Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИИ БАКТЕРИЙ-РОДА RUMINOCOCCUS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ И НЕКОТОРЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИИ БАКТЕРИЙ-РОДА RUMINOCOCCUS"

'А-3 4206

- . ыосковскпа ордена леншм

и ордена трудового красного знамени г

1I

сельскохозяйственная АКАДЕМИЯ ияини к.а.тимирязева На-правах рукописи

Лавлинский Дмитрий Юрьевич

физиолого-биохииические и некоторые генетические.аспекты'биологии

бактерии рода шшососш

03.00.07 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой' степени кандидата биологических наук

МОСКВА

-1993 г.

¿'Лг - ' ' '

О- О^СО'ы/' ? Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных

аивотных

Научный руководитель:

доктор биологических наук Б.В.Тараканов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук_ /1иьн^С(С С/, Г"

¿ансу. доктор биологических наук иесьыё ни. Ведущее учреждение: с/^ечг /с&£е-КОг£г ^-е € пи

(ХКсгсуел/Мь?' Сх/э

Защита диссертации состоится " 4 " октября 1995 г. в 16 — часов на заседании Специализированного совета К 12035".06 при Тимирязевской сельскохозяйственной академии по адресу : 127500.Москва.И-550.Тимирязевская ул.,49.9ченый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тимирязевской сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан 1995 г.

Учений секретарь Сне" • *нзип' того совета /С«./^- '"'ли., .еских начк ' „¿/сгессНсг

1; ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клетчатка грубых корнов - основной питательный субстрат, обеспечивавший энергетические потребности жвачных животных, используется последними на 40-552 от обвего ее содержания в корке. Низкая усвояемость клетчатки грубых кормов жвачными животными ставит задачу повышения эффективности ее использования. Для ревения этой проблемы необходимо выяснить какие факторы в первую очередь. лимитируют процесс утилизации целлюлозы.

Как известно, расиепление клетчатки в преджелудках до усвояемых углеводов осуществляется целлвлозолитическими микроорганизмами, обладавшими различной ферментативной активностью. Поэтому одним из перспективных путей ревения проблемы эффективной утилизации клетчатки может явиться создание новых высокоактивных втаммов на основе целлвло-золитиков рубца. Это может быть осувествлено с помовьв методов генной инженерии. Однако, начало генноинженерных работ по конструированию активных продуцентов целлюлаз сдерживается из-за отсутствия данных о биохимических и генетических особенностях целлвлозолитических бактерий рубца, в первую очередь таких,как Rueinococcus albus и RuBinococcus flavefaeiens. Более того, работы с бактериями рода Ruiinococcus у нас в стране не ведутся и они отсутствуют в отечественных коллекциях.

Актуальность и необходимость исследований по осувест-вленив генноинженерного конструирования активных продуцентов целлвлаз послужили основанием для проведения нзс-тоявей работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы было дать характеристику биохимических свойств и генетических.особенностей бактерий рода Ruiinococcus к получить втакмк, перспективные в качестве доноров генов, кодирувакх сикге? целлвлаз. .

Были поставлены следуюцие задачи:

1 )выделить из рубца жвачных животных бактепки рсдз Ru-Binococcus к отобрать втаммы с максимальной целлвлоэоли-ткческой активностью;

2)исследовать комплекс целлвлозолитических ферментов бактерий рода--

НАУЧНАЯ !. РЛсск. ci'/.i:.:oxo- ямллмия

Инв.^гАгЗ.ЙЙЙ

3)провести скрининг выделенных штаммов на плазмидн и выяснить кодируемые ими функции.

Нацчная новизна. Установлено, что бактерии рода Rumino-coccus имевт комплекс целлвлозолитических ферментов, состоящий из трех типов целлвлаз: эндо-1,4-.Р-глвканазы, цел-лобиогидролазы и ji-глвкозидазы, а также содержат ксиланаз-ный комплекс. При этом все целлшлазы и ксиланазы румино-кокков является индуцибельными ферментами и локализованы примерно поровнч внутри и вне клетки.

Отделена^глюкозидаза ферментного препарата штамма N37 R.albus от других ферментов целлюлозолитического комплекса и ксиланазы с помощью осаждения культуральной жидкости этанолом и последующей анионоооменной хроматографией на ¿¡ЗАЭ -сефадексе ft-25.

Установлено.что природная устойчивость руминококков к тетрациклину и эритромицину кодируется плазмидами.а к стрептомицину, ампициллину, рифампицину и хлорамфениколу - на хромосомах. При этом клетки оактерий рода Runinococ-cus содержат, по крайней мере, два типа некриптических плазмид с размерами около б т.п.н.. одна из которых несет ген >-глвкозидазы и устойчивость к тетрациклину.а другая, помимо гена f-глвкозидазы, имеет ген устойчивости к эритромицину.

Составлена рестриктная карта плазмиды, выделенной из штамма R.albus 37- активного продуцента целлвлозолитических ферментов и ксиланазы.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях, занимавшихся изучением микрофлоры пищеварительного тракта, проблемами целлвлолизиса, а также в теоретическом курсе подготовки студентов биологических, зооинженерных и ве--еринарных факультетов.

нпзотиия работы. Основные результаты диссертационной гаюты докладывались на научных семинарах лаооратории био--ехнологли микроорганизмов пищеварительного тракта и отдела питания с.-х.животных ВНИИФБиП.на Международной конференции по биологическим основам высокой продуктивности с.-х.животных в Калуге (1990) и на Всесоюзной конференции Микробиологические и биотехнологические основы интенсифи-

нации растениеводства и кормопроизводства" в Алма-Ате С1990).

Стрцктцра и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литератур», экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 206 названий. Диссертация изложена на 160 страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков и 18 таблиц.

2, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вивотные и рационы. Анаэробные целлюлозолитические бактерии рубца выделяли из рубцового содержимого коров черно-пестрой породы, получавших ежедневно в . составе рациона по Зкг пшеничной соломы, 20кг силоса, 10кг кормовой свеклы и 7 кг комбикорма. ¿Рубцовое содержимое" брали через фистулу или с помощью пищеводного зонда от животных вивария ВНИИФБиП (г.Боровск)Г^0ПХ "Ермолино" Боровского района Калужской области,колхоза XX партсъезда Кажирского- района Воронежской области и колхоза "Путь Ильича" Калачеевского района Воронежской области. Выделение анаэробных целлялозолитических бактерий рубца.

Для первичного выделения анаэробных целлюлозолитическкх бактерий использовали питательную среду Хангейта (Hunga-te,1950).Чистые культуры выделяли на агаризованной среде, используя метод "roll tube culture" Hungate (1969), Поддержание чистых культур. Полученные чистые культуры пересевались каждые 3-5 дней. В дальнейшем культивирование бактерий вели на синтетической среде Скотта и Дехори-ти (Scott a.Dehority.1965).

Длительное хранение штаммов осуществляли методом замораживания в жидком азоте или в морозильной камере при - 70 С по Герхардту (1984). Морфология и культцральныв свойства. При проведении идентификации выделенных чистых культур до вида исследовали общепринятыми методами морфологию клеток,размеры, отношение к окраске по Граму,спорообразование,подвижность, морфологию колоний на плотных средах,характер роста в жидких средах.

