Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Физиолого-биохимические реакции корнеплодов моркови на ранних этапах заражения возбудителем альтернариоза в процессе хранения

ВАК РФ 06.01.11, Защита растений

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические реакции корнеплодов моркови на ранних этапах заражения возбудителем альтернариоза в процессе хранения"

РГ5 ОЛ - Я Ш 1993

На правах рукописи

Соколова Татьяна Дмитриевна

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ КОРНЕПЛОДОВ МОРКОВИ НА РАННИХ ЭТАПАХ ЗАРАЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕМ АЛЬТЕРНАРИОЗА В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ

Специальность:06.01.11 - защита растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Диссертационная работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений (г.Санкт-Петербург)

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Л.Н.Логинова Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.Н.Гусева кандидат биологических наук В.Н.Савин Ведущая организация - Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится 4.1" .ш-яги . .1998 г. в 4й часов на заседании Диссертационного совета Д020.01.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 189620, г.Санкт-Петербург, Пушкин, шоссе Подбельского, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института защиты у

растений

Автореферат разослан "1" ,1^2Х]998г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета

кандидат биологических наук Г.А.Наседкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Среди овощных культур морковь занимает одно из ведущих мест по своему хозяйственному значению. Большой ущерб урожаю корнеплодов моркови в период хранения наносят инфекционные заболевания, вызывающие гнили. В последние годы все большее распространение и вредоносность среди гнилей корнеплодов моркови в период хранения приобретает альтернариоз, вызываемый грибом Alternaria radicina Meier, Drechsler et Eddy. Показано, что возбудитель альтернариоза наиболее представлен среди гнилей корнеплодов при хранении (Федоренко,1986; Свиридов,19876; Иванюк и др.,1989; Яровой, 1991). Альтернариоз в период хранения корнеплодов может вызвать потерю хранящейся продукции до 70%. Особенно большой вред наносит альтернариоз семенникам моркови. В годы эпифитотийного проявления болезни на семенниках урожай семян снижается на 80-90% (Свиридов, 19876; Яровой, 1991).

Для разработки и совершенствования мер борьбы с инфекционными заболеваниями необходима информация о физиолого-биохимических изменениях в тканях растения под воздействием патогенов.

Важно проводить исследование реакций растения на ранних этапах патогенеза, когда детерминируется развитие устойчивости или восприимчивости к заболеванию.

Согласно многочисленным публикациям (Аверьянов,1991,1995; Иванова и др., 1991; Ильинская,ОзерецковскаяД991; Глумова и др.,1994; Пасечник и др.,1995; Sutherland, 1991; Chen et al.,1993; Kiialy et al.,1993), важную роль во взаимодействии растения и патогена играют активированные кислородные метаболиты. По данным Levine et aL (1994) и Mehdy (1994), именно активные формы кислорода служат трансмембранным сигналом, индуцирующим каскад иммунных реакций растения при контакте с патогеном. Содержание в клетке активированных кислородных метаболитов в значительной степени определяют ферменты пероксидаза (в оксидазной функции) и каталаза.

Мембраны наряду с клеточными стенками являются местом первичного взаимодействия растительной клетки с метаболитами патогена. Интегральным показателем структурно-функционального состояния биомембран является уровень перекисного окисления мембранных липвдов. Важную роль в ограничении патологии мембран клетки играет фермент глутатаонредуктаза.

Для решения проблемы обнаружения скрытой инфекции актуальным является поиск инструментальных методов, позволяющих регистрировать изменения в тканях растений на ранних стадиях развития заболеваний, до появления видимых симптомов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЙ. Целью настоящей работы было: выявить изменения фюиолого-биохимического состояния корнеплодов моркови, связанные с развитием заболевания альтернариозом в течение периода хранения. '

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать особенности окислительного метаболизма корнеплодов моркови на ранних этапах заболевания альтернариозом,

- оценить показатели окислительного метаболизма корнеплодов при заражении возбудителем альтернариоза в разные сроки периода хранения (начало, середина, конец),

