Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЯ PSEUDOMOHAS METANOLICA В ПЕРИОДИЧЕСКИХ И НЕПРЕРЫВНЫХ КУЛЬТУРАХ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЯ PSEUDOMOHAS METANOLICA В ПЕРИОДИЧЕСКИХ И НЕПРЕРЫВНЫХ КУЛЬТУРАХ"

лкддвиня h 1 у к ссср институт микробиологии

втговаия luna Михавлоши

физиология bseddouûnis неясная olica

в пинсадчкких н hsiipb pubuíx культу»*

Иккробиояогня - 03.00.07 Днооврагаимя яавясала на руаокм языке/

Автореферат

диооарташм на оопока нив учено! отапеш «авдидвта биохогичвокях наук

Моокве - 1974

^ХСсс,*/гсА' г< ' t Y

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

ИУДЬГОВСКАЯ Елена Михайловна

ФИЗИОЛОГИЯ PEEOBOltOHAS MBEBABOUai

В ИГИОВИЧЕОКИХ и НЕПгеШВЯЙ КУ1ЫУИХ

Кякробжодогмя - 03.00.07 Диоовргацвя Henxcs не не русской яэетв/

Авхорвферах

Хвооврхацы на оовевание учено! отбвваж

кандидата бнологшаоккх наук

На правах рукописи

Москва - 1974

Работа выполнена в Инстнхум никробкошпш АН СССР

I

Научииа руководитель - доктер биологических наук

И.Л,Работнова

05Ециаль::и;: оппоненты:

доктор биол. наук Е.Л,Рубан канд. биол, наук Н.Б.Градова Диссертация направлена на официальны* отзыв в Институт биохикии и физиологии микроорганизмов А:! СССР, г. Пууцно -на- Оке

Автореферат разослан " " _ И74 г.

Зашить диссертации состоится " " _ ЗЭ75 г.

в______ пик. на заседании Учёного Совета Института

«ис^'л полоши АН СССР, Москва В-312, Профсоюзная, 7-а, корпус 2.

С диссертацией кожко ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

ный секретарь Учёного совета ИН1Ш АН СССР кыд, биол. наук

Л.Осни^йй.)

(.Л.к.Оснидкая)

В В ЯД В НИ Б

В яоомдвжа годы больяов внимание уд в лат ой ижвроорганиа-жоаольаугщш петая я «eta-.ол . в качестве «джимввннето ямочнжм угхарада ж вверти.

ЕО»ВОЙ Т»ОрвМЧвСНЛЙ интврэо X ЭТ1Ш MKpQ0pT8HH31falf 2ЫЗ-

мя хвя, ч1о вех полной ясности,каким обреза/ 43 Cj-ООвДМНв -us об pa»j»t о я мцеегва йаомаосв. КраЯяа охабо азучано отяо -■анжа жужьхур, окяохявддх не тан од, к вважвам фактора*.

Мехах к метания явхялтоя дарсввюеявнымж оубстратажа для иодучамд багково-шхшшшых концентратов, Uaxas - двизвоа нв-пяцама енрьа,а метанол легко доотупнна продукт-, получаемы яа яахав*. в ОХ03В в рвэработков проблавн жиробиояогичвокого оявхавя Свлкв, особенно ннтвреово аить, каково поведение культур, аовмпыумях иатаноа, пра пераодшчвокоа я гшогввно-авнрв-равнш кулътшмриванка. Подяьиищве бохьианство яооладованж* вршншявяих нмкроорганизмов проводятся на обычшл лврноднчас-хшх Kjx£i7pax баэ учета олохноотей развития теми культур.

Катод гомогенно-непрерывного кухътазврования особенно ва*ан дм «ротмааноохж мквробв алогического сжитава балка, хек вав «я пшвсея прогрвооввтм тахвологвчесхжи ирхвмс*. С pi получа -ш «ввто-вятвмаянах концентратов огромное эюченае жмаат вpoassQtasaхьяоохх лродаооа, которая вахяожх ос маогиг факто -роз: ехороотя роста продуценте, обе one чанах оптимальных уоло -Ml*- доотупностж вяаивятов пмавжв я т.д.

1 0БЯ8Ж о пп перед вмж стогаж оыдуювде «аяагчя: I/ видаханжа чяохеж кувьтура^ьспохьауюара мвтавох в xtneoxit •дявохвваяого яохояяява углерода ж аяаргяя у 2/ жвучанне $я -яяожагр-бвохжмчаеяях csottors додаханяо! ку хмуры пр* париод*-«еохск мраиванаж я г условиях xasoextxa; 5/ яаучвняе влаяияя накото^вх факторов вд роот иивроорганмвжов о цель» подбора ояхшаяьвнх уоховж* для подпаши бадва.

