

ФЛУОРЕСЦЕНТНI ТА КАЛЬЦШЗВ'ЯЗУЮЧ! ХАРАКТЕРИСТИКИ 1НДО-1 ПРИ ВЗА6М0Д11 3 ПРОТОНАМИ I БШКОВИМИ МОЛЕКУЛАМИ

03.00.02 — Бюф|'зика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертаци на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТс- 1998

Дисерташею е рукопис

Робота виконана на кафедр'1 бюф'сики КиТвського уншерситету ¡м.Тар; Шевченка

Науковий кершник: доктор бюлопчних наук, професор

Зима Валентин Леонщович КиТвський ужверситет ¡м. Тараса Шевченка

Офщмж опоненти: доктор бюлопчних наук

Костерж Серий Олексжович

1нституг öioxiMii ¡м. О. О. Палладна HAH УкраТни, завщувач вщдшом

кандидат бюлопчних наук Фшенко Анатолш Максимович

1нститут ф13ЮЛОГН,

КиТвський унщерситет ¡м.Тараса Шевченка, старший науковий сгпвробпгник

Провщна орган|'зац)'я:

1нститут молекулярноТ бюлоги та генетики HAH УкраТни, вщдт молекулярноТ бюфдеики, м. КиТв.

Захист дисертаци вщбудеться «24» лютого 1998 р. о 14 год. на засща^

спещалйзованоТ вченоТ ради Д.01.13.01 при 1нститул фЫоло

¡м. О. О. Богомольца HAH УкраТни за адресою: 252024, м. КиТв-: вул. Богомольця-4.

3 дисертац'1ею можна ознайомитись в б1блютец1 1нституту ф1зюло ¡м. О. О. Богомольця HAH УкраТни.

Автореферат розюланий «_» с!чня 1998 р.

Вчений секретар

спецшл/'зованоТ вченоТ ради, Сорокша-Мар'ша З.О.

доктор б'юлопчних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

1они кальцю вдаграють важливу роль в регуляци багатьох форм юЧтинно! активности Роль Са2+, як вторинного посередника, доведена в м'язовому скороченш i звшьненш нейротрансм!тер1в,в забезпеченн1 процесс под!лу wiiniH i регуляци динамки цитоскелета.в екзо- i ендокринжй секрецп горможв, в фоторецепцн, в перетворенн! ¡нформацп, яка поступав в юитину з зовьм i передаеться сигналю вщ плазматичноТ мембрани на pi3Hi внутршнмлинтинж структури (Rasmussen.et al,, 1979; Rasmussen, Barret, 1984; Костюк, 1986; Nickolls, 1986; Ruegg, 1986; Rink, Merrit, 1990). Важливим фактором для Bcix кальщйзалежних реакцм е цитозольна концентращя iOHie кальц1ю [Са2+]|,змЫа якоТ обумовлюе функцюнальну активнють кл|'тин. Тому з'являеться дужв важливе завдання швидкоТ i точно? peecrpauil концентрацп внутр1шньоклггинного калыую.

Використання Са2+-чутливих флуоресцентних зонд1в (фура-2, ¡ндо-1, флуо-3 та ¡ним) позволило здмснити революцмний прорив в методичних можливостях при вим1рюванн1 i «энтролювант [Са2+]| пщ час клггинноТ активносп (Grynkiewicz, et al., 1985; Cobbold, Rink, 1987; Tsien, 1988). Широке використання Са2*-чутли8их флуоресцентних зондщ дозволяв этримувати ¡нформац1Ю про внесок р!зних компоненте збудливих клггин в [Са2+]грегулящю га м модулювання вторинними посередниками i мембранним потенщалом. Флуоресцентен зонд ¡ндо-1 широко використовуеться для визначення концентрацп вшьного кальт'ю Ca2+]j в кл|'тинах,але ктькюн! розрахунки [Са2+]| обмежеж певними ефектами внутршньо-¡тинного середовища, зокрема наявшетю бшкового м1крооточення та змЫою внутршньо-л¡тинного рН для ряду ф'1з'юлопчних npoueciB. Точн1Сть визначення [Са2+]| за допомогою 1вохвильового флуоресцентного параметра Я також в значно! Mipi заложить вщ впливу 1нутр1шньоклггинного середовища на флуоресцентен та кальцмзв'зуючи характеристики чдо-1. Не дивлючись на певн1 yenixn, ще не достатньо з'ясована змЫа спектральних арактеристик ¡ндо-1 i природа зв'язування ¡ндо-1 з юнами кальщю i цитоплазматичними ёлками. 1нтерес викликае ефект закислення середовища на флуоресценцто ¡ндо-1, оскшьки еяи ф|'зюлопчн|" процеси супроводжуються зм1ною рН в wiiTvmi. Розумтня спектрально? рироди Са2+-сигналу, який рееструеться за допомогою Са2+-чутливих ¡ндикатор!в, дозво-ить скласти бтьш ч!тку картину внутршньоклггинно! сигналйацн, зокрема бшьш точно раховувати кшькгсний внесок [Са2+]| в регуляцпо р1зних внуттишньоюнтинних процеав. в'яэрк Роботи з науковими програмами. планами, темами

Роботу виконано в рамках тематики кафедри бюфквики Ки1вського уншерситету 1. Тараса Шевченка: програми фундаментальних дослщжень Mi'h. Осв|'ти УкраГни «Клггинш' молекулярж мехажзми електрогенезу i скорочення м'яз1в» номер держреестраци 26, эегуляцт та механта скорочення гладеньких м'язщ» N 123, а також проекту ДКНТ «Клппнт ехашзми активацп скоротливого апарату гладеньких м'язш» N 5.3/225. Гета лосл!пження

Вивчити флуоресцентм i кальц|'йзв'язуюч1 характеристики ¡ндо-1 в клпгинах, а також ¿¡ну цих характеристик при зз'язуванн! iндо-1 з бшками i протонами. задания дослШження

Для досягнення ujei мети були поставлен! таи завдання: . 1. Сконструювати установку, що дозволяв вим1'рювати спектральн! характеристики та двохвильовий параметр R кальщйчугливих зондщ у клггинах i тканинах.

2. Вивчити вплиа бшкового мкрооточення на флуоресцентж параметри ¡ндо-1 особливосл взаемодм ¡ндо-1 з бшками.

3. Дослщити флуоресцентж характеристики ¡ндо-1 при змМ рН середовища.

4. Дослщити кальцмзв'язуюч! характеристики ¡ндо-1 в умовах, що моделюють цитозоль оточення.

5. Одержати математичж ршняння для обл1ку внеску некапьщевих форм ¡ндо-1 ¡нтегральш спектри флуоресценцп ¡ндо-1 i для юлькюного розрахунку концентра втьного кальцю.

Наукова новизна опержаних результатов

Проведено детальний анал!з флуоресцентних характеристик кальцмчутливого зон ¡ндо-1 в клггинах, в результа-п якого виявлеж, KpiM кальцмвшьноТ (/.) i кальц^зв'язано? (L некальц1ев1 форми ¡ндо-1: протонована (LH) \ бтокзв'язана (LP). Вперше показано, i ¡ндо-1 зв'язуеться з сироватковими альбум|'нами в специфтних центрах завдяки перева но гщрофобним i, частково, електростатичним взаемодям. Взаемодт ¡ндо-1 з бшков!™ молекулами i протонами суттево змЫюе флуоресцентж параметри та кальцмзв'язук характеристики ¡ндо-1.

Вперше отримано математичне ршняння, яке зв'язуе [Са2+], з вим1рюван1 двохвильовим флуоресцентним параметром Я, в якому враховаж три флуоресцентж фор^ ¡ндо-1 ,L,LM i ¿Я, завдяки чому покращуеться кшьюсна ощнка концентрацн вшьного кальц [Са2+]|. Запропоновано новий методичний пдаод для пщрахунку уявноТ константи дисоц1а1 комплексу Са-(ндо-1( який враховуе вплив температури, ¡онно! сили та рН. Практична Шннютъ ооботи полягае в б!льш повному розкритп спектрально? природ кальцювих сигнал'ш, як'| рееструються кальцШчутливими флуоресцентними зондами, i можливост1 використання отриманих математичних р1внянь для розрахунку [Са2+]|.

Результата дисертац|°йноТ робота використовуються при викладанж спецкурсу «Бю4 зичн! методи доспщження. Спектральш методи» в Кшвському ужверситет'| ¡м. Т. Шевченка Особистий внесок злобувача

Автором особиста проведено детальний анашз лггературних джерел, заплановано проведено необхщн) експериментальн! дослщження.проанап'юовано.статистачно оброблее та узагальнено отримаш даж.

Результата дисертац1йно1 робота доповщались на М1жнародному симпоз'|у| «Биологическая подвижность» (Пущно, 1994); 1-ому 3'1зд1 УкраТнського бюф13ичног товариства (КиТв, 1994); XIV-ому 3'i3fli УкраТнського ф(зюлопчного товариства (КиГв, 1994 М1жнароджй конференци «Физика и химия органических люминофоров 95» (Харюв, 1995 XXXIII-ому МЬкнародному KOHrpeci фЫолопчних наук (С. Петербург, 1997); 5-й М!жнародн конференцм «5th International Conference on Methods and Applications of Fluorescenc Spectroscopy» (Берлин, 1997). Пхйп11ШШ1

По матер1алах дисертацм опубликовано 13 po6iT, у тому числ! 7 статей у наукових журналах.

Дисертацю складаеться з вступу,огляду лгтератури.опису матерагнв i метод1В досл^ ження.викладення результатов та ix обговорення, заключения, висновкщ та списку лггератур який мютить 199 найменувань. Робота викладена на 118 сторЫках, ¡люстрована 2 малюнками та мостить 4 таблица

МЕТОДЫ ДОСЛIДЖЕНЬ

Флуоресцентна спектроскопы. Спектри флуоресценци розчикнв ¡ндо-1 i суспеизи ромбоцит!в, завантажених ¡ндо-1, реестру вал и в 1 см кювел на спектрофлуориметр1 СДЛ-2 'ЛОМО", Pocia). Флуоресценци ¡ндо-1 збуджували ¡Це = 350 нм. Флуоресценци ¡ндо-1 еестрували пщ кутом 90° вщносно збуджуючого пучка у спектральному дапазон! вщ 360до ¡50 нм ¡з смугою пропускания 5 нм на монохроматор1 флуоресценци. Флуоресцентне итрування ¡ндо-1 южзованим кальцием проводили як описано в робот! (Grynkiewícz', ét al., 985). Bei виьфювання флуоресцентних параметров ¡ндо-1 проводились при юмнатжй eMnepaiypi.