- провести поиск инструментального метода, позволяющего обнаружить скрытые повреждения в тканях корнеплодов в инкубационном периоде заболевания.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Изучена динамика изменения активности ферментов окислительного метаболизма (пероксидазы, каталазы, глутатионре-дуктазы) и интенсивности перекисного окисления липидов корнеплодов моркови на ранних этапах заболевания альтернариозом в течение периода хранения. При этом впервые исследована активность ЫАОРН-оксвдазной функции пероксидазы в инкубационном периоде заболевания. Впервые в биологических исследованиях применен метод дериватографии и установлено, что этот метод позволяет детектировать присутствие пектолитических ферментов патогенных грибов в тканях растений.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты исследований конкретизируют физиолого-биохимичесжий аспект механизма формирования восприимчивости корнеплодов моркови к возбудителю альтернариоза, что должно быть учтено при разработке мер борьбы с этим заболеванием. Показана целесообразность изучения ЫАБРН-оксидазной активности пероксидазы в исследованиях по патогенезу растений, пораженных фито патогенами. Установлено, что метод дериватографии позволяет выявить скрытые повреждения, вызванные грибной инфекцией.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Результаты исследований были доложены на Региональном научно-пракшческом семинаре "Проблемы хранения и переработки плодоовощной продукции" (Ленинград, 1988), на Региональной конференции "Медико-биологические проблемы экологии Северо-Западного региона СССР" (Ленинград, 1990), на П съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), на Ш съезде Всероссийского общества физиологов растений (С.-Петербург,1993), на Всероссийском съезде по защите растений (С.-Петербург, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на страницах, включает 10 таблиц, 14 рисунков; состоит из введения, 4 глав и заключения. Список литературы включает 164 наименования, из них 82 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены литературные данные о болезнях корнеплодов моркови в период хранения, а также проанализированы сведения о физиологической роли ферментов окислительного метаболизма и процессе перекисного окисления лшшдов в патогенезе растений, пораженных фигопатогенами.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1. Объекты исследований

Объектами исследований служили корнеплоды моркови сортов Лосиноостровская 13 и НИИОХ 336, районированных в Ленинградской области, различающихся по лежкости и по степени восприимчивости к альтернариозу и штамм гриба Alternaria radicino № 515. Исследования проведены в 19881995 гг. на корнеплодах, выращенных в СЗНИНСХ "Белогорка". Корнеплоды, убранные во второй-третьей декаде сентября, закладывали на хранение в хранилище.

Исследования окислительного метаболизма зараженных корнеплодов выполнены в ВИЗРе, дериватографический анализ проведен на кафедре химии института торговли им. Энгельса.

Сорт Лосиноостровская 13 районирован в Ленинградской области с 1967 г. Лежкосгь - 71-78%. Пригоден для осенне-зимнего и весеннего потребления. Сорт средневосприимчив к альтернариозу и восприимчив к комплексу патогенов (Федоренко,1986; Сазонова,Власова,1990). Сорт приспособлен к хранению менее 150 суток. При более длительном хранении и наличии инфекции он подвергается сильному поражению альтернариозом (Выращивание моркови ...Д983; Сазонова и др.,1989; Кононков,Старцев, 1992).

Сорт НИИОХ 336 районирован в Ленинградской области с 1981 г. Лежкосгь - 82-92%. Пригоден для осенне-зимнего и длительного весеннего хра-

6 ,,, . нения (Выращивание моркови ...,1983; Кононков,Старцев, 1992). Сорт обладает практической устойчивостью к альтернариозу (Сазонова,Власова,19;90).

Заражение корнеплодов проводили чистой культурой гриба Alternaria radicina. Штамм возбудителя был ввделен из пораженных корнеплодов моркови, выращенных в Ленинградской области, сотрудником ВИЗР Г.А-Кононовой в 1988 г. и любезно предоставлен ею для наших исследований. Штамм передан в коллекцию культур микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии, где ему присвоен №515.

2.2. Методы исследований

Исследования проводили на протяжении всего периода хранения, с октября по май месяц включительно. Заражение осуществляли мицелием гриба A.radicina. Тщательно вымытые корнеплоды протирали спиртом и разрезали вдоль на две половины. Одну половину корнеплода использовали в качестве контроля. На поверхность корнеплодов наносили поранения путем соскабливания эпидермиса размером 5x5 мм, на которые в опытном варианте вносили кусочки мицелия гриба вместе с агаровой средой (3x3 мм). В контрольном варианте на место поранения наносили чистый агар. Обе половины корнеплодов накрывали простерилизованной фильтровальной бумагой, смоченной стерильной дистиллированной водой и помещали в разные полиэтиленовые пакеты (контроль и опыт). Зараженный и здоровый материал хранили при комнатной температуре. Одна аналитическая повторность составляла в среднем 7-9 корнеплодов. Для работы использовали прилегающую к месту заражения ткань шириной 3-4 мм. Исследования проводили через 24, 48, 72 часа после заражения, то есть о инкубационном периоде заболевания и при появлении его видимых симптомов.

Оксидазную активность пероксидазы определяли по окислению NADPH (Mudd,Burris,1959); пероксидативную активность - по скорости окисления гваякола (Galston et al.,1953). Уровень перекисного окисления липидов определяли цо методике, предложенной Андреевой и др. (1988). Активность ката-лазы определяли по методу Королюк и др. (1988), активность глутатиовре-дукгазы - по методике, описанной Edwards et al. (1990).

В целях адекватной оценки структурно-функционального состояния тканей корнеплодов активность пероксидазы и глутатионредуктазы определяли в двух различных по локализации формах ферментов - цитоплазматиче-ской и мембраносвязанной.

Определение белка проводили по методу Lowry et al. (1951).

Дериватографический анализ тканей корнеплодов при заражении возбудителем альтернариоза был выполнен на дериватографе "Q-1000 Paulic, Paulic, Erdci" производства Венгрии. Дериватограф осуществляет нагрев испытуемого образца с одновременной графической записью работы датчиков прибора.

