Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГИЯ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ ЛЮЦЕРНЫ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГИЯ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ ЛЮЦЕРНЫ"

зшч

Московская ордена Ленина н ордена Трудового Красного Знамени сельскохозяйственная академия имени К.А .Тимирязева

На правах рукописи

КАЛИНИНА ЕЛЕНА БОРИСОВНА

ФИЗИОЛОГИЯ АДАПТИВНЫХ РЕАКЦИЙ И БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ СОЛЕУСТОЙЧИВОСТИ ЛЮЦЕРНЫ

03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

Москва 1994

І

Диссертационная работа выполнена в отделе биотехнологии и клеточной селекции Всероссийского науч-но-исследовательскохо института- кормов цменв В.Р.Вильямса.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Мазин В.В.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Прусакова Л .Д.

кандидат биологических наук Аветисов В.А.

Ведущее учреждение - Институт почвоведения и фотосинтеза РАН.

Зашита состоится " & * ноября 1984 г. в ' * ч на заседании специализированного совета Д. 120.35.07 при Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева.

Адрес: 127550, И-550 г. Москва, ул. Тимирязевская, 49, сектор зашиты диссертация.

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ ТСХА.

Автореферат разослан - 3 " 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Лосева А.С,

Актуальность темы. Вовлечение засоленных земель в сельскохозяйственное проюводство - ванная народнохозяйственная задача, которая мояет быть осуществлена с помощью новых сортов кормовых культур, устойчивых к действ«» почвенного засоления. Создание таких сортов с помощью методов традиционной селекции - про-деоо дхитвлыш! * трудоемкий. Поиск новых методических подходов ж получению устойчивых генотипов и повышение устойчивости имеющихся с.помощью методов биотехнологии - задача весьма актуальная. Кроме того, недостаточно изучены физиологические механизмы адаптации растений ( в частности, кормовых культур ) х действии солевого стресса. Это затрудняет ооздание адекватных селективних систем для отбора на клеточном уровне, а также физиологически обоснованного поиска защитных препаратов.

Пель в задачи исследований. Цель данной работы состояла в изучении физволого -биохимических особенностей люцерны, полученной методом селекции Іп чіНо, а также биотехнологических сь>-собов повышения устойчивости растений к условиям солевого стресса. В соответствии о этим необходимо было решить"следующие~задачи:

1. Изучить адаптивные реакции растений люцерны в ответ на действие солевого стресса.

2. Провести сравнительную оценку влияния солевого и осмотического стресса на различных уровнях организация одного и'того 3.0 растительного организма ( клеточном, тканевом, органнзыенном) для оптимизации системы отбора на клеточном уровне;

3. Выявить эффективность использования биопрепаратов для повішеная солеустойчнвостм люцерны.

Научная новизна Работы. Впервые изучены физиолого-биохташ-чоскжв особенности люцерны,подученной методом селекции на клеточном уровне ( солеустойчнвого Клона 124). Показано, что адаптивные рзакциз глсна на солевой стресс в значительной степени отличаются от исходной формы и других сортообразцов: для Клона 124 характерен стабильный уровень гомеостаза в пределах 4-8 атм хлорида натрия.

Впервые обнаружена возможность испо.'д>зов&кхя бактериального препарата, активизирующего фотосинтез (ДФ), как адаьтогона, по-заааадвіч>_сол9устойчивость ЛЕщеряа. Показано действие хк&згчоского (кивал) и биологического ( симбионт ) препаратов на поньшлке адап тавного потенциала растений люцерны в условиях действия солзвого стрссса.

ЦЕНТРАЛЬНАЯ'

науч'ч-н библиотека; «.іосіг. сіі.'іьікохоз академии

и 1. К. А. Тн^ря

Инв.

JlpoBBzePi. »'разнптальное изучение токсического и осмотичесго-го фяк торов ччсол^чных почв на различных уровнях организации одного и того же растительного организма ( клеточном, тканевом, орга-

низм^нном) .

Практичесчал значимость работы. На основалил изучения адаптивных реакций Клона 124 подтверждена эффективность отбора на кло-іочьоч уровне для получения солеустойчивых форм растений.

Для повышен"-' устойчивости к солевому стрессу ( его осмотическому и токсическому компоненту) предложена система отбора на основе суспензионной культуры клеток люцерны.

Установлена возможность использования биологических, химических и бактериальных препаратов как альтернативный Сиотехнолоплоский метод погашения солеустойчпвости ллцертш.

¿нробзния диссертационной работы. Материалы диссертации доложена на Всесоюзной научной конференции молодых ученых и аспирантов "По актуальным проблемам интенсификации кормопроизводства" ( Москва, 19Э1), на "Межвузовской методической конференции по совершенствованию учебно-методической работы и повышении эффективности научных исследований физиологов и биотехнологов растений п с.-х. вузах" (Москва, 1994), а также на научно-технических советах селекционного центра по кормовым культурам ЕНИИ кормов и научных семинарах отдела биотехнологии и клоточной селекции ЕНИИ кормов в IS9I-1994 гг.

По материалам диссертации опубликованы 2 научные работы к два сданы в печать.

Структура и объем-диссетутасла. Диссертация состоят из введения, обзора литературы, шести глав ( из них четыре с изложением результатов), заключения, выводов, приложения, списка литературы, вклвчаюшего 150 наименований (из них 40 иностранных). Работа изложена на 130 страницах ианявописного текста, годержит 23 таблицы и ¿5 рисунков.

УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ й МЕТОДЫ ИССЛККо&ШЗ

Исследования проведены в I990-1994 гг. в отделі биотехнологии и клеточной селекции ВНИИ кормов им. В.Р.Вияьямса.

Растения выращивали в условиях селекционяо-теплтчяого коч-гтскса. Культивирование каллусных культур, а тзкез растений в условиях минровегетаьиснного опыта осусествляли в камерах искусствен-■о климата фирма "Эерер" при температуре 25°С и освеазнностд 3-

5тно.лх¡культивирование оуопензионных культур осуществляли на ххтоотатцроватшх встряхивателях KF -4 с круговым движением подме. Работу в уововвях асептики проводили в ламинарном боков.

