Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕДИ НА CANDIDA UPILIS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ДЕЙСТВИЕ ИОНОВ МЕДИ НА CANDIDA UPILIS"



ЛЕЛДЕШа НАУ1 СССР ШССТИ1УТ ШКРОШОМПШ

V О. ' л " И* Прев« руКОПВСВ

Михаил Ввтромч

- ДЕЙСТВИЕ ; вше ; икда к* ;

's*""- "V

л-Ъ с" ^.S'-..т-

Ь ■ |Цкрюбимогм : - 08.00.С7 ;:■ ';■ < (А»ссвр*ацдя :аашовяа карусском saiже);

" i в t o р • фора« ' ..5-диссортвцив вв соаскаике * ствовш

Х8НЛДвТв бМОХОГ)1Ч«ОКВХ B»JK

••'•" - ';• ^ И0сква/-/1974,

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТ1ШТ ШКРОБИОЛОГИИ

Не правах рукописи

>ОВРУЧЕБ Нихвв* Пе уроки ч

ДВИСТВИЕ ИОНиВ МИЛИ ILA

CANDIDA UTILES

Лкробиологяя - U8.00.07 (Диссертация ианисана на русском языке)

Автореферат диссертации не соискание ученой степени кандилем биологических наук

Л-14

Мисньь -

Работа наполнена в Институте микробиологаи АН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук,

профессор И.Л.Работнова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.Л.Рубан кандидат биологических наук З.А.Авакян

Диссертация направлена ка официальный отзыв на кафедру низших растении Московского государственного университета кн. И.В.Ломоносова дробленная лаборатория по разработка методов борьбы с биоразрушениеи иатериалов).

Автореферат разослан ¿¿^/З^^- г.

Завита диссертации состоится * —

1574 г. я Ж час. ЗР_ мин. на заседании Ученого Совета Института кикробиологии АН СССР, Москва В-Э12, Профсоганая ул., дон 7а.

п> диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

/ Ученый секретарь совета

канд.б?ол.наук /Л.К.Осницкая /

В ВЕД Б H ИВ

Проблема защиты материалов'от микробного поражение привлекает всё большее внимание иирокого круга исследователей. Это связано с теп, что в результате поражения материалов различными микроорганизмами наносится огромный экономический ущерб в хозяйственной деятельности человека, которые только в СССР исчисляется несколькими миллиардами рублей в год,- ■

В связи с этик необходимо иметь большое количестве!I самых разнообразных антимикробных, агентов предотвращает* порчу материалов микроорганизмамиi '

Тяжёлые металлы и их соединения относятся к числу наиболее эффективных антимикробных веществ. Однако механизм действия тяжёлых металлов на микроорганизмы изучен крайне слабо. Вследствие этого подбор антимикробных соединений, имеющих в своём составе тяжелые металлы, проводится эмпирически.

Для рационального подбора веществ, предотвращающих., порчу материалов, необходимо знать какие функции клетки повреждает тяжёлый металл и его соединения. 8яан.ю механизма действия тяжёлого металла позволит сознательно комт бинировать в биоциде способность к повреждении наиболее важных функций клетки и тем саиым обеспечит наиболее аффективное действие яда, -

Ионы .мёда после ионов серебра и-ртути являются наиболее сильнодействующими ядами для микроорганивмов* Литературные, .денные относительно характера действия меди на микроорганизмы Противоречивы ( Раазоя et ai . 1961; '" sodi&r,Truaingor. t 1967). Систематического же изучения действия меди на физиологическое состояние микроорганизмов никем не проводилось*

В качестве модельного организма для изучения действия меди была выбрано культуре C.utilie , приближавшаяся со свояй устойчивости к неблагоприятным факторам к грибам,которые наиболее часто поражает материалы* Эта культура является удобной для ведения исследований« так как растёт на простой синтетической среде в вироком диапазоне рЦ. Гомогенный poet в отличие от роста грибов позволяет проводить '' исслчдоавния при непрерывном культивировании.

В задачи данной работы входило проведение таких исследований действия меди на рост и физиологическое состояние С. atilts , которые способствовали бы выявлению функций клетки, поражаемых медью в первую очередь. i

С этой целью было проведено научение: е) физиологии модального организме в экспоненциальной фа, зе росте к влияния ионов меля не данную фазу развития;

б) кинетики подавления роста С* utliis монет меди;

в) поглощения ионов меди клетками;

г) действия меди не физиологическое состояние С. utiiis^ — . при периодическом культивировании;

I) действия меди па рост и физиологическое состояние С. iit Lita при непрерывном культивировании. к

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служила Candida utilis BRUT - 1668.