а

методы исследования

Накопительные культуры микроорганизмов варавдвахись ва минеральной орвде следующего состава (г/л): ra4KDj - 1,5; КНгР04 - 0,15; BegEPO 4 -0,75; Hgso4 -0,15; в*» -1,0, года водопроводная; рН » 7,г. метанол иопользовааи в мчаот-ва источника углерода а авергии. Для внраздвавия чаотой культура использовали среду, приготовленную на дистиллированно* воде, следующего состава (г/л): КН^РО^ - 1,36; вв^ак^ . ТЫ^О1

* 2,13; (га4)гад* -0,5; пезо*. 7 hgo -0,2; 0*012 г а20 - 0,01; *es<4 %0 - о,СО®; мпЗОА . * н20 -0,0025; наг"»0* "" 0*0025; метанол - 10,8; рН - 7,0.

Ыращиванва культуры в опытах по периодическому культивировании проводили на качалках при 190 об/мин к температуре 26-30°С. Непрерывное культивирование микроорганизмов велось в ферментера аа установке, изготовленной г мастерских ЛН ЧССР, при SO°C, о постоянное подачей воздухв и автоматической под -титровкой рН, Рабочий объем среди в ферментера I дат р.

Морфология клеток исследовалась слвдуюммвъжет одами: I/ набыщевави живой культура при фазовоковтраотком нхкросво-пированиа ш в преходящ» свете ; 2/ электронно- мвкрсокопи -ческим исследованием.

В кулыурадьвой жидкости определяли исходное и оотаточ -вое количество метаноле катодом фельдштзвя, Кланвоу ( УеЫжэдв,

, Kl^neboy , 1954), основанным ва специфичности реав -кии между формальдегидом в хромотроповой кислотой. Летучке кислота определяли патодcu паровой отгонки { Фролов-Вагреев я АгэСальянд, 1951). Содержание веществ типа цуклагаадов усхэ-яавлиъали по поглоцавва света при 260, 270 и 290 tai ва спектрофотометре СФ - 4А. Скорость растворения кислорода онре даля -лаоь оульфитныи методой ( Cooper «t al,

Спектр поглощения суопевэин клеток для характеристики пигмента снимали ва СФ-10» Интенсивность поглощения кислорода и наделение COg определяли манометрическим методом в аппарата Варбурга При 30°С в модификации Ант они и Затмаа ( latbcuy ,

-zatmaa Х96Ь). Количество биомассы определяли поело моувивв-ния при Ю5°С. Содержание балка в клахкаг определяли ло методу Лоура ( et ell 951). полисахарид об so реакции о

автронсш (Зайцева, Дфанаоьева, 195?), лишщов по катод; Фольча (yolch, 1957), поля - ох&шаслявой каолоты по не -«опт Слйсамого,"lay (Slepeakj', law , 1961). Нуглаииовые кислоты фракционировали no методу Шмидта к Тангаузара ; ( Schmidt, maanheueer, 1945). Содержание РНК определяла ошктрофотшатрячески на СФ-4 i при длинах воля 270 и 290нм (ffimpKH, 1958), ДШ - колориметрически о дифеняяамвнсм по методу Дане в кодификации Барсова ( Burton,1956). АТФ определяла онат лячковнм методой о количественно! регистрацией био-лшвнасцвндин.

Определялась удельная активность формантов акфиболк -чесвих путев : м етв нолде одр ore на ак методом Антона к Затман ( Aatheay,zatun, 1964) 9 фзназинивгаеулъфагом в 2,6 -ДихлорФвнол-авдоФааоло»; пн ру ватда гидрогв назы по окислению ЕЛД-й s прасутоми пнрузата и тиамянпирофосфатв ( cole»ick , Kaplan, 1955); L - вгщятратдвгидрог е я азн so интвнсавноств восстановление НШ ( КогнЬвг^, 1955); сужцинатмгидрвгвнавя по воосцноманлю 2,6 - днхлорфеноянвдофанала ( irrlgoni » Sins**» 1962); L -малатдвгидрогевазы ло скорости окисленоя ВД-Н ( och—, 1955).

Реэультатя

I* Удаление ж ововотва метаволокиолями» бактерии УдеаДавява» methmnollc* п. щр* BOI В-1131

*

Для внделаняя чиоюй культура, иоиольэуи«8 метанол а качеотве едявохгетмго лоточника углерода и анвргви, Лии еодользомеи образца почв К ооновской облаем* ив? од см одиночна! «олове* на уд as ось подучить чиоту»> культуру, поэтому бал пршавея метол реооега капель по Комаровой,

s

Шдаженная бактерия - грauотрацате льна я t подвихная на — дочка, монотрих, спор па образцах, авроб. На минеральной arapt-эоваиноп орода о метанолом образует круглив, гладкие колоши до 2 мм s диаметра с равно очерченным краем ярко-розового цвета. Спектр поглощанвя суопензии клеток дает ивхспжукв поглию-ния 420, 480, SIO и 550 ш, характерные для наротияоздсл» Опм-иальвэя температура для роста бактерии 28-30°С, при 3?° роота нет. йэкрооргзвиэа хорово растет в пределах pH 5,5-3,0.

