Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические механизмы микробиологической деструкции лигнина

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические механизмы микробиологической деструкции лигнина"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ1УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ВОЛЧАТОВА Ирина Владимировна

ФЙЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДЕСТРУКЦИИ ЛИГНИНА

03.00.18 - гидробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологичест наук

Иркутск - 1991

Б ОД

СЕН 19Г*:

Работа выполнена в Иркутском института органической киши 00 РАН

Научные руководители: .диктор химических наук

3.А.Бабкин,

лшндвд^т химических наук, старший научный сотрудник о.¿.Медведева

•фщиальныа ошоненты: доктор биологических наук

к ЛЬ Огарков,,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник ;{.Ф. Кашина

¡идущее учреждение: Сибирский институт физиологии у. биохимии растений СО РАН

Защита состоится"*'?2 " /994 г. в__час на заседании

■ ¡аециалиг тровошого совета К.063.32.03 при Иркутском государственном университете па адресу: 364000, Иркутск, уд. Сухэ-Батора» 5

диссертацией.,. мокко ознакомиться в Научной библиотека '.•¡ркутского государственного университета

Автореферат разослан 994 г.

¿'¡еннй секретарь спзциализиоованного .

сжата, к.б.и. Е.С.Купчмасх-.и

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В результате нерационального использования природных ресурсов и многолетней деятельности промышлен-нш предприятий, не снабженных достаточно эффективными средствами утилизации токсичных отходов, загрязнение окружающей среды р последнее время приобрело характер биосферного процесса. В частности, только за 1992 ^од предприятиями деревообрабатывающей отрасли Иркутской области было сброшено 483 млн. сточных вод. в том числе без очистки 100.9 млн. м", недостаточна очищенных 37в млн, Со сточными водами поступило 5.08 тонн фенолов, 77.3" тнс. тонн хлоридов. Контроль за содержанием лигншных веществ п стоках из-за противоречивых данных об ю токсичности в водной среде практически не ведется, хотя лигнин - один из основных компонентов стоков ЦБП. В свяп; с этим остро встает вопрос о разработке и внедрении новых, .экологически чистых технология у эффективных методов очистки сточных вод.

Среди существующих методов очистки наиболее эффективны оиг> логические. однако неспособность активного ила утилиз1фовать 'ряд токсичных ароматических соединений и лигнина яв.'тется уязвимы!-местом этого метода. В целлюлозно-бумажной промышленности пег? спективинм направлением может ст.эть использование- в процесса; обеспечивания и очистки сточных вод лигнинразруятюяш: гриоох т.к. ого! способны эффективно разлагать фенолы и технические лш юпш, хорошо размножаются в водных средах и не являются патогеь иымк. Успешное внедрение биологических счадай невозможно бе-разработки теоретически* подходов к механизму оиоразлокения лиг нина и фенолов в различных условиях среди. Кроме того, панпм-.гач-Физиологии индивидуальных потребностей культуры ..позволяет полис

исследовать лигнинолитическую систему ми.фоорганизма-делщ'яифи-катара с целью ее наилучшего использова.шя в охране водных зко-иистем.

Цель и аьдачи исследования. Целью настоящей работы было исследование лиггашолитической системы малоизученных базидиомице-тов Trametее villosus и Phanerochaete sanguínea и механизмов биохимических преврв^зний ими лигнина и фенольных соединений. Для достижения атой цели были поставлена следующие задачи:

- исследование механизма биотрансформации лигнина и фенольных соединений грибами Т.villosus и Р.sanguínea;

- изучение состава внеклеточных ферментных комплексов' грибов;

- исследование регуляции синтеза лигниназы грибами изменением биогенных факторов среда;

- изучение возможности использования базидаальных грибов для обесцвечивания и очистки сточных вод.

Научная новизна работы. Отобраны макроорганизмы, ранее малоизученное (T.villotíus и Р.sanguínea), по способности эффективно разрушать лигнин. Исследован состав йх лигнинолитических ферментных комплексов. Впервые в составе ферментного комплекса Р.sanguínea обнаружено присутствие лигниназы и Mn-зависимой па-роксидазы. Показана возможность регуляции синтеза ферментов губами путем изменена состава питательной среда. С помощью высо-

1 13

'колнформмтрвдах методов - ВЭЖХ и спектроскопии ЯМР Н и С -исследован механизм биотрансформации на-ывного лигнина и моделирующих его фенольных соединений -базидиомицетами Т.villosus и Р.sanguínea. На основе результатов этого исследования излажены представления -о процессе деструкции лигшша Зшгнинразрушающими грибами. Показана способность грибов Т.villosus и Р.sanguínea обесцвечивать стоки целлюлозно-бумажного комбината.