Спектрофотометр¡я. Спектри поглинання ¡ пропускания реестрували на спектрофотомет-iax СФ-20 ("ЛОМО", Роая) та SPECORD-M40 ("Jena", ФРН).

ЛЫроспектрофлуоресцентна спектроскопия. Нами створена мжроспектрофлуори-ютрична установка, яка дозволяв вимфювати спектри збудження ¡ випромшювання злуоресцентних ¡ндикатор1в фура-2 та ¡ндо-1 у p¡3hhx клеймах i рееструвати кальц!ев1 paH3¡6hth¡ сигнали у м'язових тканинах.

Експеримеитальна установка включав мнсроспектрофлуориметр МФТХ-2М ("ЛОМО", 'оая), тензометричний пристр1й для реестрацм м'язового скорочення, блок спряжения з 1ЕОМ та м1крокомп'ютер.

'ензометричн/ вим!рювання. Вим|'рюваиня механ:чних характеристик м'язових смужок фоводили у камер| (робочий об'ем 350 ± 10 мкл), розмщешй на предметному столику «кроскопу. Конструкц|'я камери дозволяе проводити замму розчижв у процеа проведения ензометричних вим|'рювань. Р|'вень розчинщ в камер! пщтримуеться поступим за 10помогою перистальтичиого насосу. Температура у камер1 вим1рюеться терморезистором, зометрична напруга вим1рюетъся механотроном 6МХ1С.

Урепарування i навантаження флуоресцентним барвинком гладеньком'язових :мужох. В po6oT¡ використовували препарати тонких гладеньком'язових смужок (довжина I + 5 мм, ширина 1 мм i товщина « 200 мкм) ктьцевого шару caecum \ taenia coli cninoí кишки торсько! свинки. Навантаження м'язових смужок флуоресцентним зондом ¡ндо-1/AM (5 мкМ) ¡роводили при 36 °С протягом 1 години в розчит Кребса. Для полегшення розчинення ¡ндо-/АМ, у середовище завантаження заздалепдь добавляли Pluronic F-127 (0.05%). Июля авантаження, м'язов1 смужки трич1 промивали св1жим розчином Кребса, щоб видалити ндо-1, який не зайшов у тканину. М'язов! смужки закр1плювапи в камерк Один юнець м'язовоТ :мужки приеднували до стержню механотрона, а до ¡ншого юнця прифплювапи вантаж для ¡творения вихщного натягу м'язу. Попередньо прокатбрований механотрон вим!рюваз юзвиток ¡зометричноГ сили в ньютонах. Збудження флуоресценци ¡ндо-1 проводилось за ^помогаю ¡нтерференц!йного фшьтру з максимумом пропускания X = 340 нм. ?ИД/лення i навантаження тромбоците ¡ндо-1. Кров (15 мл) в'щбирали з л1ктьовоТ вени до 1ластиковоТ npoöipKH, що мютить 2.5 мл цитратиого антикоагулянту. Вщразу ж П1сля забору :poB¡ (УНД1 кардиологи АМНУ ¡м. Н. Д. Стражеска) еритроцити осаджувапи за допомогою 15 вилинного центрифугувания при 190 g. Збагачену тромбоцитами плазму повторно (ентрифугувапи протягом 10 хв. при 3000 об/хв. Тромбоцита, що ости, ресуспендували в i мл середовища, що мютить (мМ): 150NaCI, 2.7 KCl, 1 CaCI2, 1 MgCI2, 5глюкози, 1.37 NaH2P04, 5 HEPES, pH = 6.55,50 ед/мл гепарину, 0.35% сироваткового альбумЫу бика. Jci операцм проводили у пластиковому посуд. До одержано! суспензн тромбоците додавали -що-1/AM (5 мкМ) та ¡нкубували протягом 1 години. ГПсля цього тромбоцита трнч! вщмивали

за допомогою осадження при 1200 g протягом 10 хвилин i ресуспендували у вищезгадано середовищ1 з pH 7.4 без гепарину. Флуоресценцш 1 мл суспензп тромбоците (7 • 108 KniT на 1 мл) у середовииу ¡нкубацп при вдсутносл гепарину ¡ сироваткового альбумжу при pH, реестрували на спектрофлуориметр'1 СДЛ-2 у 1 см кварцових кюветах. Bei процеду видшення, ¡нкубацм та вим1рювання проводили при юмнатжй температурь Розкпадання складних спектрт флуоресценцИ на складов/. Метод розкладання rpj туеться на положена, що ¡нтенсивнють флуоресценцм (на дажй довжиж xBWii) в ¡нтефально cneKTpi дослщжуваного розчину, який мютать N флуоресцюючих речовин е лМйж комб!нац1ею ¡нтенсивностей флуоресценцм кожноТ речовини (на т)й самм довжиж хвил1). Ma чи характеристична спектри флуоресценци кожноТ речовини, внесок вщповщного компонен визначали як розв'язок системи N ршнянь. Абсолютну помилку розкладу визначали як p¡3> цю м¡ж експериментальним ¡ синтезованим в результа-п розкладу ¡нтегральним спектром. Розчини I реакгиви. В po6oT¡ використовувапи Na ешь ¡ндо-1 та ¡ндо-1/AM, EGTA 91 чистоти, р,р'-диметтглутарову кислоту i дигитожн виробництва "Sigma" (США), сироватк вий альбум1н бика ("Sigma", США та "Fluka Chemical", Швейцарш), сироватковий альбуи людини ("Reanal", Угорщина), трипсин (СПОФА, Чех1я), папаТн та Л130цим ("Реахим", Poci пол1-ишзин M = 50000 + 100000, MES ("Serva", ФРГ), HEPES та глщин ("Fluka Chemie; Швейцар1я), Pluronic F-127 ("BASF", "Molecular Probes", США), стандарта Karibuiesi буфе; ("Molecular Probes", США), EDTA (ХЧ "РеахимТоая).

Люфитоований препарат tíctohíb був люб'язно наданий проф. С. М. Храпуновим (ка генетики Ки1вського ужверситету), а капьмодулн — канд. б юл. н. В. М. Даниловою (1нстит ф1з1ологм КиТвського ужверситету).

При флуоресцентному титруеанж ¡ндо-1 концентрацию ¡ожзованого калы^ю [Ca2 задавали сш'ввщношенням EGTATa Ca2+-EGTA в присутност: 100 мМ KCl в буферах з 10 м глщину (рНЭ.О), 10 мМ HEPES (pH 7.2), 10 мМ MES (pH 6.0), 10 мМ р,Р'-диметшглутароЕ кислоти (pH 5.2). Стандарты кальц1ев1 буфери Í3 значениями Са2+ —16.4 i 221 нМ (в буфе який включав 100 мМ KCl, 10 мМ MOPS, pH 7.2) використовували як контрольж значен ¡ожзованого кальцю.

Для видалення залишюв кальцю сироватков) альбумЫи (САБ, САЛ) д1ап1зували (2 ь 1 мМ альбумжу проти 500 мл деЬжзовано! води) у д|'ал1зних трубках Servapor ("Serv ФРН), розрахованих на д1апазон молекулярних мае 10-15 кДа, протягом 12 годин при 4 ' з трьохразовою замшою розчину. Концентрацю б1пка пюля flian¡3y визначали на СФ-< ("ЛОМО",Роая) за поглинанням на довжиж хвил1 280 нм.

Значения pH розчижв контролювали за допомогою рН-метру (рН-150) з точнгстю ; 0.01 одиниш pH.

Bei розчини готувапи у полтроптеновому посуд! на деюжзоважй бщистильоважй во ¡з питомим внутршжм опором 18 МОм - см. Полшропшеновий посуд попередньо ретелы вщмивали за допомогою детергента, замочували у 10 мМ розчиж EDTA i 10-разо! промивали деюжзованою водою.

Розрахунки концентрац!й ¡ожзованого кальцю проводили на ПЕОМ типу IBM : програмою WinMAXC v.1.70, люб'язно надажй К. Паттоном (Стенфордський ужверситет). L програма дозволяв розраховувати концентрац|'ю вшьного кальцю за заданими загапьниь концентрации Са2+ та EGTA. Розрахунки констант дисощацн (к'^"^ ) комплексу Се ¡ндо-1 та коефщента Хшла (л) проводили на ПЕОМ, за допомогою нелМйного мето; найменших квадрата.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ Флуоресцентш характеристики ¡ндо-1 у гладоньком'язових кл ¡тинах

i тромбоцитах

На першому eTani нами вивчеж Kanbuieei сигнали i флуоресцентж характеристики ¡ндо-в клггинах гладеньких м'яз'т на мкроспектрофлуориметр^ який дозволяе рееструвати не пьки Са2+-сигнал, але й спектри флуоресценцн ¡ндо-1 в кгптинах. На К+-деполяризащ'ю 'О мМ KCl) тонка гладенько-м'язова смужка caecum вщповщала швидким наростанням а2+-сигналу та ¡зометричноТ сили F. Градуальна збШьшення позакл ¡тинного К+ (вщ 30 мМ до 20 мМ) викликало поступове зроствння параметра Я та ¡зометричноТ сили F. Ритм1чж змЫи ергадичисть 25 с) флуоресцентного параметра Я виявились безпосереджм доказом того, що lOHTaHHi скорочення t. coli обумовлеж внутршньоклггинними Са2+-транз1ентами. Амплпуда тивань Са2+-сигналу становила ДЯ»0.1, що вказувало на невелию змЫи вшьного 1тозольного капьцю [Са2+]| навколо базального ршня в t. coli. Подбж спонтанж Са2+-сигнали эеструвались рашше за допомогою фура-2 в тонких смужках ileum морськоГ свинки (Himpes, Dmlyo ,1988). Проведен! досл'щження показали, що м1кроспектрофлуориметрична установка эзволяе з достатньою точнютю рееструвати як значж змЫи концентрацм цитозольного шьцто у вщповщь на К+-деполяризац1Ю, так i невелию змжи навколо базального ршня понтанж Са2+-сигнали в тонких смужках f. coli).

Спектр флуоресценцм ¡ндо-1 (5 мкМ) у гладеньком'язових клгтинах caecum, що эребувають у спокою, характеризуется максимумом флуоресценцм Я*^ = 430 нм (рис. 1 1ектр 1). Сл'щ зазначити, що спектр флуоресценцн ¡ндо-1 у кланах caecum, що перебувають у юкою, повинен був би вщповщати спектру флуоресценцн ¡ндо-1 в розчин!' з низькою жцентрацгею кальцю (базальний рвень кальцию). Фактично, спектр флуоресценцн ¡ндо-1 в tecum, бшьше нагадуе спектр флуоресценцм ¡ндо-1 в екстрацелюлярному розчиж з високою »нцентрацгёю капьцю. Встановлений факт евщчить, що флуоресцентен характеристики ¡ндо-1 шчно змЫюються в цитоплазм! гладеньком'язових митин, i це може ¡стотно впливати на пьюсне визначення концентрацм вшьного капьцю в tcnirnHi.