Лия поддержания культуры использовели агеривояаякуюс синтетическую среду, содержащую в г/л водопроводной воды: , глицерин - 20,0; "Н^З - 2,*; K2HP0v3H2O - О,»; Meso* - 0,2; erep-erap - 20,0. Для периодического кулммвирове-вяи использовали жидкую среду, содержащего те же компоненты. При непрерывном культивировании использовали среду, ; приготовленную не дистиллированной воде. Поэтому не каждый литр среды вносили 5,0 ми растворе микроэлементов, состоящего из следующих компонентов (r/S л дистиллированной воды): FeCl3 .6Й20 - 27,01; 'J¡n0i2 .«Н20 - 10; Zno - 2,04; cuCl> *2Н20 - 0,85; cooi-¿ .6В20 - 2,38; !

"■"■j-V'L; v г- ■

НВО^ - 0,31; НС1. (конц.) - 50 мл. Отдельно вносила 0,1 мл растворе СаС1г (2,2 г на 1,0 л воды) и 0,1 МП ИагИо04 (0,2 г на 1,0 л воды) на литр среды. Стерилизацию сред проводили при 1,0 атмосфере э течение 80 минут. Фосфаты и микроэлементы стерилизовали отдельно. После стерилизации рН сроды для периодического культивирования доводили до 5,0' с помощью 5$(-ных стерильных растворов щёлочи и кислоты. В опытах по непрерывному культивированию рК среды подбирался с таким расчётом, чтобы в ферментере он был равен 8,5-4,0, что является оптимальной для данной культуры.

Выращивание культуры в опытах по периодическому культивированию проводили на круговых качалках при 190 об/шл я темперетуре 28-30°С. Непрерывное культивирование проводили в ферментёре для непрерывного культивирования микроорганизмов, изготовленного в мастерских АН ЧССР, при 30°. Обхек среды в ферментёре 1,0 литр.

Количественный учёт клеток проводили в камере Горяава. Биомассу определяли нефелометрически на ФЭК - 56 11 с пересчётом не вес оухой биомассы по стандартной кривой или непосредственным высушиванием в сушильном шкафу при 105°.

Концентрацию меди определяли методом полярографии на приборе ьр-60 о ртутным капающим электродом и с самописцам. В качестве индифферентного электролита (фона) использовали 0,1 II раствор КИО5 или 1,0 11 раствор нн^ад + нн^01 . Устранение искажений вольт-емпврной кривой достигалось добавлением в электролизёр вместе с исследуемым раствором и фоаоц 2-х капель 0,5%-ного раствора желатины. Кислород, который мешает определению металлов, удаляли продуванием В2 в течение 10 минут. '

В хуяьтуральной жидкости определяли исходное и остаточное количество глицерина методом Ламберта и Нейла в. модификации Антал с соавторами ( Ап-Ьа1 еь а1 , 1964). Количество кетокислот определяли колориметрическим методом ( КвИ.Эогтота , 1959). Содержание веществ типа нуклеотидов устанавливали по поглощению УФгсвета при 260, 270 и ¿90 ни на спектрофотометра СФ-4А.

»

Содержание белке вн летках определят по методу Лоури ( Lo*ry et al * 1951), полисахариды no реакция с антро-вой (Зайцева, Афанасьева» 1957), общее содержание липядов по метод? Фольча ( Polch , 1957). Нуклеинсшые кислоты фракционировали по методу Шмидте я Тангауаера ( Schaidt, ^ Tbannbauser , 1945). Содержание РНК определяли спектро-фоюиетричоскн на СФ-4А при длинах волн 270 и 290 ны (Спирин, 1958), ДНК - колориметрически с дяфениламинон по методу Дняе в модифякацяя Барт она (Burton , 1956).

Содержание флавянов определяла фдуороматрическим негодом на ЗФ-SUA (Струговимкова, 1965), содержание цитохромов исследивали методом пиькотемяэрэтурнов опектрофотоыетрия (Цохова я др., I96B). Интенсивность дихекия клеток Cd uti-lie определяли меяометрически в аппарате Bapdypra прш 30°. О количеотве мертвых клеток 05дяди по их.способности окраяиге.ться примяли ном (tie все ль я др., 1961). Морфологические наблюдения я фотографирование ооудоствляяи, ясподь-еуя микросвопы МЕИ-6 и 11Л-2.

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. Изучение Физиологии культуры C.ufclllg у в^понеп,-циегоио^ фаае роруэт

Научение влияния различных факторов не никроорганизнн целесообразно проводить в фаве логарифмического роста. Это позволит получить лимитирование только научаемым фактором я. исключить влияние других. Поскольку предполагалось проводить изучение влияния ионов меда на рост » физиологические свойстве С.vrfcilis , яахвдячвЯоя в вкопонеяциальной фазе роста* предварительно было проведено.исследование этой фазы роота.

После работы Коно ( Иопо<1 , 1942)в литературе установилось точка зрения на акспоненкиельнуо фазу, как на рост с постоянной и максимальной удельной скоростью при постоянстве экономического коэффициента. Считалось также, что состав клеток, концентрация энзимов и метаболитов.