Биохимические тесты - наличие каталазк определяли прк

внесении в среда с культурой IX перекиси водорода;серово-дород обнаруживали с помощью бумазеи,пропитанных уксуснокислым свинцом,а аммиак - бумаяек Крупа. Индолообразова-ние определяли по качественной реакции с реактивом Зрлера в модификации Ковача ( 1976 ),раззияение зелатины устанавливали по Герхардту (1984). восстановление нитратов - по реакции с реактивом Грисса (1976), водород - облеприня-тыми методами.

Изучался рост культур при разных температурах и pri среды.

Определялись ферментационные характеристики а конечные продукты оронения.

Лля выяснения способности изучаемых микроорганизмов сорааивать различные сахара руминококки выращивали на синтетическои среде Scott a.Dehority, в которую вводили исследуемые углевода в концентрации 052.Образование кислоты определяли по изменении окраски с помощью индикатора оромкрезолпурпура, находящегося в среде (1,62-ный спирто-вый раствор).

При идентификации бактерии в качестве руководства использовали определитель Берги (1984).

Адгезивные свойства руминококков оценивали по количеству прикрепленных бактериальных клеток к формалинизирован-ным эритроцитам (Брилис и др.,1986). Биохимические методы. Конечные продукты ферментации целлилозы определяли после 10 суток инкубации чистых культур при 39еС. Культуральнув зидкость освобождали от бактерий центрифугированием.

Летучие вирные кислоты и этанол определяли с помощью газовой хроматографии.Определение нелетучих нирных кислот проводилось на газо-видкостном хроматографе с детектором ло теплопроводности.При этом молочную и янтарную кислоты з культуральной видкости переводили в метиловые эфиры. 'тзндартную смесь метилировали и экстрагировали хлороформом такзе.как л пробы с культурой (Нитрука, 1978). Знчиматические активности. Суммарную целлюлозолитическую активность руминококков определяли визуально по скорости раслепления фильтровальной бумаги на зидкой среде Scott а. Dehonty ( 1965).Активность комплекса целлюлозолитических

ферментов и ксиланазы определяли.по методике Исмаиловой и др.(1975),измеряя количество редуцирующих веществ калориметрическим методом SoBogyi a,Nelson (1944,1952) . гфи-длине волны 660 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 5 мы. Определение активности целлюлаз проводили после 72 ч культивирования штаммов на среде Scott-a.Dehority (1965) при 39еС. В качестве единственного источника углерода использовали фильтровальную бумагу (2%) или пвеничную солому ( 2% ) .

Выделение целлюлозолитических ферментов и ксмланазы. Для изучения ферментативного комплекса руминококков проводили наработку культур методом глубинного культивирования на 10-ти литровом ферментере-"Biotec" в течение 6-7 суток (Иванова с соавт.,1980). При этом использовали. жидкую среду Скотта-Дехорити с пшеничной соломой (2/£),предварительно измельченной на мельнице. Ферментные препараты,осажденные из культуральной нид-• кости разными объемами этанола и изопропанола,фракционировали на анионообменном ДЗйЗ-сефадексе fl-25 по Логиновой и др.(1981). .

В каждой фракции определяли белок по Лоури и активность исследуемых ферментов.

Генетические методы исследований.йнтибиотикоустойчивость проверяли по •росту культуры в жидкой среде Хангейта с сульфатом целлюлозы (2%) и антибиотиком в сравнении с контролем.Все итаммы были проверены на чувствительность .к эритромицину, стрептомицину, рифампицину, тетрациклину, хлорамфениколу и ампициллину,которые вносили в. среду до конечных концентраций:10;25;50;100 мкг/мл. Выявленные антибиотикоустойчивые итаммы подвергали воздействию элиминирующих внехромосомные генетические детерминанты агентов, после чего снова определяли их антибиотикорезис-тентность и ферментативные активности. В качестве злили- . нирувщих агентов применяли бромистый этидий и акридиновый оранжевый в концентрациях : 0,1: 1,0; 10,0; 100,0;1000,0 мкг/мл. В качестве элиминирующего фактора использовали такяе многократный пересев штаммов на среду с глюкозой, являющейся единственным источником углерода. Скрининг штаммов на плазмиды.Антибиотикоустойчивые итаммы.

гидролизовавиие целлвлозу в течение первых 2-3,5 суток, и атаммы.терявщие устойчивость к антибиотика« после обработки злиминатами, подвергали «елочному лизису, а выделение плазмидной ДНК проводили по методу Birnboia а. Dolly в модификации Asmundson а.Kelly (1987).

Рестрикционный анализ плазмидной ДНИ. Обработку плазмидной ДНК рестриктазами проводили по Герхардту (1984). 3 качестве маркеров использовали ДНК фага IV .порезаннув рестриктазами Hind III и Pst I. а также пяазмиды pUZ 111.3 тпн)» RSF1010(8,9 тпн). pUSi8 (2.7 тпн). p3R322 :5.4 тпн) - полученные во ВНИИгенетика (г.Иосква).

Лля картирования выделенной плазмиды применяли следующие рестриктируввие зндонуклеазы: EcoRI.EcoR О.Заш HI, nine III. Pst I. Saa I. Bgl II. Pvu II (НПО Фермент'. г.Вильнюс).

Засиепление очищенной ДНК проводили в условиях (состав реакционного буфера.температура инкубации) индивидуальных для каждой рестриктазы.в соответствии с рекомендациями изготовителя.При совместной обработке препарата несколькими рестриктазами,если это необходимо,проводили реакции.последовательно переосаждая ДНК эталоном в присутствии 5М ацетата аммония по Маниатис и др.(1984).

Результаты всех исследований обработаны статистически (Костылев с соавт..1991).Значение критерия достоверности Р при оценке полученных данных определяли по таблице Стьвдента и с использованием ЗВН.

з.реззльтйтн исследований

3.1.морфология.шьтуральные и физи0л0г0-зиохймические свойства бактерии рода rumin0c0ccus

Из 38 проо содержимого рубца крупного рогатого ско-*a.J3flToro из разных хозяйств Калужской и Воронежской об-1аст<м.эыло выделено 58 чистых культур.Все выделенные 1таммы росли в строго анаэробных условиях и оыли предс-чзлены сферическими или слегка овальными грамположитель-ными кокками. Диаметр варьировал в пределах от 0.8 до

1,2 мкм. Кокки располагались одино>- попарно или цепочками, содержащими от 4 до 12 клеток.

На плотной среде с рубцовой жидкость» румминококки образовывали несколько типов колоний. 46 штаммов формировали разлйчной формы желтые колонии,поверхностные или глубинные, чечевицеобразные,цельные,с ровными краями,диаметром 1,5-4 мм. 12 втаммов образовывали белые или просвечивающие в проходящем свете,поверхностные или глубинные,округлые,с ровными краями колонии,диаметром 2-3 мм.