Глава 3. ВЛИЯНИЕ ЗАРАЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕМ АЛЬТЕРНАРИОЗА НА ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ МЕТАБОЛИЗМ КОРНЕПЛОДОВ МОРКОВИ В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ

3.1. Изменение активности КАБРН-оксидазной и пероксидативной функций пероксидазы

Роли пероксидазы в защитном механизме растений против инфекции придается большое значение, о чем свидетельствует большое количество постоянно появляющихся публикаций, посвященных этой проблеме. Псрокси-дазе отводят важное место в поисках и разработке тестов оценки функциональной активности иммунных реакций растительного организма (Роговин и др.,1987; Андреева,1988; Юрина и др.,19936; МоггеШ е1 а1.Д994). Используя пероксвдазу в качестве маркера, исследователи пытаются найти подходы для диагностики устойчивости к патогенам различных сельскохозяйственных культур. Однако до настоящего времени авторы проводимых исследований по патогенезу растений изучают преимущественно пероксидативную функцию пероксидазы, оксидазная же функция, которой в свете свободнорада-кальной теории иммунитета принадлежит важная роль в защите растений от фитопатогенов, остается вне поля их зрения. В результате пероксидазного окисления восстановленных пиридиинуклеотвдов с использованием молекулярного кислорода генерируются активированные кислородные метаболиты, инициирующие цепь защитных реакций и обладающие циготоксическим антимикробным действием. Сопоставление активности двух разных функций пероксидазы позволит более полно охарактеризовать участие этого фермента в защитном механизме растения, подвергнувшегося нападению патогена.

Нами была впервые изучена динамика МАОРН-оксидазной активности пероксидазы на ранних стадиях заболевания, до появления видимых симптомов.

Обнаружено, что заражение корнеплодов моркови возбудителем альтер-нариоза вызывало подавление оксидазной функции пероксидазы в прилегающих к внесенному мицелию тканях. Подавление ИАОРН-оксидазной активности пероксидазы наблюдали у корнеплодов обоих исследуемых сортов до появления видимых симптомов заболевания на протяжении всего периода хранения (табл. 1 н 2).

Для сравнения было проанализировано также изменение активности пероксидативной функции пероксидазы. Выявлено, что ингибирование оксидазной функции фермента сопровождается возрастанием пероксидативной активности.

Из представленных результатов следует, что изменение активности изученных функций пероксидазы происходило неравномерно у цитоплазм атиче-ской и мембраносвязавной форм фермента.

Таблица1. Влияние заражения возбудителем альтернариоза на NАВРН-оксвдаз ную активность пероксадазы корнеплодов моркови сорта Лосиноостровская 13 (единнцы/мин/мг белка)

Период

Время после заражения, час

24

48

72

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Цитоплазматическая боома ¡Г,' 1

Октябрь-Ноябрь 5.25 ±0.11 4.20 ±0.16 5.14 ±0.24 3.64 ±0.29 5.01 ±0.15 2.71 . ±0.22

Январь-Февраль 4.16 +0.12 2.89 ±0.09 3.96 ±0.11 1.94 ±0.09 4.05 ±0.20 1.25 ±0.07

Апрель-Май 4.75 ±0.11 3.02 ±0.19 4.70 ±0.16 1.85 ±0.11 4.52 ±0.19 0.95 ±0.05

Мембраносвязанная форма

Октябрь-Ноябрь 9.15 ±0.17 9.11 ±0.20 9.33 ±0.17 8.69 ±0.21 8.90 ±0.16 6.76 ±0.21

Январь-Февраль 9.18 ±0.31 8.61 ±0.37 8.95 ±0.27 6.50 ±0.21 9.01 ±0.15 4.53 ±0.25

Апрель-Май 3.59 ±0.22 Л.93 ±0.18 3.63 ±0.17 1.15 ±0.07 3.50 ±0.19 0.57 ±0.03

В первые недели хранения через 48 часов после внесения мицелия гриба происходило подавление оксидазной активности циггопдазматической формы пероксидазы в 1.4 раза по сравнению с незараженным контролем у обоих сортов, в то время как активность мембраносвязанного фермента оставалась практически на уровне контроля.

Среди механизмов регуляции активности ферментов клеточного метаболизма особое место занимает сложный механизм изменения положения равновесия между ферментом, локализованным в цитоплазме и ферментом, связанным с клеточными структурами.

Исследование каталитической активности различных по локализации форм фермента - цитоплазмагической и мембраносвязанной, - позволяет получил» важную информацию при изучении процессов, происходящих в. тканях на ранних стадиях развития заболеваний. Токсины патогенов способны вызвать изменения нативной конформации молекул ферментов, модификацию их специфических функциональных групп, необходимых для проявления каталитической активности, а также специфические изменения мембран, связанные с нарушением компартментации ферментов и выходом их в цито-золь (Мерзляк, 1989; Логинова и др., 1991).