4

Практическая значимость работь. Настоящая работа выполнена в рамках государственной научно-технической программы по приоритетному направлению развития науки'и техники на 1590-1994 гг. 10." Новые материалы и вещества - основа создания нового поколения техники, технологии и решения специальных задач" по теме 10.1.4.3, "Исследование электрохимических, биохимических и электробиохимических реакций макрокоюонентоБ древесины" (Н гос. регистрации 018601096951. Выяснение механизма бисдеструкцки фе-нольных соединений и лигнина культурами Т.т11.'чэив и пеа, проведенное в работе, является предпосылкой использованию грибов и продуцируемых ими ферментов для очистки сточных вод* ЦБП. Возможн' сть применения базидиомицетов в этих целях вытекает из их биохимических особенностей: с одной стороны, за счет способности разлагагь лигнин до низкомолекулярных звеньев и далее - до СО^, с другой стороны, за счет полимеризации фенолсодержащих остатков с последующим осаждением полимера. Кроме того, выявленные физиологические потребности культур дают возможность максимально использовать их лигьолитическую систему. Результаты экспериментов использованы в научно-исследовательской работе в лаборатории биотехнологии природных соединений ИНУС (акт о внедрении от 5.05.1994).

Апробация заботы. Результаты исс.;едовапий докладывались и обсуягались на 3 научном семичаре "Превращения древесины при эн-зиматическом и микробиологическом воздействиях" (Рига, 1983г.) и 7 Всесоюзном симпозиуме "Инженерная энзимовогия" (Москва,1991г.).

Пуб.чкации. Но материалам диссертации опубликовано 12 научных работ в центральной и международной печати.

Структура и ?бЪем диссертации. Работа изложена на 224 с границах машинописного текста и состоит из введение, обзора литера-

туры, 4 глаз pacora,: включающих описание оЪектов исследования и методики эксперимента, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводов, списка использованной литературы и приложения. Список литературы включает 212 источников, из них 148 работ зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 таблицами, 52 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА

В работе использовали базидшальные грибы Phanerochaete sanguínea (Fr.) Bres. BKMF-2487D (предоставлен д.б.н. В.А'.Соловье-вым, ЛТА, г.Санкт-Петербург), Trametes (Coriolus) , vlllosua (Lloyd), Kreisel 0276 и Phanerochaete clu-yeosporlum ATCC 24725 (ВНП0 Гидролизпром, г.Санкт-Петербург). Культуры выращивали в среде Кирка (Klrk et al., 1978).

Высокоэффективную- жидкостную хроматографию проводили на хроматографе Милихром-1 на колонке, заполненной сорбентом Slla-eorb 7-С. g или Nucleosil 5-С^. Элюентом служили 10-70% раствори метанола в Q.01 U фосфатном буфере с pH 4.3. Детектирование осуществляли при А. 280 нм. Гель-хроматографию проводили на хроматографе Миллхром-4 на колонке с сорбентом Separan Нета S-100. В качестве элюонта использовали диметилформамид с доСавлением 0.03

М ЫВг и 0.03 М ILPO^. Продукты регистрировали при Л280 и 350 нм. ^к 1 1 ч

Спектроскопию ЯМР Н и С осуществляли на спектрометре Вги-ker WP-200SY. ПК-спектры снимали на спектрофотометре Specord М82.

Электронно-микроскопическое исследование образцов древесины осшш и лиственницы осуществляли на электронном микроскопе Philips SEM 525Ы. Биологическую обработку црьеотш проводили в течение 14 сут, 1, 2, 3 и G мо... C¡ii|Hr.!.i,ji:;,u«í потери веса, соде, ла-ния лигнина, иеллюло;ш осушкеггл« .л j.- , Олол.опокан и пр., МьЬ).

За единицу активности ферментов принимали количество фермента, которое необходимо для окисления 1 мкмоль субстрата или образования 1 мкмоль продукта в минуту на 1 мг бежа. Липшназ-нуга активность определяли по вератровому (3,4-диметоксибензило-вому) спирту, лакказную - по сирингалдазину, Мл-пероксидазную -по NABH. Целлюлазную активность определяли по Na-кэрбоксиметил-целлюлозе (КМЦ), фильтровальной бумаге, эндоглюканазную - с КМЦ вискозиметрическим методом, врил-р-глюкозидазную - но п-нктрофе-нил-р-Б-глюкопиранозиду и р-0-глюкозиду-3,4-дигидроксиагетофено-на, целлобиаыную - по целлобиозе, ксиланазную - по расщеплению ксилана. Белок определяли методом Лоури.

