Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимические и некоторые генетические аспекты биологии бактерий рода Ruminococcus

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимические и некоторые генетические аспекты биологии бактерий рода Ruminococcus"

.ИОСКЛВСШ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА тралового КРАСНОГО ЗНАЙЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ имени К.А.ТИМИРЯЗЕВА

Р г с -эд—

1 1 О?"

Нл правах рукописи

Лавлинский Лмитрий Юрьевич

ФИЗИОЛОГО-БИОХИКИЧЕСКИЕ И НЕКОТОРИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОЛОГИИ БАКТЕРИЙ РОЛА ЯиИ1НОСОСС115

03.00.07 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЖКВЙ - 1995 г.

1 "

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных

2ИВ0ТНЫХ

Научный руководитель:

доктор биологических наук Б.В.Тараканов

Официальные оппонентн: . я

доктор биологических наук4

д«шф биологических наук I/ Ведущее учреждение: \Л/ё>е^в>

С^&^еи-^бл^ ¿¿¿У.

Защита диссертации состоится " 4 " октября 1995 г.

в 16 часов на заседании Специализированного совета

К{6 \при Тимирязевской сельскохозяйственной академии по ад. твпо _____ и скл т.....„_ ло тгуп

чсьу I 1 ь/ а V V 1 аи^поа, « —оа V , д пнпрмлсрьпим ул. , ~г л. и ч с пип ииос 1 ¡ьлп.

С диссертацией иожно ознакомиться в библиотеке Тимирязевской сельскохозяйственной академии

Автореферат разослан ":г.

Ученый секретарь Специализированного совета , ..

биологических наук Лу& е-бСЦф у/

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Клетчатка грубых корнов - основной питательный субстрат, обеспечивавший энергетические потребности жвачных животных, используется последними на 40-55Z от обвего ее содержания в корме. Низкая усвояемость клетчатки грубых кормов жвачными аивотными ставят задачу повыгення эффективности ее использования. ¿¡ля рееения этой проблемы необходимо выяснить какие факторы в первув очередь лимитирувт процесс утилизации целлилозы.

Как известно, расвепление клетчатки в преджелудках до усвояемых углеводов осуиествляется целлвлозолитическими микроорганизмами, обладасщими различной ферментативной активность«!. Поэтому одним из перспективных путей решения проблемы эффективной утилизации клетчатки может явиться создание новых высокоактивных втаммов на основе целлвло-золитиков рубца. Это может быть осуществлено с помощью методов генной инженерии. Однако, начало генноинженерних работ по конструировании активных продуцентов целлвлаз сдерживается из-за отсутствия данных о биохимических и генетических особенностях целлилозолитических бактерий рубца, в первую очередь таких,как Ruainococcus albus и Rueinococcus flavefaciens. Более того, работы с бактериями рода Ruiinococcus у нас в стране не ведутся и они отсутствует в отечественных коллекциях.

Актуальность и необходимость исследований по осуществление генноинженерноге конструирования акгивних продуцентов целлвлаз послужили основанием для проведения нас -тоявей работы.

Цель и задачи исследования. Цельс работы было дать характеристику биохимических свойств и генетических особенностей бактерий рода Ruainococcus к получить атамми, перспективные в качестве доноров генов, кодирующих синге? целлвлаз.

были поставлены следус?ие задачи:

Нвыделить из рубиа жвачных кибстнкх бактепии ре да Р.ч-linococcus к отобрать жтаммы с максимальной иеллслозсли-тической активкостьв;

2)исследовать комплекс целлилозолитических ферментов бактерий рода Ruainococcus:

3)провести скрининг выделенных итаммов на плазмиды и выяснить кодируемые ими функции.

Наччная новизна. Установлено, что бактерии рода Rumino-coccus имеют комплекс целлвлозолитических ферментов, состоящий из трех типов целлюлаз: зндо-i,4-^-глюканазы, цел-лобиогидролазы и ^глюкозидазы, а также содержат ксиланаз-ный комплекс. При этом все целлвлазы и ксиланазы румино-кокков являются индуцибельными ферментами и локализованы примерно поровну внутри и вне клетки.

Отделенаjb-глюкозидаза ферментного препарата штамма N37 R.albus от других ферментов целлвлозолитического комплекса и ксиланазы с помощью осаждения культуральной жидкости этанолом и последующей анионообменной хроматографией на ДЗЙЗ -сефадексе А-25.

Установлено,что природная устойчивость руминококков к тетрациклину и эритромицину кодируется плазмидами.а к стрептомицину, ампициллину, рифампицину и хлорамфениколу - на хромосомах. При этом клетки бактерий рода Ruiinococ-cus содержат, по крайней мере, два типа некриптических плазмид с размерами около 6 т.п.н., одна из которых несет ген ^-глюкозидазы и устойчивость к тетрациклину,а другая, помимо гена>-глюкозидазы, имеет ген устойчивости к эритромицину.

Составлена рестриктная карта плазмиды, выделенной из втамма R.albus 3?- активного продуцента целлвлозолитичес-ких ферментов и ксиланазы.

Практическое значение работы. Результаты работы могут быть использованы в научно-исследовательских лабораториях, занимавщихся изучением микрофлоры пищеварительного тракта', проблемами целлюлолизиса, а также в теоретическом курсе подготовки студентов биологических, зооинженерных и ветеринарных факультетов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на научных семинарах лаборатории биотехнологии микроорганизмов пищеварительного тракта и отдела питания с.-х.животных ВНИИФБиП.на Международной конференции по биологическим основам высокой продуктивности с.-х.животных в Калуге (1990) и на Всесоюзной конференции. "Микробиологические и биотехнологические основы интенсифи-

нации растениеводства и кормопроизводства" в Алма-Ате (1990).

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения и выводов. Список литературы включает 206 названий. Диссертация излоаена на 160 страницах машинописного текста, содергит 9 рисунков и 18 таблиц.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вивотные и рационы. Анаэробные целлвлозолитические бактерии рубца выделяли из рубцового содергимого коров черно-пестрой породы, получавших еаедневно в составе рациона по 3 кг пшеничной соломы, 20 кг силоса, 10 кг кормовой свеклы и 7 кг комбикорма. Рубцовое содервиное брали через фистулу или с помощью пищеводного зонда от вивотных вивария ВНИИФБиП (г.Боровск), 0ПХ "Ермолино" Боровского района Калуаской области,колхоза XX партсъезда Каширского района Вороневской области и колхоза "Путь Ильича" Калачеевского района Воронекской области. Выделение анаэробных целлдлозолитических бактерий рубца.

Для первичного выделения анаэробных целлюлозолитических бактерий использовали питательную среду Хангейта (Hungä-te,1950).Чистые культуры выделяли на агаризованной среде, используя метод "roll tube culture" Hungate (1963). Поддервание чистых культур. Полученные чистые культуры пересевались каждые 3-5 дней. В дальнейвем культивирование бактерий вели на синтетической среде Скотта и Дехори-ти (Scott a.Dehority,1965).

Длительное хранение штаммов осуществляли методом за-морагивания в яидком азоте или в морозильной канере при - 70 С по Герхардту (1984).