Баггврня слабо растет во уколу да хеяахтае, ве разжижает в а, мп л cm о на изиевяет , вращал ва гадроляаует. Отноовтвлъ -но хорспья рост культура отмечен на ижварадъвоВ среде о янтарной, 4/иарово8, нблочкоЗ ей слотах в аспарагвне. На шйоти- а пятяугяародвых сахврах; уксусной, молочной* пропиововоВ кислотах роота нет; аз од воугла родных соединений организм использует только метаяод я Форыяат; на $opia льда гида, метиламина я метане на растет* Лучии* рост микроорганизма откачен ва среда в мета -

во icsi.

По определителям Ерасяльшшдо ( 1949) я БерджВ ( В«г -б«г'я üaau&i, хэ57) культура была огне сева в роду pwmjsw-п*а . Вод бактерии определялся по статьях Пила * Хва&ха < 1961), Антона в Затман ( Anthcnr»z*taau,

If!62>,

Ыделвнпая культура отнаоана к новому виду С зет ери« РдеиОшоод* п. ер. ВВП 3-1131.

Я« Подбор оптздальяоя ореды

Культура P3*n»ttuno>\ica хородо использует как ам-модвЯяыа, так в нитрат ива азот. Но пра выращивании культуры PB.artaKM»:iio* ва ( ын^г SO4 я жычво^ pH орадн с них меся до 4,0* Еоэхщу зих.а взята физиологически щелочная ос»

Ш>5*

"лло одрздавв о рпияниз концентрации мате вола ос 0,2 до б £ ( до - 'Свай нлв-лок в экономические коэффа -

е

цяанх. Саква большой выход бисыаосы 2,1 г/л был при концентрация метанола равно! I Концентрации метанола выше 1,5 % снижали 7 р ох а В культуры Ра.аегЬапоИг ; . Рост был ингабировав полшоотм вря концентрациях нетааогд вине 6 Лакоииальнв! вноншичеоки! коэффициент 0,22-0,21 отмечался яра концентра -цяях метанола 0,2 - 1,0

Нет од ом математического планирования эксперименте:) (йак-сихов, Федоров, 1969) была проведена оптимизация среда, Исходна а вреда оказалась оптимальной для роста культура р>. ЬивИг* •

В. Научение роста культуры Рв,де1£дпв11са при периодическое ввравдввшш.

Был научен роот культуры РеЛае-СЬааоИса при париодичяо-кон шрарвашш ох лаг-Фавн до ставдоварво!. в течение 10 чаоов каждня чае отбирались пробы. Кривая роота имала своеобразный характер о ускорениями и замедлениями.

На рко. I видно неоднократное изменение угла наклона криво! роете. Особенно четко видна неравномерность в росте кужь -турм РвлмШимиеа на кривой удельно! скорости роста М( четыре ясно выраженных подаем«, я опада(цакла), что сопровождалось неравномерны» потребление)! субстрата (рно* 2).

Колебания, удельно! скорости роота вопровохдалась перио -дячеекнмя ямевеняяия химического состава клеток (рио. 2). Во врекв первого чаеа роота культура -га^^аа^Ив« утялиая -ревела бокьяое количество метанола. В этот период синтвзкрова-ляоь РЖ, белок я,особенно интенсивно, пола - £ -ояеимаслядая кяолеха, колячеотво которо! достигало 60 ? от веса сухо! бку наосы.' Следует8 подъем схороотл роота нсскл яно! характер. В «тот период не потреблялся вмргетичеехяа суботр«, но при мем унеявяалось ссдерханке поля- р -оксаааолялой киоиот». Перед третьей я четверти циклоя прояоходяло усиление потреб-левая метанола я вовраотало количество биополимеров* Неравномерное пор л ощенив о^* выделение СО^ я накопление

т

i. llOAVtXmrt ftf* tHFMtrtUMIfl

• nHtiIMU nfc WUH 1,1спммин flOWWIIM вп »ммммпм

nutvw ь «tmcHTtK

ÍHC.Í Кпим мсти h чйсииоп tuweci* »«TU kvmtvpu ps. mtthanotira

AT» происходило перед каждым никои ju в момент 8аиадиаяия скорости роем. Особенно нихв&сигно о инт е зи рова на оь АТФ перед 3 и 4 пикомум , т.е. при наибодыши потребивши метанола. Ко-» лвбания скорости poeta сопровождались изменением удельной активности ферментов, причем гти изменения вооияи citaisooCpas-ныв характер < рис. з).

Вов кринух роста культур» Pa.aetbaa»Нее поено раа -делить на две часта:

X/ в первое части два цикла ускорения роста происходили 8« счет потребления субстрата и запасания резерв них вепевтв (I ЦИКЛ) и потребивши* полисахаридов и

- ПОЛП 'р ' »-Ч 6 - ХММ

1 Диидннм симтгл* осмое-мвш оолимеюъ и А* тон Р5 те (ЬстаИеа.

особенно поли-у! -оксииаолккой кислоты, что подтверждаете» зцавд-тельным выделением СО^ и высоким ДК. Во время первого щита значительно повышалась активность малатдегидрогеказн и пиру. -ватдегидрогеназы. Образование значительных количеств иолк-^ -оксииасляной кислоты сопрлкено с повышением активности пируватд егидрогеназ ы.

