Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологический анализ кардиотонической активности препарата жабьего яда "Буфотин"

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологический анализ кардиотонической активности препарата жабьего яда "Буфотин""



§

На правах рукописи

ОШЕВЕНСКИИ Леонид Владимирович

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КАРДИОТОНИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПРЕПАРАТА ЖАБЬЕГО ЯДА "БУФОТИН"

03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Нижний Новгород 1997

Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского

Научный руководитель:

д.б.п., профессор Крылов В.Н.

Официальные оппоненты:

д.б.н., профессор Гелашвшш Д.Б. д.м.н., профессор Суворов А.В.

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Защита состоится " (() " /О_1997 г. в /5 часов на заседании диссертационного совета К 063.77.13 Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (603600, Нижний Новгород, пр.Гагарина,23)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета

Автореферат разослан "-^Т-"-й±->»7,

Ученый секретарь диссертационного совета, к.б.н., доцент ' Александрова И.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из важнейших путей решения проблемы сердечно-сосудистых заболеваний, ставших наиболее массовыми в промышленно развитых странах, является изучение и создание новых эффективных кардиоакгивных средств. Сегодня, благодаря успехам фармацевтической химии, синтезируется большое количество соединений, обладающих высокой активностью при лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний. Вместе с тем растет и количество проявлений отрицательных побочных эффектов синтетических средств. В то же время многих из указанных недостатков лишены лекарственные кардиотропные средства, полученные из природных источников сырья — тканей растений и животных. Однако список подобных средств весьма короток, хотя их преимущества очевидны.

В связи с изложенным следует считать актуальным изучение природных соединений с направленной кардиотропной активностью. В этом плане пристальное внимание заслуживают физиологически активные вещества, продуцируемые ядовитыми животными — зоотоксины. В настоящее время к зоогоксикам проявляется повышенный интерес во всем мире ( Каменская, 1982, Орлов, Гелашвили, 1985, Крылов, 1995). Этот интерес связан с чрезвычайно высокой и специфической физиологической активностью соединений, получаемых их животных ядов.

В группе зоотоксинов особо следует выделить яды амфибий — жаб, саламандр и др. В отличие от активно ядовитых животных, амфибии защищаются путем выделения ядовитого секрета из кожных желез. Возможно, с этим связано и принципиальное различие в химическом составе ядов — в отличие от ядов змей, пчел и др., в основном, пептидных токсинов, яды амфибий представляют гетероциклические соединения. Большое значение этот факт имеет при сравнении данной группы соединений с известными сердечно-активными (кардиотоническими) соединениями — агликонами сердечных гликозидов. В соответствии с этим, такие яды, как яды жаб, имеющие в составе агликоны — буфа-диенолиды, также обладают выраженной кардиотропной активностью

(Крылов, 1983, Shimada et al., 1976). В то же время, весьма скудны сведения о разработанных препаратах из яда, хотя экспериментальные и клинические данные неоспоримо указывают на существенные терапевтические свойства соединений из ядов жаб ( Iwatsuki et al., 1965; La Barre, Ishizaka,1974, и др.). В связи с вышеизложенным, в работе проведены исследования по физиологическому анализу разработанного нами препарата из яда зеленой жабы (Bufo viridis Laur.), в значительных количествах обитающей на территории России.

Работа выполнялась в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ (№ Госрегистрации 81062913), а также в рамках грантов (головной совет по биологии — код 2-102-3-41 и программа "Университеты России" — биология, проект "Зоотоксины в патофизиологии и медицине").

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось изучение кардиотонического действия нового препарата на основе яда зеленой жабы (Bufo viridis Laur.).

При этом решались следующие задачи:

1. Выявить некоторые механизмы кардиотонического действия препарата на изолированное сердце

2. Провести физиологический анализ кардиотонического действия Буфотина при внутривенном введении животным

3. Оценить кардиотоническое действие препарата в условиях альтерации сердца.

Научная новизна.

В условиях непосредственного воздействия на изолированное сердце и при системном введении в организм животных установлено выраженное кардиостимулирующее действие нового препарата на основе яда жаб.

На основании исследования впервые изучены особенности кардио-тропной активности нового препарата жабьего яда как кардиотонического средства. Установлено, что в основе механизмов действия Буфотина лежит активация сократительного аппарата миокарда через модификацию экстракардиальных и внутриклеточных механизмов регуляции сократительной активности сердца.

На моделях альтерации системы кровообращения изучено кардио-спшулиругощее действие Буфотнна в сравнении с известными средствами аналогичного назначения. На основании проведенных исследований получен патент РФ на изобретение "Средство обладающее кардио-стимулирующим действием".

Теоретическая и практическая значимость работы.