Ми спостергали 3mihu cneKTpiB флуоресценцн ¡ндо-1 в ¡нших клггинах. Спектри пуоресценцн ¡ндо-1 (5 мкМ) у тромбоцитах людини мають максимум флуоресценцм тах = 450 нм (рис. 1 спектр 2). Схожий спектр флуоресценцм (Ущм = 450 нм) був отриманий в гактних л1мфоцитах (Owen, Shuler, 1989). Зпдно методу ГрЫкевпа та ¡н. (1985) спектр будь-:ого капьцмчутливого ¡ндикатора (¡ндо-1 чи фура-2) можна представити комб1нац1ею cneopis пуоресценцм двох форм ¡ндикатора, — капьщйзв'язано! (Ш) i кальщйвшьноТ (L). Ми отримали iKi контрольж спектри флуоресценцм ¡ндо-1 в кал!бровочних розчинах. Якщо в розчин юситься насичаюча концентрата капьцю (5 мМ), рееструеться спектр флуоресценцн LM-орми (рис. 1 спектр 3). У вщсутносп ¡OHia кальцю у розчиж ([EGTA] = 5 мМ) рееструеться юктр L-форми ¡ндо-1 (рис.1 спектр 4). Таким чином, спектри флуоресценцн ¡ндо-1 в ¡аденьком'язових кланах i в тромбоцитах, як! вщповщають базальним ршням кальцто в цих итинах, значно вдазняються в'|д спектру флуоресценцм L-форми.

Спектральний анажз отриманого спеетру ¡ндо-1 в тромбоцитах проводили методом (мп'ютерного розкладання ¡нтегрального спектру флуоресценцм ¡ндо-1 на дв1 складов!, — тктри Ш- i ¿-форм. Результат розкладу виявився незадовшьним. Значна похибка, що юстергаеться в д'шянц! 450 нм, св'щчить про наявысть додаткового спектра флуоресценцм, рактерного для некальц!евих форм ¡ндо-1 у цитоплазм! кл!тини, який не включений у

350 400 450 s00 550 600 X, HM

Рис. 1. Спектри флуоресценцК: 1 i 2 — м'язово! смужки caecum та суспензм тромбоцитов людини, вдповдно, (клгтони навантажен| 5 мкМ ¡ндо-1); 3 i 4 — 5 мкМ ¡ндо-1 у розчин! з [Са2+] = 5 мМ (Ш-форма) та у BincyixocTi кальцно 3 [EGTA] = 5 мМ (¡.-форма), вщпов'щно. 1ф — ¡нтенсивнють флуоресценцц у вщносних одиницях. = 340 нм; t = 23 °С. Спектри флуоресценцП 1 I 2 пронормовзн! в максимумах.

процедуру розкладання. Haiui дан| доЕ ре узгоджуютъся з даними po6iT Оуен i Шулера (1989) i Оуена та ¡н. (1991 На niflCTaei наших po6iT i даних ¡ншк po6iT Кон'1Ш'| та ¡н. (1988),Хоув-Медсон i Берса (1992), Бейкера та ¡н. (199' висловлено припущення, що ¡ндо-добре зв'язуеться з деякими цитс зольними бшками, змжюючи флуорес центы та кальц1йзв'язуюч1 власти boctl В багатьох експерименте юльюсне визначення концентраи в'тьного кальцию в кштиж [Са2+ оцЫюють за допомогою традицшног двохвильового методу Гр'мкевна та it (1985) без урахування некальцгёви

форм, що ¡стотно спотворюе одержаний результат. Використовуються p't3Hi методич! прийоми одержання кашбрувальних флуоресцентних параметр1в у формула

[Ca2'],. = К'

■ß

(1)

"mux

Найбшьш поширеним е метод пермеаб'млзованих кл'ггин, у якому вим'|рюються внутр'1шньо клггинно флуоресцентн! параметри Rmin, Rmax та Р або внутр|'шньоклггинш контроль^ спектр, LM- та /.-форм флуоресцентного ¡ндикатора. Константа дисоцвцм К^"1"^' визначаеться експериментах in vitro. Ми використовували цей метод для оцжки базального ршня вшьноп кальцга у тромбоцитах. Максимальне значения двохвильового параметра Rmax - 2.3: отримали при обробц! тромбоците, навантажених ¡ндо-1, диптонжом (50 мкМ) у розчин!, яки! м1стить 5 мМ [Са2+]. Вщразу ж пк:ля визначення Rmax розчин замшювався на Са2+-в1льнш розчин, який м1стить 5 мМ EGTA, що дозволило визначити Ят(л = 0.93. В цих дослщах 6yi знайдений параметр р = 1.8. Базальний ршень капьц|'ю в ¡нтактних тромбоцита: характеризуеться параметром Я =/4/0/7435 = 1.17. Bci значення флуоресцентних параметра були отримаж теля вщн!мання аутофлуоресценцм тромбоципв, яку визначапи при додаванн [Мп2+] = 2 мМ. Константа дисоцгацн приймалася = 230 нМ (Haugland, 1996)

Поставивши Ц! значення у формулу (1), ми отримали концентрац1Ю вшьного кальцю ( тромбоцитах [Ca2+]j = 80 нМ. За ¡ншими визначеннями у тромбоцитах значення [Са2+] Bapirae вщ 120-130 нМ (визначено за допомогою квЫ2) до 2000-4000 нМ (визначено зг допомогою екворину) (Орлов, Лабас, 1989). Отримане нами, без урахування некальцюви) форм ¡ндо-1, значення [Ca2+]i, можливо, е заниженим. Анал!з даних лггератури св'щчить прс значн! HeTO4HOCTi у визначенн! та великий розб!г значень концентрац1й ршня базальногс кальцто в р!зних кл¡тинах, коли оцшки [Са2+]; проводяться некоректно.

Для анал!зу внутршньоклггинно? флуоресценцм ¡ндо-1 необхщно провести детальн модельж дослщження флуоресценцм ¡ндо-1 при зв'язуванж з бтками та при змМ ph розчина. Знаючи точж спектри р|'зних внутр1шньокл!тинних форм ¡ндо-1, можна провести комплексний анал!з с клади их флуоресцентних спектрш ¡ндо-1 в к/птинах.

о

А

Б

200000

|ф

о

о

350 400 450 500 550 600 Л., нм

390 400 450 500 550 600

5ис. 2. Комп'ютерне розкладання ¡ктегральних спе>ггр|в 1ндо-1 (5 мкМ) в розчинах А — з рН 10.00(1), рН 7.00 2),рН6.53 (3) га Б — рН 6.2 (1) I рН 5.68 (2) на спектри ¿-форми (1а, 2а,За), Ш1-форми (1Ь,2Ь,ЗЬ) та Ш2-}>орми (1о,2с,Зс). = 350 нм; температура 20 °С. 1ф — ¡нтенсивтсть флуоресценцп у вщносних одиницях.

Зплив рН середовища на флуоресценцйо ¡ндо-1. Вщомо, що багато ф|'зюлопчних троцес1в супроводжуються змЫами рН юитини. Тому гидвищений ¡нтерес викликае цослщження ефекпв змми рН середовища на флуоресцентш параметри кальц^чутливих ндикатор1в.

Ми вивчили вплив зм]'ни рН середовища на флуоресценцию ¡ндо-1. В безкапьцювому эозчиы (2 мМ ЕвТА) при змМ рН вщ 10.0 до 8.0 рееструеться депротонована кальшйвшьна I-форма (АТпах=477 нм) ¡ндо-1, спектр флуоресценцп якоТ представлений на рис. 2 А (спектр 1). Зниження рН<8.0 приводить до змщення максимума спектра флуоресценцп ¡ндо-1 в сороткохвильову д'тянку по вщношенню до спектру ¡ндо-1 при рН 10.0. Для розчинщ з рН 7.0 га рН 6.53 максимуми спектрщ флуоресценцп ¡ндо-1 становили 469 нм I 460 нм, вщповщно рис. 2 А, спектри 2 I 3). Значш змЫи в спектр! флуоресценцп ¡ндо-1 спостер!гались при закисленн1 середовища до рН 5.5. Як видно з рис. 2 Б, в безкальщевому розчиж з рН 5.68 спектр флуоресценцп ¡ндо-1 сильно змщений (Я^ах = 420 нм) та уширений за рахунок значного зростання короткохвильового краю спектру. Змии ¡нтегрального спектру })луоресценцн ¡ндо-1 при закислеж розчину в1д рН 8.0 до рН 5.2 пояснювалось (Вапсе1, е1 а1.,1992) перерозподшом спектрщ флуоресценцп двох форм ¡ндо-1 — капьцмвшьно! /.-форми Лпах = 485 нм) та протонованоТ Ш-форми (Хщах = 455 нм), р1вновага яких характеризуеться :Ка = 6.18. Однак, встановлений нами характер змЫи спектра флуоресценцп ¡ндо-1 при )Н<8.0 вщр!зняеться вщ даних, приведених в робот! (Вапсе1, е1 а1.,1992). Це наводить на 1умку, що ¡нтегральний спектр флуоресценцп компонуеться б'тьш складно з ¡ндивщуапьних форм ¡ндо-1. Проведений комп'ютерний розклад ¡нтегральних спектрщ флуоресценцп ¡ндо-1 в эозчинах з рН<7.5 дозволив видшити спектри флуоресценцп шдивщуальних форм ¡ндо-1: I-}>орми (Хгпах = 477 нм), частково-протоновано! Ш/-форми = 446 нм) \ протоновано! Ш2-)>орми (Хтзх = 412 нм) (рис. 2 А ! Б). Ц1 три форми даютъ р1зний вщсотковий внесок (по флуоресценцп) в ¡нтегральний спектр флуоресценцп ¡ндо-1 при ргёних рН.