размер КЛвХОК В 8ИОПОИдиЩ48ДЬНОЙфв?0 роста постоянны (Иерусалимский, 1968; Шлегедь, 1972). В работах Шафорос-товой о соавторами (Шафоростоваи др., 1971а; 19716; Иванова и др., 1972) впервые было показано, что в период акспоненцнвльной фавн роста меняется удельная скорость роста, потребление субстрата» а также ишичэский состав клетсч.Еыло высказано предположение, что непостоянство параметров роста ^физиологического состояния клеток в экспоненциальной фезероста явление общего характера, присущее различный группам ыввроорганизыов (Работнова, 1972).

Чтобы проверить справедливость такого предположения по отновевир к С. ийив мы провели исследование кинетики роста:&ультури 8 течение экспоненциальной фазы. Пробы отбйрми через кавдый чао роста в течение 10 часов.

Время, mac

Рис.1. Динамике роста, изменение удельной скорости роста и величины.рН среды в период експоиенциальной фазы роста С. utiiis I - логарифм оптической плотности; 2 - удельная скорость роста, вычисленная ПО 0П;<3 - удельная скорость роста, вычисленная ао количеству клеток; 4 - рН культуральной жидкости.

На рисунке I видно неоднократное изменение угла наклона кривой роста, что свидетельствует о непостоянстве скорости роота. Еще более чётко неравномерность роста видна ^ т кривой удельной скорости роста {и ), имеющей форму изломанной линии с тремя максимумами. Следовательно, рост С*1Н1118 в экспоненциальной фазе неравномерные» с последовательно происходящими ускорениями и замедлениями скорости роста. Кривая удельной скорости роста, подсчитанная но числу клеток, в общих чертах биле Аналогична кривойпо оптической плотности, но максимумы и минимумы в этой случае имели более чёткий и выраженный характер.

Для того, чтобы получить более точные характеристики изменения удельной скорости роста в экспоненциальной фазе* отбирйли пробы и подсчитывалиул черва каждые 30 минут. Изменение логарифма количества клеток имеет ступенчатый характер (рис.2). Удельная скорость роста при этой меняется от максимального значения, соответствующего наибольшему, наклону логарифмической кривой« до нуля, что соответствует плато на кривой* Эти колебанияимеет закономерный характер с периодом полного колебания, равного 2-2,5 часа. Эта же закономерность была получана при выращивания культуры в ферментёре.

Известно, что ступенчатый рост н изменения р от максимума до нуля с постоянным периодом колебаний характерны для синхронных культур (Хмель, 1967). Иоходяиа этого, ложно заключить, что колебания м в период экспоненциальной фазы роста С. происходят вследствие синхронизации*

деления клеток посевного материала.

Колебания удельной скорости роста сопровождаются периодическими изменениями химического состава клеток. Содержание ДНК в клетках резко уменьшается при каждом максимуме удельной скорости роста. В периоды уменьшения скорости роота происходит увеличение ДНК в клетках. Количество РНК я белка увеличивается при увеличении удельной скорости роста и снова уменьшается при замедлении роста. Подобные изменения в содержании ДНК, РКК и белке наОлюдаютса

Ьреми, иле

Рис>2. ДИН8ЫИН8 изменения логарифме количества клеток и ельной скорости роста, вычисленной через каждые минут в течение экспоненциальной фазы роста I - логарифм количества клеток; 2 - удель»ая скорость роста, вычисленная через каждые 30 ышуг; 3 - удельная скорость роста, вычисленная через чао

при синхронизации культур микроорганизмов (Хмель, 1967).

Потребление углеродного субстрата меняется в течение экспоненциальной фазы роста таким образом, что каждому увеличении уМ предшествует усиленное потребление углеродного субстрата (рис.3). В момент же максимальной скорости росте потребление субстрата уменьшается. Усиленное потребление глицерина при минимальных значениях у сопро вождается усилением выделения кетокислот. При высоких знз чениях удеяьной скорости рост-, когда глицерина потребляется мало, образование продуктов обмена незначительное, то есть наблюдается экономичное потребление субстрата*

Рис.Э. Динамика изменения удельной скорости роста, потребления субстрата и выделения продуктов обмена культурой С.utills в период экспо-некциальной фазы роста I - удельная скорость ростам 2 - потребление глицерива; 3 - пиро-винограднея кислота; 4 - Ф -кетоглутаровая кислоте.

При внесении меди в культуральнув среду в концентра ции 15-20 мг/я в ншент засева, культура не развивалась* При внесении меди в концентрациях ниже 15 мг/л культура развивалась,.но с более низкой удельной скоростью роста, чем С13 меди* Оказалось, что медь, в ингибнрувщих ско-

рость poeta концентрациях« не^йарувает синхронности раввитая культуры.