Таблица 2. Влияние заражения возбудителем альтернариоза на ИАБРН-оксидазиую активность пероксндазы корнеплодов моркови сорта НИИОХ 336 (единицы/мин/мг белка)

Время после заражения, час

Период 24 48

хранения.

72

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Цигоплазматическая форма Октябрь- 6.60 5.46 6.78 4.94 6.68 4.07 Ноябрь ±0.25 ±0.21 ±0.22 ±0.20 ±0.27 ±0.20

Январь-..... 7*56.......5.94.......7.49........4.60........7.70...... 3~39~

Февраль ±0.19 ±0.28 ±0.27 ±0.25 ±0.21 ±0.24

Апрель"-......'9.36.......6.65........9.23........4.89........9.41......Т53~

Май ±0.33 ±0.30 ±0.35 ±0,25 ±0.39.....±0.16

Мембраносвязанная форма Октябрь- 12.50 12.34 12.50 11.84 12.24 10.28 Ноябрь ±0.41 ±0.30 ±0.41 ±0.31 ±0.33 ±0.35

Январь-......10.26.......9.17.......9.96........7.43.......Уо~12.....5 ~9 8"

Февраль ±0.24 ±0.29 ±0.39 ±0.35 ±0.24 ±0.33

Апрель-......'7.55 5~20'~......7.46........3.86........7.39......2~80~

Май ±0.20 ±0.20 ±0.26 :Ш.30 ±0.26 ±0.16

В середине периода хранения, в январе-феврале, подавление ЫАВРН-оксидазной активности пероксидазы у обоих исследуемых сортов было более существенным, чем в осенние месяцы. Через 48 часов после заражения, до появления видимых симптомов заболевания, уменьшилась активность и ци-топлазматической, и мембраносвязанной форм фермента, что свидетельствует о снижении прочности мембран корнеплодов.

В конце периода хранения иягибирование МАОРН-оксидазной активности пероксидазы при заражении возбудителем альтернариоза было наиболее значительным у обоих исследуемых сортов. Уже через 24 часа после заражения активность щггоплазматической формы фермента у корнеплодов сорта Лосиноостровская понизилась в 1.6 раза, активность мембраносвязанной формы - в 1.9 раза по сравнению с незараженным контролем. У сорта НИИОХ подавление оксидазной активности обеих форм пероксидазы было более слабым - в 1.4 раза. Таким образом, физиологические различия разных по лежкости и по степени восприимчивости к альтернариозу сортов проявляются уже на ранних стадиях развития заболевания.

Активность пероксидегавной функции пероксидазы в инкубационном периоде заболевания значительно возрастала на протяжении всего периода хранения.

В настоящее время нет однозначного ответа на вопрос, один ли активный центр пероксидазы катализирует пероксидативную и оксидазную функции, или существуют разные активные центры. Результаты нашей работа подтверждают предположение о существовании двух активных центров. Этим можно объяснить одновременное противоположное по направленности изменение активности двух функций фермента - подавление оксвдазной и возрастание пероксидативной.

Результаты наших исследований свидетельствуют, что устойчивость или восприимчивость растения к заболеванию может быть связана не с пероксидативной, а с оксидазной активностью пероксидазы. Возможно, ингибирова-ние этой функции пероксидазы, регулирующей наряду с некоторыми другими ферментами уровень активированных кислородных метаболитов в тканях, является одной из причин восприимчивости корнеплодов моркови к заболеванию альтернариозом.

3.2. Динамика активности каталазы при заражении корнеплодов моркови на протяжении периода хранения

Каталазе принадлежит важное место в комплексе антиокислительных ферментов, определяющих взаимоотношения растения и паразита. Антиокислительная функция каталазы обеспечивается разложением ею пероксида водорода и предотвращением реакции Габер-Вайса, в результате которой образуется чрезвычайно реакционноснособный, высокотоксичный падро-ксил-радикал (Осипов и др.,1990; Меныцикова, Зенков,1993). В работах многих авторов доказано участие пероксида водорода и гидроксильного радикала в фунгитоксичности, которая полностью предотвращается нативной катала-зой (Аверьянов,Лапикова, 19886; Пасечник и др.,1995; Кйа1у е1 а1.,1993).

Заражение корнеплодов моркови возбудителем альтернариоза вызывало возрастание активности каталазы в середине и конце периода хранения, о чем свидетельствуют данные, представленные на рисунке 1.

Результаты нашей работы подтверждают точку зрения (ЕйгеуаД989), что при несовместимом типе взаимодействия растения и патогена происходит снижение активности каталазы в тканях хозяина, а в случае восприимчивости активность каталазы существенно возрастает.

В первые недели после уборки корнеплодов уровень каталитической активности каталазы при искусственном заражении практически не изменялся у обоих изучаемых сортов.

Сохранение активности каталазы молодых корнеплодов после заражения на нативном уровне, по-видимому, обусловлено тем, что они обладают определенным потенциалом устойчивости к заболеванию. Для того, чтобы противостоять внедрению инфекции, растению необходимо поддерживать естественную концентрацию активированных кислородных метаболитов, если по тем или иным причинам заблокирована их пшерпродукция.