Морфология и культуральные свойства. При проведении идентификации выделенных чистых культур до вида исследовали общепринятыми методами морфологию клеток,размеок, отношение к окраске по Граму,спорообразование.подвигность. морфологию колоний на плотных средах,характер ооста н нидких средах.

Биохимические тесты - наличие каталазк определяли <ж/.

внесении в среда с культурой IX перекиси водорода;серово-дород обнаруживали с помощью бумажек,пропитанных уксуснокислым свинцом,а аммиак - бумажек Крупа. Индолообразова-ние определяли по качественной реакции с реактивом Зрлера в модификации Ковача ( 1976 ) .разжижение желатины устанавливали по Герхардту (1984), восстановление нитратов - по реакции с реактивом Грисса (1976), водород - общепринятыми методами.

Изучался рост культур при разных температурах и pH среды.

Определялись ферментационные характеристики и конечные продукты брожения.

Для выяснения способности изучаемых микроорганизмов сбраживать различные сахара руминококки выращивали на синтетической среде Scotta.Dehority, в которую вводили исследуемые углеводы в концентрации 05'/..Образование кислоты определяли по изменении окраски с помощью индикатора бромкрезолпурпура, находящегося в среде (1,6%-ный спирто-вый раствор).

При идентификации бактерии в качестве руководства использовали определитель Берги (1984).

Адгезивные свойства руминококков оценивали по количеству прикрепленных бактериальных клеток к формалинизирован-нык эритроцитам СБрилис и др.,1986).

Биохимические методы. Конечные продукты .ферментации целлюлозы определяли после 10 суток инкубации чистых культур.при 39°£. Культуральнув видкость освобовдали от бактерий центрифугированием.

Летучие жирные кислоты и этанол определяли с помощью ■ газовой хроматографии,Определение нелетучих жирных кислот проводилось на газо-иидкостном хроматографе с детектором по теплопроводности.При этом молочную и янтарную кислоты з культуральной жидкости переводили в метиловые эфиры. Стандартную смесь метилировали и экстрагировали хлороформом такие,как ;i пробы с культурой (Нитрука,1978). "

Знзиматические активности. Суммарную целлшлозолитическую активность руминококков определяли визуально по скорости расщепления фильтровальной бумаги на жидкой среде Scott а. Dehority (1965).Активность комплекса целлюлозолитических

' ферментов к ксиланазу определял;" по методике Нсмаиловоп .' др.( 1375 ),измеряя количество редуцируют?;; вепеств калориметрически]? методо!1. Sonogvi a.ilelson (1944,1952) nw длине волнл 600 ни в навете с толщиной рабочего слог? 2

Определение активности целлвлаз проводили после 72 культивирования втаммов на среде Scott a.Behority (186Ь при 39"С. В качестве единственного источника углерода использовали шильтровальнув бумагу (27.) или пкеничнув солому (27.),

Выделение целлэлозолитических ферментов и ксчлзназк. Для изучение ферментативного комплекса руиинококкот проводили наработку культур методом глубинного культив; -рования на 10-ти литровом ферментере "Biotec" г теченг" 6-7 суток (Иванова с: соавт., 1980 ). При этоь' использовали. жидкую среду Скотта-Дехорити с пшеничном соломо; С 27.),предварительно измельченной на кельнице.

Ферментные препараты.осавденные иг культурально' сиг.-кости разными объемами этанола и изопропанола,Фракцг;от -ровали на анионообменном ДЗЙЗ-сефадексе fl-25 по Логиноро» и др.(1981 ),

Б каждой фракции определяли белок по Лоури н активное' исследуемых ферментов.

Генетические методы исследований.йнтибиотикоустойчивог:. проверяли по росту культуры в еидкой среде Хангейта сульфатом целлилозы (27.) и антибиотиком в сравнении • контролен.Все итанмы оыли проверены на чувствительность .к эритромицину, стрептомицину, рифанпицину. тетрациклину, хлорамфениколу и ампициллину.которые вносили в среду до конечных концентраций:10;25;50;100 мкг/мл. Выявленный антибиотикоустойчивые штаммы подвергали воздействии элиминирующих внехромосомние генетические детерминант!' агентов, после чего снова определяли их антибиотикорезис-тентность и ферментативные активности. В качестве элиминирующих агентов применяли бромистый этидий и акридиновш; оранвевый в концентрациях : 0,1; 1,0: 10,0; 100,0;10с0,': мкг/мл. В качестве элиминирующего фактора использовал), такке многократный пересев нтамнов на среду с глвкозоГ:, являющейся единственным источником углерода. Скрининг втакыов на плазиидц.йнтибиотикоустойчивые втанви,

1 1

гидролизовавиие'целлюлозу в течение первых 2-3,5 суток, и штаммы,теряющие устойчивость к антибиотикам после обработки злиминатами, подвергали щелочному лизису, а выделение плазмидной ДНК проводили по методу BirnboiH а. Dolly в модификации Asmundson а.Kelly (1987). Рестрикционный анализ плазмидной ДНК. Обработку плазмидной ДНК рестриктазами проводили по Герхардту (1984). В качестве маркеров использовали ДНК фага Я .порезанную рестриктазами Hind III и Pst I, а также плазмиды pUZ (11.3 тпн ), RSF1010(8,9 тпн), pUS18 (2,7 тпн), pBR322 (5,4 тпн) - полученные во ВНИИгенетика (г.Москва).

Для картирования выделенной плазмиды применяли следующие рестриктирующие эндонуклеазы: EcoRI.EcoR U,Ban HI, Hind III, Pst I, Sma I, Bgl II, Pvu II (НПО "Фермент", г.Вильнюс).

Расщепление очищенной ДНК проводили в условиях (состав реакционного буфера,температура инкубации) индивидуальных для каядой рестриктазы.в соответствии с рекомендациями изготовителя.При совместной обработке препарата несколькими рестриктазами,если это необходимо,проводили реакции,последовательно переосаждая ДНК эталоном в присутствии 5М ацетата аммония по Маниатис и др.(1984).

Результаты всех исследований обработаны статистически (Костылев с соавт.,1991).Значение критерия достоверности Р при оценке полученных данных определяли по таблице Стьюдента и с использованием ЭВМ.

3.РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. МОРФОЛОГИЯ, ШЬТУРАЛЬНЫЕ И ФИЗИ0Л0Г0-5И0ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ РОДА RUMIN0C0CCUS

Из 38 проб содержимого рубца крупного рогатого скота.взятого из разных хозяйств Калужской и Воронежской областей, было выделено 58 чистых культур.Все выделенные «¡таимы росли в строго анаэробных условиях и были представлены сферическими или слегка овальными грамположитель-ними кокками. Диаметр варьировал в пределах от 0,8 до

б

1,2 мкк. Кокки распол-гал:;сь одиночно, попарно или цепочками, содержащими от 4 до I? клеток,

На плотной среде с рубцозой зидкостьв румминококки образовывали несколько типов колоний. 46 втаыиов формировали различной формы желтые колонии,поверхностные или глубинные, чечевицеобразные, цельные, с ровными краями,диаметром 1,5-4 мм. 12 штаммов образовывали белые или просвечивающие в проходящем свете.поверхностные или глубинные.округлые, с ровными краями колонии.диаметром 2-3 мм.