Таким образou, логарифмическая фаза роста С. utiiie so является равномерным процессом нарастания биомассы с постоянной удельной скорость» роста. Установлено« что колебания удельной скорости и химического состава клеток являются результате»! синхронизации культуры. Причиной этой синхронизации является определенная ритмичность в физиологии культуры» связанная, по-видииоиу, с потреблением углеродного субстрата. Клетки, попадая в свежую питательную среду интенсивно поглощают субстрат. После этого наступает период траты поглощенного субстрата, который сопровождается резким увеличение)! скорости роста. Посла исчерпания поглощенного субстрата клетки вновь поглощают его, скорость роста при эгоы падав*. Затеи цикл повторяется л так далее. Лаингациз роста медов в принципе не изменяла колебательный характер роста культуры.

2. Кинетика подавления роота С. utHis ионами цеди.

Для того, чтобы установить концентрации* ингибирующяе рост в различные периоды экспоненциальной фазы» были поставлены специальные опыты в тех же уоловиях, что и в предыдущей главе. Но после выращивание культуры до определенного часа добавляли CuS04.5H¿0 в различных концентрациях. Концентрацию меди в культуральной жидкости определяли поля-рографически. Этот метод определения меди позволяет садить также о соотоявии металла в.растворе (иои или коыпяеко с веществами среды или продуктами обмена). Простой состав среды, которую мы использовали и значение рн ниже 5,0 исключает связывание меди в комплексы (Авакян,.работнова, 1966). Это позволило нам иаучать действие па С* utille только ионов меди.

Установлено, что концентрации ионов меди в растворе необходимые для полного подавления роста C¿ utiiic должны быть таковы, чтобы на иг сухой биомассы приходилось 0,4-0,6 мг Сир+ и эта величина одинакова в течение экспоненциальной фазы роста. 11

Изучение кинетики торможения скорости роста проводили методов острых опыте®. Для этого шестичасовую культуру . разливали в серию колб, в каждую вносили определенное количество 5^-ного раствора СизО^. ,5НгО и культивировали на качалке при 30°. Через два и четыре часа в каждой колбе измеряли плотность популяции, рН и концентрации Си2*,

Ингибирование роста при внесении Сиг+ в растущую шестичасовую культура начиналось при концентрации меди 0,341,4 мМ (20-25 мг/л) и рост полностью прекращался при 1,4-1,6 мМ (90-100 иг/л), хотя клетки при это« оставались все живши.

Для описания процесса ингябирования роста иедьп иы применили уравнение Иерусалимского, заивниБ концентрацию продукта обмене, ингибирующего рост, концентрацией ингибитора: A'^i

где yU0- удельная скорость роста при отсутствии тормозящего рост вещества; J- концентрация ингибитора; Kl-констаита численно равная количеству ингибирувщего рост вещества, при которой (Иерусалимский,

Неронсша, 1965). ' ' .

Методой обратных величии Лайиуивера и Берга(Диксон, Ухэбб, 1966) были найдены средние значения jU„ ■ 0,29 и

■ 1,21. Подставив полученные значения и Kl в уравнение (I) нашли,теоретически» кривую зависимости удельной скорости pocft. от концентрации ионов ыедн (рис.4). После нанесения на этот же график эмпирически полученных значений у* , видно, что они согласуются с теоретическими. Статистическая обработка (Рокицкий, 1961) полученных данных показало,, что эмпирически полученные значения м с ' достоверность» 93$ совпадают о теоретическими.

Из полученных-денных иосно заключить, что торможение скорости роста C.utllis ионами меди описывается уравнением неконкурентного торможения ензиматических реакций. Следовательно, медь при концентрации от 0 до 1,2 мМ ин-

I J

Рис.4. Кинетика торможения удельной скорости роста

С.иьшл иовами иода. Показана теоретическая кривая зависимости и от концентрации ионов меди; х - экспериментально полученные значения

для 2 час. культивирования о медью; о - для четырех час.культивирования

с медью.

гкбирует одну энзиматическую реакцию в метаболизме, которая является ответственной зв скорость роста микробной популяции. Однако этот вывод не исключает того, что яри более высоких концентрациях ионы меди будут ивгибнровать другие реакции, или срезу несколько.

3. Поглощение ионов меди клетками С.т;111а

Вопрос о том, каким образом микробная клетка взаимодействует с ионами меди, изучен крайне слабо. Поэтому ном представлялось целесообразным провести исследование характера поглощения иовов меди клетками С. , 1

Для этого кдетки суточной культуры дрожжей суспенди- ] ровалн в 0,03 Ы рее хвора КаОХ из расчета ~30 кг/ил по весу сухой биомаооы. Суспензию еатем разливали по 50 ид в колбы Эрлонмвйере, добавляли 1,0 мЫ си2+ и инкубировали ! на качалке при 28*30°. Предварительно было установлено, что поглощение ионов меди суспензией клеток, приготовлен- \ пой ва водопроводной воде и 0*06 М растворе ца01 одинаково. Черев различные проложутки вреиени отбирали пробу, клетки отделяли центрифугированием и в центрифугате определяли содермиве меди. О поглощении ионов меди из среды клетками судили по уменьшению количества меди в среде.