Объекты упдяр^руича. в качестве объектов исследований исполь-•оваля следующие оорта к образцы люцерны:

Кяон 124 - образец люцерны посевной ' Неіілла sativa L., получав Н.А.Голыикиной ( ВНИИ кормов ) жз сорта Хивинская местная методом отбора на клеточном уровне к хлориду натрия. Отличается по-вшввно! устойчивостью к хлорадному засолению; потомство клона от самоопыления сохраняет его устойчивость ( Солодкая, Голдакжна, Ar« Федорова, 1965). .

Хжвюкшая местная, Вахшохая 300, Берехе, Надежда, Кокше - сорта люцерны посевной MccUajo <atlva L., .Bora 87, Ленинская местная, Унитро - оорта «церны изменчивой MedlajovatlaMait.

Как объекты исследования попользовали следующее биопрепараты: Актнватор фотооннтеэа (АФ) - получвн из АО "Биотехнология", где рекомендован к нспольаованию как.биоактиватор. Йрепарат создан на основе кислотообразующих анаэробных бактерий, выделенных из ризо-оферн растений. В ооотав препарата входят мккровлеыенты ( в виде ксавлексонатов), а также отабилиэаторы. Препарат включен в Спиоох рйгуляторов роота ибиоактиваторов, рекомендованных Госхимкомис-оней * применению я защищен заявкой на патент С Чекасина о соавт.,

Iése).

СШбмонт Гвмотжм ) - ростовой препарат, стимулирующий" развитие растений ■«'.' как следствае, ах урожайность. Получен не продуктов метабол■ виц грнбов-эвдофитов, выделенных из корней облепихи ( Гель-цвр, 1970). . ' ' •

MÉiu C І-хлорметяловлатран)- получен из. Государственного НИИ химия ■ технологии елементоорганхчеоких соединений. Экологически чистый кремвніоргаяічеокий препарат, биостимулятор о адаптегенными свойотвамнХ Корзнннююв, Дьяков, 1991 ).

МйІШиКіШДааШЛ. Прораівивание оемян на растворах солеї, хлормда и сульфата натрия, их смеси, карбоната натрия и маннжта проводили по методике ВИР ( Методические указания, 1974 >. Основою лші засолення почв моделировали по Е.В.Аринушкиной С 1970 ). Для сравнительного изучения солевого и оомотвчеохого стресса на уровне пророотков использовали ивоооиотическяе соотношения хлорида н сульфата натряя. а также маннжта от 2 до 8* атм ''(Методические

указанна ВИР; 1977'). і';''-v'v

Каллускую и суспензионную культура полупали, используя в качества основной питательной среда оптимизированную среду Гамбор- 1 га Bg ( Ganíotj etat., 1968; Мезенцев, IS30). Для гчнциации халлу-со^енеэа добавляли фитогорьюны в следующих концентрациях: по 8 мг/л 2,4-Я и кинетика, а "акав 0.5 мг/л НТК. Суспензионную культуру клетог лэдврнн получали из каллусов, добавляя а гадкую питательную среду Гамборга 3g по I мг/л 2,4-Л и кинатина. Влияние солевого ( хлорид натрия) и осмотического ( маннит ) стресса на культуру клеток и ткавей оценивали по изменению массы клоток в суспензионной культуре и каллусной ткани соответственно под влиянием изо-осмотических соотношений С 2-8 атм ) каждого из факторов.

Показатели эффективности симбиотаческого взаимодействия люцерны с клубеньковыми бактериями Ählioilum míílíotl ( штаїаш FS-5 и CXM-I получены из ВНИИ CHU оценивали в условиях микрове-гатационного опыта ( Методические указания ВНИИ СХЫ, 1985) я водной культурі { ble, 1969). Работа проведана совместно с сотрудниками лаборатории солевого обмана и солаустойчиэости ИФР РАН, кандидатом биологических наук Г.Ф.Хайловой и ваучнш сотрудником В.Е.Кореловым.

"атод песчаной культуры использовали для оценки влияния биопрепаратов на солеустойчивость люцерны. Растения выращивали ва сш~ си Гельригеля ( Метояичоскне указания ШР, 1977) о добавлением следующих концентраций хлорида натрия: 0,57? ( 4 атм); 0,В5 ( 6 атм ); • 1,12$ ( 8 атм ). Обработку препаратом AS проводили в фазу третьего настоящего лиота, затем через две недели ( I их па 500 мл гады); растворами препаратов кивала ( 20 иг на 100 мл &,0) я симбионта ( 10*"®*) обрабатывали аемана в течение соответственно 2 ч В 0,5 ч.

Определение пигментов s листьях ( хлорофилла а, 6 и каротп-ноншов), свободного пролива в надземных частях растениД и фенольних соединений в листьях, горцях я корнавах экссудатах проводили спектрофотометричсски ( Specmd M—100. Германия). Расчет содержания ситаентоа производили по формулам Хольма ( Шянк, 1971) при опре делания их в ацэтсноЕой Еытяззв. Содержание свободного пролива определяли по методу Soies et ai. ( 1973) а модификации Л.Г.Ка-линкиной и др. ( 1990). >?яолыше соединения идентз$ицяровали, ' используя гачэственную реакцию с роагтггса Фслина-Хениса С Сллроь-э-тоз. 1971). _ _

Цателтгичсскую оЗраСотк? рваї.-.ьїагсг і ссявдигрнка проведали н-— годом дкс"о,-спомного смог .isa {Г.осгехо^, I5G5).