1 - У ЧАС **

1 • (ДОКОЧПНП

««»помигщцчгпи»»

4 -ьЕ пяим»Д1ГИдрщ-с нчы

5 -»С иаоцятватигпдклпны

6 - & С нллктлггндрдгенич

рпс. 3 изменение МДЕАЫЮИ ШТИЬИГСТИ ФСРМСНЮЬ

иультягеи Р* тгОюпоИса ь аксгюпсмциАлоглю

РОСТ А

2/ Вторая половина кривой роста, т.е. два последующих цикла ускорения и замедления скорости роста являются следствием ступенчатого потребления субстрата из среды, цикличного синтеза основных полимеров клетки и сопряженной работа всех ферментов.

Ца^лачнк; изменения ]л ,скорости синтеза основнах поляке -ров клетки, удельной активности ферментов и потребления- оуботра-та, напоминают хост синхронных культур.Причиной этой оинхро -низании являетоя опре^четша^итмячноотъ в физиологии культуры, связи чная, л о-в иди ому, с потреблением углеродного субстрата.

1С

II. Влияние различных концентраций мага вола на poor Ps.nethanoliea

В связи о те»« что в условиях периодического выращивания, poor культура на сбалансирован, ивменяется удельная охирость роста, химича екай состав влахов, потребление вкор -готического субстрата и активность некоторых ферментов, '1 о -тересво было изучить поведение культуры в условиях хемостата. С пешокьв.этого метода можно поддергивать постоянную кощевт-рацию суботрата, что практически невозможно в периодической культуре, где по мере потребления суботрата его концентра -ция мввяэтоя.

Карашваниа культуры велось в хемостата при хьß >0,2 чао"1 (рее. 4).

1ЧИ» мннтц^ню* IwrmH« хпни * ЧПЬйкмП Mmci.tt ПН «•/-Qtwf

Концентрации метанола 0,1 - 0,23 % ( по обьему) ограничивала рост недостатком субстрата. При 'увеличении концентраций метанола до 0,3 % я same, снижался урожай клеток, экономически» коэффициент и увеличивалось количество остаточного метанола. Можно предположить, что происходила смена лимити-

руввдго фактора. Так как культура выращивала оь при различных концентрациях метанола, но при одной интенсивности аэрации, равной 1,58 г/л/чао С^, то при концентрации метанола в поступающей ореде 0,5 ; 0,7 1 I % ; соотношение метанол : кислород было следующим г/ г : 3,9 : 1,5В; 5,0 : 1,58; 7,8: 1,58 соответственно. Следовательно, кислорода становилось недостаточно. Таким образам при увеличении концентрации метанола в поступав» и среде идет смена лимитируя«» го фактора, недостатка метанола на недостаток кислорода.

При концентрации метанола в поступавшей среде 0,1 % остаточный метанох не обнаружен, "у" повыоилоя до 0,45.

Представляло болыгой интерес изучить поведение культуры Рз.аеа»аао11са при разных скороотнх потока* Были получены хемоотатные кривые при выращивании культуры Рв.*«Шаао11са при Л - 0,1; 0,2 и 0,4 чао-1, при различных концентрациях метанола ( рио. 5).

Рис. 5 Хемоотатные кривые при различных концентрациях

ч> ч* ч» ч*

V « о ч*

Д мс

метанол я.

Opa трех различных концентрациях метанола (0,05; 0,1 О,г Jt) и трах скоростях протока(о,1; 0,2; 0,4 чао-1)получены ниспадавшие xeii остатние кривые, как плотности популяций, так вкояомического коэффициента. При росте на углеводах и дру -гих углеродных субстратах и при лимитации роста их недостатком у многих микроорганизмов обычно наблюдают классическую хемсстатну» кривую: при увеличении скорости потока плотное» популяция и экономический коэффициент остается почтя постоянными до достижения Д близкого к и ыах и тогда культура вами -веется из хемостата.

Для ¿».mettaiMlica такую кривую получить не уда -лось. Едва ли виопадаязди характер хемостатвых кривых мокко объяснять сиенош лимитирующего Фактора при повышении скорости протока, так как концентрации метанола низкие, он использо -вался полностью и только его недостаток мог лимитировать рост« Для уточнения atoro вопроса был проведен ряд наблюдении.

Проводили выращивание при концентрация метаяола 0,1$ при Д = 0,1; 0,2; 0,4 чае-1, хемостатнаи кривая имела ниспа -давции характер. При увеличении интенсивности аэрации до и,13 г/л чао tig V характер хемостатных ярикых остался тем же, как и при аэрации 1,58 r/д чао 0¿. Была увеличена концентрация азота в среде до 3 г/л DOj вместо 0,5 г/л kkOj в исходной среде; и в этом случае плотность популяции оставалась прежней при воех скоростях протока.Отсюда можно заключать, что смены лимитирующего фактора не было и что рост ограничен только недостатком метанола. Было сделано предположение, что о увеличением скорости протока идет смене характера матабо -яязма*'<

Цж воех скоростях протокав культуральн ой среда определялись промежуточные продукты окисления метанола: формальдегид, форыиат + ацетат, кетакиолоты. Ни один из етих промежуточных продуктов, a также остаточный метанол при всех скоростях протока не были обнаружены.