В работе выявлены основные механизмы кардиостимулирующего действия разработанного препарата на основе яда жаб. Выявленные преимущества специфической активности препарата в условиях недостаточности сердечного выброса перед известными кардиостимуляторами, позволяют рекомендовать его к внедрению. На основании исследований разрешена и проведена 1-я фаза клинических испытаний и получено разрешение ФК МЗ РФ на проведение 2-й фазы клинических испытаний изученного средства.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный кардиотро ггньга препарат на основе яда зеленой жабы обладает выраженной кардиотонической активностью, проявляющейся как в условиях изолированого сердца, так и при системном введении в организм.

2. Кардиотоническое действие препарата обеспечивается влиянием буфадиенолидов и буфотенинов на сократительный миокард и экстра-кардиальную регуляцию.

3. Кардиотонические свойства препарата проявляются в условиях моделирования нарушений функций системы кровообращения и уменьшают негативные последствия альтерации.

4. Препарат имеет определенные преимущества перед известными средствами аналогичного действия.

Апробация работы.

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференциях по герпетологии (Ашхабад,1981, Ташкент, 1985, Тольятти, 1995), научном семинаре кафедры физиологии и биохимии человека и животных ННГУ.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 13 работ, получено 3 авторских свидетельства на изобретения и 1 патент.

з

Объем и структура диссертации.

Работа состоит из введения, обзора литературы, раздела собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы, содержащего 154 источника (102 на русском и 52 на иностранных языках), и приложений. Материалы диссертации изложены на 105 страницах машинописи, содержат 10 таблиц и 15 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика препарата яда жаб Буфотина

Разработанный нами кардиотоническеий препарат, получивший название Буфотин — от латинского родового названия жаб — "буфо" и окончания — "ин", определяющего, согласно рекомендациям ФК МЗ РФ, принадлежность к кардиотоническим средствам, представляет собой инъекционный 0,1% раствор экстракта кожных желез (жабьего яда) жабы зеленой (Bufo viridis Laur). В его состав входят, в основном, буфа-диенолиды (стероиды, производные циклопентанапергидрофенагарена, имеющие в боковой цепи дважды ненасыщенное шестичленное лактон-ное кольцо), буфотенины (иццольные производные, сходные по структуре с биогенными аминами), и мукополисахариды. Активность препарата, определенная биологическим методом титрования на кошках (ГФХ1) составляет 1,5 КЕД/мл.

Методы исследования

Эксперименты были проведены на кошках, собаках, а также препаратах изолированного сердца крыс и лягушек. Общее распределение животных по сериям экспериментов представлено в табл. 1.

Опыты первой серии были проведены на изолированных по Ланген-дорфу сердцах белых крыс, перфузируемых окснгенированньш раствором Кребса-Хензелайга при 37 °С. Регистрацию сократительной активности сердца осуществляли с помощью латексного баллончика постоянного объема, введенного в полость левого желудочка, механотронного преобразователя 6МДХ11С на самописце Н-338-4. На основании кривых давления определяли развиваемое давление в левом желудочке сердца, конечно-диастолкческое давление, максимальные скорости повышения (dp/dt max) и снижения ( — dp/dt max) давления в изоволюми-ческие фазы сокращения и расслабления желудочков. В экспериментах 4

на изолированных по Штраубу сердцах лягушек регистрировали амплитуду и ритм сокращений.

Таблица I

Количество, видовой состав и распределение животных по сериям экспериментов

Серии экспериментов Вид животных Количество

1 .Изолированное сердце крысы 43

лягушки 116

кошки 10

2.Внугр1гоенное введение кошки 22

собаки 10

3. Моделирование альтерации системы кровообращения

3.1. Гштотензия кошки 27

3.1. Гипотермия собахи И

3.2. Остановка сердца собаки 38

3.3. Аритмии кошки 35

крысы 42

ВСЕГО: 339 животных

После периода стабилизации показателей сократимости изолированного сердца в перфузат, в объеме 0,2 мл, добавляли Буфотин или фармакологические агенты.

В отдельной серии экспериментов на изолированном сердце кошек после добавления раствора Буфотнна в перфузат и получения кардио-сгимулирующего эффекта определяли содержание циклических нуклео-тидов в миокарде. Для этого на высоте эффекта (1-я мин после введения препарата) сердце фиксировали в жидком азоте. Уровень содержания циклических нуклеотидов осуществляли радиоиммунным методом с применением коммерческих наборов фирмы "Becton, Dickinson" (США). Подсчет радиоактивности и вычисление концентрации цАМФ и цГМФ в пробах выполняли на автоматическом счетчике LKB Wallak 1280 Ultro Gamma (Финляндия) с использованием специализированной ЭВМ.

В следующей части работы изучали кардиотонические свойства Бу-фотина в условиях целостного организма при внутривенном введении препарата. Эксперименты были проведены на кошках массой 2,5 — 3,5 кг, наркотизированных нембуталом (45 мг/кг, внутрибрюшинно), соба-

ках массой 22-35 кг ( премедикация — промедол, атропин в общепринятых дозах, шпубационный эфирно-воздушный наркоз).