Подбор оптимальных условий синтеза лигниназы грибом Р.sanguínea осуществляли, изменяя в составе питательной среды концентрацию глюкозы от 0.05 до 0.5%, азота от 1.8 до 10 мМ, фосфора от 0.74 до 2.2 мМ, марганца от О до 5.52 мкМ, рН среды от 3.35 до 5.90. В составе среда для 'í'.vill«. jus варьировали содержание глюкозы от 0.005 до 2%, азота от. 0.06 до 10 мМ, Босфора от 0.6 -до 3 мМ, рН среды от 3.0. до 5.0. Синтез лигниназы контролировали по образованию вератровоги альдегида из вератрового спирта, введенного экзогенно перед инокулированием. Индукшго Мп-пароксидазы осуществляли дополнительным введением ионов Мп .

Исследование механизмов действия грибов проводили на натив-ном лигнине осины и сер™ ароматичёских соединений, часть из которых - товарные реактивы, часть - синтезированы по методикам (Закис,' 1980). Субстраты вносили в среду перед иноку.пированием в виде раствора в ДМФА.

Цветность сточных вод измеряли при К 430 нм и выражали в градусах хроматокобальтовой шкалы ;°ХКШ). Химическое потреблении кислорода (ХПК) определяли по (Лурье, Рыбникова* 1966). В качвс-

тве тост-объекта для определения токсичнг -ти использовали элодею канадскую (Elodea canadensls Michx.). Для исследований орали чершй галок и сток щелочения Байкальского ЦБК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Действие грибов Trarnetes vlllosus и Phanerochaete sanguínea на лигнин в древесине

Лигниндеструктирующая способность грибов была оценена то ¡ изменениям клеточной структуры древесины осины и лиственницы, пора^нной выбранными грибами I' sanguínea и Т.vlllosus, и для сравнения - известно грибом P.chrysosporluin, методом-электронной микроскопии. Благодаря способности секретировать экзофермен-ты грибы растворяли клеточную оболочку .без непосредственного контакта гифу с клеткой и проникали таким образом в древесную ткань. Р.chrysosporlum с большой скоростью утилизировал все компоненты клеточной стенки одновременно. В отличие от него, грибы Т.vlllosus и Р.sanguínea осуществляли избирательную делигнифика-цию клеточных элементов древесины, что выражалось в преимущественном разрушении срединных пластинок, норовых мембран и клеток лучевой паренхмш. Факт селективной делигнификации подтверждался ■гакке данными химического анализа биологически разрушенной дре- . весшы и индексами ксилолиза.

Процессы, происходящие непосредственно с лигнином при микробиологическом воздействии, изучены методом количественной ЯМР 'к, и ПК-спектроскопии. Объектами исследования служили лиг-шш, выделенный иь лиственницы здоровой, и биолигнины, выделенное после обработки древесип грибом Р.sanguínea.

По сравнению с исходным, биолигнины более окисленные они .одержали больше СО-, С00- и ОН фенольных групп (табл. 1),

о

Таблица 1

Количество функциональных фрагментов в лигчшах лиственницы, разрушенной грибом Р.sanguínea (на 100 ароматических колнн;

Структурный фрагмент Потеря массы, % I

0 2.1 G.9 14.5 i

СО 27-2 47^5 36-4 52-5 1

ООО 33±3 97¿9 91 --6 94-8 i II

01W 37±4 49Í-6 50-Г; 47±S 1

1 V° 162-1 ú ' 144-14 141U 4 139±14 i

Í Сар-°-С G7¿1 б 110-24 6Э±16 102-22 i

i СН3° 86-Б 8BÍ6 90-ь ' 76-4 |

ffl 6?-4 50-3 64 Í3 67-3 |

¡ 1

f - доля атомов углерода ароматических колец

Окислителыше процессы затрагивали как а-, так и р-полоиэштп пропановой цего', причем содержание сопряженных (С„) карбонильных групп, увеличиваясь в результате биообработки, оставалось посто jдннын с увеличением потери массы (ПЮ древесины (таол. 2).