1 ¥ i "

Происходило изменение активности емфаболачвских фер-квнтов по паре ускорения роста (рае. 6).

Активность метанолде -гид рогеназы уведичв -ваетоя о уваличанаем скорости протока. Акта«-вость некоторых фар -ментов цикла Крвбоа падает о увеличением скорости, а активность пир рувида гид роге наем увеличивается. Таким образом о увеличением око-роотж протока, обмен культуры сдвигался в сторону образования ацатил-КоД, а ферменты цикла Кребоа рапрво -оируютоя. Определенна макрсмолакуяярного состава клеток позволило отметить лишь на -большие его изменения о увеличением окоровтя роота.

Содержание балка снижалось от 50 % до 39 % от веса сухой био -масон, содержание ПК не изменялось при всех скоростях роста А ■ 0,1 ; 0,2 ; 0,4 чао-1. Это отличает Pe. Mttuaollca от очень многих других микроорганизмов, у которых отмечалось воэраотанже РИС и белка о увеличением скорости роота (Работ -нова, Иванова, 1971). Содержание поли- ß -оковмаолявой кислоты возрастает о 20 до 30 J6 от сухого ваоа клеток.

Суммируя подученные данные можно заключить, что при увеличении скорости роста s клетках £*в*п»*&ап»11е& проаохо-

рис. «

i • .1 мтмыдепимтшм г -it wvuTWuAPtmuu» 3 -4t ЯЮЧИГМТМГЛАРОГСММ * - 4 t («цмимгинпми 1-lC NMllMntMIIMM

rlWUniflHt МТЯМОСТП McatONX «tMVUTW Mit »циан» cmwacTH dhiou M ta. mtttiaiwti rtt

дят изменения в характера метаболизма. Овн имеют следующую направленное»: увеличивалась активность пиру ва где гидр о -геназы и . снижалась активность некоторых фа центов цикла Кребоа. В это вракя образуются ацетид-КоА и пнруват.кото -рыа являются благоприятными субстратами для синтеза поли -р> -оксшасляной кислоты.

Известно, что гликолмические процессы менее выгодны энергетически, чек путь окисления в ЩК, этим можно объяо-нить: накопление nosu-^ -оксимаояяноя кислоты, снижение содержания балка и снижение количества образовавшейся био -масон.

Следует откатить,что цепь реакций гликолиза представлена у культур окислявши метанол на полностью, а лишь зве -нам от глицерата ( — фосфоглицерат - ФЭП — пиру ват —) до ацетиж - КоА.

Перестройка метаболизма под влиянием увеличения скорости протока, привела к усилении менее выгодного пути пре -образования промежуточных продуктов окиоления метанола, что вызвало овяжание экономического коэффициента. Такого рода изменение метаболизма при ускорении роота не являвтоя особенностью Рв.т*Ш*п«11е* . Они описаны для некоторых бактерий и дрожжей ( В«ок,Кадаг, 1968; OUrtw, 1969).

7. Рост культуры p»ia*tii*nellea в хекостате при ннгябировааия ионаки Н* а ОЙ"

Одним из важнейшие факторов, определяющие роот культур, является рН среди. Небольвва изменения в концентраций Н+ и ОЙ™ яовов оказывала сальное влияние на роот в Физяологичас -вое состояние культур. Поэтому установление оптимального рН среды очень важно во время роота, с,другой стороны большой внтерео представляло взучевяе влияния неблагоприятных зна -ченяй рй орады ва рост микроорганизмов.

Изучение влияния ингибиторов на микроорганизмы при вырацававии в хекостате является на разработанным вопросом.

1В

Неизвестно, нокно ли получить равновесное состояние в хемо -стата при лимитации скорости роста только ингибитора). Однако, безусловно, нежно наблщдать действие ингибитора на культуру, лимитированную недостаткам какого-нибудь элемента питания и находящуюся в стационарном состоянии в хемоотата. Таким путам можно получить информации о характера действия ингибитора на метаболизм* Именно таким образон изучат действие наблагоприятной температуры на микроорганизм» ( в го-пи, вояе, 1969? joaee, нолей,li>?0).

Изучение деЯствня Н+ и ОН" ионов ва культуру pe.m»th*-nolic* вели в условиях хемостата при двух скоростях протона 3 * 0,1 ; 0,2 час"1, Метанол брали в концентрации 0,19 —0»2ЦЦ, рост ограничен недостатком углерода* На втои фока сникали или ношшави рН среды.

При периодическом выращивании культура Рз.жвъЬааоН©* хорошо растет в пределах рН 5,5-8,0, оптимальным рН являатоя 6,0-7,0.