У животных при искусственном дыхании, производили левостороннюю торакотомию, вскрывали перикард и силиконовым катетером осуществляли пункцию передней стенки левого желудочка сердца. Регистрацию внутрижелудочкового давления осуществляли при помощи меха-нотронного элекгроманометра с записью на элекгроэнцефалографе ЭЭГ-4, регистраторе "Биокомб". Одаовременно производили запись артериального давления (АД), центрального венозного давления (ЦВД), ЭКГ, периферической и интегральной (ИРГТ) реограмм. По показаниям ИРГТ вычисляли ударный (УО) и минутный объем (МОС) сердца.

Раствор Буфотина в дозах 0,01-0,5 мг/кг вводили внутривенно. С целью сравнения кардиотонической активности в части опытов наряду с Буфотином животным вводили один из быстродействующих сердечных глккозвдов — коргликон в той же дозе или адреналин. Контролем служило введение физиологического раствора в равном объеме (мл).

Следующие серии экспериментов проводили на животных в условиях альтерации сердечно-сосудистой системы.

Гипотензия. Опыты были проведены на кошках, у которых оценивали кардио- и вазотоническую активность Буфотина в условиях пониженного артериального давления (АД). Гипотензию вызывали до велечины АД 55 ±6- мм рт. ст. продолжительностью 60 мин. свободным кровопусканием до заданного уровня (по Уиггерсу) или введением этаминала-натрия (60 мг/кг, внутримышечно).

Остановка сердца и реанимация. Опыты были проведены на беспородных собаках в условиях кранио-церебральной гипотермии. При достижении ректальной температуры 28-30°С и температуры мозга 23-25°С производили торакотомию в VI межреберье, справа, рассекали перикард и выключали сердце из кровообращения путем наложения турникетов на предсердные вены. Длительность выключения сердца из кровообращения во всех опытах составляла 55-60 мин. Восстановление сердечной деятельности начинали с освобождения полых и непарной вен, масажа сердца, проведения искусственной вентиляции легких и согревания животного. Проведено 2 серии опытов. В первой серии во время реанимации проводили внутриартериальное (в/а) нагнетание с последующим внутривенным (в/в) капельным введением полиглюкина (50100 мл) с адреналина-гидрохлоридом (0,06 мг/кг в/а и 0,1 мг/кг в/в). Во

второй — вместо адреналина использовали Буфотин, который добавляли в раствор для в/а нагнетания в количестве 0,05 мг/кг и в той же дозе — в раствор для в/в капельного введения.

Для гистологического и ультраструктурного анализа забирали миокард животных на высоте согревания (33-35° С). Для электронномикро-скопического анализа тонкие срезы из папиллярной мышцы готовили на ультратоме ЬКВ и просматривали на электронном микроскопе ЭМВ-100 А.

Аритмии. Об антиаритмической активности Буфотина судили по его влиянию на аритмию смешанного типа, вызываемую аконитином (0,1 мг/кг, внутривенно), на желудочковые нарушения ритма, вызываемые кальция хлоридом (0,3 мл 10% раствора, в-в) и адреналиновой интоксикацией (0,02 мг/кг, в-в), согласно рекомендациям Кавериной и Сеновой (1981), на нейрогенные аритмии (Ситщин,1970), на рефрактерный период сердца (Гацура, 1974).Длительность рефрактерного периода определяли по тест-ответу сердца на подпороговый стимул, наносимый в определенную фазу сердечного цикла (Павленко, 1974) по модифицированной нами методике (Крылов,Ошевенасий,1985 ).Во всех сериях экспериментов Буфотин в интервале терапевтических доз (0,01-0,25 мг/кг) вводили внутривенно за 3-5 мин до воздействия аригмогенных факторов, или на фоне устойчивых аритмий. С целью сравнения в опытах использовали известные антиаритмические средства хинидин и этмозин в рекомендуемых дозах.

Результаты экспериментов обрабатывали общепринятыми методами с использованием Т-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследование карднотонического действия препарата на изолированное сердце

В опытах было установлено, что добавление раствора Буфотина в перфузат приводило к повышению сократительной активности изолированного сердца крыс (табл.2). При этом кардиостимулирующее действие возникало сразу после добавления препарата в перфузат, а эффект зависел от добавляемой дозы Буфотина.

Следует отметить, что введение препарата в названном выше широком интервале разведений приводило к увеличению сократительной активности сердца без учащения сердечного ритма. Указанная особен-

ность характеризует достаточно высокую селективность инотропного действия Буфотина (Чекман, Ткачук, 1984).

Из анализа показателей фазовой структуры сердечного цикла следует выделить не только максимальную скорость нарастания давления в изоволюмическую фазу, но и возрастание максимальной скорости расслабления сердца в аналогичную фазу (табл. 2). Возрастание скорости расслабления даже при неизменной частоте, но при увеличении силы сокращений сердца обеспечивает сохранении адекватной диастоличе-ской паузы сердца (Меерсон,Капелько,1972). Таким образом, систолический эффект Буфотина проявляется и за счет кардиодиастолического действия.