ЗКСПЕРИМШАШИЯ ЧАСТЬ

. СОРТОВЫЕ ОСОБЕННОСТИ ДЕЙСТВИЯ СОЛЕВОГО СТРЕССА , НА РАСТЕНИЯ ЛПЦЕРНЫ рдиодиа долевого стресса на прорастание семян и рост про-роотвов JfYiftPHtii Проводили сравнительное изучение сортообразцов люцерны по прораотаяию семян и рост; проростков на солевых растворах. Как критерий устойчивости использовали показатели количества проросших оемян и длины корня проростков.

Уотановлено.что порогом токсичности солей для прорастания семян сортообразцов Унятро, Кокше, Надежда, Ленинская местная является 1% хлорида и.сульфата натрия, тогда как для роста корня проростков-* 0,5$ кавдой из солей.

Показано, что для прорастания семян и роста корня проростков ящерки характерны общие закономерности: стимулирование при 0,5< уровне засоления и значительное ингибировакиа при возрастании концентрации как хлорида,- так и сульфата натрия до 2,5%.

По прорастанию семян на растворах солей хлорида п сульфата натрия исследованные оортообразцы располагались следующим образом: • ; ■ Унитро > Надеада > Кокше > Ленинская местная. Однако по длине первичного корня-расположение сортообразцов ' было там:-

Ленинская местная* Кокше »Унитро >Надевда. . Полученные нами данные согласуются о литературными о большей чувствительности к засолению роста первичного корня растений по сравнению о прорастанием семян ( Удовеяко.1989).

Полученные результаты дали.оонование выделить контрастные к действию солевого стрвсоа сорта, с которыми проводилась дальней-ааяработа.Однако сравнение изопроцентных концентраций солей затруднительно, поскольку они различаются по осмотическому давлении растворов. В этойовязи било иоследовано действие солей в конце"-грациях, выравненных по осмотическому давлению.

Действие различных компонентов солевого стреода на рост проростков я содержание уют^иллд. Солевой стресс включает осмотическое неспецифическое действие солевого расгвора и непосредственное влияние ионов солей ( Строганов, 1973). Для сравнительного изу чения осмотического стресса использовали маннит; токсическое действие солей моделировали применением хлорида а сульфата натрия в

Таблица I

?-;л7.г:з салэсого п осшпгмового стресса ка рост проростков ляцэриы з ссдэршша хлорофилла в листьях, % к кзв!ролв

Ьид и } •гавань (ати ) I К по ( Т?,4 » На. пекла | Ленинск I местная

стргсо- Лак юра ! СдаиасоаЮуш» хло-!Оиоыасса ! суша хло- [сумма хло-

I ! ро^дио в ! 1 рофэллаа 1 ! рОфИЛЛОВ

Наняит 103 151 93 123 103 119

2 агл 1лСС ПО 112 93 74 61 106

76 87 78 74 81 96

Мшт 73 161 87 127 81 120

; 1тч Ы1 £0 ЭЭ 75 73 71 60

Со 145 48 ее 59 17

Ца'нат 83 152 75 137 71 99

6 атн КйС£ 93 97 57 63 59 57

иа2гс( 43 32 45 14 43 14

5Цгазт 73 136 £6 104 5Э 85

С пг' ик 73 73 48 61 62 50

-

изоосмотических концентрациях. Поскольку на стадии проростков растения переходят к автотрофному типу питания, исследовано действие различных компонентов стресса на содержание зеленых пигментов.

Общей закономерностью для трех исследованных образцов было снижение биомасоы проростков и содержания в них хлорофиллов под влиянием возрастающих концентраций солей ( табл. I ). Различия токсичности в большей степени проявились при средних ( 4 атм ) и высоких ( б атм ) уровнях стресс-факторов. Сульфат натрия отличался большей токсичностью по сравнению с хлоридом, что характерно для всех исследованных образцов. При уровне засоления 8 атм сульфат натрия полностью иигибировал рост проростков, тогда как хлорид натрия и манннт лить частично.. ( табл. I). Действие маннита в меньшей степени снижало биомассу проростков и содержание'хлорофилла в.листьях, что сообвнно выражено у лщерны Клон 124. По-видимому, это может характеризовать осмоустойчивооть клона. Даже при самом высоком уровне осмотического стресса ( 8 атм ) значительно увеличивалось . суммарное содержание хлорофилла в листьях проростков Клона 124 ( 136* ), тогда как у оорта Надежда этот показатель был на уровне контроля (I04Í ). У люцерны Ленинская местная в тех же условиях наблвдалооь снижение содержания хлорофилла ( 85$ ). Было показано, что под влиянием сульфата натрия ( 4 атм ) у проростков Клона 124 происходит значительное накопление зеленых пигментов за счет хлорофилла в ( I45JÍ к контролю.). Можно предполагать, что увеличение его содержания связано о активизацией механизмов защиты от солевого стресса, что не характерно доя сортов лщерны Надежда и Лэнинсвая местная.'

Таким образом, нами выявлен один из механизмов адаптации Клона 124 к действии изучаемых отресс-факторов.

Влияние солевого отресоа на рост, содержание "Пигментов и ■Тврп^нцт; поапцреотШ у диаид я условиях ммШм-мгеапкпга ЙЯяп-мо действия с fthunStum metitoU. Оценку эффективности симбиоти-ческого взаимодействия лщерны Клон 124 и его исходного сорта Хивинская местная о клубеньковыми бактериями К., metitetl ( штамм PÍ-5) в условиях засоления проводили по комплексу показателей ( габл. 2).

Выявлен противоположный характер изменения изучаемых показателей у образцов лщерны при засолении. Хлорид натрия в кон-.энтрации 0.75Í не снижал надземную массу и массу клубеньков у ..¿на 124 С 109 и 100% к контролю соответственно), несколько ува-

. ■ ................Таблица 2

Изменение показателей эффективности сиыбиотичеокого' взаимодействия лгцерны с ILmeliCott при засолении

Показатель

I Клон 124 !Хивинская мест-IHCPr«: по _____!рл__[фактору закон-« Mn et ГТКон-JыГр» I соления

,^(0,75* ) (0,75* ) !

! !еда-IS к I

I !ницы!кон-! ! !изм.!тро-1

II !лю !