Все выделенные штаммы расщепляли целлюлозу и целлобио-зу,причем клетчатку гидролизовали с разной - скоростью.Так,из штамма R.flavefaciens 17,4% полностью расщепляли очищенную целлюлозу (фильтровальную бумагу) за 48 ч (группа высокоактивных), 8,7% - за 72 ч и 13,62 - за 84 ч (среднеактивные), 45,72 - за 108 ч (низкоактивные) и 8,62 - за 8-9 суток.Среди штаммов R.albus по 25% было высоко- и среднеактивных, а* 50% культур оказались низкоактивными.

Кроме целлюлозы и целлобиозы из штаммов R.flavefaciens 11 расщепляли пентозы,(17,4% - ксилозу и 6,5% - арабино-зу), 3 штамма - моносахара (4,3% - фруктозу и 2,7% - глюкозу), из дисахаридов, кроме целлобиозы, 6,5% фементиро-вали лактозу и 4,3% - сахарозу,а из полисахаридов,помимо целлюлозы,один штамм гидролизовал зскулин.

Среди штаммов R.albus 33,3% ферментировали ксилозу, 16,7% - глюкозу, 8,3% - фруктозу и 8,3% -лактозц.Ни один из изученных штаммов руминококков не ферментировал манно-зы,галактозы и мальтозы и не гидролизовал крахмал,глицерин, дульцит. Ни один из штаммов не продуцировал индола.ка-талозы,сероводорода и не восстанавливал нитраты,но по два штамма каждого вида ражжижали желатину.

Определение конечных продуктов ферментации целлюлозы показало,что более 80% штаммов образовывало уксусную кислоту. Бее штаммы R.flavefaciens * продуцировали янтарную и один - молочную кислоту. Все штаммы R.albu? образовывали молочную кислоту,а 91,7% - этиловый слиот и водород. Ни один из 58 штаммов не образовывал масляной кислоты:

На основании полученных данных 46 штаммов,которые про-

дуцировали янтарнув кислота и при росте на агаризованной среде с рубцовой аидкостью образовывали желтые колонии, бы ли идентифицированы нами как Ruminococcus flauefa-ciens.a 12 безпигментных штаммов,не образовывавших янтарную кислоту, отнесены к виду Ruainococcus albus.

3.2.ГИДРОЛИЗ ОЧИЩЕННОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА РШН0К0КК0В

Целлюлозолитические микроорганизмы характеризуются способность!! гидролизовать высокоупорядоченнуш целлюлозу до более простых сахаров:целлобиозы и глюкозы.Наиболее просто целлюлозолизис можно определить визуально по скорости расщепления фильтровальной бумаги,представляющую собой очищенную целлюлозу.

В серии опытов in virto была изучена скорость гидролиза целлюлозы у 12 штаммов R.albus и 46 штаммов R.flavefaci-ens. Исследования показали,что все изученные атаммы обладали неодинаковой скоростью гидролиза целлюлозы.Так, 11 штаммов полностью расщепляли полоску фильтровальной бумаги за 4В ч после посева - высокоактивные (NN 19,37,44 -атаммы R,albus и N 9, 24,31,34.43,48,50,58 - атаммы R.flavefaciens). четыре штамма - через 60 и 72 ч - активные (NN 6,7,8,52 - R.flavefaciens), 12 штаммов - через 84 ч - среднеактивные (NN 16, 27, 49 - R.albus и N 3,10,11,18,23,35,36,41,55 - R. flavefaciens). Остальные атаммы были отнесены к низкоактивныы, среди которых 11 разрушали целлюлозу за 96 ч (R.albus NN 39 и R.flavefaciens NN 1.4,5,13,26,29,30,46,53) 13 - через 108 ч (R.albus NN 2.21,28 и R.flavefaciens NN 12,14,15,17,20,25,32,40, 47,57) и 6 штаммов только спустя 8-9 суток (R.albus N 45 л R.flavefaciens NN 22,33,38,51,54).

Известно,что способность сбраживать какой-либо субстрат бактериальными клетками тесно связана с их адгезивными свойствами (Брилис с соавт..1982;Брилис,1983:Брилис 1 лр.,1Ь86;Зау0г et al.,1983;Savage,1970). В связи с >- ш 'ига »печена способность руминококков к адгезии.Труд-

'Ст I .ао/ЕЮНия за этим процессом на очищенной целлюлозе .мчзно! "рт'нтке л невозможность -очного полсчета

осевших на целлюлозе кокков 'заставили нас искать другой подходящий .субстрат для изучения адгезии руминококков. Таким субстратом были- выбраны эритроциты человека.Они имеют на своей поверхности гликофорин - вещество,идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток,на котором располо-кены рецепторы для адгезинов' бактерий.По мнению Брилис и др. (1986) эритроциты являются универсальной моделью, для изучения адгезии различных микроорганизмов.

Для изучения адгезивных свойств было отобрано 6 штаммов R.albus и 21 штамм R.flavefaciens, которые полностью расщепляли очищенную глюкозу в течение первых 2-3,5 суток.Результаты исследований представлены в таблице 1.,

Таблица 1

Адгезивные свойства руминококков

Номера : СПА : К : ИАМ. : : Номера : СПА : К : ИАМ

штаммов: : : ; штаммов: : :

3 1,1 74 1,49 ' 6 2,0 60 3,33

? 1.1 78 1.41 8 1.2 54 2,22

9 3,9 88 4,43 10 2,7 84 3,21

11 1,0 48 ' 2,08 ' 16 1.4 88 1,59

18 0,6 40 1,75 . 19. 3,3 64 5,16

23 0,7 36 1,94 24 4,2 86 4,88

27 1.3 50 2,60 31 5,2 90 5,78

34 6,2 96 6,46 35 0.6 16 3,75 '

36 1,2 66 1.82 37 6,3 98 6,43

41 0,9 38: '2,37 43 1.5 52 2,89

44 4,2 86 4,88 48 2.2 '70 3,14

' 49 0,9- 48 1,88 50 1.7 56 2,14

•58 2,1 64 3,28

Обозначения: СГ1Асредний показатель адгезии, К - коэффициент участия эритроцитов в процессе адгезии (процент эритроцитов,имеющих на своей поверхности адгезированные бактерии), ИАМ - среднее количество клеток на одном участвующем в процессе адгезии эритроците (см.методику).

Из данных таблицы 1 следует.что из 27 изученных штаммов

7 обладали высокой адгезивностью С N 19, 37, 44 - штаммы R.albus и N 9, 31". 34 - R.fiavefaciens). 9 - средней (К 27 - R.albus и 8 6,10,35.43,48,50.52,58 - R.fiavefaciens) и 7 - низкой ( N 49 - R.albus и N 8,11,23.36.41.55 -R.fiavefaciens). У 4 штаммов она отсутствовала ( Hl6 -R.albus и NN 3, 7, 18 - R.fiavefaciens).

Мы также выясняли влияет ли способность руминококков прикрепляться к субстрату на скорость расщепления целлюлозы? Результаты такого сопоставления представлены на рисунке 1.