Таблица 2

Влияние Буфотина (1:5104 г/мл) на сократительную функцию левого желудочка изолированного сердца крыс (М* т , п=10)

Показатель до введения Время после введения, мин

1 5 10

Диастолическое давление, мм рт.ет. 11,4*1,6 9,3*3,3 11,3*2,8 11,3*2,6

Развиваемое давление, мм рт.ет. 76*9 104*6* 83*4 79*7

Скорость сокращения, (dp/dt max) мм рт.ст./с 1142*109 1522±90 * 1183*112 1157*75

Скорость расслабления, (- dp/dt шах) мм рт.ст./с 655±105 1332*168* 1066*174* 926*112

Примечание: * — указана достоверность различий показателей по сравнению с исходными (Р<0,05)

Эксперименты, проведенные на изолированном сердце холоднокровных животных показали, что препарат вызывает еще более выраженное кардиотоническое действие, чем на сердце теплокровных. Было установлено, что Буфотин уже в концентрации 2-Ю"6 г/мл оказывал значительный положительный эффект на изолированное сердце лягушки Известно, что многие кардиотропные факторы реализуют свой положительный эффект путем увеличения в клетке концентрации ионов кальция, играющего важную роль в механизме сопряжения возбуждения с сокращением (Меерсон, Брегер, 1976).

С целью проверки данного предположения мы провели опыты с использованием блокатора кальциевых каналов кадмия ( СсЮ2). Сразу

после введения в перфузат ионов кадмия амплитуда сокращений резко уменьшалась. Добавление Са 24 не вызывало повышения силы сердечных сокращений. Введение на этом фоне препарата приводило к росту амплитуды сокращений сердца .

Можно предположить, что Са2+, находящийся вне клетки, не оказывает существенного влияния при реализации положительного ионотроп-нош действия препарата. Это было подтверждено в экспериментах с применением этилевдиаминтетраацетата (ЭДТА), связывающего свободный кальций как вне, так и внутри клетки (Ленинджср, 1974). Прирост амплитуды сокращений после введения препарата наблюдался и в этом случае, тогда как кальций, вводимый на этом фоне, не вызывал прироста амплитуды. Это можно объяснить либо тем, что препарат задерживает удаления кальция из клетки после каждого Са-залпа, либо выходом дополнительных порций кальция из внутриклеточных депо, которые уже не связываются ЭДТА.

Вышеизложенные результаты экспериментов позволяют считать, что кардиостимулирующий эффект препарата жабьего яда в опытах на изолированном сердце опосредуется через несколько механизмов, наиболее важными из которых является активация внутриклеточного кальция. Для выяснения вопроса о механизмах этой активации, мы провели серию опытов с определением концентрации вторичных посредников известных кардиотсмуляторов. Для этого определяли содержание ц АМФ и цГМФ в миокарде изолированного сердца кошек на максимуме стимулирующего эффекта Буфотина. В опытах было установлено, что в момент максимума кардиотонического эффекта Буфотина концентрация цГМФ уменьшилась с 0,4s1 0,05 до 0,28i 0,04 пмоль/мг, при этом концентрация цАМФ осталась на исходном уровне( 0,52t 0,12 в контроле и 0,56^ 0,15 пмоль/мг в опыте). Таким образом, можно полагать, что стимулирующий эффект Буфотина не опосредован повышением содержания цАМФ, как это установлено для катехоламинов( Williamson, 1972; Wolenberger, Krause,1973). В то же время, уменьшение уровня цГМФ может свидетельствовать об уменьшении парасимпатического эффекта репрессии активности сердечной деятельности. Таким образом, полученное в опытах снижение уровня цГМФ в миокарде кошек при действии Буфотина следует трактовать как один из механизмов его кардио-сгимулирующего действия. Полученные данные свидетельствуют что препарат вызывает кардиотонический эффект на изолированное сердце, воздействуя на обмен веществ в миокардиальных клетках, в частности,

активизируя внутриклеточный кальций и уменьшая уровень вторичного посредника, тормозящего сократительную активность миокарда.

Влияние Буфотина на кардиогемодинамику животных при внутривенном введении

Эксперименты на кошках показали, что внутривенное введение Буфотина в интервале доз 0,05-0,2 мг/кг приводило к выраженным изменениям регистрируемых параметров. Исключением являлась ЭКГ, параметры зубцов и интервалов которой изменялись весьма незначительно.

В опытах было установлено, что первые изменения в ответ на введение Буфотина наблюдались со стороны внутрижелудочковош и артериального давления, увеличивающихся сразу после введения препарата. Увеличивались также пульсовое давление. Содержание кислорода в мышце той же конечности увеличивалось. Наблюдаемый эффект достигал максимума через 2-5 мин. после введения Буфотина и продолжался 20-35 мин. с постепенным возвращением параметров к исходному уровню.