В безкальщевому розчит (2 мМ ЕвТА) двохвильовий параметр Я, що позначений у (эормул! (1) як Ят;п, при змМ рН вщ рН 10.0 до рН 8.0 залишаеться поспйним I доршнюе "т/п= 0.1. При зниженн1 рН<8.0 Ят1п швидко зростае ! при рН5.54 набувае значения 1.77

Вплив фактор!в середовища \ бокового мшрооточення на флуоресцентн! параметри ¡ндо-1

(рис.3, крива 1). Ми поршняли тенденци

змши параметра Ягап, отриманого

¡нтегральних спектрш ¡ндо-1, з тенденц1е(

змши параметра Рн — /412А146, яки

характеризуе сп'1вв!дношення Ш2-форми т

Ш1-форми ¡ндо-1. При зниженж рН в(

рН 8.0 до рН 7.0 параметр Рн змЫюетьс

незначно, тому що вщсотковий вклад Ш£

форми ще невеликий, I в цих межах р1

незначно пщвищуеться йт,п. Подальш

закислення розчину (рН<7.0) приводить д

ргёкого зростання параметра Рн внаслщо

переважного Зростання Ш2-форми ¡ндо-1.:

цим добре корелюе значне пдвищення Ят„

Тому використання Ят/Л з ¡нтегральноп

^ спектра ¡ндо-1 в розчинах з рН<8.0, коли Н!

Рис.3. Залежшсть двохвильового флуоресцентного н н г '

параметра Я (1,2) I параметра Рн (спювщношення Ш2- береться до уваги вщсотковий внесок Ш2-

ДО ШГ-форми) (3) ¡НДО-1 (5 МКМ) ВД рн розчину. 1 I шГ-форм, приводить до значних похибо

3 — у вйсугност) [Са2+1 (2мМ ЕйТА); 2 — концентрация . г„

[Саг+] = 2 мМ. хзб= 350 нм; температура20 -С. ПРИ визначенш [Са2+], за формулою (1).

Вплив полярност! середовища / б'ткового м'исрооточення на флуоресиенти параметры ¡ндо-1. Спроба розкласти спектр флуоресценци ¡ндо-1 в тромбоцитах використовуючи тшьки спектри флуоресценци I- \ Ш-форм, була невдапою, тому що з; доломогою цих двох спектров неможливо зробити задовшьне наближення до експеримен тального спектру, в д1пянц1 440-450 нм спостер|гапась значна середньозважена похибка Максимум спектра флуоресценци ¡ндо-1 в клггиж змщений в б1пьш короткохвильову дтяню. спектру по вщношенню до спектру флуоресценци ¡ндо-1 в безбшкових розчинах при найт ральних рН. У стан! спокою штини характеризуються низькими концентрации юнш кальцк (базальний р1вень [Саг+],),тому слщ було чекати, що спектри флуоресценци ¡ндо-1 в гпадень-ком'язових кл¡тинах \ тромбоцитах будутъ под!бними до спектру флуоресценци /.-форми ¡ндо-1. Виявилось, що вони значно змщеж в короткохвильову дшянку спектра з Ятах = 440450 нм. Висловлено припущення, що таю спектрально змми ¡ндо-1 в кл1ТИН1 зумовлен взаемодею ¡ндо-1 з деякими б ¡яками цитоплазми.

У розчиж сироваткового альбумЫу бика (САБ) та сироваткового апьбумшу людини (САЛ) 40 мкМ максимум спектру флуоресценци ¡ндо-1 у вщсутност южв Са2+ зм:щуеться в короткохвильову дшянку з максимумом =440 нм-450 нм, вщповщно, що свщчить про утворення комплексу сироватковий альбум|'н-1ндо-1 (¿Р-форма) (рис. 4, спектр 3). Ця розбскнють максимум'« спектр!в флуоресценци, можливо, пов'язана з деякою вщмЫн'ютю мкрооточення ¡ндо-1 в центрах зв'язування. При внесенж в цей розчин 2 мМ Са2+ спектр флуоресценци ще бшьше змщуеться в короткохвильову дшянку з Хтах=412нм (рис.4, спектр 4). У розчиж з 8 М сечовини, у якому руйнуеться компактна структура б'шку, спектр флуоресценци ¡ндо-1 наближався до спектру флуоресценци ¡ндо-1 без САБ (рис. 4, спектр 5). Максимум спектра флуоресценци ¡ндо-1 також був змщений до Хтах = 454 нм у розчиж пстонщ 50 мкМ при низьюй ¡онн!й сил! ц = 0.004 М. При пщвищенж юнно! сили до ц = 0.5 М спектр флуоресценци зм!щуеться в довгохвильову дшянку Хщах = 463 нм \ наближаеться до спектру ¿-форми ¡ндо-1.

В розчинах таких бшюв, як капьмодулЫ, зоцим, трипсин, папаТн ми не спостер1гали viih флуоресцентних параметр1в ¡ндо-1, то зщчить про вщсутн1сть зв'язування ждо-1 ими бтками.

Анагнз отриманих результатов свщчить ро те, що ¡ндо-1 зв'язуеться з бтками за ахунок пдрофобних взаемод|'й цикшчних еполярних структур зонду та зарядових заемод(й чотирьох карбоксильних труп ¡ндо-1 позитивно зарядженими л^зиновими та рп'нжовими ам|'нокислотними залишками ¡люв. Можливо, певний вплив на зв'язування iae карбоксильна трупа на ароматичному ¡льц! ¡ндо-1. У випадку зв'язування ¡ндо-1 стонами, основними е зарядов! взаемоди,

ому що при низьюй ЮНН1Й сил1 ц = 0.004 М Рис- 4- Спектри флуоресценцп ¡ндо-1 (5 мкМ):

1 — кальц|'йвшьноГ i-форми; 2 — капьцшзв'язаноГ щсутне екранування позитивно заряджених ш-форми; з-комплексу сироватковий альбумы ¡зинових та арпжнових амшокислотних бика, САБ-1ндо-1 (i.p-форма) у вщсутносп ¡онш

алишюв, локал!зованих переважно на N-KiHui кальц'ю; "-комплексу САБНндо-1 в присутност!

¡OHia калыую; 5 — САБНндо-1 при вщсутност1 ¡онга голекули пстона. Для гако! зв'язаноТ форми кальцю в присутност! 8 М сечовини.

що-1 (нами позначеноГ як Ц^-форма) характерний власний спектр флуоресценцй з

max = 454 нм. Для nepeeipKH цього припущення нами вим|'ряж спектри флуоресценцп ¡ндо-1 у

озчиж' П0Л|'-1"Л13ИНУ (0.01%). Спостер|'гапось невелике зм|'щення спектру флуоресценцй ¡ндо-

в короткохвильову дшянку (Х^ах = 473 нм) при зв'язуванж на полК-л1зиж. Нами показано,

»о при 3MiHi ¡OHHOi сили вщ ц = 0.004 М до ц = 0.5 М спостертаються neBHi змши спектра

»луоресценци ¡ндо-1, яю свщчать про екранування зарядових взаемодм, характерних для

Р^-форми. Однак бшыиа частина ¡ндо-1 зв'язуеться на пдрофобних центрах бшкових

олекул сироваткових альбумМв, про що свщчать xapaicrepHi спектри флуоресценцп LP-

юрми з Яшм = 440-450 нм.

Проведет модельж дослщження пщтверджують наше припущення про те, що поляр-¡сть середовища впливае на флуоресцентж параметри i що спектр LP-форми ¡ндо-1 пере-ажно визначаеться пдрофобною природою центра зв'язування. Спектри флуоресценцй що-1 5 мкМ в диоксаж (дюлектрична стала е = 2.2) у вщсутносл iOHia Са2+ значно змщеж короткохвильову дтянку з Ящах = 443 нм. Цей спектр дуже подгний до спектру ¡ндо-1 при в'язуванж з САБ. Зв'язування гожв Са2+ ¡ндо-1 в диоксаж приводить до значного щвищення квантового виходу флуоресценцй i додаткового змадення спектру до пах = 438 НМ.

Таким чином, на флуоресцентна спектральж параметри ¡ндо-1, а, отже, i на кшыа'сне изначення [Са2+]| впливае внутршньоклггинне середовище, особливо цитоплазматичн! ¡лки. Встановлено, що максимум спектру флуоресценцй ¡ндо-1 в к^тинах змщений в синю ¡лянку спектру у портнянж 3i спектром флуоресценцй ¡ндо-1 у безбткових розчинах при ейтрапьних рН. Такий зсув спектру флуоресценцп ¡ндо-1 характерний у розчинах таких ¡лив як сироватков! альбумЫи, гютони, альдолаза м'яз1в, яю зв'язують ¡ндо-1, утворюючи луоресцюючу LP-форму ¡ндо-1. Нами виявлено, що визначапьну роль у зв'язуванж ¡ндо-1 у

х, нм

неполярних "кишенях" сироваткових альбум'ж'ш в'щ'|грають гщрофобш взаемоди I неполяри мкрооточення зумовлюе короткохвильове положения Хтах= 440-450 нм. Такий висновс пщтверджують даш роботи Хе (1992), у яий за допомогою рентгеноструктурного анал1зу I високим роздшенням 0.28 им), встановлено атомну структуру САЛ I показано, що кальци чутлив1 зонди зв'язуються у пдрофобн1й кишеж субдомежв 11А \ ША \ у такому зв'язуван л^анда беруть участь пдрофобж залишки, зокрема Тгр214. Певну роль у стабмйа!. комплексу вдограють електростатичж взаемоди ¡ндо-1 з позитивно зарядженим л13иновими I арпнжовими залишками аминокислот. Короткохвильове положения максимум флуоресценцй ¡ндо-1 при зв'язуванж з сироватковим альбумЫом також може бут зумовлено зниженням рухомост! бшкових груп у центр! зв'язування ¡ндо-1, як це бул показано для таких флуоресцентних зондш як АНС, ТНС, ДНС у в'язких розчинах або твердих матрицях (Демченко, 1988). Експериментально встановлено, що у системах уповтьненою релаксацию ^¡крооточення навколо флуоресцентного зонду спостер^гаетьс зм1щення максимуму його флуоресценцй у довгохвильовий 61'к при "червоному" крайовок/ збудженнй При зв'язуванж ¡ндо-1 з сироватковим апьбумжом ми спостер1гали ефег червоного крайового збудження: при зм;ж Язв. вщ 370 нм до 400 нм максиму флуоресценцм ¡ндо-1 змщувався у довгохвильовий б1к вщ 450 нм до 458 нм. У вод1 ефеи червоного краю не спостер1гаеться, що означав швидку рухомють полярних молекул вод навколо ¡ндо-1.

Наявжсть флуоресцюючо! ¿Р-форми ¡ндо-1 у розчиж з рН>8.0, коли вщсутж Ш1-Ш2-форми, призводить до зм1ни кал1брувального параметра Ат{П I вж зростае вщ 0. (безбшковий розчин) до 0.58 при внесенж 50 мкМ сироваткового альбум'жу. Ятах I р пр цьому змЫюються незначно.