Все выделенные штаммы расщепляли целлюлозу и целлобио-зу,причем клетчатку гидролизовали с разной - скоростью.Так,из штамма R.flavefaciens 17,42 полностью расщепляли очищенную целлюлозу (фильтровальную бумагу) за 48 ч (группа высокоактивных), 8 ,72 - за 72 ч и 19,6% - за 84 ч (среднеактивные), 45,72 - за 108 ч (низкоактивные) и 8,62 - за 8-9 суток.Среди штаммов R.albus по 252 было высоко- и среднеактивных, а 502 культур оказались низкоактивными.

Кроме целлюлозы и целлобиозы из штаммов R.flavefaciens 11 расщепляли пентозы (17,42 - ксилозу и 6,52 - арабино-зу), 3 атамма - моносахара (4,32 - фруктозу и 2,72 - глюкозу), из дисахаридов, кроме целлобиозы, 6,52 фементиро-вали лактозу и 4,32 - сахарозу,а из полисахаридов,помимо целлюлозы,один штамм гидролизовал эскулин.

Среди штаммов R.albus 33,32 ферментировали ксилозу, 16,72 - глюкозу, 8,32 - фруктозу и 8,32 -лактозу.Ни один из изученных штаммов руминококков не ферментировал маннс-зы.галактозы и мальтозы и не гидролизовал крахмал,глицерин,дульцит.Ни один из штаммов не продуцировал индола.ка-талозы,сероводорода и не .восстанавливал нитраты.но по два штамма каждого вида ражжижали желатину.

Определение конечных продуктов ферментации целлюлозы показало.что более 802 атаммов образовывало уксусную кислоту. Все штаммы R.flavefaciens продуцировали янтарную и один - моЛочнув кислоту. Все штаммы R.albu? образовывали молочную кислоту,а 91,72 - этиловый слирт v водород. Ни один из 58 штаммов не образовывал масляное кислоты.

На основании полученных данных 46 штаммов.которые про-

дуцнровали янтарную - кислоту и при росте на агаризованной среде с рубцовой жидкостью образовывали желтые колонии, были идентифицированы нами как Ruainococcus flavefa-ciens.a 12 безпигментных штаммов,не образовывавших янтарную кислоту, отнесены к виду Ruainococcus albus.

3.2.ГИДРОЛИЗ ОЧИЩЕННОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ И АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА РУМИНОКОККОВ

Целлюлозолитические микроорганизмы характеризуются способностью гидролизовать высокоупорядоченную целлюлозу до более простых Сахаров:целлобиозы и глюкозы.Наиболее просто целлюлозолизис можно определить визуально по скорости расщепления фильтровальной бумаги,представляющую собой очищенную целлюлозу.

В серии опытов in virto была изучена скорость гидролиза целлюлозы у 12 штаммов R.albus и 46 штаммов R.flavefaciens. Исследования показали,что все изученные штаммы обладали неодинаковой скоростью гидролиза целлюлозы.Так, И штаммов полностью расщепляли полоску фильтровальной бумаги за 48 ч после посева - высокоактивные (NH 19,37,44 -штаммы R.albus и N 9, 24,31,34,43,48,50,58 - штаммы R.flavefaciens), четыре штамма - через 60 и 72 ч - активные (NN 6,7,8,52 - R.flavefaciens), 12 штаммов - через 84 ч - среднеактивные (NN 16, 27, 49 - R.albus и N 3,10,1.1,18,23,35,36,41,55 - R. flavefaciens). Остальные штаммы были -отнесены к низкоактивным, среди которых И разрушали целлюлозу за 96 ч (R.albus NN 39 и R.flavefaciens NN 1,4,5,13,26,29,30,46,53) 13 - через 108 ч (R.albus . NN 2,21,28 и R.flavefaciens NN 12,14,15,17,20,25,32,40, 47,57) и 6 штаммов только спустя 8-9 суток (R.albus N 45 и R.flavefaciens NN 22,33,38,51,54).

Известно,что способность сбраживать какой-либо субстрат бактериальными клетками тесно связана с их адгезивными свойствами (Брилис с соавт.,1982;Брилис,1983;Брилис я др.,1986;Bayer et al.,1983;Savage,1970). В связи с этим была изучена способность руминококков к адгезии.Трудности наблюдения за этим процессом на очищенной целлюлозе ■лл'л нативной клетчатке и невозможность точного подсчета

осевших на целлюлозе кокков заставили нас искать другой подходящий субстрат для изучения адгезии руминококков. Таким субстратом были выбраны эритроциты человека.Они имеют на своей поверхности гликофорин - вещество,идентичное гликокаликсу эпителиальных клеток,на котором располо-нены рецепторы для адгезиноб бактерий.По мнению Брилис и др. (1986) эритроциты являются универсальной моделью для изучения адгезии различных микроорганизмов.

Для изучения адгезивных свойств было отобрано 6 штаммов R.albus и 21 штамм R.flavefaciens, которые полностью расщепляли очищенную глюкозу в течение первых 2-3,5 суток.Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Адгезивные свойства руминококков

Номера : штаммов: СПА : И : « « ИАМ : : Номера : : штаммов: СПА : к : « « НАМ

3 1,1 74 1,49 6 2,0 60 3,33

7 1,1 78 1.41 8 1,2 54 2,22

9 3,9 88 4,43 10 2,7 84 3,21

11 1,0 48 2,08 16 1,4 88 1,59

18 0,6 40 1,75 19 3,3 64 5,16

23 0,7 36 1,94 24 4,2 86 4,88

27 1,3 50 2,60 31 5,2 90 5,78

34 6,2 96 6,46 35 0.6 16 3,75 '

36 1,2 66 1,82 37 6,3 98 6,43

41 0.9 38 2,37 43 1,5 52 2,89

44 4,2 86 4,88 48 2,2 70 3,14

49 0.9 48 1,88 50 1,7 56 2,14

58 2,1 64 3,28

Обозначения: СПА - средний показатель адгезии, К - коэффициент участия эритроцитов в процессе адгезии (процент эритроцитов,имеющих на своей поверхности адгезированные бактерии). ИАН - среднее количество клеток на однон участвующем в процессе адгезии эритроците (см.методику ).

Из данных таблицы 1 следует,что из 27 изученных штаммоБ

а

7 обладали высокой адгезивностьв ( N 19, 37, 44 - итаммы R.albus и N 9, 31', 34 - R.flavefaciens), 9 - средней (N 27 - R.albus и N 6,10,35,43,48,50.52,58 -R.flavefaciens) и 7 -низкой ( Я 49 - R.albus и N 8,11,23,36,41,55 -R.flavefaciens). У 4 штаммов она отсутствовала ( N16 -R.albus и NN 3, 7, 18 - R.flavefaciens).

Мы также выясняли влияет ли способность руминококков прикрепляться к субстрату на скорость расщепления целлюлозы? Результаты такого сопоставления представлены на рисунке 1.