После внесения ионов меди в гуотую оуопонэию клеток С,. наблюдали уменьшение содержания Си2+ в сре-

де. Это уменьшение тем значительнее, чем бохьве время - -контакта клеток с медью. Следовательно, кдчтки дрожжей . могли поглощать некоторое количество ионов меди на среды. Динамика поглощения меди суспензией клеток представлена иа риоуике 5. Видно, что наиболее интенсивно клетки поглощали Си2+ и течение первого часа, К концу второго часа происходило практически полное насыцекме клеток медью. При белее длительной инкубации дальнейшего поглощения Си2* клетками не наблюдалось. Исходя и« того,что живые идетки за 10 минут ?ключвют около 15% меди и только за две часа происходит полно» иаонцеиие клетея,можно сказать, что процесс включении меди клетками не является простой адсорбцией клеточкой поверхностью, так как навестив, что а случае адсорбции включение большей чае» воце<}твв клеткой происходи* ва 2-5 минут ( Ра1со»в,в1ос1о, 1965).

Клетки, предварительно убитые нагреванием в течение 10 кинут при 80°, поглощеди Си2* практически моментально, причём количество поглощенной меди такое как и у живых клеток (1,60 - 1,65 мг/г). По-видимому, вследствие водного нарупения барьера проницаемости, а также другихУ клеточных функций, которые происходят при гибели микро--: организма, все клеточные веществе, способные реагировать

lo го эо бо «о lio

Ьрсмй, мим

Ряс.5. Динеиике поглощения яоаов иодх шип (I) и убитая к детка мх (2) клетками C.utuie.

о ионами меди,становятся легко доотулнымн для них. Поэтому происходит очень быстрое снизывание Си2* этими вевщст-,.М1ы. Поглощение Си2+ живыми и убитыми клетками происходит по-рваному. Следовательно, иокно ьекдачить, что процесс поглощения cvi2+ не ввдяетоя физико-химическим процессом, е, по-вмдимоиу, связан о жизнедеятельности) /ыикрооргааявма.

I' Это предположение подтверждается денными о зависимо- , оти поглощения меди у живых клеток от состояния культуры. Так клетка 48чгесовой культуры, находящейся в стационарной фазе роста, за один час поглощали 0,9 мг/л,Си2+ и максимальное количество поглощенной меда составляло 1,1 иг/г. Клетки 24-часовой к 8-чесовой культур за первый ^час поглощали почти одинаковое количество Сиг+ (1,4 и

1Í .

1,5 мг/л). Но если насыщение клеток 24-часовой культуры происходило за 2 часа и составляло 1,6 мг/г, то насыщение клеток 8-чаоовой культуры за два часа не происходило,Следовательно, наиболее интенсивное поглощение меди осуществляли клетки 8-часовой культуры, находящейся в экспоненци еиьяой фазе роста. По мере замедления роста культуры поглощение меди клетками уменьшается.

Следует отметить, что хотя клетки поипщаюг менее 2 мг меди на грамм сухой биомассы, количество меди в реет воре, необходимое для полного ингибирования роста, в расчёте на вес сухой биомассы должно быть порядка 0,11-0,6 мг Си2* нв мг биомассы (см.раздел 2).

веется оптимальная зона рН я температуры для поглощения ионов меди. Эта зона совпадает с оптимумом для роста культуры. Причем уменьшение температуры инкубации от 30° до 20° вызывает уменьшение скорости поглощения клетка ми более чем в 3 разе. Из зтого следует, что ионы меди проникают в клетку не путём простой диффузии, так как'известно, что в случае диффузии повышение температуры на . каждые 10° ускоряет процесс в 1,3-1,4 раза (Гизе, 1959)» Полученная « зависимость поглощения от температуры харак терна для процессов активного транспорта веществ в клетку

Зависимость скорости поглощения меди от её концентрации в среде имела характер кинетики насыщения. Построив графическую зависимость обратных величин скорости поглощения от обратных величин концентраций меди было установлено, что эта зависимость имеет линейный характер. Следовательно, процесс поглощения ионов меди клетками с'.. иъ±11п описывается уравнением ¿.ихазлиса - Ыентея (Диксон, УзйЛ, 1966), Известно, что подобная кинетика поступления веществ в клеьку характерна для таких процессов, в которых перенос осуществляется с.помощью специфических транспортных систем (Роуз, 1971).

Внесение источнике энергии - глицерина в суспензию клеток вместе с ионами меди значительно стимулировало поглощение Сиг+ клетками. Добавление к суспензии кекото-19.

рых ядов энергетического обмена (йодацетат, 2,4-дикитрофе-нол, цианистый калий) в концентрации 10~8-10~Т1 привело в ингибированию поглощения меди. Эти ленные указывают на то, что поглощение меди осуществляется с затратой энергии.