!еди- к I !ницы 1коп-1 1изм. !тро-!

J_»Д> I

1. Масса надземных органов, мг/растениэ -

2. Масса корней ыг/рас-

т0ни9

3. Ыасса клубеньков. . мг/растение

4. Количеотво клубеньков, шт/растенив

5. Нитрогеназная активность ,иМоль/растение в час

Б. Сумма хлорофиллов, ■ ыг/г сыроа массы

7. Каротиноида, ыг/г сырой массы

449 490 109 493 356 72 44

150 144 96 320 242 75 30

16 16 100" 34 9 26 . ' 35

25 19 76 38 II 28 4

II794 39566 335.65870 36062 54 2557'

32,27 35,75 11137,10 24,74 67 6,18

7,20 7,06 SO 8,10-1,67 20 0,78

лзчивал содер-жание хлорофилла ( III?), тогда как содержание ка-ротиноидов оставалось на уровне контроля ( 9Si). Этот образец в условиях засоления характеризовался возрастанием более чем в три раза нитрогеказной активности. Исходный сорт Хивинская местная значительно снижал при засолении надземную массу, ыассу корней, клубеньков и их число, а такая показатель нитрогеназной актиа- • ности. У сорта Хивинская местная отмечено снижение содержания хлорофилла и «аротиноидов, что может быть свидетельством действия стросс-фактора. Кроме того, содержание пигментов в листьях бобовых может быть одним из критериев эффективности езогфикса-ции ( Посыпанов, 1991 ).

В условиях скыбиотического Езаиыодействия лыцерны с R.meftfoti ( итамм СХГ.1—I) при засолении изучали такжз изменение содержания фенольных соединений с максимумами поглощения ьр- ¿15-235 им .и 255-275 км, которые могут иметь залетные фуняциг ( Кретович,

1971; Запрометов, 1974). Показаны различия в содержании этих веществ в листьях, корнях, & также корневых экссудатах лщерны Клон 124 в условиях засоления. Можно предполагать, что фенольные соединения корневых экссудатов ( 255-275 нм) являются ответной реакцией на симбиотическое взаимодейотвие растений с Ä.. meftfotl к солевой стресс. Возможно, что эти соединения могут быть сигнальными молекулами, - участвующими в регуляции взаимоотношений бактерии и растения.

ВЛИЯНИЕ СОЛЕВОГО СТРЕССА НА. КУЛЬТУРУ КЛЕТОК И".

ТКАНЕЙ ЛЮЦЕРНЫ

Наши исследования выявили значительные различия устойчивости оортов к токсическому и осмотическому компонентам солевого стресоа ча уровне интактных растений. Представляло интерес выяснить, как действуют эти факторы на уровне неорганизованной ткани ж клеточной суспензионной культуры. Кроме того, эффективность . образования каллусов и их морфогенез зависят от используемого эк-спланта (лист, гипокотиль и др.) ( Мезенцев, 1977 ). -. Сортовые особенности каллтсогенеза люиешы. Показано , что каждый из изучавшихся эксплантов ( семядольные листья, гипокотиль, корень) способен к каллусогенезу, однако величина каллусов, степень некротизации и их морфо-физиологические характеристики могут быть различны. Установлено, что ткани гшокотшш отличались высоким уровнем кадлуоогвнеэа. Исследованные сорта люцерны различались по каллусогвнезу следующим образом: Коков ( 100? ), ;{адеада ( 9256 ), затем Ленинская местная ( 76% ) и Унитро ( 58% ). Выявлено, что для каллусных тканей этих сортов характера! различные морфо-физиологические показатели ( коноиотенцкя, отруктура, окраска, масса и др.). .

Высокий морфогенетический потенциал каллусных тканей выявлен 7 образцов лхцерны Надевда и Ленинская местная.

Наряду с Сортовыми различиями показаны также различия мс -Урологических характеристик каллусных тканей, образованных из различных эксплантов« что в равной степени относится ко всем исследованным образцам люцерны. Наибольшее количество неморфогенных-каллусов образовалось из ткани корня ( по 83%- у люцерны Налеада и пекинская местная К" Больший выход морфогенвдх каллусов получен из ипокотилей ( 40,30 и 10% соответственно для сортов Ленинская мест чя, Надежда и Унитро).

ivwprea солевогд стресса на рост уяюгускоА тцзну лзлететч. На- . мп показано, что действие низких концентраций солей ( сульфата и ' хлорида натрия) стимулировало рост' яророотков люцерни. Стимулирующее действие этих оолай проявилось также на уровне каллусной ткаяи.

Следует отметить, что при низких концентрациях солей;(О,5%) иаблэдалось стимулирование роста первичных каллусных тяапэй, полученных из разных эксплаагов -люцерны, что в больней с та пекл ха-'' рактерно для сорта Ленинская местная. При увеличения содержания как хлорида, так и сульфата натрия до 0,75$ в средэ для культивирования снижался уровень каллусогенеза, угнетался рост каллусной . ткани и увеличивался ее некроз. У сорта Надежда дальнеСпев погызе-ние уровня засоления (до 1%) полностью ингибировало каллусогеноз; люцерна Ленинская местная отличалась более выоокой устойчивостью каллусной ткани.к действию сульфата натрия, когда .даже I? концентрация этой оола не ингибировала катаусогенез.

Исследования показали различную степень устойчивости перьич-ных каллусных тканей, образованных"из лиотоеых эксплантоЪ, пгао- ' котяля и корпя. Это иожет свидетельствовать об относительной устойчивости различных органов растений к согласуется'с результатами, полученными Р.Г.Бутенко и др. ( 1067 ). Наименее устойчива каддуская ткань, полученная из семядольных листьев, более устойчива ткань гд-покотиля и корня. Однако высокий морфогекетический потенциал ткани пгпокоткля дает основаїгае для его предпочтительного использования в качестве экспланта для получения тканевых и суспонзионнах • клеточных культур, используемых в-клеточной селвюрш.