А Кат

Сорт Лосиноостровская 13

140 -| 120 -100 -80 -60 -40 -20 0

Ж

Н|

л:

1 V,

г!

24 48 72

Октябрь

24 48 72

Январь-Февраль

24 48 72

Апрель-май

□ Контроль

□ Опыт

А Кат

Сорт НИИОХ336

120 100 80 60 40 Н 20

1+Й

&

г+

1

4

г+1

24 48 72

Октябрь

24 48 72

Январь-Февраль

24 48 72

Апрель-май

□ Контроль

□ Опыт

Рис.1. Изменение активности каталазы (Кат, ммоль НгОг/мин/мг белка) при заражении возбудителем альтернариоза корнеплодов моркови в процессе хранения (1 - часы после заражения)

4-

Повышение активности каталазы, выявленное при заражении корнеплодов моркови в середине и конце периода хранения, приводит к снижению в тканях корнеплодов содержания форм активного кислорода и, тем самым, к ослаблению защитных реакций.

В январе-феврале заражение возбудителем альтернариоза вызывало повышение уровня активности каталазы по сравнению с незараженным контролем как у корнеплодов сорта Лосиноостровская 13, так и у корнеплодов сорта НИИОХ 336. Через 48 часов после внесения инфекции, до появления видимых симптомов заболевания, активность фермента в тканях, прилегающих к месту заражения, возросла в 1.3 раза у сорта Лосиноостровская и в 1.2 - у сорта НИИОХ.

Наиболее значительное увеличение активности каталазы в ответ на заражение происходило в конце хранения, причем у корнеплодов сорта Лосиноостровская, сильно поражаемых весной альтернариозом, активность фермента при заражении возрастала в большей степени, чем у более лежкого и менее восприимчивого к альтераариозу сорта НИИОХ.

Известно, что по мере увеличения продолжительности хранения овощей возрастает их восприимчивость к гнилям (Бэргон,1985). Обнаруженная нами динамика изменения активности каталазы при заражении корнеплодов моркови на протяжении периода хранения подчеркивает роль этого фермента в определении восприимчивости хозяина к патогену.

3.3. Изменение уровня перекисного окисления липидов

Среди критериев физиологического состояния растений, несомненно, особого внимания заслуживает свободнорадикальное окисление липидов, которое оказывает регулирующее воздействие практически на все стороны метаболизма клетки.

Представляло интерес выяснить, изменяется ли уровень перекисного окисления лнпидов (ПОЛ) в тканях восприимчивых к альтериариозу корнеплодов моркови до появления видимых симптомов заболевания. Выявлено, что на ранних этапах заболевания в тканях корнеплодов обоих исследуемых сортов происходило усиление пероксидации липидов (табл.3).

Интенсификацию ПОЛ при заражении корнеплодов наблюдали на протяжении всего периода хранения, но наибольшее возрастание этого показателя происходило в весенние месяцы. В апреле-мае заражение вызывало усиление пероксидации липидов в корнеплодах у сорта Лосиноостровская 13 через 72 часа после внесения инфекции почти в два раза, в корнеплодах сорта НИИОХ 336 - в 1.7 раза по сравнению с контролем, то есть у корнеплодов сорта НИИОХ происходило менее выраженное усиление ПОЛ. Возможно, сильная поражаемость весной корнеплодов сорта Лосиноостровская альтернариозом обусловлена, в числе прочих факторов, значительной лабилизацией мембран хранящихся корнеплодов и глубокими окислительными повреждениями мембран при контакте с метаболитами патогена.

Таблица 3. Уровень перекнсного окисления липидов корнеплодов моркови, зараженных возбудителем альтернариоза (нмоль МДА/г сырой массы ткани)

Период

Время после заражения, час

24

48

72

Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Сорт Лосиноостровская 13

Октябрь- 23.2. 28.8 22.1 30.9 23.7 37.6

Ноябрь ±1.3 ±1.6 ±1.1 ±2.4 ±1.6 ±3.2

Январь- 24.7 30.5 23.8 35.4 25.6 42.4

Февраль ±2.1 ±2.4 ±2.1 ±2.9 ±1.6 ±2.9

Апрель- 62.8 89.7 63.6 103.8 62.5 122.6

Май ±4.6 ±6.3 ±4.5 ±8.7 ±4.5 ±9.7

Сорт НИИОХ 336

Октябрь- 26.4 30.3 26.9 33.1 26.7 37.4

Ноябрь ±1.9 ±1.5 ±1.6 ±2.1 ±2.1 ±2.8

Январь-Февраль 29.2 ±1.5 34.7 ±2.4 29.6 +2.1 38.7 ±2.7 30.0 ±2.1 43.7 ±3.1

Апрель-Май

49.4 ±2.7

62.8 ±4.7

48.3 ±3.0

70.6 ±5.4

50.1 ±3.2

87.4 ±8.0

Вероятно, усиление процесса пероксддации мембранных лилццов на ранних стадиях совместимого взаимодействия, примером которого может быть система корнеплоды моркови - возбудитель альтернариоза, может играть роль промотора развития заболевания.