Таким чином, проведен! дослщження свщчать про те, що взаемодт ¡ндо-1 з протонам I бтковими молекулами, зокрема з сироватковими альбумЫами, змжюе флуоресцен™ параметри ¡ндо-1. Це необх!дно враховувати при визначенж кал!брувальних параметр1в, ж використовуються для визначення внутр!шньокл¡тинного вшьного кальцию [Саг+],.

Вплив рН середовища I б!лкового ыйкрооточення на параметри зв'язування Са2+ з ¡ндо-1

Вивчено вплив рН на кальцЮзв'язуюч! характеристики ¡ндо-1. Спочатку так! дослщженн; було проведено в лужному середовищ'| (рН 9.0), коли вщсутия Ш-форма I можливо провеет! точний аналй зв'язування Са2+ з ¡ндо-1 за наявжстю тшьки двох /.-1Ш- форм ¡ндо-1.

Нами запропонований новий методичний пщмд визначення константи дисошац комплексу Са-ждо-1 \ загально! концентрацн кальцю [Са2+]. у розчиж, який безпосередны грунтуеться на вим^юванж флуоресцентних параметр1в ¡ндо-1. На рис. 5, А представлен спектри флуоресценцм ¡ндо-1 в безб1пковому розчин! (рН 9.0) з рйними концентрацюм* кальцто в ¡нтервал1 вщ 0 до 10 мМ. Розчин 50 мкМ ¡ндо-1 (у вщсутносп ЕСТА) послщовнс насичуеться ганами кальщю. Урахування ефекту розбавлеення ¡ндо-1 (не б'!льш 10% виконувалося за допомогою введення коррекцжного коеф^енту. Одержана намь ¡зоемюйна точка Х = 462 нм свщчить про наявнгсть у розчиж тшьки двох форм ¡ндо-1: I форми (Яти, = 477 нм) ! Ш-форми (Я^ах = 415 нм). На наступному етат ми розбавляль 50 мкМ ¡ндо-1 тим же буферним розчином, у якому знаходилася невщома, апе пос^йнг ктьюсть загального кальц)Ю. Використання тако! високоТ концентрацн зонду необхщно дл того, щоб максимально знизити вщсоток ¡ндо-1, який зв'язав слщовий кальцм у розчиж. Ц

500

X, нм

1x10*

Ax-lC* Sx10*

2x10* 3x1ff*

Hf M

'ис. 5. A — Br,лив [Саг+1) на спеюри флуоресценци мдо-1 (50 ыхЩ. Б — Змма молярного внеску (XJ сальц|'йв1пьно1 форми ¡ндо-1 в!д загально! концентрацн ¡ндо-1 ([(.],) при: 1 — слщових (домшкових) сонцентрацтх кальцио; 2 — внесены в розчин невелико! конценгращ! кальщ'ю. = 350 нм; рН 9.0; t = 20 °С.

комплексу Са-Ыдо-1 i загапьну послщовному розбавленж зонду

процедура дозволяв точно розрахувати к^ сонцентрацю кальцю [Са2+]( у розчиш. При ;постер|'гаеться пщвищення внеску кальщй-зв'язаноТ (Ш) i знижуеться внесок капьц(й-ыльноТ (L) форми ¡ндо-1.

Для урахування розбавлення розчину ¡ндо-1 спектри флуоресценци нормувапися у зоемюйжй точцк 3 цих скоригованих спектров флуоресценци молярна доля /.-форми |ндо-1 рН 9.0) визначапася за формулою:

Осктьки \ [Са2+], е поспйними величинами, можна розрахувати змЫу

лолярноТ дол! /.-форми ¡ндо-1 (XL) за таким рвнянням:

Lh ■ [XJ2 + (К ™ '"^ + [Ca2+]f - [/.],) • [XL] - Kf -^ = 0 . (2)

Отримаж експериментальж дан| при рН 9.0 добре описуються теоретичною кривою з (•а-*®-! = 167 ± 27 нМ i [Ca2+]t = 1.98 ± 0.059 цМ (рис. 5 Б, крива 1).

Дал1 були дослщжеж кальц1йзв'язуюч1 характеристики ¡ндо-1 в нейтральному розчим рН 7.2). Корекцго на загальний кальки, що внесений у вигляд! дом1шок з дегажзованою одою i речовинами, на яких готуються буферж розчини.необхщно проводити з урахуванням еличини [Са2+](,що визначаетъся з експериментщ рис. 5 Б.

На рис. 6 наведен! залежносп при рН 7.2 mix двохвильовим параметром Я, який находили 3i cneiapie флуоресценци ¡ндо-1, i концентрацию вшьного кальц1ю [Са2+Ь яку адавали Ca-EGTA-буферэми. Це — кал1брувальш крив!, як! одержан! in vitro. кспериментальн! точки (рис. 6) добре описуються З-поибною залежжстю

Г = -

1 +

р-к:

" + Я_

(3)

([Са2*1)"

е Я — вщношення !нтенсивностей флуоресценци ¡ндо-1 на 410 I 495 нм С410//495)!

— вщношення ¡нтенсивностей флуоресценци /.-форми до Ш-форми на 495 нм ( /¿,495/'ш,495 )l тах — двохвильовий параметр у вщсутност! !он!в Са2+ (10 мМ EGTA);

max — двохвильовий параметр при насичуючих концентрациях !он!в Са2+ (10 мМ);

— коеф!ц!ент Хшла, який характеризуе стех1ометр!ю зв'язування Сг?+ з ¡ндо-1.

В експерименл ми одержали таю флуоресцентж параметри ¡ндо-1 (розчини з рН 7.2):

R !•» 1.0

10"® 10"* 10'7 10"* 10"® 10"1 10J 10"1 [Са^.М

Рис. 6. Залежнклъ двохвильового флуоресцентного параметра Я вщ [Ca2+]¡. □ i А — експериментальм значения, отриман! в процеа' титрування 1ндо-1; • — контрольж точки, отримам за допомогою стандартних Са-буферш ("Molecular Probes"): 1—у в'дсутност! б1лка; 2 — в розчиж САБ (50 мкМ). Концентрац'я ¡ндо-1 5 мкМ; рН 7.2.

(Р = 2.554). Експериментальж дан1

Яга/Л = 0.102, Ята* = 2.175 I р = 2.528. Ек периментальж дат, отриман1 на стандар них капыуевих буферах (рис. 6, крива добре сп1впадають з теоретичною кривою к-с.-шт-1 = 210 ± 33 нМ I п = 1.04. Значен;

близьке до , одержаногс

робол Гржкев^а та ¡н. (1985), а одержа значения п свщчить про те, що зв'язуван Са2+ з ¡ндо-1 вщбуваеться 31 стехюметр'к 1 : 1.

У розчин'1 бшку калЮрувальна кри певним чином змшюетъся (рис. 6, крива; Параметр Rm¡n пщвищуеться в 11 разш складае 1.165. Ятах пщвищуеться Ятах = 3.09. Майже не змЫюеться параметр апроксимуються теоретичною кривою

¿са-ыяу-1 = 842 ± 33 нМ. Це значения к]0""^ добре сШвпадае з к^"^ , одержаним у роб, Бессен! та ¡и. (1995). Ми оцмили чутлив1сть методу, коли вимфювана величина Я незнач перевищуе Ят/П — у випадку без бшка вона становила Я = 0.152, з бшком — Я= 1.2" Поставивши у формулу (3) значения Я i кал1брувальш параметри Ят/Л, Ятр i кйСа "до"1, i одержали таю концентрацй [Са2+],: мш1мальну 13.12 нМ у вщсутносгп б'шка i 57.3 нМ п наявнооп у розчин!' бшка. Таю оценки свщчать, що наявнютъ бшка значно ускладнюе bhi рювання низьких концентрац|'й ioniB кальщю. Це необхщно враховувати у випадку визначен базальноТ концентрацм ¡OHie калы^ю в кл'ггин!.

Ми вивчили вплив закислення середовища на флуоресцентн1 i калы^йзв'язук параметри ¡ндо-1. У розчиж без бшку (рН 6.0) одержан! таи кал1брувапьн1 параметр Ят/„ = 0.216; Яша* = 2.18; Р = 2.643 i Kf-'"^' =538±137иМ. Величина константи дисоц1а дуже близька до величини, визначеноТ в робот! Лагтанзю (1990). У розчин! з бшком отрим; таю значения параметре: Ят)У)= 1.277; Rmax= 3.525; р= 1.879 i K'f""^' = 5696 ± 236 н Пщвищене значения K'f^' = 1696 нМ було встаноалене у розчин: (рН 6.3) з бшков!

екстракгом ¡з м'язу (Baker, et al., 193 Використовуючи метод пщгонки експериме тальних дан их до S-nofli6HoT криво! за формуле (3), ми одержали у розчиж з рН 5.2 величи /С™ = 3262 ± 66 нМ. 1ншим методом у розч! без EGTA з рН 5.2 була знайдена ранк ^■сэ-вдм =3160нМ (Bancel, et al., 1990). Як вид

величини клс'-'"дсИ t одержан! р!зними метода1

добре епщпадаютъ. Залежнють констан дисоц!ацЯ комплексу Сачндо-1 вщ змши | розчину наведена на рис. 7.

Проведен! дослщження св'щчать про те, ■

7

рН

Рис. 7. Залежнють константи дисоц!ацП комплекСу Ca-¡Hflp-1 вщ рН розчину. Юмнатна температура, ц = 0.105 М.

аявнють бтка, концентрац1я якого близька до энцентрацм розчинених цитозольних бмюв, та зкислення розчину виявляють адитивш ефекти а флуоресцентш параметри i зв'язування îohïb а2+ з ¡ндо-1. У BÎflcyTHOcrri б'тку при закисленн! озчину (в'|д рН 7.2 до 6.0) майже не змшюються >луоресцентн1 параметри Яшах i Р. але у 2-2.5 аз зростають Rmi„ та . При наявнооп у

озчиж САБ закислення незначно вппивае на шуоресцентн! параметри Rm;„ i Rmax, проте начно знижуе кальц|'йзв'язуюч1 властивооп |до-1: K'f'1"^ зростае в 6.8 рази.

LU LP L

1.0 HH) _

0.8 S ш/ i / A / \ \

0.6 ! a \ \

1Ф 0.4 ■ b / * i / / n\ \ S & ' '■- 1 \

0.2 /// Л S LU \\ \v

0.0 ». . 2 12 , ...... ' ■

500 X, нм

Рис. 8. Нормован! в максимумах спеетри флуоресценцп, що в1дпов1дають ¡ндивмуальним формам ¡ндо-1 (С Ш,£Я або Ш).