Дэйствие ттзоосмотич^сяух соотнотпдтгай х^отша ттггя п і'^гргн- , та р-»- рост каглтсной ткачи и суспенэго?ной уулътугч дгчд^і. На модельных объектах било показано, что осмотический отреоо в гораздо меньшей степени блияэт на ростовые процессы, чем дейстазэ растворов солей в пзоосмотических концентрациях. Представляло китэрес сравнить действие этих фаятороэ на оргаяизмеяном и клеточном уровне. Каллусную ткань и суспензионную культуру клэтек получали из гкпокотилей люцерны Надоэда и Ленинская местная.

Показано ( табл. 3,4 ), что при осмотическом давлении 4-6 атм . солевой стресс ( хлорид натрия ) в большей степени ингибяровал рост каллусной ткани и суспензионной культуры, чем осмотический ( раствор маннита). Слабый осмотический и солевой стресс ( 2 атм ) в равной степени стимулировали рост каллусной тка^л; г;:высоком осмотическом давлении ( 8 атм ) различия по их действию также мгая-. малъны ( табл. 3 ).

"" " Таблица З

Влияние солевого и осмотического стресса на массу кадлусной ткани дгцерны

Стресс-фактор, атм ! Глееа каллусов

Уровень1Ьзд засоле-} сорт Надежда ! сорт Ленинская местная

НЯЯг» 1 т> 1 ! Ъ. 1 г \% от ксн-! ! ПОЛЯ 1 г ! % от кон! тголя

Контроль 2 атм Цзянит Хлорид аат- SribS ООО • 100 119 . 104 ООО АСП^ -sJtOCTl 100 ИЗ 102

4 атм. 'Маннит Хлорид натрия 0,49 0І36 102 75 0,40 0,32 87 69

6 атм . маннит Хлорид натрім U.4B 0,17 iUU 35 ОС Sic ал 35

8 атм Манялт Хлорид нат-гия U,14 0,12 ■¿м 25 0,13 0,08 ■¿а 17

НСРрд по Pj 0,05 0,05

по îvj 0,03 0,03

" ' " ™Слёду0Т~оп1втетьГ что у обоих сортов на уровне каллусной ~ ткагя выявлена ¿¿львая устойчивость к осмотическому стрессу, чем .. в солевому. Тек, каллусная ткань сорта Надежда выдерживала до Є атм шянята в только 2 атм. - хлорзда натрия.

Симулирующее влияние осмотска в большей ^степени проявилось пра действии на культуру клеток люцерны ( табл. 4 ). Осмотический стресо.. 12 и 4 атм ) стимулировал рост клеток в'суспензионной культуре у исследованных сортов лщерны. Хлорид натрия (2 атм ) увеличивал массу клетох лгль у лхцеряы Ленинская местная ( I42Î); у.сорта Надежда этот показатель оставался на уровне контроля (03J5). Под влиянием 4 атм хлорида натрия масса клеток у обоих сортов слабо отлгчалась от контроля. Показало, что суспензионные культуры проявила бадьаую устойчивость действии солевого стресса, чем каллусная ткань, что характерно для обоих сортов люцерна. Так, у сорта Надецда ыасса клэгоя сохранялась на уровне контроля при действии 4 атм хлорида натрия; шсса каллусной тка-ня в тех же условиях значительно снижалась. Подобная закономерность была менее четко выражена в культурах In vltxo сорта Ленинская местная.

Таблица 4

Влияние солевого и осмотического стресса на массу клеток * оуспенэионной культуре люцерны

Стресс-фактор, і атм ! Масса клеток в суспензионной культуре

Уровень 1Вид за- 1 сорт надежда I сорт Ленинская местная

засоле- 1соления ! ! Р2 ! г 1 % от кон-! ! траля ! .г 1 % от кон-I троля

Контроль 0,43 100 0,26 100

Маннит 0,55 128 0,44 169

2 атм Хлорка натрия 0,42 98 0,37 142

Мастит 0,52 121 0,31 119

4 атм Хлорид натрия 0,39 91 0,24 92

6 атм Маннит Хлорид натрия 0,28 0,10 65 25 0,20 . 0,07 77 27

Маннит 0,6Ь ш и.иь 13

8 атм Хлорид натрия 0,04 9 0,03 II

НСР05 по ^ 0,08 0,04

поР2 0,05 0,02

Таким образом, на уровне ткани и клеток отмечены сортовые различия устойчивости люцерны к солевому и осмотическому стрессу. Следует отметить также, что характер действия солевого и осмотического стресса на клеточном уровне,соответствует влиянию этих факторов на уровне интактного растения.

ДЕЙСТВИЕ БИОПРЕПАРАТОВ НА СОЛЕУСТОЙЧИЭОСТЬ ЛЮЦЕРНЫ К настоящему времени созданы препараты нового поколения (биологические, химические, бактериальные), обладающие широким спектром полезных свойств и отличающиеся экологической безопасностью. Действие некоторых препаратов носит неспецифический характер и связано со стабилизацией функций мембран растительных клеток ( Шеве-

'ха, 1992). Это предполагает возможность их применения для повышения адаптации растений к условиям солевого стресса.

Нами показано, что действие засоления в значительной степени снижает содержание зеленых пигментов в листьях растений люцерны. При засолении также отмечено снижение интенсивности фотосинтеза .('Лапина, 1973; Строгой-"*, 1973). В связи с этим било оделано предположение, что биопрепарат, активирующий фотосинтез ( АФ), будет компенсировать отрицательное действие солевого стресса. Поддержание фонда зеленых пигментов на необходимом физиологическом уровне является проявлением адаптации растений в условиях засоления. Кроме того, для оценки влияния на растения солевого стресса было определено содержание каротиноидов, свободного пролина, а также изменение биомассы ( продуктивности). Дня сравнительной оценки эффективности действия препарата АФ использовали ррепарат ыивал, изаеот-~шй едаптогенными свойствами I Корзиннлков,' Дьяков, 1991) и биопрепарат симбионт. Исследования проведены на лэдерне Клон 124, его исходном сорте Хивинская местная и сорте Надежда.