Таолиця •

Относительнне интегральные интенсивности полос 1/4с=о/А150п) ! ИК спектрах липшнов лиственницы, разрушенной гриоом Р.sanguínea.

r¡--г

Потеря массы, %

1730 см

(С00)

1730 см

1670 СМ

6. i 14. í

0.24 i

о. 9** ;

0.7У i

О.Г;°- Í

сз.б:-0.6: О. '

0.1;:

0.4 г О.Ь. 0.4'

-JL

При больших ПМ 'древесины (14.5%) протекали реакции деметок-

силирования. Биодеструкцйя лигнина происходила за счет разрыва

Сар-С сьязей. Некоторые фрагменты здгипна, содериащие свободные

ОН фенольные группы, конденсировались за счет образования

С„„-0-С связей. аР

Изучение состава ферментных комплексов грибов Trametes viilOBus и Pl^erochaete sanguínea

В ocho: е биотехнологий лежат ферментативные процессы. Поэтому нами был изучен качественный и количественный состав внеклеточных ферментов, продуцируемых Р,sanguínea и T.Yllloaus. Активность ряда энзимов, определенная в бесклеточных культуралышх фильтратах грибов, представлена в таблица 3.

. Таблица 3

Ферментная активность культуральных фильтратов грибов T.vlllosus и Р.sanguínea (мкмоль/мин на Г мг белка)

tKTHBHOCTH T.YlllOBUB P.eanguine

Лигниназная 0.1-0.2 нет

Лакквзная 0.2-0.55 нет

Mn-пероксидазная нет О.ОЬЬ

Арил-б-глюкоэипазная Целлсбиазная 0.23-0.71 Ü.1Í)

нет 0.1U и.

КЩ-езная нет нет

Эндоглюканазная ..нет нет

По фильтровальной бумаге нет нет

Из лигнинолитических ферментов у Т.vlllocus били ,щ лигшшаза и лаккаэа, у Р.sanguínea - Mn-зависимая пер:-

10

j'lt, i! , i;caiij:«>

Как показали исследования последних лет, лигниназная активность коррелирует со способностью гриба окислять верэтровый спирт в вератровый альдегид. Эта реакция зафиксирована при инкубировании Р.sanguínea на среде с вератровым спиртом, т.е. в условиях ín vire, хотя в фильтратах гриба ее не наблюдалось. Это несоответствие в опытах дало основание предположить, что лигни-наза'Р.sanguínea локализована в.клетке или структурно включена или связана с мембранами клеточной стенки. Последнее предположение было подтверждено путем тестирования лигниназной активности в ферментном препарате, полученном после растирания мицелия.

Лйгниназа считается ключевым ферментом лкгнинолитического комплекса грибов. Известно, что активность и скорость биосинтеза фермента во .многом определяется условиями культивирования микроорганизма. Взяв в качестве источника углерода глюкозу, мы выяснили, что количество вератрового альдегида в опытах с Р.sanguínea возрастало с увеличением ее концентрации до 0.2%. Дальнейшее повышение ингибировало реакцию окисления вератрового спирта в •альдегид. У T.vlllosus .было откзчено два максимума активности фермента - при концентрации глюкозы 0.01 и 0.43%.

Азот является одним из компонентов питали.!, ответственных за переход культуры в стадию вторичного метаболизма, во 'время которой и наблгдается появление лигнйнязной активности. В качестве источников азота мы использовали аспарагин и азотнокислый аммоний. Максимальное накопление вератрового альдегида наблюдалось на средах с минимальным азотом (рис. 1). Для Р.sanguínea оптимальная концентрация его составляла 1.8-1.9 мМ, для T.vlllo-8u3 - 0.0S мМ. Варьированиз. концентрации азота от 0.06 до 7 мМ показало отсутствие значимости этого элемента для Т.уШоглш в интервале от 2 до 7 мМ. Синтез лигниназы грибом Р.sanguínea

' 11 .

SI

С,мкМ

/

^3.80

"a.01

/

i

_iJ.40

4.........2.Q9

\

•4.S0

0.0

-i

8 12 16 20 g 4

-утки

Рис. i Содержание вератрового альдегида в культуральншс фильтратах Plianerochaete sanguínea при различной концентрации суммарного азота (мМ) в питательной среде

ингибировался азотом и концентрации свыше 1.9 мМ. 11нгибирование наблюдалось кик при максимальных концентрациях обоих, источников, так и при максимуме хотя бы одного из них. Действие органического и неорганического азота было близким, хотя гриб отдавал некоторое нрздпочтение оргшшческой форме.