HAU

И

12

48 ч 60-72 ч 84 ч

Рис.1. Связь целлвлолизиса руминококков с их адгезивными свойствами

Обозначения: ИАМ - адгезивность: Т- время полного расщепления фильтровальной бумаги (ч); цифры в столбцах - количество штаммов в каждой группе.

"^•иний показатель адгезии штаммов, разрушающих филь--рсзалънчш бумагу за 48 ч (4.54+0,42), был на 47.22 боль-

ч

.о, ), •з) ч

) такового у агтаммов. деградировавших целлюлозу .10 0.40). и на 50.22 (Р< 0.05) больше,чем у -таммов,расцеплявших фильтровальную бумагу за 84 ч -.-¿¿0.13). Видовых достоверных различий в зтих свойс--га< изученных зтаммов не обнаружено. Между скоростью "гр'-ланиз фильтровальной бумаги и адгезией бактерий наб-

j

людалась достоверная (Р<0,05) корреляционная связь г=0,63.

Таким образом,руминококки обладают разной скоростью гидролиза целлюлозы,которая находится в прямой зависимости от способности бактериальных клеток прикрепляться к субстрату.

3.3.АКТИВНОСТЬ ЦЕЛЛЮЛАЗ Ч БАКТЕРИЙ РОДА RUMIN0C0CCUS

Мы исследовали у руминококков способность к образованию трех главных типов целлюлаз,необходимых для гидролиза клетчатки: зндо-1,4- ß -глюканазы (группа эндоглвканаз), целлобиогидролазы (группа экзоглюканаз) и ^-глюкозидазы (группа целлобиаз).

В этих опытах использовали б «таймов R.albus и 21 атамм R.flavefaciens, которые активно гидролизовали целлюлозу в течение первых 2-3,5 суток.Культивирование руминококков вели на средах с фильтровальной бумагой или пвеничной соломой в качестве единственного источника углерода,а опре- . деление активности энзимов проводили спустя 72 . ч после начала культивирования.

Нами не обнаружено достоверных различий между'активностью отдельных целлюлаз у.R.albus и R.flavefaciens на одном и том же субстрате (табл.2).

Таблица 2 '

Активность целлюлаз R.albus и R.flavefaciens с разными источниками углерода

румино- гтатив-: среда с очииен: среда с натив-:верность. кокков : ная : ной целлюлозой: ной клетчаткой: Р :актив-: : : :ность : : :

Активность целлюлаз, ед/мл:

Виды :Фермен:

: Досто-

1 и

3

Г,

ЦБГ

R.albus ЭГ п=6 Г

.13,47+1,02 20,73+0,SS <0,001 16,80+1,-31 31,43+0,66 <0,001 9,40+0.69 11.68+0,61 <0,05

Продолжение таблицы 2

1:2: 3 : 4 5

ЦБГ 12.96±4,20 20.05+0.37 <0.05

Ч.flavefa- ЗГ 17.50+6.36 31.94+0.42 <0,05

ciens Г 8.60+2.43 12,48+0.34 <0.05

род ЦБГ 13.04+3.90 20.13+0.35 <0.01

Rummococ- ЗГ 17.35+5.49 31.37+0.35 <0.05

cus Г 3.77+2.12 12.30+0.30 <0.05

п=27

Обозначения: ЦБГ - целлобиогидролазная активность; ЭГ -I,4-^-зндоглвканазная активность: Г -jJ-глюкозидазная активность

Замена очищенной целлюлозы природной клетчаткой привела л возростанию це-ллобиогидролазной активности на 54%. 1.4-_/*-глвканазной активности - на 40.3% у всех втаммов рода Ruminococcus. JV-глвкозидазная активность у R.flave-faciens на очищенной целлюлозе составила 8.60 ед/мл. Замена этого источника углерода нативной клетчаткой привела к увеличению активности энзима до 12,48 "ед/мл СР<0.05) или на 45,1% , активность того же фермента у R.albus на очищенной целлюлозе - 9,40 ед/мл,а на природной клетчатке - 11.68 ед/мл (Р<0,05),то есть выве на 24%. Эта же тенденция сохраняется и в отновении двух других энзимов у обоих видов руминококков.

Таким образом.активность целлвлозолитических ферментов 13 инкрустированной лигнином природной клетчатке была начительно выше по сравнении с использованием в качестве источника чглерода очищенной целлюлозы.прячем оолее всего !Озросл<з эндог-.^каназная активность 1на 87% и 83% у R.al-DLt' л 1 laveiaciens соответственно). 'Из этого можно сделать гчзол.что натизная клетчатка индуцирует продукции Цс.твлзз. • огорые у Руминококков являются индуц.'.оельными ;еркентами.

Скорость гидролиза целлюлозы целлюлазами определяют как время, необходимое для расщепления ее до простых Сахаров. Нами была определена активность целлюлаз руминококков по группам с разной скоростью гидролиза и на различных субстратах (табл.3).

Таблица 3

Активность целлюлаз руминококков,обладающих разной скоростью гидролиза целлюлозы

Источ-:Фермен-ник :татив-

: ная углеро;актив-да : ность

Активность целлюлаз. ед/мл группы гидролиза целлюлозы

за 48 ч : за 60-72 ч : за 84 ч п=11 : п=4 : п=12

• ЦБР очищен- ЗГ ная Г

целлюло за

14.93+0.68 17.92+1.19 8,78+0.44

12,70+0,84* 17,23+0,85 7.95+0.60

11,45+0.33* 16,87±0,48 9.13±0.29

ЦБГ

нативная.; ЗГ клетчат- Г ка

21.80+0.42 31,82+0,30 11.87+0,27

21,73+0,29 32.48+0.90 12,60±1,01

18,72±0,26* 30.37+0.61* 12,65+0,54

* - Р<0,05 (достоверность разницы по сравнению с группой руминококков, расщепляющих.целлюлозу за 48 ч)

Как видно из таблицы 3,высокоактивные штаммы руминококков (гидролиз целлюлозы за 48 ч) имеют более высокие значения активности целлюлаз. за исключением ,/}-глюкозидазы, по сравнению с низкоактивными штаммами (гидролиз за 84ч). Так,активность целлобиогидролазы у всех штаммов с высокой скоростью гидролиза клетчатки (за 48 ч) на очищенной целлюлозе была выше,чем у штаммов с низкой скоростью гидролиза клетчатки (84 ч) на 30,4% (Р<0,05). а на природной

клетчатке - на 16,5% СР<0,05).Между скоростью гидролиза очищенной целлюлозы и целлобиогидролазной активностью существует высокодостоверная положительная корреляционная связь г=0.79 СР<0.05).Эндо-1,4- £ -глюканазная активность штаммов с высокой скоростью гидролиза клетчатки была на 5'/. выше .чем у штаммов с низкой скоростью гидролиза клетчатки (Р<0,05.источник углерода:нативная клетчатка). Скорость гидролиза очищенной целлюлозы Сгидроллз за 48 ч и 84 ч ) и активность эндо-l,4-j*-глюканазы также находятся в достоверной (Р<0,05) положительной корреляционной зависимости (г=0.87).тогда как активность ji-глюьо-зидазы у высоко- и низкоактивных штаммов была практически одинаковой.