Походным значением рН в хемостате было 6,9 при этом рост лимитировав недостатком углерода. При действия Н+ и ОЙ" ионов были получены хемостатные кривые. Чан больше скорость протока,тем ближе к оптимальному рН граница вымывания. Так, при скорости Д «0,2 чао"1 культура вымывается при рН 6,0, в то аремя как прн Д * 0,1 чао'>* культура бодав уотоИчнва к концентрации ионов водорода: ае роет возможен при рН 5,9. При Д » 0,1 чао" 1 наблюдался рост культуры Рв. шетайоНсв, ннгибярованныи величиной рН 7,25 и 7,5. При повышении fH до 7,6 при скорости протокао,1 чао"1- наблюдалось вымывание культуры.

Таким образом, ивгибировавие роста хемоотатяов нуль-тури неблагоприятным значением рН наблюдалось в белее уз -них границах по сравнении с периодической культурой»

Потребление углеродного субстрата (метанола) на грамм сухого веса клеток составляет 6,7 г/г при деВотаии Н* ионами (рН 5,8) и 5,0 г/г прв действии ОН" -ионами СрН 7,25) по сравнению о культурой лимитированной недостатком углерода, ко-

ie

тора я потребила только 1»ь г метанола на г биомассы (рН 6,9).

Махно предиояоклть, что для роста при неблагоприятном значении рН не обходимы повышенные затраты энергетического субстрате.

При ингибирования роста культуры неблагоприятным рН увеличивалось поглощение кислорода я гаде да ни: углекислоты.

дк

(•во,; а - а СО» ; Э- АК

Рис. 7 биияя«« рп СМДМ М (ЮГМЩШМ 01

VI И АЯДОМЛЬН*** *0н**ииС1П

[»я П >0,1 чМ*'

Как видно из рис.7 поглощение виолорода при рН >< 7,25 резко увеичиваатоя, а удельная активность метаиондегидро-генавы падает а 7,2 до 2,35. Известно, что оптимальный рН для работы чистого фермевта 9,0 ( ¿щ&ицг.га-Ьип, 1964).

Иакно предположи», что дейстше ОН" ва клетку я вошшко Фермевтов находящийся в клетке иное, чел ва фериенхвый препарат. При действии ц+ ионов на культуру Рж.»»1Ьап»11о* снижается активнооть некоторых ферментов цикла Кребса (иго -цитрадвгядрогенааы - ИД; м ала тдв гид роге н азы - 115; оукци -на т де гид роге ва зы), в ато же время активность паруватдегидро-гвназа возрастает почти в 4 раза по оравнени» о контролем.

Таким образом, гядрокоильный ион влияет на активность первого Фер1авта в окислении метанола - мвтанолдегидрогвна'-зу, в то время как водородный ион ториоэят активность неко -торых ферментов цикла Кребса. На химический состав в морфе -доги» клеток рб не оказывал влияния. Седаржание всех поли -меров клетки, исключая поли- р -окоинаодянув кислоту, ва из -менялось.

При действия как кислым, так и палочным рН наблвдалась тенденция и уменьшения поли- р -окснмаслявой киолсты.

Таким образов, ингибиругиве концентрации ионов Н* я ОН" приводнликявтевснфивацни процессов потребления субстрата культурой оо значительным понижением экономического коэффициента и выхода биомавсы.

Был проведен расчет скорости катаболизма,по формуле предложенной Нейхардси ( 1965): А0 « >

где 40 - скорость катаболизма ; -скорость роста »

и - экономический коэффициент г/м11.

Расчет скорооти катаболизма показал, что при действии . ионов Н* я он" скорооть катаболизма возрастает о 0,07 мин-1/ (углеродная лимитация) до 0,3 мин",1/г-1/мК (иигибиро-ванив Н* ионами) я 0,2 ыин~*/г /и11 (ингибировааие ОН" иова -ми). Это говорят о том, что происходит разобщив между ка -таболизмом я анаболизмом в клетках ^а.пеъьапоНо* при ия -гябмровааия роста ионами Н^ я т,в". роот культура не сбалансирован*

Таблица I

Влияние рН среды на выход биомассы, экономический коэффициент и активность ферментов >

Тип шшнтацнп

'*Д чао :Потреб-: "у •;Би«мо'

:натанол; : Г/л ; пд

: Г/1 : : :гвназа :

Активность ферментов

ИД

11Д

СИ

РН 5,9 рН 7,25

лимитация угле -родом

рН 6,9

0,1 6,7 0,147 0,22 8,64 3,48 10,2 33,2 2,35 0,1 5,0 0,20 0,32 2,35 5,2 13,3 ?б,8 3,6

0,1 1,6 0,61 0,48 7,2 следы 18,7 71,05 4,3

Я. Химический состав биомассы

при разных условиях культивирования

В овязи о разработвоЗ проблемы микробиологического сна-таза балка, проявляется большой интерес к бактериям окисляв -ниш одноуглароднне соединения, метан и метанол, поэтому представляло большое интерес определить химический состав куль -туры, для которой метанол является лучвюа источником углерода.