И AM

5 4

11

12

48 ч 60-72 ч 84 ч

Рис.1. Связь целлилолизиса руминококков с их адгезивными свойствами

Обозначения: ИАМ - адгезивность; Т- время полного расщепления фильтровальной бумаги (ч); цифры в столбцах - количество штаммов в каждой группе.

Средний показатель адгезии штаммов, разрушающих фильтровальную бумагу за 48 ч С4.54+0,42), был на 47,2% боль-га (Р'„0,05) такового у штаммов .деградировавших целлюлозу за 60 ч V2,40 + 0,40), и на 50,27. (Р< 0,05) больше,чем у :таммов,расцеплявших фильтровальную бумагу за 84 ч ,2.22+0.19). Видовых достоверных различий в этих свойствах у изученных штаммов не обнаружено. Между скоростью разрушения фильтровальной бумаги и адгезией бактерий наб-

X

людалась достоверная (Р<0,05) корреляционная связь г=0,69.

Таким образом,руминококки обладают разной скоростью гидролиза целлюлозы,которая находится в прямой зависимости от способности бактериальных клеток прикрепляться к субстрату.

3.3.АКТИВНОСТЬ ЦЕЛЛЮЛАЗ У БАКТЕРИИ РОДА RUMIN0C0CCUS

Мы исследовали у руминококков способность к образованию трех главных типов целлюлаз,необходимых для гидролиза клетчатки: эндо-1,4- ß -глюканазы (группа эндоглюканаз), целлобиогидролазы (группа экзоглнжаназ) и ^З-глвкозидазы (группа целлобиаз).

В этих опытах использовали 6 штаммов R.albus и 21 штамм R.flavefaciens, которые активно гидролизовали целлюлозу в течение первых 2-3,5 суток.Культивирование руминококков вели на средах с фильтровальной бумагой или пшеничной соломой в качестве единственного источника углерода,а опре- . деление активности энзимов проводили спустя 72 ч после начала культивирования.

Намине обнаружено достоверных различий между'активностью отдельных целлюлаз у R.albus и R.flavefaciens на одном и том же субстрате (табл.2).

Таблица 2

Активность целлюлаз R.albus и R.flavefaciens с разными источниками углерода

румино- :татив-: среда с очищен: среда с натив-:верность.

кокков : ная : ной целлюлозой: ной клетчаткой: V

:актив-: : :

:ность : : :

Активность целлюлаз, ед/мл:

Виды :Фермен:

: Досто-

3

ЦБ Г

R.albus 3Г п=6 Г

13,47+1,02 20.73+0.8Ь <0,001 16.30+1,-31 31,43+0,66 <0,001 '9.40+0,69 11,68+0,61 <0,05

Продолжение таблицы 2

1 : 2 : 3 : 4 : 5

ЦБГ 12,96+4,20 20 ,05+0,37 <0,05

R.flavefa- ЗГ 17,50+6,36 31 .94+0,42 <0,05

ciens Г 8,60+2,43 12 ,48+0,34 <0,05

род ЦБГ 13,04+3,30 . 20 ,13+0,35 <0,01

Ruminococ- ЗГ 17,35+5,49 31 ,37+Ö,35 <0,05

cus Г 8,77+2,12 32 ,30+0,30 <0,05

п=27

Обозначения: ЦБГ - целлобиогидролазная активность; 3Г -i,4-^эндоглвканазная активность: Г -_/^глвкозидазнаа активность

Замена очищенной целлюлозы природной клетчаткой привела к возростанию целлобногидролазной активности на 542. 1,4-./^-глвканазной активности - на 40,32 у всех втаммов рода Rufflinococcus. ^глвкозидазная активность у R.flave-faciens на очищенной целлвлозе составила 8,60 ед/мл. Замена зтого источника углерода нзтивной клетчаткой привела к увеличению активности энзима до 12,48 ед/мл (Р<0,05) или на 45,12 , активность того же фермента у R.albus на "очищенной целлвлозе - 9,40 ед/мл,а на природной клетчатке - 11,68 ед/мл (Р<0,05),то есть выше на 24%. Эта же тенденция сохраняется и в отношении двух других энзимов у обоих видов руминококков.

Таким образом.активность целлюлозолитических ферментов на инкрустированной лигнином природной клетчатке была значительно ваше по сравнению с использованием в качестве источника углерода очищенной целлюлозы,причем более всего зозросла эндоглзжаназная активность (на 87% и 832 у R,albus и R.flavefaciens соответственно). Из-этого мокно сделать вывод,что нативная клетчатка индуцирует продукции целлвлаз, которые у руминококков являются индуцибельными Ферментами.

Скорость гидролиза целлюлозы целлвлазаии определяют как время, необходимое для расщепления ее до простых Сахаров. Нами была определена активность целлюлаз руминококков по группам с разной скорость® гидролиза и на различных субстратах С табл.3).

Таблица 3

Активность целлюлаз руминококков,обладающих разной скоростью гидролиза целлюлозы

Источ-:Фермен-: Активность целлюлаз, ед/мл

ник :татив- :--------------------------------------

: ная ' : группы гидролиза целлюлозы

углеро: актив- :---------------------------'-----------

да : ность : за 48 ч : за 60-72 ч : за 84 ч : : п=Н : п=4 : п=12

ЦБГ

очищен- ЭГ ная Г

целлюло за

14,93+0,68 17,92+1,19 8,78+0,44

12,70±0,84* 17,23+0,85 7,95+0,60

11 ,45+0,33* 16,87+0,48 9,13+0,29

ЦБГ

нативная ЭГ клетчат- Г ка

21,80+0,42 31,82+0,30 11,87+0,27

21,73+0,29 32,48+0,90 12,60+1,01

18.72+0.26* 30,37+0,61* 12,85+0,54

* - Р<0,05 (достоверность разницы по сравнению с группой руминококков, расщепляющих целлюлозу за 48 ч)

Как видно из таблицы 3,высокоактивные штаммы руминококков (гидролиз целлюлозы за 48 ч) имеют более высокие значения активности целлюлаз, за исключением .д-глюкозидазы, по сравнении с низкоактивными штаммами (гидролиз за 84ч). Так,активность целлобиогидролазы у всех штаммов с высокой скоростью гидролиза клетчатки (за 48 ч) на очищенной целлюлозе была выше,чем у штаммов с низкой скоростью гидролиза клетчатки (84 ч) на 30,4% (Р<0,05), а на природной

клетчатке - на 16,52 СР<0,05 ).Между скоростью гидролиза очищенной целлюлозы и целлобиогидролазной активностью существует высокодостоверная положительная корреляционная связь г=0,79 (Р<0,05).Эндо-1,4-ji-глюканазная активность штаммов с высокой скоростью гидролиза клетчатки была на 5У. выше ,чем у штаммов с низкой скоростью гидролиза клетчатки СР<0,05,источник углерода:нативная клетчатка). Скорость гидролиза очищенной целлюлозы (гидролиз за 48 ч и 84 ч ) и активность зндо-1,4-jb-глнжаназы также находятся в достоверной СР<0,053 положительной корреляционной зависимости С г = 0,87).тогда как активность jV-глнжо-зидазы у высоко- и низкоактивных штаммов была практически одинаковой.