3.4. Активность глугатионредуктазы корнеплодов моркови, зараженных возбудителем альтернариоза

Участию глугатионредуктазы в "окислительном взрыве", имеющем место у устойчивых растений при действии различных экстремальных факторов абиотического характера, уделяется большое внимание. Роль глутатиовре-дукгазы в патогенезе заболеваний изучена значительно меньше. Изучение активности глугатионредуктазы при заражении возбудителем альтернариоза представляется необходимым потому, что этот фермент, входящий в категорию эндогенных антиоксидангов, является важным мембранопротекгором. Исследование интенсивности перекисного окисления липидов зараженного растения целесообразно сочетать с исследованием динамики активности глу-татионредукгазы, играющей важную роль в ограничении деструктивного действия ПОЛ.

Результаты влияния заражения возбудителем альтернариоза на активность глутатионредуктазы корнеплодов моркови сортов Лосиноостровская 13 и НИИОХ 336 представлены в таблице 4 и на рисунке 2.

Таблица 4. Активность цитоплазматической формы глутатионредуктазы корнеплодов моркови, зараженных возбудителем альтернариоза (нмоль ЫАОРНДпш/мг белка)

Время после заражения, час

Период ---

хранения__II_22_

_Контроль Опыт Контроль Опыт Контроль Опыт

Сорт Лосиноостровская 13

Октябрь- 39.06 32.78 38.75 19.97 38.00 11.69

Ноябрь ±1.18 ±1.24 ±1.24 ±1.18 ±0.81 ±0.50

Январь- 27.18 20.15 27.18 13.62 25.81 5.85

Февраль ±1.31 ±1.43 ±1.31 ±1.00 ±0.87 ±0.50

Апрель- 33.59 21.27 34.71 13.44 34.15 2.24

Май ±1.80 ±1.49 ±1.80 ±0.87 ±0.93 ±0.00

Сорт НИИОХ 336

Октябрь- 44.78 39.31 43.66 26.31 45.10 20.22

Ноябрь ±1.74 ±2.24 ±1.74 ±2.49 ±1.87 ±1.68

Январь- 39.06 27.55 37.63 19.78 36.82 11.76

Февраль ±1.87 ±1.87 ±1.06 ±1.18 ±0.81 ±0.87

Апрель- 33.46 20.28 33.77 14.68 31.66 6.72

Май ±0.50 ±1.68 ±1.12 ±0.87 ±1.43 ±0.62

Обнаружено, что заражение возбудителем альтернариоза вызывало ин-гибирование глутатионредуктазы как у корнеплодов сорта Лосиноостровская 13, так и у корнеплодов сорта НИИОХ 336.

На протяжении периода хранения постинфекционное ингибирование глутатионредуктазы зараженных корнеплодов прогрессировало. В начале периода хранения активность глутатионредуктазы у обоих исследуемых сортов подавлялась в меньшей степени, чем в последующие месяцы.

Ингибирование активности глутатионредуктазы под влиянием заражения возбудителем альтернариоза в конце периода хранения было наиболее сильным, при этом подавление активности фермента у корнеплодов более лежкого и менее восприимчивого к альтернариозу сорта НИИОХ 336 было не столь выражено, как у корнеплодов сорта Лосиноостровская 13. Так, через 24 часа после заражения активность фермента у корнеплодов сорта Лосиноостровская понизилась по сравнению с контролем в 1,6 раза в цитоплазме и в 1.9 - в мембранной фракции. У корнеплодов сорта НИИОХ активность фермента и в цитоплазме, и во фракции мембран понизилась в 1.6 раза.

АГР

Сорт Лосиноостровская 13

80 70 60 -5040 30 -20 -10 -

гЬ

гЬ •

гЬ

к

к

I "* I

24 48 72

I " "Г "" I

24 48 72

I ** ! "I 1 I 1

24 48 72

Октябрь-ноябрь Январь-Февраль Апрель-май

□ Контроль □ Опыт

АГР

100 904 80 70 60 50 -40 -30 -20100

гЬ

л

Сорт НИИОХ336

гЬ

к

41

41

гЬ

24 48 , 72

Октябрь-ноябрь

24 48 72

Январь-Февраль

24 48 72

Апрель-май

□ Контроль

□ Опыт

Рис.2. Изменение активности мембраиосвязанной формы глутатноиредуктазы (ГР, нмоль NАОРН/шш/мг белка) при заражении возбудителем альтернарноза корнеплодов моркови в процессе хранения 0 - часы после заражения)

I

Вероятно, способность тканей корнеплодов сорта НИИОХ 336 в конце периода хранения сохранять более высокую активность глутатионредукгазы обеспечивает им и более высокий уровень восстановленного глутатиона, который, являясь протектором и стабилизатором мембран, ограничивает развитие деструктивных изменений мембранных структур, в том числе перекисное окисление липидов.