В периодической культуре определялся макромолекуляршй состав клеток по ходу кривой роста* Была обнаружена большая лабильность соотношений полимеров по ходу клеточного цикла в условиях частичной синхронизации роста и под влиянием состава ср?дн. Количества белка от 33 % увеличивалось до 69 веса сухих клеток. Содержание поли -^ - оксинасляной кислоты так -же на постоянно, через три часа роста в клетках накапливалось до 60 %, а затем этот полимер потреблялся и к концу экспоненциальной фазы" составлял 20-28 % (табл. 2).

Содержание РШ в культуре Рв.ъгймпб11ва колебалось от 2 до 3 %. это содержание РЖ ниже, чем у других микроорганизмов. Количество РШ в дрожжах о оставляет около 20 % (Покровский,1972).

Большое содержание ПК в пище неблагоприятно сказывается гл животных в человеке, поэтому низкое содержание РЖ у ^*т№аао11се является достоинством этой культуры, как коркового препарата.

При выращивании культуры в хемостата

при лимитации роста недостатком метанола и скоростях протока Д » 0,1; 0,2 ; 0,4 чао**1, также наблюдалась изменения в составе клеток. При увеличении окороств протока от 0,1 до 0,4 чао-* содержание белка онижалось от 51 до 39 а содержание поля -р -оксвмаоляной кислоты увеличивалось от 21 до 27 ЗДтабл.З).

С увеличением скорости роста содержание РШ остается на одном уровне, что являетоа особенностью Pe.tttetbaiM.Llea . Экономический коэффициент при увеличении окорости протока падав! V- 0,61 до 0,31. При действии неблагоприятного значения

Содержим основных пояшаров кужьтуры ?а. мишоИс* но ходу правой роста

Таблица 2

Браня в часах 9 1/ьчао-1 * а : Балок : * дш р РЖ % • :ПСИЕ % » * * 1аднды:ПоЕИоа-£ :хариды %

I 0,47 33,6 0,9 2,9 36,0 5,0 5,0

г 0,18 33,9 0,45 4,5 27,0 4,0 2,9

3 0,0 40,0 0,80 4,0 60,0 3,0 2,5

4 0,41 57,0 0,60 5,5 22,0 8,0 5,6

5 0,15 68,0 0,80 5,0 19,0 9,0 6,0

6 0,55 65,0 0,60 «»2 21,0 9,0 7,5

7 0,22 63,0 0,60 7,3 23,0 10,0 4,5

8 0,04 60,0 0,90 ,2 26,0 10,0 8,0

9 0,57 54,0 0,80 .6,8 28,0 10,0 5,5

рН при S * 0,1 чае-1, химический состав клатев,практически на менялся по сравнении с контролем (контролем являлась культура, лимитированная недостатком метанола, при 3 = 0,1 чао"*). Интересно отметить, что количество полк- f> - океанасляной кислота при не благоприятных концентрациях Н* к ОН- ионов уменьшалось от 21,05 (лимитация углеродом) до 11,5-16,8 ¡S, Величины экономических коэффициентов при неблагоприятных значенное рН, очень низки 0,15-0,20.

Таблица 3

С оде резни в основных полимеров культур» Ра. mathanolio» в условиях хемоотата

Тип лимитации Д Дчас * % : % * ' * ' * * » » : рек : % m » mm % лиля -ДН JE •:поли- :. а :>* :

Недостатком

углерода ОД 51,7 0,44 7,2 21,05 7,25 14,4 0,61

0,2 43,5 0,32 7,26 25,02 8,25 11,4 0,45

ОД 39,0 0,27 7,25 27,0 14,3 0,31

рв 5,9 0,1 51,8 0,49 7,20 16,8 7 Л 13,9 0,15

рН 7,25 0,1 50,0 0,40 7,21 XI,5 7,4 13,6 ОДО

В лаборатории синтеза пищевых ъецеотв ИЕВОС 13 СССР была испытана относительная питательная ценное» ( в^ ) биомассы r8»a«tauui*ii«a . Эти исследования показали достаточно высокую питательную ценность клеток P»jwth*n*ilû*, равную или несколько кние питательной ценности яичного альбумина.

В лаборатория микробиология ВШЩснитвзбелоя проверена патогенное» культуры на кроликах, Ря.ш»вш»11ет сказала» безвредной.

Таким образом культуру >e.wtb*B#ilse можно ревсме»-

дохах* для получения балка* Для этого следует выращивать * лимитируя рост кедостатком метанола, т.е. в условиях полного выедания субстрата. Этот организм маках предотавлять интерес для очиотки сточных вод. При втсм целесообразно проводить лимитацию роста культуры не -благоприятным значением рн. В етях условиях бактерии растут о наименьшим экономическим коэффициентом 0,15-0,20, окисляя больвие концентрации метанола о минимальным синтезом био -масоы.