Дейстрие препарата АЗ на адаптивные свойства лгашгны в у ло-учях засоления. В таблице 5 представлены результаты влияния препарата АФ па содержание фотосивтетических пигментов. Выявлено, что препарат вызывает повышение содержания хлорофилла и каротиноидов. Это действие сортоспецифичво и зависит от уровня засоления. Увеличение содержания пигментов при засолении под влиянием АФ в большей степени проявилось у оортов Хивинская местная и Надежда. Позы-ивние синтеза пигментов под влиянием АФ у люцерны Клон 124 пока- , зало в интервале концентраций хлорида натрия, соответствующих 4-6 • атм ■ осмотического давления, а также в варианте без засоления. При высоком уровне стресс-фактора (8 атм ) эффективность препарата снижалась; подобные закономерности характерны также для каротиноидов. Действие АФ проявилось в повышении суммарного содержания хлорофилла у сорта Хивинская местная на всех уровнях засоления (48 атм ), а каротиноидов - при 6-8 атм. Для сорта Надежда повышение содержания обеих групп пигментов под влиянием АФ показано также на всех уровнях засоления.

Выявлено, что изучаемые образцы лщерны в значительной степени отличались по содержанию фотосинтетических пигментов в норма, а также по направленности ответной реакции в условиях засолэния ( табл. 5). С возрастанием уровня хлоридного засоления у люцерны Клон 124 не выявлено снижения содержания оосих групп пигаенюв,

что может быть свидетельством ярко выраженных адаптивных реакций, характерных для этого образца. У исходного сорта наблюдали сь-^гл-

Таблица 5

Влияние препарата АФ в условиях засоленля на содержание фотосинтатических пигиенюв в листьях люцерны, иг/г сырой пассы

Сортообразец ! Вариант I Уровень хлоридного засоления

! * 1 " " (о.др. угм ^

и—Г

Клон 124

Контроль ( без обработки )

Обработка АФ

Процент от контроля

НСР05 по ^

20.97 3,36

21,19 3,93

33.99 5,66

23,69

1755

по Ро

0.26 Dt«I

23,35 17SD

35.26 2Q.3Q

Хивинская местная

Контроль 19.54 . 17.16 15.56 13.27 ( без об- 2,43 8,55 3.29 3,04

іб^тки

Обработка 15.32 20.40 26.81 АФ 5,06 3,ь4 5,05

Процент от 78 Щ '■' 175 контроля 208 4Г 153

2 0,43

НСР05 по P!=§tll ; ПОР^

Надежда

Контроль 17,87 26.05 15.43 12.00

( без об- 3,25 6,47 ТТЗЗ 3,28 работки

. Обработка 34,92 36,57 22.33 16.то

АФ 3,67 ■ 7,12 12177 Й.43

Процент от - 195 140 145 134.

контроля Пз ГГО 295 Тйб

НСР05 по f='07§i ;

Примечание. В числителе - сукна хлорофиллов, в внамваетвле - каро-тяноядов. Fj и - факторы действия васолеяия я АФ соответственно.

ние содержания суммы хлорофиллов с возрастанием уровня засоления, а также уменьшение содержания каротиноидов. Сорт Надежда также сни-л содержание фотосинтетическкх пигментов при высоких уровнях за-

оодвния ( 6-6 атм ). Более низкий уровень глоридного засоления (4 атм ) стгмулкровал накопление пкплентов.

В таблице 6 показано влияние препарата АФ на содержание свободного пролина и продуктивность образцов .тоцврны при засолении. Действие АФ на эта показатели такие сортоспецифично. У лщерны Клон 124 повдаенне содержания свободного пролина ( 269-233?) показано а интервале концентраций хлорида натрия, соответствующих 4-6 атм осмотического давления, а также без засоления ( 123?). При его высоком уровлё аффекмвноога препарата снизалась. Содержание свободного прелина под влияетеы обработки АФ повышалось в пределах концентраций хлорида натрия 6-8 атм у сорта Хивинская местная и на всех уровнях засоления ( 4-0 атм ) у сорта Надежда.

Обнаружено, что ееследуемые образцы лщерны в значительной степени различались уровнем свободного пролина в норме и при за-солеши. Известна протекторная роль пролива в раотениях при солевой стресса ( Зовняова, Карслевсян, 1994; Ray et а(., 1912). 7 Клона 124 отмечав наиболее высокий уровень свободного пролина. Со мера возрастания хлорддного стресса его содержание достоверно увеличивалось. У исходного сорта Хивинская местная и оорта Надежда, вооборог, нжЛлтяалд снижение этого показателя.

Зое фяазолого-бЕошаячэсхяе изменения, вызванные засолением, отразились на продуктивности образцов лщеряы (табл. 6). У Клона 124 отмечено возрастание бвошооы надземных органов при низких ( 4 атм ) я средних (. 6 атм ) концентрациях стресс-фактора, затем пра угелгчгнхш уровня гасолэния до S атм С 1,125) показатель не стлгчалоя достоверно от контроля. Для исходного сорта Хивинская азотная s сорта Надежда характерно снижение продуктивности о возрастанием урсвая засоления.

ПоЕааеета ворыозой биомасса ( от 185 до 255«) под влиянием обработки биопрепаратом АФ ( табл. 6) установлено для сорта Хзгаиа-схая иеотаая пра ссах уровнях засоления, а также л отсутствии строг са ( 119?). 7 сорта Еадэжда препарат АФ в значительной степени погасая продуктивнеегь без засоления ( до 127?) а при его высоком уровне ( 187$ У лщерны Клон 124 обработка препаратом АФ повисала продуктивность прз низких и средних ( IC3 и 1Ы} соотгатстввн-го) уровнях засоления, а также в варианте без засоления и Сила ке о-^Двктжыа ври высс?сй гепцентрални хлорида катряя ( 8 атм ).