Что касается межвидовых различий в активности различных целлилаз.то исследования показали,что активность целлоби-огидролазы у штаммов R.albus и R.flavefaciens. гидролизу-юиих целлюлозу за 48 ч.была достоверно выше,чем у культур,расщепляющих ее за 84 ч.

Между всеми типами целлюлозолитической активности и адгезивными свойствами руыинококков существует достоверная положительная коррелятивная связь. Она имеет довольно высокие значения между целлобиогидролазной активностью и адгезией руминококков, а также между эндо-гликаназной активностью на обоих субстратах и индексом адгезии бактерий рода Runlnococcus.

При этом значения коррелятивной связи между эндоглгака-назной активностью и индексом адгезии микроорганизмов выше.чем между целлобиогидролазной активностью и адгезив-ностью руминококков. Эта закономерность сохранялась как у высокоактивных штаммов.так и низкоактиЕНых. хотя у последних значения коэффициентов корреляции были нескоть-гл низе,

горрелятивная связь между jJ-глюкозияазной активностью ниэко- и высокоактивных штаммов руминококков и их адге-зизностью на обеих субстратах была невысокой.То есть.увеличение адгезивности бактерий не сопровождалось обязательным нарастанием активности >-глюкозид«?зы румминоко-ков.Кроме того.отсутствовала коррелятивная связь мечду сьоростьв расцепления очищенной целлюлозы и ji-глюкози-

дазной активностью,а увеличение времени расщепления на-тивной клетчатки у нлзкоактивных штаммов вело к нарастанию |»-глюкозияазной активности.

Таким образом,из трех основных типов целлюлаз - целло-биогидролззы и зндопюканазы имели высокую взаимосвязь яр1ДУ активностью и адгезивными свойствами руминокок-ков,тогда как ^-глюкозидазз достоверной коррелятивной связи с адг^зивность") руминочокков не прочв.-чла.

Поскольку микроорганизмы способны секретировап ьаь внутриклеточное.так и внеклеточные ферменты.мы резичи выяснить как ведут себя в этом плане руминококки.

Исследования показали.что все три типа ферментов целлв-лазного комплекса с^кретируются руминококками в культу-ральную жидкость,но 552 целлобиогидролазы.около 602 эн-доглюканазы и 482 .Р-глшкозидазы связано с клеткой.

Итак.бактериям рсда Яшппососсиз присуще наличие все^ главных типов ферментов целлюлозолитического комплекса.причем достоверных видовых различий в активности этих ферментов не обнаружено.Все виды коррелятивной свзи между активностью руминококков и их свойствами (скоростью расщепления клетчатки.адгезивностью) выне там,где использовали в качестве субстрата инкрустированную лигнином пророднуа клетчатку и у высокоактивных штаммов по сравнению с низкоактивными. Зто позволяет сдеаать вывод.что на-тивная клетчатка индуцирует продукцию целлюлаз.которые руминококкоЕ являются индуцибельными Ферментами, при этом около половины их связано с клеткой.Эти результаты согласуются с данными литературы (Могп5 а.Со!е.!93?\

3.4. ЧСИЙЙНРЗНЛЧ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОЛА • (¡и^ШОСОССиБ

Комплекс ?ерчентсв. расщртячщих кгиган, назначат ксиланазой (Логинева и др..1581).

Проведенные нами исследования показ 1яи,чт- виделрчнч* из содержимого рубца крчпного рогатого скотэ гчктрр/и рода Яиттососсиз кроме высокой целлюлоэолитичрской эктив-ности по отноаению к такому субстрату.как пшеничная ссчо-ма.проявляли и ксилантзную активность. Из 2? зтэммов ру-

I г

минококков,гидролизоваввих.-очищенную целлюлозу в течение первых 2-3,5 суток, только'44,4% обладали ксиланазной активностью. Активность ксиланазы руминококков при использовании в качестве субстрата природной клетчатки была на 79,6% выше (Р<0,05), чем когда субстратом слувила очищенная целлюлоза. .

Мы считаем,что эти различия обусловлены большим содержанием гемицеллюлозы в природной клетчатке в сравнении с очищенной целлюлозой,то есть объясняются механизмом субстратной индукции. - ,

Что касается активности ксиланаз у руминококков, обладающих разной скоростью гидролиза целлюлозы и адгезивное™»,то она у высоко- и - низкоактивных культур была практически одинаковой.

В доступной,литературе мы ' не обнаружили данных о локализации ксиланазы у руминококков и это побудило нас выяснить.выделяется ли она в культуральную среду или связана только с клеткой. -

Исследования по определению активности ксиланазы, в культуральной жидкости с добавлением экстракта разрушенных клеток и только в культуральной жидкости позволили установить,что ксиланаза руминококков локализуется приблизительно поровну внутри и вне клетки.

3.5.ВЫДЕЛЕНИЕ'И ОЧИСТКА ПРЕПАРАТОВ ЦЕЛЛШЛАЗ И КСМЙНАЗН ИЗ РУМИНОКОККОВ

Для более детального" изучения ферментного комплекса руминококков нами были проведены исследования по выделению и очистке ферментных препаратов vb оактерий рода Ru-ffiinococcus. •

Была отработана возможное¡ь глубинного культивирования некоторых штаммов руминококкез (NN ii.3? — наиболее активных продуцентов целлюлаз) в ?.0-литровом ферментере В1-otec.

Ферментацию прекращали на 6-7 сутки,культуральную , жидкость сепарировали и осаждали находящиеся там белки при 4° С двумя 'объемами изопропано;.^, „ двумя объемами ацетона, и двумя,тремя и четырьмя объемами этайола, После

этого жидкости центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин. отделяли осадок и высунивали в вакуум-зксикаторе. Определяли массу препарата. В 100 мл дистиллированной "воды растворяли один грамм препарата.после чего в растворе определяли белок по Лоури, активность целлплаз и ксиланазы.

Анализируя данные активности ферментных препаратов, полученных при осаждении культуральной жидкости зтано-лом.зцетоном л изопропанолом. мы приели к выводу, что наиболее активные ферментные препараты получаются при использовании двух и трех объемов этанола (для целлобио-гидролаэы - изспропанола),при этом происходит частичное разделение серчентов целлвлозолитического комплекса ричинокпкков. Повторяя прсцрдуру осаждения ферментов деумя объемами этанола, можно получить препарат, содержаний пр°им1.'збстЕрнно ji-глвкозидазу с наибольшей активностью. Аналогичные данные были получены Логиновой и другими (1981). когда при осаждении двумя объемами •»тзнола был получен препарат гриба Asperei Hus terreus 17Р, имевший наибольшую активность jb-глвкозидазы (2052 по сравнению с культуральной жидкостью).

В доступной нам литературе наиболее распространенным методом очистки целлюлаз и, в частности, j^-глюкозидазы (преимущественно у грибных продуцентов) было фракционирование на ДЗАЗ-сефадексе А-25 и ДЗАЗ-сефадексе А-50 (Handels. Reese.1964: Hood.1985а,19856; Eriksson a. Petterson, 1973:Логинова и др..1981). Дальнейшее более глубокое разделение целлплаз микроорганизмов проводится уже на основе результатов очистки, полученных после ионообменной хроматографии.