Анализ кривых давления в левом желудочке показал, что при введении Буфотина происходило увеличение максимального давления в желудочке (Р тах), уменьшение изометрической фазы как сокращения , так и расслабления желудочка , увеличение скорости нарастания давления в изоволюмическую фазу (табл.3). Это свидетельствовало о повышении сократительной функции сердца, т.к. по современным представлениям приведенные выше показатели манометрии желудочка, отражают подлинную сократимость миокарда и мало зависят от диастоличе-ского объема желудочков, обладая чувствительностью к инотропным воздействиям (Меерсон с соавт., 1972 , Изаков с соавт., 1981).

В опытах было показано, что Буфотин, вводимый в дозах, вызывающих обратимый эффект на кардиогемодинамику животных, весьма незначительно влияет на биоэлектрическую активность сердца, проявляя лишь брадикардический эффект. Из полученных результатов следует, «по брадикардия в ответ на введение препарата имеет рефлекторное происхождение, реализующееся через систему блуждающих нервов. Сказанное было подтверждено нами в экспериментах на животных, которым Буфотин вводился нв фоне действия атропина (0,5 мг/кг) или перерезки блуждающих нервов на шее. Было установлено, что в этих

условиях введение препарата в терапевтических и токсических дозах не вызывало урежения ритма сердцебиений (интервал К- Я составлял: до введения (после ваготомии) 30 ± 17, после введения — 32 ± 1,4 с"2 ; Р> 0,05).

Таблица 3

Влияние Буфотина (0,1 мг/кг ) на сократительную активность сердца кошек при внутривенном введении

Режим исследования Пульс (уд/мин) Показатели сократимости миокарда (Мтп)

<1р/сИ шах мм.рт.ст. /с Ртах % ИС % -ф/сИ шах мм.рт.ст / с

До введения препарата 1184 1991*53,3 100 100 793,6* 17,0

После введения (мин) 1-я 112*18 2563*146,2* 119,7*2,1* 107,2*2,5* 723,0*28,7*

2-я 105*3,7 3410*277,4» 151,5*4,0* 111,0*2,2* 901,0*42,7*

15-я 105*2,6 2750*313,6* 130,3*6,6* 103,0*2,6 746,0*33,3

Примечание: * — отмечены показатели, достоверно отличающиеся (Р < 0,05) от исходных.

Таким образом, из полученных данных можно предположить, что одним из механизмов кардиотонического действия Буфотина в условиях целостного организма является его "диастолическое" действие, когда по мере урежения ритма реализуется гетерометрический механизм повышения сократительной активности сердца (Франка-Старлинга).

Другим возможным механизмом увеличения сердечных сокращений при действии Буфотина могло быть повышение давления в аорте (гомеометрический механизм Анрепа). Из приведенных выше экспериментов видно, что введение препарата приводило к существенному повышению аортального и артериального давления у кошек.

Было установлено, что блокада бета- адренорецепторов обзиданом (1 мг/кг) не изменяла достоверно реакции повышения АД на введение Буфотина кошкам в дозе 0,1 мг/кг. Так, если у интактных животных АД повышалось на 44,3± 5,7 мм.рт.ст., то на фоне действия обзидана — на 36, 2 ± 8,5 мм.рт. ст. (Р> 0, 05). В отличие от этого введение Буфотина на фоне блокады а-адренорецепторов дигидроэрготоксином (1мг/кг) приводило к существенному ослаблению прессорного эффета Буфотина. АД при этом повышалось лишь на 26,4 ± 5,5 мм.рт.ст. (Р<0,05).

И

Приведенные результаты дают основание полагать, что кардиотони-ческий эффект Буфотина частично опосредуется через гомеометриче-ский механизм — повышение фронтального сопротивления в аорте.

Анализ показателей сократимости миокарда при действии Буфотина показал, что препарат оказывает непосредственное влияние на сократимость миокарда, повышая скорости нарастания и падения давления желудочках сердца в изоволюмические фазы, увеличивая индексы сократимости сердца. Определенный вклад в кардиосгимулирующий эффект при внутривенном введении Буфотина вносят также гетерометри-ческий (за счет умеренной брадикардии) и гомеометрический (в связи с вазопрессорным действием) механизмы ауторегуляции сердца.

Вышеизложенные механизмы кардиотонического действия Буфотина, установленные в опытах на кошках, полностью проявлялись и при введении препарата собакам. В экспериментах было установлено, что внутривенное введение собакам как в условиях нормотермии, гак и гипотермии Буфотина в дозе 0,05-0,1 мг/юг, так же существенно повышало показатели кардиогемодинамики. Кардиотоническое действие проявлялось сразу после введения препарата в кровоток и продолжалось в течение 15-30 мин, а затем регистрируемые параметры возвращались к исходным. Наибольшие изменения при этом наблюдались внутриже-лудочкового и аортального давления. Анализ параметров внутрижелу-дочкового давления позволил заключить, что Буфотин увеличивал основные индексы сократимости сердечной мышцы собак.