Сопоставление результатов изменения активности глутатионредукгазы и уровня перекисного окисления липидов свидетельствует, что в корнеплодах моркови на ранних стадиях развития альтернариоза усиление процесса ПОЛ сопровождается инактивацией глутатионредукгазы. Такая скоординированная модификация биохимических параметров, определяющих функциональное состояние клеточных мембран, позволяет предположить, что деструктивные изменения мембранных структур являются важной предпосылкой для успешной колонизации патогеном тканей корнеплодов. Для этого патогену необходимо заблокировать внутриклеточную защиту мембран от повреждающего действия перекисного окисления липидов, что и обеспечивается инактивацией глутатионредукгазы. Вероятно, специфическое действие токсина гриба А.гасИапа проявляется в интенсификации ПОЛ и ннгибировании каталитической активности глутатионредукгазы.

Глава 4. ДЕРИВАТОГРАФИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРНО-БИОХИМИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ ТКАНЕЙ КОРНЕПЛОДОВ МОРКОВИ, ЗАРАЖЕННЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕМ АЛЬТЕРНАРИОЗА

Клеточные стенки - это первый "оборонительный барьер", который стоит на пути проникновения патогенов в клетку. Фитопатогенные микроорганизмы секретируюг в растениях экстрацеллюлярные ферменты, способные разлагать все полимеры, входящие в состав растительной клеточной стенки. Таким образом, при колонизации растения фитопатогенным микроорганизмом клеточные стенки растения-хозяина претерпевают сложные биохимические изменения.

Дериватография, как разновидность термического анализа, является чувствительным методом индикации физико-химических изменений состояния исследуемого объекта.

Сущность термографии заключается в изучении фазовых превращений, совершающихся в системах или индивидуальных веществах, по сопровождающим эти превращения тепловым эффектам.

Дериватограф производит одновременное измерение температуры, изменения массы и скорости изменения энтальпии исследуемого образца. Протекание термических превращений испытуемых проб определяется их теплопроводностью и теплоемкостью (Берг, 1969).

Нами впервые был проведен дериватографический анализ тканей корнеплодов моркови, зараженных возбудителем заболевания. Ранее этот метод для изучения скрытых повреждений тканей растений не применялся.

Согласно результатам, представленным в таблице 5, развитие процесса заболевания альтернариозом корнеплодов моркови обоих исследуемых сортов сопровождалось уменьшением глубины пика ОТС-П на кривой дифференциально-термогравиметрического анализа, соответствующего второму тепловому эффекту, вплоть до его полного исчезновения через 72 часа после заражения. Через 48 часов, до появления видимых симптомов заболевания, глубина этого пика у зараженных корнёплодов и сорта Лосиноостровская 13, и сорта НИИОХ 336 уменьшалась в среднем в 2.3 раза по сравнению с контролем.

Таблица 5. Глубина пика ОТв-П на дериватограммах корнеплодов моркови, зараженных возбудителем альтернариоза (мм)

Вариант

Время после заражения, час

24

48

72

Контроль

(здоровые)

Опыт

(зараженные)

Контроль (здоровые) Опыт (зар

Сорт Лосиноостровская 13

5.67 ±0.52 5.57 ±0.53 5.71 ±0.49

4.40 ±0.55 2.40 ±0.55 0

Сорт НИИОХ 336.

4.40 ± 0.55 4.60 ±0.55 4.50 ±0.55

3.40 ±0.55 2.00 ±0.00 0

Известно, что при заражении корнеплодов моркови альтернариозом грибница развивается сначала в межклетниках, затем проникает в клетки (Сазонова,Власова, 1990). Межклеточное продвижение связано с разрушением срединных пластин, соединяющих клетки, а внутриклеточное - с разрушением клеточных стенок, прежде всего с распадом в них пектиновых веществ, которые являются естественным субстратом пекголитических ферментов. Нами было сделано предположение, что уменьшение и исчезновение пика ШСг-П на кривых дериватограмм зараженных корнеплодов связано с деятельностью пекголитических ферментов паразита.

Для проверки этого предположения был проведен дополнительный эксперимент: ткани корнеплодов обрабатывали 0.25% раствором пектомацерина в течение 24 часов. Дериватограммы обработанных таким образом тканей корнеплодов были идентичны дериватограммам корнеплодов с 72-часовым сроком заражения, то есть на них отсутствовал пик ОТС-П.

Результаты этого эксперимента подтверждают, что исчезновение на дериватограммах пика, соответствующего второму тепловому эффекту, при

заражении корнеплодов моркови возбудителем альтернариоза, связано с разрушением пектинового матрикса клеточных стенок под действием пеюголи-тических ферментов гриба А.га<Иша.

Таким образом, уменьшение н исчезновение пика ЕШЗ-П на деривато-граммах зараженных корнеплодов является наглядной иллюстрацией ультраструктурных и биохимических изменений, происходящих в тканях корнеплодов моркови на ранних этапах заболевания. Метод дериватографии, позволяющий выявить такие изменения до появления видимых симптомов, прост в исполнении и не связан с проведением гистохимических и биохимических анализов.