Поэтому с целью возможно более глубокой очистки препаратов целлалаз и ксиланаз R.albus штамма 37. имевшихся у нас пр.: осагдрнии культуральной жидкости двумя и тремя объемами этанола, их Фракционировали на анионообменном ^ЗАЗ-сасздексе А-25. Колонку с ДЗАЗ-СРфадексом А-25 Фирмы "Pharmacia Fine Cheaicals" С'веция) уравновешивали 0,1М зцотаткым бус^ром П4.3 «л 0.2М уксусной кислоты, 35.2 мл 0.2И ацетата нзтрия довести водой до 100 мл) pH 5.0. Один грамм препарата, полученного из культуральной жидкости

штамма N 3?, растворяли в 100 ил 0,1М ацетатного буфера (рН 5,0), нерастворимый осадок отделяли центрифугированием и супернатант наносили на колонку с сефадексом. Ферменты злвировали 0,1М ацетатным буфером СрН 5,0) со -скоростью—40 мл/ч. Собирали фракции по 5 мл, в которых определяли активности зндо-1,4-^ -глвканазы, >-глвкози-дазы, целлобиогидролазы, ксиланазы и белок по Лоури.

Анионообменная хроматография ферментного препарата,- полученного осаждением из культуральной жидкости штамма N3? тремя объемами этанола выявила 1002 активности ^глю-зидазы во фракциях Г-6, при этом более 90% всей активнос-ти>глюкозидазы, вышедшей с колонки, находилось во фракциях 1-4, не содершащих никаких других ферментативных активностей (рис.2). Следовательно, повторение процедур осаждения культуральной жидкости.руминококков тремя объемами этанола с последующим фракционированием ферментного комплекса, используя ионообменную хроматографию, может отделить ^р-глюкозидазу от других ферментов.

полученных осаядением этанолом в отношении 1:3. на колонке с ДЭАЗ-сефадексом А-25 Обозначения:

1- белок по Лоури,

2- целлобиогидролаза,

3- эндо-1.4-^-глвканаза,

4->глюкозидаза,

5- чсиланаза

Препараты целлюлазы и ксилачазы из руминококков лучше зсего выделялись с псмощью осаждения культуральной жидкости дзумя и тремя объемами этанола. В лервпм стуча-проявляется иачслмзльнзя активность^гликсзидазы, зо втором - эндогликаназы. Лзльнайиаа очистка $еоментныл пррпарагоЕ с псмояыв анионооомрнной лромагогрлфии позволила отделить ^гиыозидазу ¿т других рррментов.

3.5.ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Я7АММ0В РОДА 8иМ1Н0С0ССи$

3.6.1.Естественная антибиотикоустойчивость руминококков

Множество бактерий имеют автономно реплицирующиеся внехромосомные ДНК - плазмиды,которые мйгут кодировать разнообразные генетические признаки и. в частности.естественную антибиотикоустойчивость сЯ-плазмиды).

Для обнаруяения штаммов, потенциальных носителей плаз-мид.нами была изучена природная антибиотикоустойчивость руминококков,способных быстро гидролизовать целлюлозу »т выделенных от зивотных, не получавших антибиотиков. Антибиотикоустойчивость проверяли по росту культуры в яидкои среде Хангейта с сульфатом целлюлозы (2Х) и антибиотиком в сравнении с контролем. Все ятаммы были проверены на чувствительность к эритромицину.стрептомицину,рифампици-ну.тетрациклину.хлорамфениколу и ампициллину. катара? вносили в среду з концентрациях 10:25:50:100 мкг/мл.

Исстедования показали, что из 21 зтамма К.Паи^ас1епв 20 росли при добавлении в среду какого-либо одного или

^нескольких антибиотиков в концентрации 10 мкг/мл. 16 штаммов имели устойчивость, к одному из антибиотиков в концентрации 25 мкг/мл, а 7 сохраняло антибиотикоустойчивость при концентрации 50 мкг/мл. Один штамм имелдвой-нуш устойчивость - к эритромицину и хлорамфениколу (25 мкг/мл).

Из 6,штаммов R. albas у пяти отсутствовала чувствительность к одному или нескольким антибиотикам в концентрации 10 мкг/мл. 4 штамма росли при добавлении в среду одного из антибиотиков в концентрации 25 мкг/мл.. Четыре . штамма проявляли антибиотикоустойчивость при концентрации 50 мкг/мл. Два штамма имели двойную устойчивость к тетрациклину и эритромицину (25 мкг/мл).

Таким образом, целлшлозолитические руминококки, обитающие в рубце крупного рогатого скота, обладают природной устойчивостью к стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу. ампициллину, эритромицину и рифампицину (концентрация 10-50 мкг/мл), а некоторые штаммы имеют двойную и да-se множественную устойчивость к этим антибиотикам.

3.6.2. Влияние элиминирующих плазмиды факторов на антибиотикоустойчивость и ферментативные свойства • руминококков

При добавлении в 'среду таких веществ.как акридиновые красители, бромистый этидий.додецилсульфат. натрия и других,а также при нагревании или резкой смене условий культивирования из бактериальных клеток могут высвобовдаться молекулы плазмидной ДНК (Couturier et al.,1988).

Чтобы-изучить на хромоссаалъном-или плазмидном уровне кодируется антябиотикоустг'- гивость руминококков.была проведена обработка антибиотг'^устойчивых' штаммов элимината-ки: акридиновым оранжевым бромистым этидием в концентрации от 0,1 до.1000 мкг/мл.

Исследования показали, -"о гз 20- штаммов R.flavefaciens только два потеряли устп*чивггть после обработки их эли-' кинатами. В результате обработки бромистым зтидием в концентрации 10 ккг/кл и-.традик—..¿м гпанжевым-в концентрации 5 0мкг/мл итак!: îl iw пгтерял сстсЛчивость к тетра-

циклину.а N 52 - к эритромицину.

Из четырех штаммов R.albus два также утрачивали нечувствительность к антибиотику после обработки. При культивировании в среде с бромистым этидием (10 мкг/мл) и акридиновым оранжевым (100 мкг/мл) штаммы N 37 и N 44 потеряли устойчивость к эритромицину. Что касается остальных атам-«ов руминококков. то воздействие бромистым этидием и акридиновым оранжевым не повлияло на их антибиотикоустойчи-ассть.Учитывая данные литературы и собственных исследований, мы предположили,что устойчивость к тетрациклину л эритромицину кодируется плззмидами. а к стррптомицину, ампициллину, рифампицинч и хлорамфениколу - на уровне хромосом.

Было обнаружено, что после культивирования в среда с бромистым этидием и акридиновым оранжевым у тех зе четырех штаммов руминококков (NM 37.44.50.52) изменялась л Ферментативная активность С табл.5).

Таблица 5

Активность целлвлозолитических ферментов и ксиланазы

у некоторых антибиотикоустойчивых штаммов до и после обработки элиминатами

•.Активность целлвлаз,ед/мл :Актив-

Номера :--------------------------:ность

Обработка : штаммов : целло- : эндоглв- глвко- :ксилана-

:биогид- : каназы ¡зидазы : зы.