Оц1нка [Са2+]| за двохвильовим флуоресцентним параметром Я з урахуванням ¿М, ¿Р (£Н) форм ¡ндо-1

Для кшьисного розрахунку [Са2+]|, актуальним стае питания знаходження математичних шввщношень, я и б б1пьш точно враховували б спектральну гетерогеннють флуоресцентного игнапу капьц1й-чутливих ¡ндикаторщ. Для урахування внеску некапьщевих форм ¡ндо-1 в вохвильовий параметр Я ми розглянули модельну систему, в яий приймають участь 1луоресцююч11-, Ш-, LP- \ Ш-форми ¡ндо-1.

На рис. 8 зображеж нормован! у максимум! спектри флуоресценцп /.-, Ш-, 1.Р- ! Ш-юрм ¡ндо-1. Точки на спектрах, що вщповщають довжинам хвиль Х-\ I %2, на яких еестрували двохвильовий параметр Я, позначен! на рис. 8, як коефщгёнти б. ¡ндекси бтя зжного з коефМентш 5 вщображають природу взаемоди зонда з кальщем (Ш), з бтком -Р), з протоном (¿.Я). 3 урахуванням присутност! у середовищ! трьох форм ¡ндо-1 (1, Ш! Р) ¡нтенсивносл флуоресценцп / на двох довжинах хвиль 1 Х2,запишуться як

- ^ -[Ц + в?" •[¿А*1 + 5?' .[¿Я] ,

= $ • [/.] + в? ■ [Ш] + Б? ■ [ЬР] . (4)

э Э — параметри, яю знаходяться з контрольних спектр1в (рис.8). эд1 двохвильовий параметр Я буде визначатися так

/, -[1]+ 5,ш • [Ш] + ■ [/.Р]

(5)

/2 SL2 -Щ + S? -[LM] + S? -[LP] ' сий з урахуванням вщповщних констант дисощащй K'd перетворюеться у вираз

oi J. о"*

[Са ], ^

OiP [Р],

' K'L-LM ■ K'l,-LP

С' Л.

[Са2'],

о W IPh '

°г ^ °2 • ts'L-LU 2 • L-LP Kd Kd

ри певних граничних умовах цей вираз може так змжюватись:

I У розчиж, що мютить кальщй у вщсутност1 розчиненого бшку, тобто [Са2+]| * 0 i [Р]| = 0, вняння (6) приймае такий вигляд

(6)

nlM _ pL

"mav min

U0L

KJ

- + Я1

[Са l

еш ot «i,

ЫМ _ . о L _ _ 2

"■шах оШ ■ mki - ~t ' P ~ '

2) У розчиж, що мютить бшок ([Р11 * О) у вщсутност! южв кальц1ю ([Са2+]( = 0,10 мМ ЕСТ р'шняння (6) набувае такого вигляду

Яи> п1.

----------па» ~ тгнп | ¡-¡I (8)

ирм-Ь—

31Я << с1-__!_■ д1 _ 21-. я1--"' - 2

"*тах ~ ^¿Р ' птк1 ~ ' "

[Р1

и- Я"

У випадку, коли моделюеться внутр!шньокл1тиннв оточення для ¡ндо-1 I в розчиж' е ю кальфю I бшок ([Са2+]|# О I [Р]|#0),р1вняння (6) буде мати такий вид: 0ш а1-"'

- + , (9)

У 1-ш + ^ ГР]/-

К?

_+1

[СаП

3 виразу (9) знаходимо концентращю кальцю [Са2+]| в залежносл вщ флуоресцентно параметру Я, який рееструеться експериментапьно:

[Са2*], =

+ р Ц>-1М

к:

В _ Я1"""

^й^Г ■ (10)

п.

шах

або з урахуванням вщпов'щних постановок маемо

Ч-Ш

[Са 1 = Ка ■ р

-и>

1 + —-^- (11)

о"" яш о " 1

тал У "ти ~ "

Загальне рщняння (11) дозволяв визначати концентрацш южзованого кальцю розчиж з бшками, яи зв'язують ¡ндо-1 ! змЫюють йога флуоресцентж параметри.

Окремим випадком рвнянь (10, 11) е вщома формула ГршкевЫа та ¡н. (1985) вщсутносл б|лку):

(12)

"ггих

оскшьки при [Р]1= О маемо Я"* = Я^п .

Подбж розрахунки можуть бути застосовани при розгляд! кислотно-лужного баланс випадку дисоц!ацп ¡ндо-1 при змМ рН.

Тсайеном (1980) наводяться константи южзаци атомт N (рКа1 = 6.36 \ рКаг= 5.47) I ВАРТА — сполуки, на шдстав! яко! змодельована калыий-хелатуюча дшянка ¡ндо Константи дисоцюци для карбоксильних труп вимфяти не вдалося через низьку розчиннк | слабкий заряд ВАРТА при рН<4.0.1ндо-1 здатний зворотньо вщдавати або приеднувати у розчиж. Протонування може вщбуватися по двох атомах N. розташованих кальщйхелатуючм дшянщ, а також по карбоксильних трупах — чотири прот'они кальцмхелатуючш дшянц1 \ один у положенж 6 ¡ндолшьного запишку.

3 урахуванням цього, загальна концентращя ¡ндо-1, [Ц,, буде представляти су вшьно? форми [Ц, I век протонованих форм ¡ндо-1: [Ц(= И + [Ш] + [Шг] + [Шэ] + [и-При рН (>6.0) внеском Ш3 I 1Л4 форм можна знехтувати. Тод! при будь-яко ф!зюлопчному значенж рН уявна константа дисошацм комплексу СаНндо-1 (/С/" визначаеться як добуток концентрацм вшьного кальцю \ незакомплексованоТ форми ¡ндс до концентрацм комплексу СаЧндо-1:

.t-ш _ [Ca*], • (Щ, - ILM]) _ [Ca'*], • W + [LH] + [ЦЦ - [IM]) " [Ш] [LM]

Якщо чисельник i зиаменник р1вняння (13) помножити на [/.] i перетворита його з

рахуванням, i то одержимо

■1-Ш ,,1-щ N [H»l [H*]2 I (14)

d - nd * ßl-LH\ т К1--^ J1 * '

бо з точжстю до коеф№нта активное™ Н+ (ун) можна записати

■г-Ш _ fcL-U* . + IqIp^îI-pW) +1Q(o*«1*I>f»2-äP'') J (15)

3 р1вняння (15) видно, що закислення середовища пщвищуе величину уявноТ константи исощацм комплексу Са-зонд {KaL'L"). Цей висновок добре тдтверджуеться як нашими езультатами (рис. 7), так i даними лгератури (Lattanzio, 1990; Roe, et al., 1990; Lattanzio, artschat, 1991; Eberhard, Erne, 1991; Martinez-Zaguilan, et al., 1991).

Значения KtfutM, що наводяться у лп-epaTypi, е коректними т'тьки для конкретних умов лм1рювань. Проте, деяю дослщники для розрахунюв використовують константу дисоц1ацп з эботи Гр1нкев1ча та ¡н. (1985), не беручи до уваги вщповщнють наведених значень pH, !мператури, юнного складу тим значениям, при яких плануеться проводи™ експеримент. кщо ж умови проведения експерименту вщрвняються в'щ вказаних хоча б по одному з 1раметр1в, то для одержання BipHoro значения [Са2+], необхщно проводи™ нове кап1брування використанням Са-буфер1в для визначення уявноТ в цих умовах.

Нами запропоиований метод математичного розрахунку уявноТ константи дисощацм комплексу СаЧндо-1 з урахуванням впливу юнноТ сили, температури та pH без >оведення додаткових кал1брувальних BHMipiB. Такий методичний пщх'щ досить добре ¡зроблений для розрахунку уявних констант дисоц1ацм капьцю для таких речовии як EGTA та \РТА (Harrison, Bers, 1987; Harrison, Bers, 1989; Marks, Maxfield, 1991; Bers, 1994). BiH унтуеться на використанн1 ¡ндивщуальних протонних i кальц1евих констант зв'язування для >зрахунку уявноТ констан™ дисощацп комплексу Са-хелатор. Оскшьки числов1 значения ^ив'щуальних констант acouiauiï запежать вщ температури та юнноТ сили, то для цих нстант треба ввес™ поправку на умови, в яких проводять вим|'рювання (температура, юина ла). 3 урахуванням ¡ндивщуальних констант, скоригованих на ¡онну силу i температуру, вну константу дисоцгацп розраховують при даному значенж pH.

Як було показано ражше, у ршнянж (14) для розрахунку уявноТ константи дисо^ацй «»-»«и комплекСу Са-Ыдо-1 використовуються ¡ндивщуальж протонж KLdLH\ та

пьц^ева К1;ш константи дисоц1ацм, числов| значения яких залежать вщ температури та moi сили. Для цих констант треба ввести поправку на умови, при яких проводять вим>рю-ння (температура, юнна сила).

Анал1зуючи дан! л'ггератури, ми розрахували вщповщно до умов, що

водятъея р^ними авторами. При корекцй на температуру та ¡онну силу розчину

«и використаж наступи! ¡ндивщуальн! np0T0HHÎ констан™, оцжеж за даними Латтанзю )90) при t = 20 "С i ii = 0.1 M, KLdm = 716 нМ (ДН^-"*1 = 13.52 кДж/моль) i чишг _ 3 2 мкМ - 352.88 кДж/моль), i кальщева константа дисоцйцй

ш = 163 нМ (Д= 8.99 кДж/моль).

Коректнгсть проведених розраху к) в можна оцЫити, порвнюю1 константу , яку розраховш

математично, з експерименталы визначеною константою дисоцга!

для даних умов експеримен

(рис. 9). Видно, що у бшьшост! випад» (при [Мд2+], = 0) спостер!гаеться доб| спшпадання розрахованого з експер ментально визначеним значенж

Рис. 9. ГрафЫна взаемозалежнютъ констант дисощ'ацй, роз- . Проте, в деяких випадк

рахованоТ та експериментально! К^^, спостергаються значн! вщхилення

комплексу СаНндо-1. у = - 0.041 +1.009 • х, г= 0.998. експериментальна к'^^ е в 2-3 ра

бтьшою, що може свщчити про неточнють ТТ визначення.