Поглощение ионов меди клетками дрожжей является специфическим процессом* И» II испытанных солей тяжелых металлов только ионы ртути и свинца незначительно подавляли поглощение цеди, что может бить связано с высокой токсичностью этих металлов.

Связывание меди клетками С.^ъшв чрезвычайно прочное. Вода и солевой раствор за два часа не отмывали поглощенную медь, И только при действии разбавленной кислоты ионы меди обнаруживались,в среде.

Таким образом клетки С.имия активно поглощают яоии меди из среды. Активный характер поглощения меди объясняется тем, что медь, входя в состав некоторых ферментов, является необходимым элементом для роста микроорганизмов, вследствие чего клетки, по-видимому, обладают системой активного переноса ионов цеди через клеточную мембрану. Не исключено, что, при субдетальных когдеятрациях меди в среде, в клетке могут накапливаться не только необходимые, не и токсичные дозы сиг+ , что может привести к нарушению ¿физиологических процессов и тем самым к торможению роста, IV затем и к гибели клеток.

4. Изучение химического состава и физиологичеоких свойств С. \itiii3 в периодической культуре при ингибировзнии роста ионами меди,

Потребление углеродного субстрата у С, исШа , растущей без меди, составляло 4,4-4,5 г глицерина на грамм ¿образованной биомассы. Добавление к культуре 1,0 м11 меди *не влияло на потребление глицерина, хотя скорость роста ^подавлялась л два раза. Следовательно, процесс потребления глицерина не может являться первичным местом приложевая токсического действия меди.

Энергетический обмен С.цбШа чрезвычайно чувствителен' к действию ионов меди (таОл.1). Ухе через 15 минут после внесения 1,0 ыЦ Си2+в растущую культуру поглоцеезо кислорода подавлялось, почти в 5 раз, С течением времени инглбированне поглощения кислорода медью возрастало. С увеличением концентрации меди дыхание подавлялось сильнее, Ингибирующее действие меди на потребление кислорода сопровождалось уменьшением содержания цитохромов (табл.2).

Таблица I.

Влияние ионов меди на поглощение кислорода клетками : С. иЫ118 (мкл/мг в чао).

Время после добавления меди (мин)

Контроль (без меди)

1,0 кЫ меди

1,6 мЦ меди

15 30 60

82,4 72,0 75,0

17,0 9,0 6.0

5,6 8,0

- определение не проводили.

Таблица г.

Влияние иоиов меди на содержание цитохромов в патентных суспензиях клеток С. ut3.Ha (значения дайн в условник единицах, равных величине оптической плотности деленную на единицу сухой биомассы,4И<Г*).

, Концентрация , модм(мы) Цатохромы <

" С °1 в 3 1

)___ - _ .

' 0,0 7,82 6,63 9,00 5,95 ' '

; 1.о 2,4$ 2,72 5,10 8,90 |

1 1.6 2,70 3,40 .6,12 4,08 |

Наиболее сильво затрагивались цитохроыы группы о. Количество флавнаов при этом не менялось.

Анализ химического состава клеток показал, что уже через два часа после добавления меди, в инщбируюцих скорость росте концентрациях, к растущей культуре происходили изменения в содержания основных полимеров клетки. Ионы

[меди вызывали уменьшение количества белка в клетках. Но-[видимому, медь ингибирует синтез белка. В присутствии ке-|ди наблюдалось увеличение содержания липидов в клетках, |что может быть следствием нарушения нормального хода »энергетических процессов.

Ионы меди вызывали утечку веществ нуклеотидиой природы из клетки. В таблице 3 приведены данные по поглощении УФ-света культуральной жидкостью в области длин волн, поглощаемых веществами типа нуклеотидов. Значения дайн в условных единицах, равных единице оптической'плотности делённую на единицу образованной биомассы. Видно, что в присутствии меди наблюдается значительное увеличение содержания нуклеотидов в культуральной жидкости. Причём наибольшее поглощение УФ-света происходит при ¿60 нм, что характерно для аденина.

| Таблица Г.

Влияние ионов меди на выделение веществ типа нуклеотидов ' г в культуральную жидкость с,и«.11в

| (значения даны в условных единицах)

Я

{Концентрация | меди (ыН) Длина волны в ни 1

260 1 270 ! 290 \

1 0,0 .0,12 0,14 0,10 |

| 1.0 0.44 0,35 0,20 1

0,62 0,56 0,30 '

и |]

I]

1:

Щ Поскольку в клеточкой мембране содержится большое 'количество различных конплек&бразующих веществ, то моздо гдумать, что основная часть поглощенной меди связывается

веществами, локализованными на мембране. Связывание ионов

** - .

.меди с веществами клеточкой мембраны ведет к повреждению 'функций мембраны как барьера проницаемости. В результате [этого наблюдается "утечка" из клетки веществ нуклеотидной -природы, а токже, возможно к других веществ. Кроме того, происходит ингибирование окислительно-восстановительных процессов, ферменты которых ассоциированы о клеточной мембраной. Это подтверждается высокой чувствительностью дыхания клеток к действию меди и понижением содержания в клет-

не цмтохромов* С нарушением энергетического обмена, вероятно, связаны о изменения содержания в клетках запао-ных веществ*

Однако, возможно проникновение меди и к внутренний участкам клетки, о чем свидетельствует подавление синтеза белка. Но не исключено, что снижение содержания белка в клетке имеет вторичнпй характер, связанный с нарушением хода энергетических процессов.