Что касается межвидовых различий в активности различных целлюлаз.то исследования показали,что активность целлоби-огидролазы у штаммов R.albus и R.flavefaciens, гидролизу-ющих целлюлозу за 48 ч.была достоверно выше,чем у культур, расщепляющих ее за 84 ч.

Нежду всеми типами целлюлозолитической активности и адгезивными свойствами руминококков существует достоверная положительная коррелятивная связь. Она имеет довольно высокие значения между целлобиогидролазной активностью и адгезией руминококков, а также между эндо-глвканазной активность» на обоих субстратах и индексом адгезии бактерий рода Ruainococcus.

При этом значения коррелятивной связи между эндоглюка-назной активностью и индексом адгезии.микроорганизмов выше,чем между целлобиогидролазной активностью и адгезив-ностьв руминококков. Эта закономерность сохранялась как у высокоактивных штаммов,так и низкоактивных, хотя у последних значения коэффициентов корреляции были несколько няне.

Коррелятивная связь между ji-глюкозидазной активностью низко- и высокоактивных штаммов руминококков и их адге-зивностью на обоих субстратах была невысокой.То есть,увеличение адгезивности бактерий не сопровождалось обязательным нарастанием активности ji-глюкозидазы румминоко-ков.Кроме того,отсутствовала коррелятивная связь между скоростью расщепления очищенной целлюлозы и jy-глюкози-

дазной активностью,а увеличение времени расщепления на-тивной клетчатки у низкоактивных штаммов вело к нарастанию jJ-глшкозидазной активности.

Таким образом,из трех основных типов целлюлаз - целло-биогидролазы и эндоглюканазы имели высокую взаимосвязь «езду активностью и адгезивными свойствами руминокок-ков,тогда как j^-глюкозидаза достоверной коррелятивной связи с адгезивностью руминококков не проявляла.

Поскольку микроорганизмы способны секретировать как внутриклеточные,так и внеклеточные ферменты,мы решили выяснить как ведут себя в этом плане руминококки.

Исследования показали.что все три типа ферментов целлю-лазного комплекса секретируются руминококками в культу-ральнуга жидкость,но 55Х целлобиогидролазы,около 60/i эндоглюканазы и 487. J^-глюкозидазы связано с клеткой.

Итак,бактериям рода Ruminococcus присуще наличие все?с главных типов ферментов целлюлозолитического комплекса,причем достоверных видовых различий в активности этих ферментов не обнаружено.Все виды коррелятивной свзи между активностью руминококков и их свойствами (скоростью расщепления клетчатки,адгезивностью) выше там,где использовали в качестве субстрата инкрустированную лигнином пророднуи клетчатку и у высокоактивных штаммов по сравнению с низкоактивными. Зто позволяет сделать вывод.что на-тивная клетчатка индуцирует продукцию целлюлаз,которые у руминококков являются индццибельными ферментами, при этом около половины их связано с клеткой.Зти результаты согласуются с данными литературы (Morris a.Cole. 193? ).

3.4. КСИЛАНЙЗНЙЯ АКТИВНОСТЬ БАКТЕРИЙ РОДА • RUMINOCOCCUS

Комплекс ферментов, расщепляющих ксилан, называют ксиланазой (Логинева и др.,1981).

Проведенные нами исследования показали.что выделенные из содержимого рубца крупного рогатого скота бактерии рода Рипппососсиз кроме высокой целлвлозолитической активности по отношению к такому субстрату.как пшеничная солома.проявляли и ксиланазную активность. Из 21 штаммов ру-

минококков .гидролизовавиих.-очщенную целлюлозу в течение первых 2-3,5 суток, только 44,4% обладали ксиланазной активностью. Активность ксиланазы руминококков при использовании в качестве субстрата природной клетчатки была на 79,6% выше СР<0,05). чем когда субстратом слувила очищенная целлюлоза.

Мы считаем,что эти различия обусловлены большим содержанием гемицеллюлозы в природной клетчатке в сравнении с очищенной целлюлозой,то есть объясняются механизмом субстратной индукции.

Что касается активности ксиланаз у руминококков. обладающих разной скоростью гидролиза целлюлозы и адгезив-ностью.то она у высоко- и низко'активных культур была практически одинаковой.

В доступной литературе мы не обнаружили данных о локализации ксиланазы у руминококков и это побудило нас выяснить,выделяется ли она в культуральную среду или связана только с клеткой.

Исследования по определению активности ксиланазы . в культуральной жидкости с добавлением экстракта разрушенных клеток и только в культдральной нидкости позволили установить,что ксиланаза руминококков локализуется приблизительно поровну внутри и вне клетки.

3,5.ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРЕПАРАТОВ ЦЕЛЛЯЛАЗ И КСИЛЙНАЗН ИВ РУМИНОКОККОВ

Для более детального ' изучения ферментного комплекса руминококков нами были проведены исследования по выделению и очистке ферментных препаратов бактерий рода Ри-липососсиз. . -

Была отработана возможнвг 1 глубинного культивирования некоторых штаммов руыинокою■в СКМ 11,37 - наиболее активных продуцентов целлылаз; в 10-литровом ферментере ЕИ-о!ес.

Ферментацию прекращали на 6-7 сутки,культуральную жидкость сепарировали и осаждали находящиеся там белки при 4° С двумя объемами изопрспанол^, двумя объемами ацетона, и двумя,тремя и четырьмя объема»! зтайола. После

• »

этого жидкости центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 мин, отделяли осадок и высушивали в вакуум- ' эксикаторе. Определяли массу препарата. В 100 мл дистиллированной воды растворяли один грамм препарата,после чего в растворе определяли белок по Лоури, активность целлвлаз и ксиланазы.

Анализируя данные активности ферментных препаратов, полученных при осаждении культуральной аидкости этано-лом,ацетоном и изопропанолом, мы причли к выводу, что. наиболее активные Ферментные препараты получаются при использовании двух и трех объемов этанола (для целлобио-гидролазы - изопропанола),при этом происходит частичное разделение ферментов целлплозолитического комплекса руминококков. Повторяя процедуру осаждения ферментов двумя объемами этанола, можно получить препарат, содержаний преимущественно jb-глЕкозидазу с наибольшей активностью. Аналогичные данные были получены Логиновой и другими (1981), когда при осаждении двумя объемами этанола был получен препарат гриба Aspergillus terreus 17Р, иыевций наибольвую активность ji-глюкозидазы (205У. по сравнения с культуральной жидкостью).

В доступной нам литературе наиболее распространенным методом очистки целлвлаз и, в частности, J^-глвкозидазы (преимущественно у грибных продуцентов) было фракционирование на ДЗАЗ-сефадексе fl-25 и ДЗАЗ-сефадексе А-50 (Handels, Reese. 1964; Hood,1985а,19856; Eriksson a. Petterson, 1973;Логинова и др.,1981). Дальнейшее более глубокое разделение целлвлаз микроорганизмов проводится уже на основе результатов очистки, полученных после ионообменной хроматографии.