:ролазы : : ¿д/кл

1 : 1 : 3 : 4 с : 5

37 15,5 13.0 10.3 "1 с

необработанные 44 15.3 20.4 11.1 -

19.7 24.5 10.2 20,3

з2 15*3 от •> и С . с. 9.9 21.3

1б.3±0,9 10,4*0. 1

с, 1.3±0.5 д^о.а

Продолжение т-аблицы 5

• 1 . 0 , : 3 : 4 . : 5 : б

37 15.9 ' • 19,0 0,1 21,2

бромистым 44 17.4 21,0 0.1 -

этидием .. 50 18,9 24,4 0,8 21,7

52 18,1 . 21,9 0,3 22,5

й±я 17,Б±0 .4 0,3±0,1

21,6±0,4 21,8±0.6

3? 16,7 21,0 0,2 22,7

акридиновым 44 16,1 20,8 .0.5 -

оранжевым 50 17,8 23,9 0,4 21,0

52 17,6 22,5 0,4 21,8

«¿в .17.1*0 .3 0,4±0,1

22,1*0,7 22,0±10,8

Зндо-1,4-Д-глвканазназ и целлобиогидролазная активность у антибиотикоустойчивых штаммов руминококков после обработки злиминатами не изменилась.В то же время, практически исчезла '^-глвкозидазная активность: 0,3 и 0,4 против 10,4 ед/мл в случае обработки бромистым этидием (}0 мкг/мл) и акридиновым оранжевым С100 мкг/мл) соответственно. Ксиланазная ; активность у изученных культур руаи-нококков после воздействия этими агентами практически не изменилась.

Резкое снижение одного типа ферментативной активности С >-глюкозидазной) под действием обоих.элиминирующих плаз-миды агентов свидетельствует, по-видимому,о том,что ген ^д-глюкозидазы детерминирован на плазмиде руиинскокка. Остаточная активность этого ферменте, показывает.что "излечивающий" эффект распространяется не на 100% плазмид в •клетках руминококков.

3 качестве стрессового актора, оказывающего элиминирующее действие'на плазмиды, был испытан многократный пересев на среду с глюкозой.

Это привело к снижению ^-глюкозидазной активности на

80.22 и незначительному уменьшению целлобисгидролазной (на 182) и эндоглвканазной Сна активностей, тогда как ак-тиеность ксиланазн не изменилась.

Исходя из полученных результатов,а такае данных Barros 3.7hcsson(1987> л K-зъа: л1Д 1987 ), показавшими селсь «езду эндоглвканазной зктивьостъю риминококкав с хромосомами. можно ^ачгзчлть. ?то -рчы, д»-г?минир*чгвщ<8 ^-г-гкозидазнуя активность, локализованы на плазчидр, а "^ны црллобиогидрслзснгй. 'ндсг.-якэнагной и чсиланэзнси lri-ибнтстрй рэслтложрнь на хромсгсмр.

5.3. Скрининг руминспокков на плазхиды

„л^ гтл'гчиднсгс профиля цетлвлоз^литичоск'/х

"И-ггрсиД рода 5п1тсосс-13 1ыл использован метод лелочно-го лимита пз 5лрнбойму и Доли з модификации й5аип115оп з.КеПу' (1987). Электрофорез ДНК руминококков и маркерных плазмид проводили в горизонтальных пластинках 0.7%-ного агзрозного геля при напряжении электрического поля I В/см. Электрофорез вели в буфере следующего состава: 0.04М трис-ацетат.рН 3,0:0,01М ЭДТА.Гели для визуализации окрашивали бромистым этидием (0,5 мкг/мл) и фотографировали в ультрафиолетовом свете на пленку Микрат 300 с красным светофильтром.

Из 21 антибиотикоустойчивого штамма бактерий рода Кит-пососиг удалось добиться лизиса у 10 штаммов, необрабо- -танных бромистым этидием и аридиновым оранжевым - N 3 N 9 Тс*. N 7 Тс"Сш*ИгЯ 9 Тс'. N 11 Еш*5НГ*Сш*. Н 27 Тс^Сз*. N 37 Ев*. N 44 Ея". Я 50 Тс*. Ч 52 Еш*. а также у четырех ятгммовпстеряввих антибиотикоустойчи-зость после обработки злиминатами - Я 37 Ел3, N 44 Ем5. Ч 50 Тс5. К 52 Еа5.

Электро-роретические исследования выделенной ДНК показали, что I зтаммов N 37 Еа* N 44 Еа*. Я 50 Те* л Ч 52 наблюдались линии пласмиячо1 ЛНК. лвчяашойсз линер-10й."зжяая размером около -сВ. ть-чое зт'»мма.!:тг'5р1нзлв .'стойчибссть ч анти*ло-,ш 14 л чтгат'лс-гир

такозидазниа зкт/в-пс-ь ----э рсл* /х

натами.не имели линий плазмидной ДНК tN•37 Еаf N 44 Ев5, N 50 TcJ, H 32 Ees).

Данные электрофореза препаратов ДНК, свидетельствующие . о наличие плазмид у втаммов Rusinococcus до обработки и их отсутствие у тех ве втаммов после обработки элимината-ми, дали основание заключить,что геныантибиотикоустойчи-вости к эритромицину и тетрациклину и ген^глюкозидазной активности локализованы у руминококков на плазмидах.а ге- : ны, детерминирующие эндоглюканазнув и целлобиогидролазную активности,а'такке устойчивость к стрептомицину,ампициллину, хлорамфениколу и рифампицину, возможно, расположены на хромосоме.

Сравнительный анализ данных электрофореза ДНК руминококков и их антибиотикорезистентности (3.6.1. ), а также о влиянии элиминатов на антибиотикоустойчивость и ферментативные свойства (3.6.2. ) показывает,что бактерии рода Ru-ninococcus имеют, по крайней мере , два типа плазмид. Так, втаммы N37 Еш? N44'Em*и N52 Ет^имеют плазмидную ДНК, несущую гены,кодирующие резистентность к эритромицину и • >-глюкозидазную активность,а втамм N50 Т.с обладает плаз-мидой с генами, детерминирующими устойчивость к тетрациклину и jfr-глюкозидазную активность.

Таким образом,по крайней мере, у четырех штаммов рода Runinococcus - NN 37 Em Г 44: Ев? 50 Тс*и 52 Ев"имеются не криптйческие размером около 6 кВ плазмиды, которые детерминируют устойчивость- к эритромицину- и тетрациклину,а также кодируют jv-глюкозидазную активность.

Для дальнейшей работы-по анализу плазмидной ДНК руминококков нами был отобран вт? !м R.albut Н37 Ел ^.являющийся . активным продуцентом целлвлс.з, который легко лизировался и имел четкий плазмидный п;ч>?иль при электрофорезе.