5. Изучение влияния ионов меди на С. Otilia в непрерывной культуре,,

Изучение непрерывных культур микроорганизмов яри лимитации роста недостатком различных ингредиентов питательной среды, например, углеродом, азотом, фосфором, магнием в последние годы было посвацено значительное число работ во многих странах, особенно в Англии, Поведение популяция при лимитации ростане голоданием, а отравлением изучено крайне слабо. Изучение непрерывных культур микроорганизмов при лпятации роста тяжелыми металлами до сих пор никем не проводилось. В цеди нашей работы входило: во-первых, сравнение физиологии непрерывной культуры С. utiüs при лимитации роста недостатком углеродного субстрата и отравлением ионами меди, во-вторых, изучение влияния скорости разбавления на физиологическое состояние культуры, ликитиро-ванной ионами меди.

При лимитации роста непрерывной культуры С. «tilia недостатком углеродного субстрата количество биомассы не менялось при скоростях разбавления (Д) от 0,1 до 0,25 чао"1 Остаточный глицерин в культуральной жидкости при этих Д де обнаруживался. При более высоких Д, равных 0,3 и 0,4 час-1 биомасса уменьоалась, а количество остаточного глицерина увеличивалось (рис,б). Экономический коэффициент также не менялся в интервале Д от 0.1 до 0,3 и был равен 0,27-0,29, ■ только на грани вымывания при Д * 0,4 экономический коэффициент резко уменьшался. Следовательно при лимитации роста недостатком углеродного субстрата получена нормальная хеио-

30 ■

ататная кривая о постоянной концентрацией биомассы при ско-Гростях разбавлений от 0,1 до 0,25 чао-1. | При лимитации роота C.utiiis нонами меди картина била иная. Количество биомассы при Д = 0,1 чао была менме, чем при культивировании без меди (рис.б). С увеличением скорости протока количество образованной биомассы уменьшилось линейно, а количество остаточного глицерина линейно возрастало. Количество же потребленного субстрата на единицу биомассы и, следовательно, экономический коэффици-[Л при втоц был таким же как и при лимитации углеродом.

qi Ql ((9

Скоиасть pkmmrms», мс4

Рис 6. Устанонишиеся концентрации биомассы и глицерина в хе-иостате;J-концентрациЯ биомассы при лимитации роста глицерином;2-концентрация остаточного глицерине; 3-кошдеатрация биомассы и концентрация остаточного глицерина при лимитации роста отравлением медьв; ^-теоретическая кривая изменения биомассы с увеличением скорости протока при лимитации роста ингибиторами.

Таким образом, характер роста С* utiiie при лимита-цвм недостатком глицерина и отравленном ионами меди был различен, физиологическое состояние культуры, лимитированное недостатком.глицерина и отравлением медыа было также различным (табл.4).

Обращает внимание значительное ингибирзвание дыхательной активности клеток. Потребление кислорода у клеток, выросших в присутствия меди, было подавлено более чей в 5 рае по сравнение с клеткам*; выросшими без пади, в выделение COg более чем в 4 раза. Эти данные указывают.на повреждение энергетического обмене под влаянием меди, унии-ческий состав клеток такие различается в зависимости от типа лимитации. Особенно это касается количества балке, которого на 2056 меньше в клетках, рост которых лимитирован отравлением медью, по сравнению о клетками, растущими при лимитации недостатком углеродного субстрата. Изменения в содержании РНХ и ДНК незначительны» Количество полисахаридов и липндов увеличивалось при отревденни медью,

С увеличением скорости протока повреидащее действие «еди на физиологические свойства и химический состав »деток С, utUie уменьшалась. Вследствие этого несколько восстанавливалось дыхание клеток, повивалось содержание белка и ksqткех, а количество вацасных веществ снижалось* Это обменяется ген, что при повышении Л клетки находятся а ферментёре'иеньое* «рмя, что приводит к уменьшают времени контакта клеток с ыедьр и, сдедоватавьго, степени отравления,

ионы меди вызывали морфодогичеокве изменения у С. utiiis . Клетки приобретали неправильную Форму, почки не отделались от материнских клеток. Обнаружены клетки сильно разросшиеся, но на разделившиеся. По-видимому, коны меди нарушают функцию клеточного деления.