Поэтому с целью возможно более глубокой очистки препаратов целлвлаз и ксиланаз R.albus штамма 37, имевшихся у нас при осагдении культуральной аидкости двумя и тремя объемами этанола, их Фракционировали на' анионообменном ДЗАЗ-сефадексе А-25. Колонку с ДЗАЗ-сефадексом й-25 фирмы "Pharsacia Fine Cheaicals" (Швеция) уравновешивали 0.iМ ацетатным буфером (14,8 мл 0,2М уксусной кислоты, 35,2 мл 0.2М ацетата натрия довести водой до 100 мл) рН 5,0. Один грамм препарата, полученного из культуральной аидкости .

атамма N 3?, растворяли в 100 мл 0.1М ацетатного буфера (рН 5,0), нерастворимый осадок отделяли центрифугированием и супернатант наносили на колонку с сефадексом. Ферменты злюировали 0,1М ацетатным буфером СрН 5,0) со скоростью 40 мл/ч. Собирали фракции по 5 мл. в которых определяли активности эндо-1,4-У1-глюканази, ^-гликоэи-дазы, целлобиогидролазы, ксиланазы и белок по Лоури.

йнионообменная хроматография ферментного препарата, полученного осаждением из культуральной жидкости штамма N37 тремя объемами этанола выявила 1002 активности ^гла-зидазы во фракциях Г-б, при этом более 902 всей активности >глюкозидазы, вышедшей с колонки, находилось во фракциях 1-4, не содержащих никаких других ферментативных активностей (рис.2). Следовательно, повторение процедур осаждения культуральной жидкости руминококков тремя объемами этанола с последующим фракционированием ферментного комплекса, используя ионообменную хроматографию, может отделить ^глвкозидазу от других ферментов.

Активность Д3 Оптическая

ед/мл \\ плотность

0,6

ь с.ч

ь \

J_bUJLi.UL-l.-Li

5" й? о" О

Рис.2. Динамика фракционирования г.гмчлозолитических фепментов я ««г^.т^назя зн й.зИшг N 37,

полученных осаждением этанолом в отношении 1:3, на колонке с ДЗАЗ-сефадексом А-25 Обозначения:

1- белок по Лоури,

2- целлобиогидролаза,

3- эндо-1,4-^-гликаназа,

4->глюкозидаза,

5- ксиланаза

Препараты целлшлазы и ксиланазы из руминококков лучше всего выделялись с помощью осаждения культиральной жидкости двумя и тремя объемами этанола. В первом случае проявляется максимальная активностьДглюксзидазы, во втором - зндоглюканазы. Дальнейшая очистка ферментных препаратов с помощью анионообменной хроматографии позволила отделить _/5-глюкозидазу от других ферментов.

3.б.ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ РОДА йиМШОСОССиБ

3.6.1.Естественная антибиотикоустойчивость руминококков

Множество бактерий имеют автономно реплицирующиеся внехромосомные ДНК - плазмидн,которые мо'гут кодировать разнообразные генетические признаки и, в частности,естественную антибиотикоустойчивость (Л-плазмиды).

Для обнаружения штаммов, потенциальных носителей плаз-аид.нами была изучена природная антибиотикоустойчивость руминококков,способных быстро гидролизовать целлюлозу и выделенных от животных, не получавших антибиотиков. Антибиотикоустойчивость проверяли по росту культуры в жидкой среде Хангейта с сульфатом целлюлозы (22) и антибиотиком в сравнении с контролем. Все штаммы были проверены на чувствительность к эритромицину,стрептомицину,рифампици-ну,тетрациклину.хлорамфёниколу и ампициллину. которые вносили б среду в концентрациях 10:25;50;100 мкг/мл.

Исследования показали, что из 21 штамма Р.Г1аие!ас1епз 20 росли при добавлении в среду какого-либо одного или—*

нескольких антибиотиков в концентрации 10 'мкг/мл\ 16 штаммов имели устойчивость к одному из антибиотиков в концентрации 25 мкг/мл, а ? сохраняло антибиотикоустой-чивость при концентрации 50 мкг/мл. Один штамм имел двой-нуш устойчивость - к эритромицину и хлорамфениколу С 25 мкг/мл).

Из б штаммов R. albus у пяти отсутствовала чувствительность к одному или нескольким антибиотикам в концентрации 10 мкг/мл. 4 штамма росли при добавлении в среду одного из антибиотиков в концентрации 25 мкг/мл. Четыре . штамма проявляли антибиотикоустойчивость при концентрации 50 мкг/мл. Два штамма имели двойную устойчивость к тетрациклину и эритромицину (25 мкг/мл).

Таким образом, целлвлозолитические руминококки, обитающие в рубце крупного рогатого скота, обладают природной устойчивостью к стрептомицину, тетрациклину, хлорамфениколу, ампициллину, эритромицину и рифампицину (концентрация 10-50 мкг/мл), а некоторые штаммы имеют двойную и даже множественную устойчивость к этим антибиотикам.

3.6,2. Влияние элиминирующих плазмиды факторов на антибиотикоустойчивость и ферментативные свойства • руминококков

s

При добавлении в '.среду таких веществ,как акридиновые красители, бромистый этидий,додецилсульфат. натрия и других, а также при нагревании или резкой смене условий культивирования из бактериальных клеток могут высвобождаться молекулы плазкидной ДНК (Couturier et al., 1988 ).

Чтобы-изучить на ХрОМОГ:"'.!а.пьном или плазмидном уровне кодируется антибиотикоусто:" ибость рцминококкое,была проведена обработка антибиотг устойчивых' штаммов элимината-ми: акридиновым оранжевым и бромистым этидием б концентрации от 0,1 до 5000 мкг/мл.

Исслсдованил показали, что из 20 штаммов R.flavefaciens только два потеряли устойчивость после обработки их эли-кинатами. В результате наработки бромистым зтидием в концентрации 10 мкг/мл и скркдини. сро.'ОгеБЫм в концентрации 100 мкг/мл штаки H 50 пп.ерял устойчивость к тетра-

циклину.а N 52 - к эритромицину.

Из четырех штаммов R.albus два также утрачивали нечувствительность к антибиотику после обработки. При культивировании в среде с бромистым зтидием (10 мкг/мл) и акридиновым оранжевым (100 мкг/мл) штаммы N 37 и N 44 потеряли устойчивость к эритромицину. Что касается остальных штаммов руминококков, то воздействие бромистым этидиеа и акридиновым оранжевым не повлияло на их антибиотикоустойчи-зссть.Учитывая данные-литературы и собственных исследований, мы предположили,что устойчивость к тетрациклину и эритромицину кодируется плазмидами. а к стрептомицину, ампициллину, рифампицину и хлорамфениколу - на уровне хромосом.,

Было обнаружено, что после культивирования в среде с бромистым зтидием и акридиновым оранжевым у тех же четырех штаммов руминококков (NN 37,44,50,52) изменялась и ферментативная активность (табл.5).