-.¡рода с рН 4.0 была наилучше'': для обоих грибов. Для определения оптимального состава буфера было исследовано шесть буферных систем с такой кислотностью (табл. 4). Мы остановились нь суьщшатном буфере, показавшем лучшие результаты.

Оптимальная концентрация фосфора в питательной, среде для V.aungulitóa оказалась равной 1.84 м?>1, для T.villoeus - i ЛЬ Ш. ¡¡ля обоих градов отмечено положительное воздействие кислоро. .

лдишность Мл-лороксидаэы Р.sanguínea в обычной среде сила мьыооной. Для впличения в питательную среду ррила -шли

'"аблица -2

Содержание вератрового альдегида в культуральных фильтратах Р1шпегооЬае!е запяШпеа с различными буферными смесями (рН 4.0)

! 1 • Буферные ! смеси Оукцшатный Нитратный .... — ... Гарт- ратный Диматглсук-цинатиый

Янтарная Янтарная кислота+ кислота+ янтарно- ЫаОН кислый Ма Лимоиивя Лимонная кислота+ кислота* лимонио- ЫаОН кислый На К вин-нокис-•шй + ПаСК Дыде таловый зфир янтарной КИ'УЮТЫ |

|вератро-¡вый альдегид, | мкМ ; 8.15 3.31 в.СЗ 5.12 | 5.00 ; ! 6.00

дополнительно введены нош Мп^* и лигнин. Гриб, выраще.щцй ь птил условиях, показал значительную активность Мп-пероксндазы даже н ..•екойц^нтоироващщх культуралышх фильтратах (ри;. 2).

'Т. 5-|

1 А.аду'иг

\

.4

0.5-)

Шс. 2 Влияние концентрации ионов Мпл+но активность Мп-пердкси-дазы РПалегоспаеге аап^ипеа. Концентрация Мп^ в питательной греде (мг/л): I - п.1В; Я '-'.5; 3 - 50; 1 - 100 (?'. 3' - я лрисутствии лигнина)

возраст культуры, сутки

Биохимические механизмы микробиологической деструкция фенольных соединений и лигнина

В оптимально условиях т исследовали возможность применения грибов для утилизации низкомолекулярцых ароматических веществ и лигнина. Для этого использовали се, лш соединений, моделирующих отдельные фрагменты и связи лигнина, и отличающиеся типом замещения кольца (о-дигидрокси-, гваяцильный, вератрильный, сирингильный), в также замещением и степенью окисления атомов углерода пропанобой цепи:

о-дигидрокси- гба я цильный вератрильный

НО-О НО-^-С-СН-СНд

НО' Н3С0/ НдСО7 к2

И,= Н.ОН или =0 Н,= Н,бН или =0

1*2= Н или -0-(3 Е?= Н: Н,0Н;=0 или

Н~С0/ я,со/

ф-О-4) «3- СН3 йлй СН20Н <0-0-.

Было обнаружено, что Оиодеструкиия грибом Т.уШоеиа ве-ратршшропановых субстратов, моделирующих замен, иную фенольную единицу лигнина, оспествлялаЛ за счет разрыва Сд-Ср связи и сопровождалась окг.слительно-восстанопительными реакциями сй,§= 0 <"~"'' са,р~ М8ВДУ которыми устанавливалось т намичес-кое равновесие. Оно со временем сдвигались в сторону образования соединений с грудой Са-0Н к последующей их деструкцией (рис. 3). Разрыву Са-Ср связи могло предшествовать окисление атома Ср. Существовала зависимость скорости деструкции субстратов от степени окисления Са и Ср атомов пропаноьой цепи. Так, субстраты, содержащие Са-0Н группу (1), легко включались в метаболизм гриба. У соединений, содержащих в прпановой цлги только Са=0 группу (?-'). ^являлась резистентгость к биотрансформации, но при

14

с.ыкМ

100-

CU3 СНз

& > í"2 неон со

ir

кг

СНО СНрОН Ir 4N ir з

Аг -^^—OCHg

OCH3

4 6 8 10

сутки

Рис:. 3 Содержание в культуралыюм фильтрате T.vlllosug субстрата (1) и метаболитов (2-'): I- вератрилпропанол-1, 2- вератрил-пронаион- I, 3- вератровый спирт. 4- вератровый альдегид; 2'и 5-ьермтрнлпропанон-) и вератрилпронанон-1 -ол-2 а кыестве субстрата

аопсдлительном введении UH-группы в р-положение (5) соединение деструктировалось так же легко.