Перев1рка математичного ршняння, що враховуе внесок ¡.М- I !-Р-фор ¡ндо-1 у Са2+-флуоресцентний сигнал

Для перев!рки правильное^ ршнянь (10 I 11) необхщно знати капЮрувапь флуоресцентж параметри \ константу дисоцюцй К^ ^ САБЧндо-1. Ми вивчили спект| флуоресценцп ¡ндо-1 (5 мкМ) у розчинах САБ рЬно? концентрацм (вщ 0.43 до 43.1 мкМ) вщсутност1 юн!в кальцю (10 мМ ЕСТА) (рис. 10). Як видно з рисунку, при невелик концентратах САБ у розчин!, коли вщношення концентрацм ¡ндо-1 до САБ, т = [¡ндо-1 ]/[Г е великим (т>1) (рис. 10 спектри 1 \ 2), положення максимуму спектру флуоресценцп ¡нд 1 вщповщае кальц1й-втьжй (Ц форм! ¡ндо-1. При збшьшенж концентрацм САБ, коли т< Хтах поступово зм!щуеться в короткохвильову дтянку \ при концентрацм САБ 43.1 мк А^ах= 440 нм. Таке положення Хщах = 440 нм вказуе на утворення ¿.Р-форми ¡ндо-Наявнгсть ¡зоем1с1йно1 точки X = 465 нм для родини спектрш на рис. 10 евщчить про те, щс розчиж у стан! р1вноваги знаходяться дв1 форми ¡ндо-1, сп!ввщношення яких зм!нюеться збшьшенням концентрацм САБ: при т>1 переважае /--форма, при т<1 — /.Р-форма ¡ндо-1

На рис. 11 наведено залежжеть двохвильового параметру Яи1я вщ концентрацм САБ безкапьщевому розчин! (10 мМ ЕСТА). Експериментальн! точки, отримаж ¡3 спектр флуоресценцп ¡ндо-1 (рис. 10), добре описуються сигмоТдною кривою на баз! р!вняння (( До експериментальних даних добре пщганяеться теоретична крива з такиг кал!брувальними параметрами: =1.65; = 1.81; К^ =3.98 ± 0.25 мкМ. Визначе! нами К¡¡~и> комплексу САБ-ждо-1 бшьша жж у 10 разш вщ константи дисоц!ац!Т, одержан у робот1 Банцела та ¡нил (1992). Одержана цими авторами константа К^ =300 нМ, я близька до константи дисоц:ацн комплексу Са-!ндо-1, скор!ше за все не зове

в1рна, бо при додаванж м1кромолярних концентрацм южв Са2+ у розчин, в якому молекули САБ (50 мкМ), зникае спектр флуоресценцп з Х^ах = 440 нм ((Р-форма ¡ндо-1 виникае спектр з Хтах=415нм (Ш-форма). Одержана нами значения дуже близьке , константи дисощацн К^ = 4 мкМ комплексу САЛ-кв1н2 (НгеЬИеЮ 1996).

Для перевфки запропонованого нами математичного виразу (11) проведен

К*

, м

1000

100-

1000 X Са-/ндо-1 'Мтвааиг«* • м

60000 50000 40000 30000

|ф

20000 10000

350 400 450 500 550 600 650 Ó " 1¿< Ю-» 1¿-< 10-'

x, нм [p](. m

ис. 10. Спекгри флуоресценцц ¡ндо-1 (5 мкМ) у в|дсутност1 íohíb капьцю (10 мМ EGTA) у розчинах з жцентращею сироваткового альбум1ну бика (в мкМ): 1—0; 2 — 0.86; 3 — 2.13; 4 — 5.05; 5—12.20; 6 — I9.73; 7 — 43.1. Лзб.= 350 нм; рН 7.2; t = 20 °С.

ис. 11. Залежнють двохвильового параметру RL'LP в'|д концентрацК [Р], САБ. ■ — експериментальн! начення. Концентращя ¡ндо-1 5 мкМ; >.зв = 350 нм; рН 7.2; t = 20 °С.

ксперимент, в якому промодельовано ефект зв'язування ¡ндо-1 з САБ (7 мкМ) i вибран! мови, необхщж для одержання кашбрувальних параметр1в (безкальц!евий розчин, О мМ EGTA) ¡ Я^ (насичуюча концентрацы Са2+ 10 мМ). Для ощнки концентрацК [Ca2+]i ¿користовувапи таю кагпбрувальж флуоресцентж параметри, одержан! в даному кспериментк Kf"1"^ = 210 нМ, R¡^,„ = 0.101, RZ = 2.172, PL'LM = 2.72.

У контрольному експеримент! (рН 7.2; t = 20 °С) ми записали спектр флуоресценци i 1значили двохвильовий параметр Я = 0.597 ¡ндо-1 у стандартному кальц!евому буфер! з домою концентрац!ею ([Ca2+]¡ = 190 нМ, "Molecular Probes") (безбтковий розчин, [Р] = 0). энтрольну концентрац!ю капьц!ю в стандартному кальц!евому буфер! визначили за ормулою Гржкев'на та ¡н. (1, 12): :а2+], = RL)/(RZ -я) =

210 • 2.72 • (0.597 - 0.101) / (2.172 - 0.597 ) = 180 нМ.

цержане значения е дещо занижении у пор!внянн! Í3 вказаним (190 нМ), що, можливо, )в'язано !з термжом збер!гання кал!брувальних кальц!евих буфер!в (Marks, Maxfield, 1991).

Знаючи концентрацю [Ca2+]¡ у контрольному розчин!, ми перев1рили в!рнють ü ощнки у >исутност! бшку САБ (7 мкМ) при використанн! pi3HHX метсдав кал!брування. Спочатку для инки концентрацн вшьного капьщю використовували традищйне р!вняння (1, 12), в якому 'аховуються тГльки дв( форми ¡ндо-1, L i Ш, та застосовуються кажбрувальж параметри, |,ержаж в експериментах in vitro та in vivo. Для розрахунку [Ca2+]¡ використовуеться охвильовий параметр Я = 0.856, одержаний в стандартному капьшевому буфер! i САБ vikM, а також:

кал!брувальж параметри , Р1~ш, Я^, Я^, одержат in vitro:

a2+]¡ = К^ - р™ ■ (Я - Я1 ) / ( Я- - Я ) = 210 • 2.72 • (0.856 - 0.101) / (2.172 - 0.856) = 328 нМ.

1ержане значения концентрацн [Ca2+]¡ е homîtho завищеним у портнянж з контрольним аченням [Ca2+]¡ = 180 нМ. Дйсно, у багатьох експериментах, коли ощнювалась нцентрацш [Ca2+]¡. в штинах або тканинах ¡з використанням такого методичного •йому, одержан! значения концентрацн цитозольного кальцю е значно завищеними.

6) кал1брувальн1 параметры Я1--"" = 0.638 (в розчиж САБ 7 мкМ у вщсутносл кальи [Ca2+]¡ = 0) ¡ ри^ч*- 2.038, одержан In vivo: [Ca2+]¡ = rl-v ) / (fí^ - fí ) =

= 210 • 2.038 • (0.856 - 0.638) / (2.172 - 0.856) = 71 нМ.

Одержана значения концентрацн [Ca2+]¡ е занижении внаслщок зменшення р (Р збшьшення Rmiп (Я ) завдяки присутносл у розчиж LP-форми ¡ндо-1. Дании розрахун пщтверджуе одержане нами занижене значения [Ca2+]¡ у тромбоцитах. Це може б> свщченням певних недолшв описаного кашбрування in vivo, пов'язаних ¡з некоректн: урахуванням LP-форми i використанням заниженого значения ^<rfCa-'ндо-,,

На наш погляд, найбшыи коректним е кал!брування in situ, яке виконуеться використанням Са-буферщ у присутносл кальцгёвих юнофор1в (А23187, íohomíuhh). Зпд одержаних даних, представлених у координатах [Ca2+]i = f((R - Rm¡n) / (Ятах ~ Я)), знаход> значения добутку K'f ~>°"a■ р, що визначають як тангенс кута нахилу (1, 12). Цю величин; подальшому використовують для розрахунку концентрацн цитозольного [Ca2+]¡. Про-проведения такого кашбрування е дуже складним.

Ми провели оцЫку [Ca2+]¡, використовуючи запропоноване нами р1вняння (11), я враховуе три форми ¡ндо-1 —L,LM\LP\

Одержане нами значения [Са2+]|, е найбшьш близьким до контрольно! величини.

Таким чином, на баз1 к1нетики взаемодп ¡ндо-1 з ¡онами кальцто та бшковш молекулами одержано математичне р!вняння (11), яке враховуе три флуоресцентж фор: ¡ндо-1, — L, Ш та LP. Використания цього ршняння покращуе юлькюну оцЫку концентра цитозольного втьного кальщю [Са2+](.

1. За допомогою комп'ютерного розкладання встановлено, що ¡нтегральна флуоресцен1 ¡ндо-1 у кл¡тинах е спектрально гетерогенною i складаеться ¡з спектрш флуоресцен чотирьох ¡ндивщуальних форм ¡ндо-1, — кальцЮвшьно! L, кальщйзв'язано! Ш, протонован LH та LP-форми, зумовлено! зв'язуванням ¡ндо-1 з цитозольними бтками.

2. В безкальц|'евому розчин! (10 мМ EGTA) i у вщсутносп бтюв флуоресцентж парамет сильно змЫюються при рН<7.2, а ¡нтефальний спектр флуоресценцн ¡ндо-1 являе собс комбЫацю cneiapiB флуоресценцн двох Ш-форм (частково протоновано! Lh Vnax = 446 нм i протоновано! Ш2, Vnax = 412 им) i депротоновано! L-форми (^¡w = 477 и з р1зним вщсотковим внеском в залежносл вщ pH середовища.

3. Показано, що ¡ндо-1 взаемод1е з певними балками, що веде до утворення ¡ндивщуалы /.Р-форми з характерным спектром флуоресценцн. Спектр залежить вщ типу бшка, — д сироваткового альбумЫу бика, САБ (Я™« = 440 нм),дпя сироваткового апьбум1ну людиь С АЛ (Ятах = 450 нм) , riCTOHiB (/-max — 454 нм). Bei одержан! спектри флуоресценцн ¿Р-фО[ значно змщеж в короткохвильову дшянку спектру у пор1внянж ¡з спектром кальцмвшьно! форми (Ä^ax = 477 нм) i наближуються за формою до спектру флуоресценцн ¡ндо-1 ¡нтактних кл ¡тинах у стаж спокою.

210-2.72^1 +

= 145 нМ.