Проведенное в описываемой серии опытов сравнение кардиотонического эффекта Буфотина с сердечным гликозидом быстрого действия — коргликоном, вводимом в той же дозе, позволило установить, что корг-ликон, введенный в кровоток собак, по активности и скорости наступления эффекта уступает Буфогину. Так, если после введения Буфотина (0,05 мг/кг) dp/dt max в левом желудочке уже на 1-й мин достигала 146,5 + 10,5 % от исходного, а на 10-й составила 135,6 + 9,0% , то для коргликона эти показатели были, соответственно, 120,3 + 8,3% и 126,5 + 6,6%.

Внутривенное введение Буфотина гипотермированным животным в дозе 0,05 мг/кг приводило к существенному улучшению сниженных показателей кардиогемодинамики собак. На ИРГТ это находило отражение в возрастании амплитуды анакроткческой фазы реограммы и увеличении скорости ее нарастания. Соответственно увеличивались ударный и минутный объем сердца. Повышались АД и ЦВД, показатели 12

которых на 2 -ой минуте после введения препарата составили 122*3,2% и 134*7,5% по отношению к уровню до введения Буфотина. Таким образом, установлено, что кардио- и вазостимулирующий эффект препарата проявляется и в условиях пониженной реактивности организма.

Кардиотоническое действие Буфотина на моделях альтерации кровообращения

Гипотетия. В экспериментах было установлено, что внутривенное введение кошкам Буфотина в дозе 0,05-0,1 мг/кг на фоне гипотензии приводило к существенному повышению артериального давления животных. Указанный эффект возникал сразу после введения препарата и наблюдался в течение 15-60 мин , в зависимости от вводимой дозы Буфотина. При этом уровень АД, составляющий перед введением препарата 55+6- мм рт.ст. повышался до 100 +12- мм рт.ст., то есть происходило восстановление исходного уровня АД. В опытах было показано, что реакция на введение Буфотнна по степени выраженности не зависела от выбранной модели гипотензии.

В отличие от Буфотина, гипергензивный эффект адреналина, достигающий максимума на 1-й мин после введения, был непродолжителен и уже к 5-й мин действия артериальное давление вновь понижалось и не отличалось от моделируемого. По продолжительности гипертензивного эффекта на моделях гипотензии, вызванной геморрагией, Буфотин имеет определенное преимущество, т.к. при действии препарата и на 30-й мин действия Буфотина АД было достоверно повышено по сравнению с уровнем гипотензии.

Остановка сердца и реанимация. В экспериментах было установлено, что применение в процессе реанимации в качестве кардио- и вазо-тонического средства Буфотина приводило к восстановлению самостоятельных сердечных сокращений через 3-7 мин после начала реанимационных мероприятий. Одновременно с этим повышались САД и ударный объем сердца (УО).Указанные показатели кардиогемодинамики, а также ЦВД н минутный объем сердца (МОС) стабилизировались на 5-10 мин. после введения препарата и поддерживались без существенных изменений в процессе всего согревания животных до 33-35 °С (табл. 4).

Важно отметить, что сразу после восстановления самостоятельных сердечных сокращений устанавливался правильный синусовый ритм с

соответствующим положением зубцов и интервалов ЭКГ. Одной из особенностей действия Буфотина в этих условиях явилась выраженная брадикардия, которая уменьшилась по мере согревания животных.

Таблица 4

Показатели кардногсмодинамнкн собак в процессе реанимации после выключения сердца из кровообращения (М* ш).

Показатели Восстановительный период (мин)

15 60 120

САД, мм рт.ст 100±5 1101 15 1051 10

ЦВД, мм вод,ст. 8545 53±7

ЧСС, уд/ мин 70±4 7515 86±12

МОС,% к нормотермии 90± 11 105116 102±6

Так, если перед окклюзией сердечный ритм составил 87ь3 уд./мин. (против 200 ± уд./мин. нормотермии), то после восстановлешш сердечной деятельности он равнялся 704 (Р<0,05). Однако, несмотря на уре-жение ритма сердцебиений, МОС типотермированных собак был стабильным и сравним с МОС нормотермированных животных, так как УО при действии препарата был существенно повышен.

В другой серии опытов, где в качестве кардио- и вазотонического средства был применен адреналин, в большинстве опытов регистрировались нарушения сердечного ритма — интерполированные желудочковые экстрасистолы, пароксизмальная желудочковая тахисистолия, синусовая аритмия и др.

Изучение действия Буфотина на сердце на структурном уровне показало, что препарат не оказывал повреждающего действия на структуру миокарда. Гистологический анализ показал, что при применении Буфотина не выявлялось микрокровоизлияний и некрозов, деструкции кар-диомиоцитов, как это определялось в серии опытов с использовании адреналина.

Вышеприведенные результаты экспериментов позволяют заключить, что применение Буфотина в качестве кардио- и вазотонического средства в комплексе реанимационных мероприятий после длительного выключения сердца из кровообращения в условиях гипотермии способствует в короткий срок восстановлению эффективной сердечной деятельности с одновременным уменьшением выраженности нежелательных побочных эффектов реанимации — нарушений ритма сердца и деструк-

тивных изменений в миокарде, как это было показано при использовании адреналина.