р- одеструкиин под действием T.viUosus подвергались и более сдоите соединении, в том числе, 'димеры феншшропана, имеющие (3-0 4 структуру. Ь'иодеструкщ;л вератрилзамсденных (3-0--1 эфиров 'и.кжи протекала с разрывом Са~Ср связи и приводила к образованию пвратрового альдегида и, далее, вератрового спирта. Кроме разрыли с^-Ср свяаи наблюдал-.Jb окисление Са-атома. Степень окислен-нп,;тн С^,-атома не оказывала влияния на скорость и направленность процесса биодеградации субо^раток ц -и-4 тпа.

ГваЯЦИ.Ц I'liti ............. 114. .;u!'»!J>u .,'!.,- ,.¡n..x дИиА .рШ'ШЫШЙ ГИД-

рои. U.t. и,.; , г. ¡!v ч» ••!,•> .1 11! Ч i,;iiHh J'|:tV> f.i.. ll¡.i-.»lMyil«CT~

»•• 1Ы..Ч. •! • ; ..• ih—,.1 ¡; ["-ílli.'-iji >! M-i* i'.i:l -'Ii irtMA... Ii>-«ti.-.rl ». í¡tirf

и/или поликонденсация. Методом гель-проникающей хроматогрзфик Оыло установлено, что все полимеры полидисперсны, в среднем они содержали-от 2 до 35 мономерных единиц.

Гриб Р.еап^итеа, в отличие от Т.УШовив, не способен разрывать Са-Сс связь в вератрилпропановых соединениях. Однако о» подвергал превращениям гваяцилсодержащие субстраты. Степени включают субстратов в метаболизм гриба Р.вап£и1пеа зависела от наличия свободных ОН фенолышх групп и от типа замещения а ром я тического кольца (рис. 4).

Рис. 4 Содержание п культуральных фильтратах Pha..ároctmete sanguínea субстратов: рератрола (й). гваяг.ола (б), пирокатехина (в;

Биотрансформация .рибом Р.sanguínea оубстратов с незамещенным фенолышм гидроксилом так ке протекала в основное за счо ; реакций поликонденсашш. Биодеструкция пирокатехина, однако, со црозождалась образованием .да.цис-муконэвой кислоты, что свидетельствовало о способности гриба катализировать разрыв аромата, ческого кольца в ирто-дигидроксизамещенных структура;..

С целью исследовать, направленности полимеризационных про цессов, осуществляемых грибаш, была изучена структура полимерок; гваякола, гваяцилпропанола и 5еруловой кислоты методом спектшс копии ff.IP Ни lciC. В гюли. í ере, пс лучащемся при воздействии

Н,

Т.уШовиа на гваякол, обнаружены связи Свр-Сар и СПр~0-Сар, реализуемые по С1, и С1, С^ положениям ароматических колец соответственно, например, в подобных структурах (химические сдвиги даш в м.д.):'

00Н3

А2-М

н3со

НШ 'т осн3

ОН

Гваяцилпропанол и феруловая кислота претерпевал!? такие ке превращения, кроме реаклй по С1. При . наличии двойной связи у субстрата (феруловая кислота) в биополимере происходило образование а- и р-О-арильных (Аг) эфирных связей:

НО-

-(3

г

ÓCHg

-й

сн-

ОАг ОН

В оптимальных условиях культивирования грибы легко подвергали биодеструкции лигнин. T.vlllosus за 7 суток инкубирования разрушал 57% лигшыа осины, а Р.sanguínea за 15 суток - 38%. Исследования остаточного лигнина методом количественной Якг1 'н и 1 я

С спектроскопии наглядно показали, что под действием Р.sanguínea протекали окислительные процессы (в лигнине почти в два раза увеличилось содержание карбонильных групп,4 и реакции деывтокси-лкрования (снизилось содержание метоксильных гругг;) (табл. ó).

17

Таблица Б

Количество функциональных групп и фрагментов в лигнине осины, обработанном грибами ТлШовив и Р.вап^и1пеа (на 100 ароматических колец)

Структурный фрагмент

Лигнин осины здоровой

Биологически обр .ботанный лигнин

Т.ПИозив

Р.валяй!пеа

СО

соо .

п

6ок.ц0п.