Таблица 5

Активность целлюлозолитических ферментов и ксиланазы

у некоторых антибиотикоустойчивых штаммов до и после обработки элиминатами

Активность целлшлаз,ед/мл :Актив-

Номера :--------------------------:ность

штаммов: целло- :эндогля-: глшко- :ксилака-:биогид- :каназы :зидазы :' зы, :ролазы : : : ед/мл

1 : 2 : з 4 : 5 6

37 15,5 18,0 10,3 . 00 < О , 1

необработанные 44 16.9 20,4 ■11,1 -

50 13,7 24,5 10,2 20,9

52 16,3 22,2 ■ • 9,9 21.3

М±а 16.9±0,9 Ю,4±0, 1

21,3±0.6 21,4+0,8

f

Обработка

Продолкение таблицы 5

1:2:3 : 4 : 5:6

3?

бромистым 44

этидием 50

52 Н±ш

37

акридиновым 44 оранжевым 50

52 М+-Л

15,9 - 19,0 17,4 21,0 18,9 24,4 ' 18,1 21,9 17,6±0,4

21,6±0,4

16,7 21,0 16,1 20,В 17,б 23,9 17,6 22,5 17,1±0,3

22.1*0.7

0,1 21,2

0.1 -

0,8 21,7

0,3 П с: (.(. , и

0.3±0.1

21, .8+0.6

0,2 22,7

0,5 -

0,4 21,0

0,4 21,8

0,4±0,1

22;0±10,8

Зндо-1,4-;^-глвканазная и целлобиогидролазная активность у антибиотикоустойчивых итаммов рукинококков после обработки злиминатани не изменилась.В то же время, практически исчезла :/5-глюкозидазная активность: 0,3 и 0,4 против 10,4 ед/кл б случае обработки бромистым этидием С10 икг/мл) и акридиновым ораняевым (100 мкг/мл) соответственно. Ксиланазная активность у изученных культур руми-нококков после воздействия этими агентами практически не изменилась.

Резкое снижение одного типа ферментативной активности Огликозидазной) под действием обоих элиминирующих плаз-миды агентов свидетельствует, по-видимому,с том,что ген _д-глюкозидазы детерминирован на плазыиде рукинококка. Остаточная активность этого ферменте - оказывает,что "излечивающий" эффект распрог раняется не на 100% плазмид в клетках руминококков.

В качестве стрессового пчктора оказывающего элиминирующее • йсгвие на плазмидк Зг7 испытан многократный пересев на среду с глюкозой.

Зто привело к снижению ,>-глвкозидазной активности на

80,2% и незначительному уменьшению целлобиогидролазной (на 182) и эндоглвканазной (на 132) активностей, тогда как активность ксиланазы не изменилась.

Исходя из полученных результатов,а также данных Barros a.ThoasonC1987) и Kauai at al,(1987), показавшими связь неяду эндоглвканазной активностью руминококков с хромосомами,' можно заключить, что гены, детерминирующие /-глюкозидазнуа активность, локализованы на плазмиде, а гена целлобиогидролазной, эндоглюканазной и ксиланазнсй активностей расположены на хромосоме.

3.5.3.Скрининг руминококков на плазмиды

Для определения плазмидного профиля целлялозолитических бактерий рода Rimnococcus был использован метод щелочного -лизиса по Бирнбойму и Доли в модификации flsaundson a.Kelly (1987). Электрофорез ДНК руминококков и маркерных плазмид проводили в горизонтальных пластинках 0,72-ного агарозкого геля при напряжении электрического пола 1 В/см. Электрофорез вели в буфере следующего состава: 0.04М трис-ацетат.рН 8,0;0,01М ЗДТА.Гели для визуализации окрашивали бромистым зтидием (0,5 мкг/мл) и фотографировали в ультрафиолетовом свете на пленку Микрат 300 с красным светофильтром.

Из 21 антибиотикоустойчивого штамма.бактерий рода Rurai-nococus удалось добиться лизиса у 10 итаммов, необрабо- -танных бромистым этидием и аридиновым оранжевым - N 3 Sa, N б Тс*. N 7 Tc*Ci*Rif"Sa'i, N 9 Тс*. N И Era*Rif*Ca*, N 27 Тс*Еш*Са*, N 37 Еш*. Н 44 Ев*. Я 50 Тс*, N 52 Еш*. э также у четырех штаммовпотерявших антибиотикоустойчи-зость после обработки элиминатами - N 37 Eas, N 44 E¡ns, í 50 Тс5, Я 52 Eas. '

Электрофоретические исследования выделенной ДНК показали ,что у штаммов N 37 Ея,*'Н 44 Ел*. N 50 Тс* и N 52 Егя *аблюдались линии плазмидной ДНК. являющейся яимер-íofl,каждая размером около 6 кВ. Четное зтамма.пптерязшие устойчивость к антибиотикам и. практически чтративше ji-глзкозидазнув активность после обоасотки их «лики-

натами.не имели линий плазыидной ДНК СМ 37 Ейf 11 44 Er N 50 Тс5, К '52 Ее5).

Данные электрофореза препаратов ДНК, свидетельствующие о наличие плазыид у втамков Ruainococcus до обработки и их отсутствие у тех se итамнов после обработки злимината-ми, дали основание заключить,что генн-антибиотикоустойчи-вости к эритромицину и тетрациклину и ген/^гликозидазной активности локализованы у рукинококков на плазмидах.а гены, детерминирующие эндоглвканазную и целлобиогидролазнус активности,а такнге устойчивость к стрептомицину,ампициллину, хлорамфениколу и рифампицину, возможно, располокени на хромосоме.

Сравнительный анализ данных электрофореза ДНК рукинококков и их антибиотикорезистентности (З.Ь.1,), а также и влиянии элиминатов на антибиотикоустойчивость и ферментативные свойства (3.6.2.) показывает,что бактерии рода Ii;.: sinococcus имеют, по крайней мере , два типа плазыид. Так,- стаимы Н37 Ев* N44 Еики N52 Ев'имевт плазмидную ДНК, несущую гены,кодирующие резистентность к эритромицину и

j-глвкозидазную активность,а штамн N50 Тс обладает плаз ккдой с генами, детерминирующими устойчивость к тетрациклину и ^тглвкозидазнун активности.

Таким образок,по крайней мере, у четыре;- штаммов рода Ruainococcus КК 3? Ее Г 44 Еш? 50 Тс"и 52 Еш'имевтся но криптИческие размером около ti кВ плазмиды, которые детео-йинирушт устойчивость к эритромицину и тетрациклину,г такке кодируит ji-глюкозидазнув активность.

Для дальнейшей paoovH по анализу ш-азмидной ДНК румино-кокков нами был отобран dt ■ R.alb „> ИЗ? Еш'\авлявщийся активным продуцентов целлк з, который легко лизировался и имел четкий ллазмидный nj ?иль лгш электрофорезе.