Аритмии сердца. В опытах было установлено, что Буфотин увеличивает длительность рефрактерного периода более эффективно, чем один из наиболее активных антиаритмиков-мембранодепрессантов — хинидин. Так, если через 10 мин после введения Буфотина в дозе 0,05 мг/кг длительность рефрактерного периода увеличивалась до 123,8 ± 6,7 % от исходного уровня, то для хинвдина (1 мг/кг) этот показатель составил 123,8 ± 6,7%. Кроме того, в отличие от последнего, Буфотин не угнетал ЭДС сердца, оцениваемый по амплитуде ЭКГ.

В экспериментах с воспроизведением аконигиновой аритмии у крыс было установлено, что предварительные введения Буфотина в дозе 0,050,2 мг/кг, так же, как и введение его на фоне развивающихся аритмий (политопная экстрасистолия на фоне атрио-венгрикулярного блока, мерцательная аритмия, длящаяся до конца опьгга — 40 +6- мин), не предотвращало и не снимало нарушенного ритма сердца. Таким образом, на акошппновой модели аритмий Буфотин не проявил ангиаригми-ческих свойств.

В отличие от аконитиновой модели, на других моделях аритмий было выявлено определенное ангиаритмическое действие Буфотина. Так, было установлено, что введение крысам кальция-хлорида приводило к обратимым аритмиям (желудочковая экстрасистолия, аллоарит-мия,фибрилляция желудочков), не снимающихся и не предотвращающихся Буфотином или примененным в качестве сравнения известным антиаритмиком этмозином. Однако, и Буфотин и этмозин существенно (Р<0,05) уменьшали продолжительность аритмий (табл. 5).

Таблица 5

Антиаритмическая активность Буфотина и этмозина на модели кальциевой аритмии у крыс

Вещество Длительность аритмий, с

Контроль (физиол р-р) 40,76^4,09

Буфотин (0,2мг/кг ) 14, Я6± 2,73

Этмозин (3 мг/кг) 15,66 ± 3,17

Еще более эффективное аитиаритмическое действие Буфотина было показано на адреналиновой модели аритмии. В опытах было установлено, что введение препарата в дозе 0,1 мг/кг на фоне развивающихся

адреналиновых аротмий (желудочковая и суправенгрикулярная экстра-систолия длительностью 3-5 мин) у 8 кошек из 10 восстанавливало правильный синусовый ритм сразу после введения Буфотина и кровоток. Предварительное введение препарата также препятствоавло возникновению аритмий в ответ на введение адреналина в 50% опытов, а в остальных опытах- уменьшало длительность аритмий.

Интересные результаты были получены при анализе влияния Буфотина на течение нейрогенных аритмий. В контрольных экспериментах этой серии было установлено, что при раздражении ретикулярной формации, таламуса, коры больших полушарий у кошек возникали устойчивые аритмии типа желудочковой и суправентрикулярной эксграсистолии различной продолжительности ( от 15 до 175 с). Введение животным Буфотина в дозе 0, 02 мг/кг, производимое за 3-5 мин до нанесения раздражения, не меняя существенно характер аритмий, у одних животных (30% опытов) уменьшало их длительность, у других — или не изменяло, или увеличивало их продолжительность.

Из представленных экспериментальных данных следует , что Буфо-тин обладает определенным антиаритмическим действием при введешш в систему кровообращения животных. При этом, в отличие от известных ангиаритмиков, препарат не угнетает биоэлектрическую активность сердца. Мы полагаем, что ангиаритмическое действие Буфотина в первую очередь связано с его способностью увеличивать эффективный рефрактерный период. Поэтому наибольший антиаритмический эффект препарата был выявлен на моделях желудочковых форм аритмий (кальциевой и адреналиновой), для которых характерно действие на рефрактерность сердца, в сторону ее уменьшения. С другой стороны, определенное ангиаритмическое действие Буфотина при нейрогенных аритмиях свидетельствует о влиянии препарата на динамику взаимоотношений миокардиальных механизмов ритма с экстракардиальной регуляцией сердца, нарушение которой лежит в основе аритмий при раздражении ЦНС (Синицыи,1970).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенное изучение кардиотоническон активности Буфотина позволяет заключить, что препарат обладает выраженной специфической активностью как при действии непосредственно на сердце, так и при введении в организм животных.

Из результатов анализа возможных механизмов кардиостимули-рующего действия Буфотина следует, что по характеру действия на механизм формирования систолического выброса его можно отнести к группе стероидных кардиотонических средств. Проведенные эксперименты и литературные данные доказывают реализацию положительного инотропного эффекта по следующей цепи: торможение активности Na, К — АТФ- азы мембраны — изменение Са2+-обмена — повышение внутриклеточного уровня свободного кальция, а также включение экстра-кардиальных механизмов повышения сердечного выброса.

На изученных экспериментальных моделях альтерации системы кровообращения установлено, что Буфотин обладает не только кардиотони-ческой, но и выраженной вазотонической активностью. Это позволило провести успешную терапию таких экспериментальных моделей патологии, как клиническая смерть, гипотензня. Кроме того, было показано, что на некоторых моделях сердечных аритмий Буфотин может проявлять определенные антиаригмические свойства.