висновки

l. Встановлено, що основну роль в утворенж комплексу ¡ндо-1-б1пок (LP-форма) вщ1грають гщрофобж взаемодм, частково у стабшЬацИ цього комплексу беругь участь електростатичж взаемодй з позитивно зарядженими лЬиновими та арпжновими амЫокислотмими залишками бшкш. Визначено константу дисощацй комплексу САБЧндо-1, К^ = 3.98 мкМ.

>. Розроблено новий методичний п'щхщ для визначення константи дисоц!ацч комплексу Са-¡ндо-1 i загально! концентрацн [Ca2+J( у розчиж.який грунтуеться на визначенж молярноТ дол1 XL кальц|'й-в'1льн01 L-форми в ¡нтефальному cneiopi флуоресценцн ¡ндо-1. i. Встановлено, що сироватков1 апьбумЫи, концентрац1я яких близька до кон центра nil розчинених цитозольних бшюв, i закислення розчижв ведуть до змЫ флуоресцентних пара-MeTpiB та кальц|'йзв'язуючих характеристик ¡ндо-1. Закислення безбшкового розчину знижуе здатжстъ ¡ндо-1 зв'язувати ¡они кальцю, при цьому константа дисоцацй Kf* комплексу Са-!ндо-1 при 20 °С становить: 167 нМ (рН 9.0), 210 нМ (рН 7.2), 538 нМ (рН 6.0), 3262 нМ (рН 5.2). При наявносл у розчиж (рН 7.2) б1лку САБ K'f" ' збшьшуеться до 842 нМ. . Запропоновано метод математичного розрахунку уявноТ константи дисоцшцм к,йс*"'"д>'1 комплексу СаЧндо-1 з урахуванням впливу ¡онноТ сили, температури та рН без проведения додаткових кал!брувальних вим1рювань. Цей методичний пщхщ грунтуеться на використанж ¡ндивщуальних протонних (K\fw\ Kfutm) та кальцшво! (К1а'ш) констант дисощацм для розрахунку кас*"'ль1 ,яю залежатъ вщ температури та ¡онноТ сили.

. На основ1 к!нетики взаемодм ¡ндо-1 з юнами кальцто i бшковими молекулами (або протонами) одержано математичне р1вняння, яке враховуе три ¡ндивщуальж флуоресцентж форми ¡ндо-1, кальщйвшьну (/.), кальщйзв'язану (Ш) i бшокзв'язану (LP) (або протоновану LH). Це ртняння дЬзволяе бшьш точно к'шьюсно визначати концентрац'ю вшьного цитозольного кальцю [Са2+]| .

Слисок ро61т, опублжованих за темою дисертац!Т

Zyma V. L., Dyachok О. М. Calcium signal: registration in cell and quantitative estimation // Physics of the alive. — 1994. — 2, N1. —P. 46-54.

Зима В. Л., Дячок О. М. Вплив полярносл середовища I бшкового мкрооточення на флуоресценцто ¡ндо-1 // Укр. биохим. журн. — 1995. — 67, N2. —С. 100-103. Зима В. Л., Дячок О. М., Ветров О. П. Вплив рН i бшкового оточення на флуоресцентн! параметри ¡ндо-1 // Physics of the Alive. — 1995. — 3, N1. —С. 75-80.

Зима В. Л., Дячок О. М., ГанчурЫ В. В. Модифкащя методики дослщження вшьного внутршньоклггинного кальцю // ФЫолопчн. ж. — 1995. — т. 41, N3-4, —С. 115-120.

Дячок О. М., Зима В. Л., Семенов Ю. В. Вплив бшкового оточення на спектри флуоресценцн i зв'язування Са2+ ¡ндо-1 // Physics of the Alive. — 1996. — 4, N1. — С. 58-66.

Дячок О. М.,3има В. Л. Флуоресценция индо-1: влияние полярности среды и белкового

микроокружения // ДоповЦи Нац. Акад. Наук УкраТни,— 1997. N8. — С. 168-172.

Дячок О. М.,3има В. Л..Семенов Ю. В. Количественная оценка цитозольного свободного

кальция с помощью индо-1 // Physics of the Alive. — 1998. — 6, N1. — С. 65-71.

Zyma V. L., Dyachok О. M. Calcium transients of smooth muscles In response to different

levels of depolarization. // Abstracts. International Symposium «Biological motility»,

Puschino, —1994. — P. 142-143.

Дячок О. M., Ластовский В. В., Зима В. Л., Ляховецький Р. В. Апаратно-програмовий комплекс реестрацн внутршньоклггинного Са2+//Тези. I з'Тзд украТнського бюфЬичного товариства. КиТв. — 1994. — С. 95.

10. Дячок О. M., Зима В. Л. Вплив бокового оточення на флуоресценцю ¡ндо-1 зв'язуванш ¡ohíb кальт'ю // Тези. I з'Тзд украТнського бюфЬичного товариства Ки?е 1994.— С. 94.

11 .Зима В. Л., Дячок О. М., Ганчурш В. В. Кальц1ев1 сигнали при р1зних pit деполяризацп гладеньких м'яз'!в // Тези допов'щей XIV з'Тзду УкраТнського фйюлопчь товариства. КиТв, —1994. — С. 9.

12,Dyachok О. М., Zyma V. L. lndo-1 fluorescence: influence of medium polarity and pro microenvironment // Тезисы докладов Межд. научн. конф. «Физика и химия органичес люминофоров 95» 9-13 октября 1995 г. Харьков, — 1995. — С. 131.

13.DyachokO. M., Zyma V. L. Calcium signal: Registration in smooth muscles and quantita estimation // Abstracts XXXIII International Congress of Physiological Sciences, St. Petert June 30-July 5. 1997. P.037.04.

АНОТАЦ1Я

Дячок О. M. ФлуоресцентнI та кальцШзв'язуючI характеристики ¡ндо-1 » взаемоди з протонами / б!лковими молекулами. — Рукопис.

Дисертац|'я на здобуття наукового ступеня кандидата бюлог1чних наук за спещальнг 03.00.02 — б!оф1зика. — 1нститут фЫолопТ 1м. О. О. Богомольця HAH УкраТни.

Дисертац|'я присвячена досл1дженню флуоресцентшх i кальц1йзв'язуючих характерис ¡ндо-1, який широко використовуеться для реестрацм вшьного цитозольного капьц'по в кгатт Показано, що в кл^инах кальц!ев1 сигнали спектрально гетерогонж i кр:'м кальцжвшьноТ (i калыд1йзв'язанно1 (Ш) форм ¡ндо-1 рееструютъся некальц1ев1 форми, — протонована (Lh бмокзв'язана {LP) форми ¡ндо-l. Виявлено.що ¡ндо-l зв'язуеться з сироватковими альбумша в специф1чних центрах завдяки переважно г1дрофобним ¡,частково,електростатичним взаемод! Зменшення pH < 7.2 ¡ наявнють б1люв в розчин! значно знижують кальц!йзв'язуюч1 характернее ¡ндо-1 i эмшюють флуоресцентнi параметри ¡ндо-t. Отримано математичне р1вняння,яке зв'я: [Ca2+]¡ з вим^рюваним двохвильовим параметром Я I в якому врахован! три флуоресцен форми, L, LM ¡ LP, 1ндо-1, завдяки чому покращуеться ктьк(сна ouiHKa концентрацл в1льн< кальцто. Запропоновано новий методичний пщх1д для пщрахунку уявноТ константи дисоц]': комплексу СаЧндо-1 з урахуванням зм!ни температури, Iohhoï сили ¡ pH.

КлючовI слова: ¡ндо-1, флуоресценц!я,зв'язування Саг+, константа дисоц/ацИ.сироваткое альбумЫ, pH.

Дячок О. М. Флуоресцентные и кальцийсвязывающие характеристики индо при взаимодействии с протонами и белковыми молекулами. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальное 03.00.02 — биофизика. — Институт физиологии им. О. О. Богомольца HAH Украины.

Диссертация посвящена исследованию флуоресцентных и кальцийсвязывающих хараю ристик и ндо-1 .который широко используется для регистрации свободного цитозольного кальци* клетках. Показано, что в клетках кальциевые сигналы спектрально гетерогенны и кроме каль^ свободной (/.) и кальцийсвязанной (Ш) форм индо-1 регистрируются некальциевые формы, протонированная (LH) и белоксвязанная (LP) формы индо-1. Установлено, что индо-1 связывает с сывороточными альбуминами в специфичных центрах благодаря преимущественно гидрофс ным и, частично, электростатическим взаимодействиям. Уменьшение pH < 7.2 и присутствие растворе белков значительно снижают кальцийсвязывающие характеристики индо-1 и измени! флуоресцентные параметры индо-1. Получено математическое уравнение, которое связыва [Са2+]| с измеряемым двухволновым параметром Я и в котором учтены три флуоресцентн! формы индо-1,— L, LM и LP, благодаря чему улучшается количественная оценка концентрат свободного кальция. Предложен новый методический подход для расчета кажущейся констан-диссоциации комплекса Са-индо-1 с учетом изменения температуры,ионной силы и pH.

Ключевые слова: индо-1, флуоресценция, связывание Саг+, константа диссоциац сывороточный альбумин, pH.

Dyachok O. M. The fluorescent and calcium binding characteristics of indo-1 by the nteraction with protons and proteins. — Manuscript.

Thesis (or obtaining scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.02 -biophysics. — Bogomoletz Institute of Physiology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to investigation of fluorescent and calcium binding characteristics of ndo-1, which is frequently used for registration of cytoplasmic free calcium in living cells. It was shown hat calcium signals are spectrally heterogeneous in cells Protonated {LH) and bound with protein (LP) orms of lndo-1 were registered besides calcium free (I.) and calcium-bound (LM) ones. It was established that indo-1 binds to serum albumins in specific sites due to hydrophobic and, particularly, electrostatic interactions. Acidification of the solution to pH less then 7.2 as well as presence of Droteins decrease calcium binding properties of indo-1 and alter indo-1 fluorescent parameters. The equation connecting [Ca2+]j with double wavelength parameter R that is measured during the experiment was obtained proceeding from three fluorescent forms of indo-1 (L, LM and LP). Using this equation permits improving calculation of [Ca2+],. The new approach for evaluation of the apparent Jissociation constant of indo-1 to Ca2+ is proposed. This method permits calculating Kj* ""1 :onsidering variation in temperature, ionic strength and pH.

Key words: indo-1, fluorescence, Ca?+ binding, dissociation constant, serum albumine, pH.

Пщписано до друку 20.01.98 p. Формат 60x90/16. Ум. друк. арк.1.0, Обл.-вид. арк. 0,8. Наклад 100. Зам. 14.

Вщдт оперативно! пол'графн Центру МжнародноТ ocbîth 227-12-75, 227-37-86