Характер зависимости стационарных концентраций биомассы в хемостате от скорости разбавления при лимитации риста отравлением медью позволил предположить, что при (шзиы* скоростях протока изменяется K¿. Методом матема-

.ил. ПИТ и........ ...........

Влияние тяге таилтации аа фазлологичесвое состояние с.икшв • растущей

Т«1 лимитации роста ( Содержание основных полимеров ■ клетки (г процентах от веса высланной биомассы) .о* о о §53 <п и _ ¿. е> о 1

« (0 «а »Оп ' О О1^ (О я емэ В > I ф М И- а & 0 Я к ■ 0 1 а та § я > »4 со омр чех», цЯ, ъц о о Зо N §ёЗ ««от ым 88;* не а я II ) о^ 1 ; | 1 ( 1

' Недостаток I субстрате ) 1 2,2 47,0 0,23 5,21 29,7 8,45 84,8 75,4 > 0,86 ,

< ! Отравление | иедБв I.? 37,5 0,21 7,56 43,2 12,3 14,5 16,5 1.1 1 1

ю

тического ыоделировзнмя показано* что изменение К'1 в зависимости от £> имеет гиперболический характер* Это происходит вследствие различной степени, е возможно и механизме токсического действия меди не культуру при различных скоростях протока.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что логарифмическая фазе рост С* utilie характеризуется неравномерность» нарастания биомассы. Эта неравномерность выражается в колебании удельной скорости роста, потребления углеродного субстрата и выделения продуктов обмена и сопровождается изменениями химического состава клеток. Причиной этих колебаний является синхронизация культуры, связанная о определенным ритмом жизнедеятельности микроорганизма. Тем не менее концентрация неди, полностью ингибирующая рост, постоянен на про*-тяженш всего период«« логарифмического.роста.

2. Ингибироваяие роста культуры С. utills , находящейся в вкслоненцизльвой фазе роста, начиналось при концентрации меди в среде 0,8-0,4 мИ и рост полностью прекращался : при 1,4-1,6 мН. Изучение кинетики подавления роста С. utllla показало, что ингибирование роста иедью в концоктпашш от 0 до 1,2 М описывается уравнением неконкурентного торможения энзиматических реакций. Следовательно, медь при атих концентрациях ингибирует одну энзи-матическу» реакцию в метаболизме, ответственную за скорость росте культуры.

8. Локаз&до, что клетки С. utills поглощают новы меди нз среды. Характер этого поглощения активный, зависящий от возрзстз культуры, температуры, значения рН, концентрации меди в среде. Внесение источника энергии ускоряет этот процесс, а внесение ингибиторов энергетического обмена подавляет поглощение меди клетками.

Ионы меди вызывают подавление дыхания c.utilia которое сопровождается уменьшением количестве цитохромов в клетках. Обнаружено, что в присутствия меди содержание белка в клетках уменьшается, в количество лкпидоя и полисахаридов возрастает,

5. Под действием ионов меди нарушается проницаемость клеточной мембраны.

6. Характер росте и физиологическое состояния непрерывной культуры c.utilia , лимитированной отравлением ионами меди отличается от характера роете я состояния клеток при лимитации роста недостатком углеродного субстрата. При лимитации роста недостатком углеродного субстрате получен« нормальная хемостатная кривая. При лимитации роота отравление* медью количество образованной биомассы линейно уменьшалась с увеличением скорости протока, что мохет быть связано с непостоянством Kj* Методом математического моделирования похевамо, что зависимость г* от о имеет гиперболический характер.

7. В результате изучения токсического действия ионов ■еди на рост и физиологическое оостояямя c.utilia оделено заключение, что повреждение клеточной мембреим и функций ассоциированных о ней является наиболее важным участком токсического действия меди яа клетку, ответственного за подавление росте, в затем и гибель клетки. Однако не исключено я действие меди на внутренние структуры клеток.

-ЩА

Список работ, опубликованных по тепе ■ диссертации

I. ХоврычевИ.Д, и Работновв И,Xj, 1972. Кинетика лодев-ленин роста c*ndid« utilis ионами меди. Микробиология, 41, 4, 672.

. iоврычав Ii .П., 1973. Поглощение ионов меди клетками Candida utilis» Микробиология, 5, 839.

1J. Ховрычев М.П., Фёдорова Т.Д., и Раб охи ов а И Д., 1974; О влиянии ионов меди на рост Candida utilis в непрерывной культура. Микробиология, 43, I, 95.

t. ховрмчев U.U., Иванова И.И., Салтыкова СД<. В74. Изучение химического состава ифизиологических свойств Candida' utilis при ннгнбировакии роста ионами меди. Микробиологии, в печати'.

Поди. * печ. 18/Ш-Мг. Формат 00x6-4 1/18 д.л. Объем 1,7« я.»и Заказ 41 ВО Тираж 200

Фабрика КМП Глаевого управления вычислительны! работ

ЦСУ СССР

i

I »