Метод дериватографии применяется для товароведной оценки продовольственной продукции в институте торговли имени Энгельса.

ВЫВОДЫ

1. Развитие заболевания корнеплодов моркови альтернариозом, вызываемое грибом АЬетапа гасйапа, сопровождается модификацией активности ферментов (ингибированием оксидазной функции пероксидазы и активацией каталазы), определяющих уровень содержания активированных кислородных метаболитов, в сторону его понижения.

2. Появлению видимых симптомов заболевания предшествует возникновение окислительной патологии мембран, сопряженное с инактивацией глутати-онредукгазы, - эндогенного мембранопротектора.

3. Степень изменения показателей окислительного метаболизма под влиянием заражения зависит от возраста хранящихся корнеплодов. В начале хранения эти изменения были наименее выраженными за весь период исследований, в конце хранения - наиболее значимыми.

4. При старении корнеплодов в процессе хранения происходит перераспределение каталитической активности пероксидазы и глутатионредукгазы между цитоплазматической и мембраносвязанной формами ферментов. В начале периода хранения фермента находятся преимущественно в связанной с мембранами форме, в конце хранения возрастает доля цитоплазматической формы ферментов, что свидетельствует о лабилизации мембран стареющих корнеплодов.

5. Изученные сорта корнеплодов моркови Лосиноостровская 13 и НИИОХ 336 различаются между собой по интенсивности изменения исследованных показателей окислительного метаболизма при заражении возбудителем альтернариоза, что особенно четко проявлялось в конце периода хранения. Заражение вызывало более значительные изменения исследованных показателей у менее лежкого и более восприимчивого к альтернариозу сорта Лосиноостровская 13.

6. Метод дериватографии позволяет выявить на ранних этапах заболевания скрытые структурно-биохимические изменения в тканях корнеплодов моркови, вызванные воздействием патогенного гриба А. гасИста.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При разработке тестов на устойчивость растений к заболеваниям следует учитывать активность ЫАЕ)Р-оксидазной функции пероксидазы.

2. Метод дернватографии рекомендуется для использования в качестве инструментального экспресс-метода индикации скрытых изменений в тканях растений, вызванных грибной инфекцией.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Барсуков А.В., Ульмаскулова Т.Д. (Соколова) Применение метода дернватографии для диагностики фитосанитарного состояния корнеплодов моркови//Бюллетень ВИЗР. - 1988,-№72,- С.59-61.

2. Барсуков А.В., Ульмаскулова Т.Д. Определение фитосанитарного состояния корнеплодов моркови методом дернватографии// Региональный научно-практический семинар "Проблемы хранения и переработки плодоовощной продукции" (26-27 апреля, 1988, Л.): Тезисы докладов. - Л., 1988. - С.38.

3. Логинова Л.Н., Карчик О.Н., Карпова Л.М., Ульмаскулова Т.Д., Кононова Г.А. Микотоксины, пестициды и нитраты в сельскохозяйственных растениях// Региональная конференция "Медико-биологические проблемы экологии Северо-Западного региона СССР" (29-31 мая, 1990, Л.): Тезисы докладов.-Я, 1990.-С.55.

4. Логинова Л.Н., Волокигина М.В., Карпова Л.М., Каганская В.В., Ульмаскулова ТД Окислительные системы сельскохозяйственных растений при патогенезе и хранении// П съезд Всесоюзного общества физиологов растений (24-29 сентября, 1990, Минск): Тезисы докладов. - М., 1990. - С.54.

5. Древаль Г.М, Егорова Г.Л., Карпова Л.М., Карчик О.Н., Логинова Л.Н., Соколова Т.Д. Роль свободнорадикального окисления в регуляции не-таболизма растений// Ш съезд Всероссийского общества физиологов растений (24-29 июня, 1993, С.-Петербург): Тезисы докладов. С.-Пб., 1993. - С.97.

6. Соколова Т.Д О возможности ранней диагностики альтернариоза корнеплодов моркови на основе комплекса показателей окислительного метаболизма// Всероссийский съезд по защите растений. Защита растений в условиях реформирования агропромышленного комплекса: экономика, эффективность, экологичность (4-9 декабря, 1995, С.-Петербург): Тезисы докладов. - С.-Пб., 1995. - С.88-89.

7. Соколова Т.Д., Логинова Л.Н. Окислительный метаболизм корнеплодов моркови при заражении возбудителем альтернариоза в период хранения// Бюллетень ВИЗР. - 1998. (в печати).

8. Соколова Т.Д, Барсуков А_В. Дериватотрафический метод диагностики скрытых повреждений тканей корнеплодов моркови, вызванных возбудителем альтернариоза// Бюллетень ВИЗР. -1998. (в печати).

Научное издание Отпечатано на дубликаторе ООО "ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ" ВИЗР 95 120