Тагии сбрагом, з результата изучения ая.гкля Сактер га-'Ьчого агитатора фотссгггеча (AÎ) "ч солеустсйчгьоотг. с'рач^тч -хг.чр'С!

Таблица 6

Влияние препарата АФ в условиях засоления на содержание свободного пролина ( мкг/г) и лродуктивнооть люцерны (г).

Сортообразец ! Вариант ! Уровень хлоридного засоления (о.д.)

» I_ ЙТМ_

»• ' 10 14

« 6 ! 8

Клон 124

Контроль 87,78 180,18 • 272,58

( без обра- П7Г 27Эй 271Г ботки АФ)

Обработка ВД2 ^ . S^

Процент от контроля

НСР,

05

порГ07

233 69

l5ö 5i

№

Хивинская местная

w в2 т

ботки АФ )

Обработка АФ p^ga I^a ip^Q

Процент от JSL 167

^^ ШГ 26b

контроля

НСРоб

11,83 Ü723

Надежда

Контроль 71.61 236.00 160.54 106.26

(без обра- Т738 2,28 17ЯГ ОТбТ ботки Аф )

Обработка АФ 95.86 292,21 351Л5 194.04

ТТТь 1,91 ' 1.72 1Г18

134 123 219 .182

12у ¡33 ШГ IB7

Процент от контроля

НСР05

по

ш

Примечание. В числителе - содержание свободного пролина в надземных органах, в внанвнатела - продуктивность. *т в ?? - факторы девствжд засоления и АФ соответственно.

выявлена зависимость его действия от сорта и уровня заооленяя. Показано, что в большей степени действие препарата проявляется у менее уотойчивых к засолению образцов люцерны ( Хивинокая мастная и Надежда).

Вместе с тем показаны различия физиолого-биохимических реакций образцов при засолении. Увеличение содержания фотосинтетичас-ких пигментов, свободного пролина и продуктивности у лщерны Клон .

124 по маре возрастания уровня хдоридиого засоления,по-видимому, является следствием отбора на клеточном уровне я свидетельствует об адаптивной пргроде исследованных показателей.

Влияние симблонта •• пивала на солеустс ^отвость люцерны. Результаты исследований показали, что у люцерны Клон 124 наибольший эффект от применения симбионта был получен в варианте без засоления, а также при его низком уровне С 4 атм ), что отразилось в изменении физиолого-биохимических показателей ( фотосинтетических пигментов, свободного пролина, биомассы надземных органов). Сумма хлорофиллов, например, изменялась от 104$ в варианте без засоления до 161$ при засолении 4 атм. Дальнейшее увеличение уровня засоления ( до 6-6 атм ) приводило к снижению действия препарата С 83 и 68 $ соответственно ). В большей степени действие симбионта проявилось у сортов Хивинская местная и Надежда при уровнях засоления 6-8 атм, а также без засоления.

Выявлено, что крвмнийорганический адаптоген иивал значительно увеличивал накопление зеленых пигментов на всех уровнях хлорид-ного засоления у лвдерны Надежда С от 134 до 191$ ), и не онижал этот показатель у Клона 124 при 6-8 атм, что составило соответственно 116-101$.

Таким образом, в результате исследований установлено, что действие препаратов симбионта я кивала на изучаемые показатели у образцов лхцерны зависит от уровня засоления з степени солеустойчи -воотз сорта.

Опыты показали, что с помощью физиологически іктігвішх соединений, образуемых микроорганизмами ( препараты АО и симбионт ) mosco исправлять недостатки существующих сортов, в частности, повышать адаптивные свойства кормовых культур а отношении солевого страсса. Химический биостимулятор кивал, обладающий адаптогенгаллт свойствами, также USZHO эффективно использовать для этой цели.

ЗАКЛЮЧЕН®

СортооЗразшх лпхерны Клон 124, полученный методом отбора на глэточном уровне, обладал существенными отличиями от исходного сорта Хявжкяая местная а других сортов, районированных в Волгоградской области. Вочрастапяее действие солевого ссрясса ( ст 2 до 8 атм ) у агслэдованных сортов зазивало ударіїгчяго сслчрта'ол фото-

синтетических ..пгментов, свободного пролива, фенольних соединение, нитрогенаэной активности аэотфиксируицих клубеньков, образованных A, meíltotl, я снихение эеленой массы ( продуктивности). Реакция Клона 124 на засоление характеризовалась повышением исследованных показателей, что влекло за собой увеличение продуктивности растений при низких и средних уровнях засоления и сохранение зеленой массы на уровне контроля при высоком уровне засоле-. нкя. Под влиянием солевого отреоса увеличивалось содержание каротиноидов, что свидетельствовало об улучшении кормовых качеотв люцерны Клон 124. Потери хозяйственно-ценных свойств исходного оор-та люцерны обнаружено не было. Следовательно, о помочью клеточной селекции можно придавать раатениям люцерны свойство устойчивости к засолению, а возможно, и к другим абиотическим стресоовш факторам. Получение солеустойчивой люцерны методами гибридизации о дикими видами.обладающими такой устойчивостью, часто влечет ва собой перенос и гибридное растение нежелательных свойств дикого родителя. Поэтому метод клеточной селекции имеет оуоеатвеяное положительное отличие от традиционных методов гибридизации.

Изучение устойчивости люцерны к солевому стрессу при pasma уровнях организации растительного организма показало, что наибольшей устойчивостью отличаются клетки в оуопензионвой культуре в условиях гетеротрофного питания, то есть уотойчивостьонижаетоя по . мере повышения уровня организации растительного органиаиа. Можно предполагать, что снижение устойчивости происходит в овяви о переходом растительного органиаиа к автотрофному способу питания. По-видимому, отрицательное действие соли влияет в значительной мере на фотооивтетичеокую систему растения, что подтверждается снижением уровня фотосннтетичеоких пигментов, показанным нами, а также снижением интенсивности фотосинтеза различных культур под влияя»-, ем солового стресса ( Гончарях 1968; Зуев, 1977; Gafe, ftíUtkoff-MaySet, 1970).