Vе

Сар-°-С СНцО

9±1 68-6 532-50 122-12 11 4—1 б 144-13 46-2

7-1 42-4 352-33 102-10 130±18 132-12 54-3

18-1 51 ±4 322-30 113±11 110-15 37-3 56±3

Биодестоукцгя лигнина происходила за счет разгпва С„_-С и

* с1р

С-С связей алифатической цепи; о чем свидетельствовало уменьшение в лигнине количества соответствующих атомов углерода.

Эти реакции с лигнином мы отмечали и при действии грйба на древесину (табл. \>, ог'ако при непосредственном воздействии на лигнин биодес;рукция шла быстрее. Кроме того, в последнем случае в условиях, оптимальных ДЛ1. развития лигниназной активности, протекали реакции разрыва С-С- связей алифатической цепи, не обнаруженные нами рчнее.

Под воздействием Т./Шоаиа протекали такие же деструкцион-ные процессы. -Учитывая то, что гриб вызывает деструкцию лигнина на 57%, можно полагать, что образовавшиеся окисленные низкомолекулярные фрагменты лигнина переходят в рас вор. В присутствии гриба происходили также конкурирующие реакции конденсации с образованием связей. Эть процессы подтверждались ме-

18

тодом гель-хроматографии.

Грибы Р.sanguínea и T.villosus показали способность обес-t цвечивать cT04Hiíe воды ЦБК. Они хорошо росли на разбавленных стоках (черном, щелоке'и стоке щелочения), нейтрализованных до рН 5-6. За 40 суток инкубирования Р.sanguínea обесцвечивал черный телок на 24-61%, а сток щелочения на 46Ж, причем степень обесцвечивания зависела от концентрации стока: наибольшее снию нме цветности наблюдалось при разбавлении черного щелока в 60 раз, а стока щелочения в 3 раза (рис. 5).

Рис. 5 Изменение цветности черного,щелока грибом Phanerochaete sanguínea (40, 50, 60 - разбавление)

С уменьшением цветности происходило и снижение ХЛК на 1014%. Токсикологические эксперименты с элодеей показали, что стоки после биологической счистки грибами не являются токсичными, а в никоторых случаях даже стимулируют рост побегов в длину.

выводи

í , 11.. измене!..ш микроморГюлогических признаков древесины ■ ¡..¡-niг, (..^лытешнаи лигшшдеструктируюма.1 способность грибов ¡г- да-.т. vi Ловив и Miancroe.UaBte sanguínea.

. Мг-.тгччамп ИК а ЛМР 'íf и спектроскопии аоокедовани

!

. лигнины, выделенные из разрушенной грибом Р.sanguínea древесины лиственница. Обнаружено, что биодеструкция лигнина является окислительным процессом, сопровождающимся появлением гидроксиль-ных, карбонильных и сложноэфиршх групп, расщеплением Сдр-С связей.

3. Установлен состав лигнинолитг?еских ферментных комплексов базидиомицетов T.vllloaus и Р.sanguínea. В ферментном комплексе ^.vlllosus присутствует лакказв и лигнинэза, Р.sanguínea -Мп-зввисимая пероксидаза и лигниназа.

4. Установлено влияние компонентов питат льной среды (глюкозы, азота, фосфора, марганца, кислорода), а та-та их оптимальные концентрации и pH на способность грибов с.штезировать лигни-•'азу. Найдена оптимальная концентрация ионов Мп2* в питательной среде для образования Mn-пероксидази грибом I'.ea.^ vlnea.

5. Изучены механизмы биотрансформзции некоторых ароматических соединений и лигнина грибами T.vlllosus и Р.sanguínea. Показано, что деструкция их ноет окислительна характер и протекает

с разрывом алифатических С-С и Са„-С связей. Направление реакций

* ^

зависит от типа заместителей в бензольном кольце и пропановой цепи. Бкотрансфорсоция вератрилзамеиеннчт субстратов под действием T.vlllosus, в отличие от Р.sanguínea, осуществляется с разрывом C0-Cß связи. В случае фвнольных субстратов под действием обрих грибов происходят конкурирующие процессы полимеризации (конденсации) и деструкции.

6. Показана способность грибов T.vIHobup и Р.sanguínea на 24-31% обесцвечивать стоки целлюлозно7бумажного комбината, и уменьшать ХПК на 10-14Ж.

.СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ PALOT 1. Медведева С.А., Бабки-.i В.А., Соловьев В.А., Александрова

20

Г.П., Малышева О,H., Иванова G.3., Волчатова И.В. Исследование лигнолитической активности Phanerochaete aangulnea с целью использования базидиомицета в биотехнологических процессах в ЦБП// Тез. докл. Всесоюзн.«конф. "Основные направления и координация работ в области химии древесины и целлюлозы до 2000 г."- Ленинград. 1988.- G. 1 '16—117. .

2. Медведева С.А.\ Бабкин В.А., Волчатова И.В , Антипова И.4., Спиридонова Л-.Н., Павлинский В.Г.. Соловьев В.А., Малышева О.Н. Изучение лигниназной активности базидйомищ та Phanerochaete вап-guinea. Пути дестр.укции грибом фенольных соединений // Тез. докл. 3 научн. семин. "Превращения древесины при 'анзиматическом и микробиологическом воздействиях".- Рига, 1988.- С. 98-99.

3. Медведева С.А.. Бабкин В.А., Волчатова И.В., Соловьев В.А., Малышева О.Н., Спиридонова Л.Н.. Александрова Г.П. Изучение лигниназной активности базидиомицета Phanerochaete songuinea // Химия древесины.- 1989.- N 6:- С: 75-76.

4. Медведева С.А., Иванова С.З., Волчатова И.В., Белоусова И.А., Антипова И.А.. Бабкин В.А. Окисление лигнина и фенольных соединений микроорганизмами // Тез. докл. Всесоюзн. семин. "Проблемы окислительно-восстановительных превращений компонентов древесины".- Архангельск, 1990.- С. 79.

Б. Медведева С.А., Хуторянский В.А., Иванова С.З., Волчатова И,В., Бабкин В.А., Е'арам Г.И. Анализ ароматических метаболитов -продуктов биодеструкции лигнина методом ВЭЖХ // Тез. дс..л. V Всессизн. симпозиума по молекулярной жидкостной хроматографии.-Рига, 1990.- С. 55.

6. Медведева С.А., Волчатова И.В., Иванова 0,3., Апрелкова Н.Ф., Хуторянский В.А., Антипова И.А., Середкина С.Г., Бабкин В.А,

Превращения мономерных ароматических соединений вератрильного *

ряда базидиомицатом Corlolus vilioeus (Lloyd) Kreisel // XiMH.« дрэвосшш.- 1991.- H а.-- C. 76-80.

7. Медведева С.А.. Бабкин В.А., Сиишнн А.П., Аптипова К.я., Волчатова И.О., Иванова C.S. Деструкция арилметановых и арилпрс Пановых соединения базидиальными грибами Corloluß vlllosu6 и Phanerochaete sangulnea // Тез. докл.' VII Всесоюэя. симпозиума "Инженерная внзимология".- Москва, (991.- С. 15G-li>v

8. fc'cdv-deva S.A., Babkln V.A., SlnJtslti A.P., Antlpova 1.ä.v Volchatova I.V., Ivanova S.Z. Decomposition of arylmettiane- anc; arylpropane-containing compounds by baeidlal nigl Corlolus vli Iofus and Phanerochaete sanguinea '' Russian Biochemistry ant: biotechnology.- 1991.- Vol. 1. N 2Л,- P. 9rf.

9. Медведева С.«., Волчатова И.В., Антипова H.A.. Бабкин В.л. Окислительная деструкция лигнина и фзнольных соединений базидиальными грибами Pnanerochaete eanguinea и Corloluo villosus // Тоз. докл. мэадун. конф. "Проблемы окислительно-восстакозитель mix превращений компонентов древесины"Архангельск, 1992.- С. 81-82.

*

10. Medvedeva S.A., Vni„natova I.V., Seredkina S.G., Antlpova I.A., BelouBova 1.'., Babkin V.A. Oxidative destruction of lie nln and phenol compounds with Daeidlal fungi Phanerochaete вач guinea and Corlolus vlllosufl // Materials of the 7-th Int. Symp Wood and Pulp. Chew.- Beijing, 1903.

11. Александрова Г.П.. Бабкин В,А., Буряченков М.И., Заказо!: А.Н., Медведева С.А., Волчатова И.В. Способ получения целлюлозь.. Пателт РФ 93-019492

12. Волчатова И.В., Медведева С.А., Бабкин В.А. Изучение состав." вньклетсчьых ферментов грибои Phanerochaete sangulnea и Corlolu; vliioßus // 1йихимия.- 1994.- Т. 59, вып. 6.- С. 7Э7-80о. ^ /