ВЫВОДЫ

I* Выделена чистая культура бактерий, которая использовала матавсл в качестве единственного источника углерода а энергии. Культура получана из одной клетки. Она описана как новый ни пм4«я*ш1 мшили©* щц &-П31. Культура асоимилирует некоторые йот очники углерода {спирты, Сф-кволоты, яопарагин), во лучшим является метанол, урожай клеток на метанола а 2-4 раза выше, чем на других источниках углерода.

2. Показано, что рост периодической культуры -й*л*А±са протекает неравномерно: изменяется удельная ско-рооть роста, химический состав клеток, потребление энергетического оуботрата и активность некоторых ферментов. Это обь-яоняатоя синхронным раамнеаением клеток.

3. Изучалаоь зависимость скорости роста культуры ш*ЦЬимЛ1е* от концентрации оуботрата в уоловиях хемостата.

Выйояено, что концентрации метанола 0,1-0,2 % ограничивали poor культуры в данных условиях, а при увеличении количества субстрата выше 0,2 % происходила смана лимитирующего фактора на недостаток кислорода.

При полном использовании субстрата в условиях хемостата, получена ниспадающая хемоотатвая кривая концентрации биомассы и экономического коэффициента. Падание урожая биомао-еы, количества белка и "у", о увеличением скорости роста про -

исходило в результате перестройка метаболизма, усиления энергетически менее выгодного пути.

5. В отличие от установившегося мнения о повниенна у многих микроорганизмов содержания РНС при увеличении скорости роста, количество РНК у Pe.aothaaolloa оставалось постоянным.

6. Химический состав биомассы ори концентрации суб -страна .0,1 JS в пределах скоростей Д в 0,1; 0,2 ; 0,4 час"1 изменялся. Содержание белка снижалось от 51 % до 39 Í, в содержании поли- f> - оксшасляной киолоты намечалась тен -дэнция к увеличению, остальное полимеры клетки оставались на одном уровне.

7. При ингибировании кулмуры Н* и ОН" конами проиоко-дклм холостое сжигание субстрата я "у" падал.'о 0,6 до 0,1, что связано о повышением скорости окисления оубстрата и раз-обцзнием анаболических и катаболичеоких реакций.

8. Зля получения биомассы на метаноле о наивысшим экономическим но&гФацизнтои следует выращивать культуру при ниэ-KB.S скоростях протока и низких концентрациях метанола;- Экономический коэффициент в данном режиме достигает 0,9-0,61*

Для очистки сточных вод от метанола* цашсообряяно . íüyniKaBíiTi, культуру в условиях ингибирования1 «вачааие» pH, KHJ&'IU или щолочным. В этих условиях экономический коэффициент равен 0,1.

списск работ, шгсшеомнша по ткав дассвшщга

1. Шульговская S.u., Андреева В.А. я Работнова UJ.I97I. Ш-

деганка я свойства иатанолокиеляшнй бактерии РмоДовопая mtawlio» и* «р. Микробиология 40, 5, 862.

2. Рзботноза И Д.,Шу льговская S.U. »Андреева Е.А.,1971.

Авторское свидетельство К 332123 на втаки ^юойшмм metäiaasllea и* ер. продуцент биомассы.

3, Работнова ИД..Иванова И.И.,Лирова С.А..Андреева Б,А, , Ибрагимова С .П.,Сахароза З.В.,ШаФоростова ЛЛ.,

Шульговоная ЕД1. 1971. Особенности роста кулмур «икр о организм оз. Тезисы докладов 17 съезде Всесоюзного микробиологического общества. Иад-во "Наука и те зшака", Минск, 1971. Ош1в«г*к*7а Е.м., iranav» I.I. end Botnie erv G.G. 1973

Exponential growth phase of PeeudomoMH aetba-nollCÄ be tob o\tltur«e. Zeitschriftb fur Alig. Mitorabieloeie ,13, 6, 523. * 8hafor*et«T« I.D. ,Iv*no\re I.I. ,Süule*Yskay» E.M. ,Habot-шггл Growth of microorganlaiae during

exponential phas».Blotecbnelogy and Blo«ngl -a • ring, 4, 175-

6. Иванова И.И.,Щульговокая S.M.,Работнова И.Л. фиэиолого-

биохнмичаскив свойства культуры Pe.methanoii&a в условиях лимитации углеродом. В печати. Микробиология.

7. Иванова и.И,,Шуяьговская в.м., Работнова и.Л. Рост куль-

туры Pa.eetbanelloa в хемостате при ин-гибировании иоааии Н+ и (ЯГ. S печати. » Микробиология.

В. Шукьговокая S.u.,Иванова И.И.»Работнова ИЛ.Хшшчво -кий состав биомассы Ps.eetbeneiica при разных условиях культивирования. В печати. Микробиология.

Пади, в ва%ЗТ/Х1-Т4г, Формат 00*84 1 /16л. я. Овмм t.?*».«. »ИМ 17383_Тжр»ж аоо

ФкАрш КМП Глашого увр*ы<ш tuiicniTtjiúMi jmCqt

• ЦСУ СССР