Таким образом, "слабым" звеном метаболической цепи лщеркы -являетоя фотосинтез. По-видимому, отбор на клеточном уровне на устойчивость к засолению можно дополнить оценкой активности фотосинтетического аппарата растений в условиях действия стресс-факторе.

Биологические препараты ( АФ и симбионт ), влияющие на фотосинтетическую оистему растения, о чем свидетельствует увеличение

*

уровня фотосинтетических пигментов, снижали отрицательное действие солевого стресса. Исследованные биопрепараты, а также мизал, могут быть рекомендованы для испытания их в. падевых условиях с целью повышения солеуотойчивости люцерны. При практическом применении препаратов следует учитывать сортовые особенности культур и почвенно-климатические условия региона.

ШВДШ •

" I. Одной из первых морфэ—физиологических реакций люцерны на засоление является ингибированиэ роста первичного корня. Этот показатель может быть использован для ранней диагностики солеуотойчивости люцерны. Ксследованнкэ сорта располагались следующим образом по степени скитания устойчивости:

Ленинская мастная > Коков > Унитро > Надежда

2. Сорта люцерны различались по способности генотипов к каллу-согенезу, росту каддуской ткани 1п »Иго и мэрфо-физиологическил • характеристикам каллусной ткани. Каибольней способностью к каллусо-генезу отличался сорт Кокше, затем в порядке снижения показателя следовали Надежда, Ленинская местная, Унитро. Каллубная ткань сортов люцерны Надежда и Ленинская местная отличалась высоким иорфо-генетическим потенциалом.

3. Экспланты,' выделенные из различных органов люцерны ( корень, гипокотиль, семядольные листья), различались по каллусогене-зу, а также по характеру роста на питательной среде, содержащей хлорид и сульфат натрия. Ткань корня г гидохотиля отличалась большей устойчивость!) к засолении, однако для отбора на клеточной уровне предпочтительнее использовать ткань гипокотиля в связи с ее большей морфогенетической бктивносты).

4. Показано,' что устойчивость лицерла к засолению имзет двух-факторный характер. Осыэтическая составлявшая солевого стресса по сравнению о токсической оказывает меньшее ингибируацее деЗствпо на образование биомассы лхцерны, что проявляемся на всех уровнях организации растительного организма.

5. На двух сортах люцерны ( Надежда и Ленинская местная ) в культуре Чп »Иго показана различная устойчивость тканевых и'сус-пензионшееклеточных культур к солевому и осмотическому стрессу. По-видимому, у'исследованных сортов механизма устойчивости к осмо- •

тнческому фактору реализуются на тканевом, а к солевому стрессу -на клеточном уровне, '

6. Лвухфакторный характер действия солевого стресса дает основание для рекомендаций по проведению двухэтапной клеточной се- • лекции люцерны к засолению: на устойчивость к осмотическому ( 1-й этап) и токсическому ( 2-й этап ) факторам. '

-7. Люцерна Клон 124, полученная методом клеточной селекции, отличается от"исходного сорта Хивинская местная реакцией на действие солевого стресса. В ответ на возрастапаеэ осмотическое давление, создаваемое хлоридом натрия С до 8 атм, что соответствует 1,12% ), отмечено увеличение содержания фотосинтэтаческих пигментов, свободного пролкна, факельных соединений ж зеленой массы,. что позволяет считать эта физиолого-бйохиютвсиЕв показатели адаптивным». Исходный сорт закономерно снижает исе Есоледованные характеристики под влиянием засоления.

8. В условиях солевого стресса при симбиотичесиом взаимодействия люцерны с R.. mefitoti обнаружено повышение уровня нитроге-назяой активности в корнях лвдерзы Клон 124 более чем з три раза, при этем отоечено значительное падензз ( в два різа ) натрегенаэ-еой активности в корнях исходного сорта Хивинская местная.

9. Обнаружено повышение уроетя соединений фенольной приходы ' с максимумами поглощения 215-235 й 255-275 нм. Изменение содержания этмс веаеств в листьях, корнях в корневых экссудатах дает основание считать, что они являются ответной реакцией растений лг>- ' цэрны на солевой стресс з иаояуляцня mefiioti.

10.-Метод отбора па клеточном уровне позволяет получать гезо-типн, отличащиеся от исходных глубокими 'физаолого-Йвохимическимя. изменениями адапттгнпого характера, сохраняющимися у семенного потомства, то есть уяучгать существуйте сорта люцвpay, придавая га новые CEoSc-пза, Приобретение eobsx не вызывает потере гаащвхся' хозяйственно—ценных признаков.

11. Для повышения вдалтшгных ceoSctb лацерны в условиях солевого стресса наряду с отбором на клеточном уровне цэлесообраз-но использовать блотехнологгчесхие препараты, обладающие адапто-геннкмя свойствами: бактериальный - активатор фотосинтеза (A3 ), . прародин." регулятор роста симбионт, а такге креиннйоргеааческ-ій препарат кязал. •

Публикации по теме диссертационной работы:

1. Калинина Е.Б. Лабораторная оценка солаустойчи-востн генотипов люцерны // Тез. докл. конф. молодых ученых н асннрантов 'По актуальным проблемам интенсификации кормопроизводства' (Москва, 1961) - М., 1991. - 72 с.

2. Калинина Є.Б., Мазнн ВІВ., Шарикова Л.А., Че-каснна Е.В. О повышении устойчивости н кормовой ценности оюцерны под влиянием бактериального арепа • рата в условиях засоления // Сельскохозяйственная биология. - 1994. - № 8. - С. 98-102.

Подп. в печ. 07.10.94. Формат 60x84/16. Печ. л. 1.25. Тираж 100 экз. Закач № 131

Подразделение оперативной печати ВНИИ кормов 141740, Московская область, г. Лобня,