3.6.4.Рестрикционный .дна.. ;з плазыидной.ДНИ

штампа Р. >lbus 37 Еш "

Для построения рестрнктной карты плазмиды втаына R.albus 37 EK'f обозначенной рР.а Г, .. пользовали весть рест-риктаз: Есо Rü, Hind Ш, Pv„ 11, Е?1 ¡1. Sna I, Pst 1. Варке/са служила ДНК фага , обработанная рестриктазаки

Pst I и Hind III. Расщепление плазмидной ДНК проводили в условиях (состав рестрикционного буфера, температура инкубации) .индивидуальных для каждой рестриктазы. Для построения рестриктной карты плазнидную ДНК штамма R. albus 37 Em подвергали обработке рестрицирунщими зндо-нуклеазами.

Сравнительный анализ данных трех электрофореграмм позволил установить наличие четырех сайтов "узнавания" рестриктазани на плазмиде, выделенной из штамма R.albus N37 Еш, причем два из них по EcoRli и Hind III уникальны, а два других "узнаются" рестриктазой Pvu II. При этом плазмида режется на следующие фрагменты:

Pvu II - Puu II - 2.7 т.п.н.

Pvu II - Hind III - 1,8 т.п.н.

Pvu II - EcoRU - 1.3 т.п.н.

EcoRU - Hind III 0.2 т.п.н.

Размеры самой плазмиды в сумме составляют примерно 6 Т.П.Н; (рис.3).

Рис.З.Рестриктная карта pRa37

Плазмида не имеет сайтов "узнавания" по рестриктазам Sgl II, Sma I, Pst I. Кодируемые признаки: устойчивость к эритромицину и ^-глвкозидазная активность.

Таким образом, из активного продуцента целлвлозолити-ческих ферментов R.albus N3? выделена плазмида pRa 37, несущая гены, детерминирующие образование ^з-глвкозидазы и устойчивости к эритромицину.

4. ВЫВОДЫ

1. Природная популяция бактерий рода RuBinococcus в рубце крупного рогатого скота неоднородна по скорости гидролиза очищенной целлюлозы и ыозет быть подразделена на высоко-, средне- и низкоактивные штаммы. Из 46 изученных штаммов R.flavefaciens 17,42 были высокоактивными,а 28,32 и 54,32 средне- и низкоактивными. Среди 12 штаммов R.albus по 25У. составляли высоко- и среднеактивные.а 502 культур были низкоактивными.

2. Скорость гидролиза целлюлозы руыинококками находится в прямой зависимости от их способности прикрепляться к субстрату и характеризуется достоверной (Р<0,05) коррелятивной связь® г=0,69. Средний показатель адгезии штаммов руаинококков, разрушающих очищеннув целлюлозу за 48 ч .

' 4.54 ± 0,42), был на 47,27. выше (Р<0.05) такового у культур, деградировавших целлюлозу за 60 ч (2,40 ± 0,40), :я на 50.2Z СРсО,05) больие, чем у штаммов, расцеплявших шильтровальнув бумагу за 84 ч (2,22 ± 0,19). Видовых различий в этих свойствах у изученных руминококков не обна-puseHc.

3. Бактерии рода Rmainocor is иыевт комплекс целлвлозо-литических ферментов, состоя ,1й из трех типов целлшлаз: эндо-5,4-/>-глвканазы. целлоояогидролазы и „^-глвкозидаэы, а такае содержат ксиланазн^л комплекс. Активность этих зерментав увеличивается с запеной источника углерода -осиленной целлюлозы на нативнув клетчатку: эндо-1,4-^ -гдвканазы - на B2Z. иеллобиогидролазы - на 542, jb-глвко-зилазй - на 40У. и ксиланазм - на Г\62. тс есть ферменты руминококков явдявтся индуциоелышми. 0ко;;о половины цел-лслаз и ксиланазы локализованы внутри и вне клетки бакте-

рий.

4. Анионообменная хроматография на ДЭЙЭ - сефадексе ft-25 позволяет отделить^глюкозидазу (до 902) ферментного препарата, полученного осаждением культуральной жидкости штамма N3? тремя объемами этанола, от других ферментов целлюлозолитического комплекса и ксиланаз,.

5. Целлгалозолитические руминококки, обитающие в рубце крупного рогатого скота, обладают природной нечувствительностью к стрептомицину, тетрациклину.ампициллину,хло-рамфениколу, эритромицину и рифампицину (концентрации 10-50 мкг/мл). При этом 422 штаммов R.flavefaciens и 502 штаммов R.albus имеют множественную устойчивость (концентрация 10 мкг/мл) к трем и даже четырем антибиотикам одновременно. Природная устойчивость руминококков к антибиотикам после обработки их элиминатами (бромистый эти-дий,акридиновый оранжевый) у многих клонов может теряться, но не у всех. Устойчивость клеток к тетрациклину и эритромицину кодируется плазмидами.а к стрептомицину, ампициллину, рифампицину и хлорамфениколу - на хромосомах.

6. В клетках целлюлозолитических'бактерий рода Runino-coccus имеется, по крайней мере, два типа плазмид с размерами около б т.п.н., одна из которых несет ген >глюко-зидазы и устойчивость к тетрациклину, а другая, помимо гена^глвкозидазы, инеет ген устойчивости к эритромицину. Выделенная из целлюлозолитического штамма R.albus N37 плазмида pRa3? не является криптической. Она несет гены устойчивости к эритромицину (25 мкг/мл) и >-глюкозидазной активности.

7. Составлена рестрикционная карта плазмиды, выделенной из штамма R.albus37 - активного продуцента целлюлозолитических ферментов и ксиланазы. Общий размер плазмиды -примерно 6 т.п.н. Плазмида имеет 4 сайта "узнавания", два из них уникальны (EcoRU, HindiII), остальные два имеет рестриктаза PvuII. При этом образуются следующие фрагменты: PvuII. - PvuII =- 2.3 т.п.н.: Pvul1—Hindi 11 = 1,8 т.п.н.: PvuII-EcoRU = 1,3 т.п.н.; EcoRU-Hindl11 = 0,2 т.п.н. Плазмида не имеет сайтов "узнавания" рестриктазами Bgl II, Sma I, Pst I.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНН СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ

1..Тараканов Б.В., Д.Ю.Лавлинский. Физиолого-биохкикчес-кие свойства бактерий рода Яившссоссиг. бвллетень ВНИИФБиП, 1990, в.2 (98). с.76-79.

2. Тараканов Б.В., Д.Ю.Лавлинский. Физиолого-биохимичес-кие свойства бактерий рода 1?ив1пососси5. Ме1дународнаа конференция "Биологические основа высокой продуктивности сельскохозяйственных «ивотных". Тезисы докладов. Боровск. 3-7 сентября 1990. ч.Н. с.124-125.

3. Тараканов Б.В., Д.Ю.Лавлинский. Взаимосвязь между цел-лвлазолитической активностью и адгезивностьв у бактерий рода 1*ив1пососсиз. Всесовзная конференция "Микробиологические и биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". Тезисы докладов. Алма-Ата, 1990. секция 1, с.82.

4. Тараканов Б.В., Д.Ю.Лавлинский.'Естественная антибио-тикоустойчивость у бактерий рода Кия1пососси$. Всесоюзная конференция "Микробиологические к биотехнологические основы интенсификации растениеводства и кормопроизводства". Тезисы докладов. Алма-Ата. 1990. секция 1, с.83.