3.6.4.Рестрикционный анализ плазмидной ДНК .втамма R.albus 37 Ей"

Для построения рестриктной карты плазмиды втамма R.albus 37 Ев? обозначенной pRa 37, .. аользсгзли шесть рест-риктаз: Eco RV, .Hind III., Pvj II, ù<ïl II, Sœa I, Pst I. Маркером служила ДНК фага ; обработанная рестриктазами

Pst I и Hind III. Расщепление плазмидной ДНК проводили в условиях (состав рестрикционного буфера. температура инкуоации) .индивидуальных для каждой рестриктазы. Для построения рестриктной карты плазмиднуш ДНК атамма R. albus 37 Ев подвергав ооработке рестрицирушщими эндо-нукдеазами.

Сравнительный анализ данных трех злектрофореграмм позволил установить наличие четырех сайтов "узнавания рестриктазами на плазмиде. выделенной из штамма R.albus N37 Ей. причем два из них по EcoRU и Hind III уникальны, а два других узнаются" рестриктазой Pvu II. При этом плазчида ренется на следующие фрагменты:

Pvu II - Pvu II - 2.7 т.п.н.

Pvu II - Hind III - 1.3 т.п.н.

?vu I! - EcoRU - 1.3 т.п.н.

EcoRU - Hind III 0.2 т.п.н.

Размеры самой плазмиды в сумме составляют примерно б т.п.н. (рис.3).

PI/u]

т.п.н.

\

4 PVU£

Рис.З.Рестриктная карта pRc37

Плазмида не имеет сайтов "узнавания" по рестриктазам Bgl II, S«a I, Pst I. Кодируемые признаки: устойчивость к эритромицину и Ji-глюкозидазная активность.

Таким образом, из активного продуцента целлюлозолити-ческих ферментов R,albus N37 выделена плазмида pRa 37, несущая гены, детерминирующие образование ^-глвкозидазы и устойчивости к эритромицину.

4. ВЫВОЛН

1. Природная популяция бактерий рода Ruilnococcus в рубце крупного рогатого. скота неоднородна по скорости гидролиза очищенной целлюлозы и может быть подразделена на высоко-, средне- и низкоактивные штаммы. Из 46 изученных штаммов R.flavefaciens 17,4% • были высокоактивными,а 28,32 и 54,32 средне- и низкоактивными. Среди 12 штаммов R.albus по 252 составляли высоко- и среднеактивные.а 50% культур были низкоактивными.

2. Скорость гидролиза целлюлозы руминококками находится в прямой зависимости от их способности прикрепляться к субстрату и характеризуется достоверной (Р<0,05) коррелятивной связью г=0,69. Средний показатель адгезии штаммов руминококков, разрушающих очищенную целлюлозу за 48 ч . 14,54 ± 0,42), был на 47,22 .выше (Р<0.05) такового у культур, деградировавших целлюлозу за 60 ч (2,40 i 0,40), и на 50.22 (Р<0,05) больше, чем у штаммов, расщепляющих фильтровальную бумагу за 84 ч (2.22 ± 0,19), Видовых различий в этих свойствах у изученных руминококков не обна-рияено. .

3. Бактерии рода Ruainococc 'S имеют комплекс целлюлозо-литических ферментов, состоя, й из трех типов целлюлаз: зндо-1,4-^-глвканазы. целло^логидролазы и ^/-глвкозидазы, а такие содержат ксиланазныя комплекс. Активность этих Ферментов увеличивается с заменой источника углерода -

• ачикенной целлвлозк на нативную клетчатку: эндо-1,4-^ -глвканазы - на 82%. целлобиогидролазы - на 54%, ^/ъ-глвко-зияазн - на 402 и ксиланазк - на 7",6%, то есть ферменты руминококков является индуциоельнвми. Около половины целлюлаз и ксиланазы локализованы внутри и вне клетки бакте-

рий.

4. йнионоооменная хроматография на ДЭАЗ - свфадексе й-25 позволяет отделить/-глвкозидазу (до 90%) ферментного препарата, полученного осаждением культуральной жидкости штамма N37 тремя объемами зтанола, от других ферментов целлюлозолитического комплекса и ксиланаз.

5. Целлюлозолитические руминококки. обитавшие в рубце крупного рогатого скота, обладавт природной нечувствительностью к стрептомицину, тетрациклину.ампициллину.хло-рамфениколу, эритромицину и рифампицину (концентрации 10-50 мкг/мл). При этом 42% штаммов R.flavefaciens и 50% штаммов R.aibus имеют множественнув устойчивость (концентрация 10 мкг/мл) к трем и даже четырем антибиотикам одновременно. Природная устойчивость руминококков к анти-оиотикам после ооработки их элиминатами (бромистый зти-дий.акридиновый оранжевый) у многих клонов может теряться. но не у всех. Устойчивость клеток к тетрациклину и эритромицину кодируется плазмидами.а к стрептомицину, ампициллину, рифампицину и хлорамфениколу - на хромосомах.

6. В клетках целлюлозолитических бактерий рода Ruaino-coccus имеется, по крайней мере, два типа плазмид с размерами около б т.п.н., одна из которых несет ген ^-глвко-зидазы и устойчивость к тетрациклину, а другая, помимо гена^-глвкозидазы, имеет ген устойчивости к эритромицину. Выделенная из целлюлозолитического штамма R.albus N37 плазмида pRa37 не является криптической. Она несет гены устойчивости к эритромицину (25 мкг/мл) и >-глвкозидазной активности.

7. Составлена рестрикционная карта плазмиды, выделенной из штамма R.albus3? - активного продуцента целлюлозолитических ферментов и ксиланазы. Общий размер плазмиды -примерно b т.п.н. Плазмида имеет 4 сайта "узнавания", два из них уникальны (EcoRU, HindiII). остальные два имеет рестриктаза PuuII. При этом образуются следующие фрагменты: PvuII - PwuII - 2.3 т.п.н.: PvulI—Hindi II = 1.8 т.п.н.: PvuII-EcoRU = 1.3 т.п.н.: EcoRlMhndlll = 0.2" т.п.н. Плазмида не имеет сайтов 'узнавания' рестриктазами Bei II. Sma I. Pst I.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РйБОТН

1,.Тараканов Б.В., Д.В.Лавлинский. Физиолого-биохииичес-кие свойства бактерий рода Ки*1пососси$. Бюллетень ВНИИФБиП, 1990,.в, 2 (98). с.76-79.

2. Тараканов Б.В., Д.В.Лавлинский; Физиолого-биохимичес.-кие свойства бактерий рода {^тпососсиз. Международная конференция ."Биологические основы высокой продуктивности сельскохозяйственных животных". Тезисы докладов. Боровск, 3-7 сентября 1990, ч.П, с.124-125.

3.. Тараканов Б.В., Д.В.Лавлинский. Взаимосвязь между цел-лвлозолитической активность» и адгезивностьв у бактерий рода Ри«1пососси5. , Всесоюзная конференция "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства".-' Тезисы докладов. Алма-Ата, 1990,'секция 1, с.82. •

4. Тараканов Б.В., Д.В.Лавлинский.'Естественная антибио-тикоустойчивость у бактерий рода {инипососсиз. Всесоюзная конференция "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". Тезисы докладов. Алма-Ата, 1990, секция I, с.83.