На основании вышеизложенного следует заключить, что Буфотин является оригинальным препаратом, перспективным в ряду кардиотонических средств срочного действия.

ВЫВОДЫ

1. Разработанный на основе ада зеленой жабы (Bufo viridis Laur.) препарат Буфотин обладает выраженным кардиотоническим действием, повышая показатели сократимости сердца животных (dp/dt шах, Р шах, ИС и др. ) как в условиях его изоляции при добавлении в перфузат, так и при внутривенном введении.

2. В условиях изолированного сердца Буфотин оказывает непосредственное кардиотоническое действие, проявляющееся в условиях блокады кальциевых каналов кадмием, но отменяющееся на фоне ЭДТА . Препарат вызывает модификацию активности внутриклеточного кальция , уменьшая уровень цГМФ.

3. При внутривенном введении Буфотин вызывает кардаостимули-рующий эффект как за счет непосредственного влияния на миокард, так и в результате проявления брадикардического действия (эффект Фран-ка-Старлинга), а также повышения аортального сопротивления (эффект Анрепа) за счет вазотонического действия препарата.

4. Кардиотонический эффект Буфотина проявляется на разных моделях альтерации системы кровообращения животных, характеризующихся низким сердечным выбросом (гипотензия различной природы, гипотермия, остановка сердца и реанимация, аритмии).

5. В условиях выключения сердца собак из кровообращения при восстановлении кардиогемодинамики применение Буфотина позволило провести более эффективную реанимацию и уменьшить негативные последствия реанимационных мероприятий (сохранение ультраструктуры кардиомиоцигов и противоаритмический эффект) по сравнению с адреналином.

6. Кардиогоническое действие Буфотина при внутривенном введении животным имеет преимущество перед известными средствами аналогичного назначения, адреналином по длительности проявления эффекта, а перед коргликоном — по скорости его наступления.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Крылов В.Н., Бояринов Г.А., Перетяган С.П., Косенкова И.Л., Солоципскт. С.С., Ошевенский Л.В., Влияние жабьего яда на некоторые показатели гемодинамики собак в условиях кранио-церебральной гипотермии // Механизмы действия зоогоксинов. Горький: Изд-во Горьк. гос. ун-та, 1978. С. 91-96.

2. Орлов Б.Н., Крылов В.Н., Ошевенский Л.В. Влияние жабьего яда на сократительную функцию сердца кошек // Физиология и патология сердчно-сосудистой системы и почек. Чебоксары, 1980. С. 17-21.

3. Крылов В. Н., Ошевенский Л.В., Колесникова А. Б. Сравнительный анализ кардиотонического действия жабьего яда и его очищенного препарата // Механизмы действия зоогоксинов. Горький: Изд-во Горьк. гос. ун-та, 1980. С. 143-147.

4. Крылов В Н., Абрамова И.В., Ошевенсюш Л.В. Ангиаригмиче-ское действие некоторых зоогоксинов // Научно-практическая конференция молодых ученых Горьковской обл. посвященная 110 годовщине рождения В.И. Ленина / Тез. докл. Горький, 1981. С. 71-72.

5. Орлов ЕМ., Крылов В Н., Ошевенский Л.В., Колесникова А.Б. Буфодиенолидин — кардиотонический препарат жабьего яда // Вопросы герпетологии. Ленинград, 1981. С. 95.

6. Крылов В.Н., Синицын Л.Н., Абрамова И.В., Ошевенский Л.В. Действие пчелиного и жабьего адов на экспериментальные аритмии сердца И Механизмы действия зоотоксинов. Горький: Изд-во Горьк. гос. ун-та, 1981. С. 40-46.

7. Крылов В.Н., Синицын Л.Н., Бушуев Ю. И., Ошевенский Л.В.. Абрамова И.В. К фармокологии очищенного препарата жабьего яда // Механизмы действия зоотоксинов. Горький: Изд-во Горьк. гос. ун-та, 1982. С. 65-71.

8. Орлов Б. Н., Крылов В.Н., Ошевенский Л.В. Измерение давления в полостях сердца с использованием преобразователя гетеродинного типа // Метрологическое обеспечение измерений / Тез. докл. научно-техи. конф. Таллин, 1983. С. 130-131.

9. Ошевенский Л.В.. Крылов В.Н. Влияние очищенного препарата жабьего яда на кардиодинамику кошек // Тезисы докладов научной конференции молодых ученых Горьковской области. Горький, 1983. С. 149150.

10. Козлова Н.В., Ошевенский Л.В. К механизмам кардиотропного действия очищенного препарата жабьего яда // Механизмы действия зоотоксинов . Горький: Изд-воГорьк. гос. ун-та, 1983. С. 21-25.

11. КрыловВ.Н., Ошевенский Л.В. Сравнительный анализ кардиотропного действия некоторых зоотоксинов//Механизмы действия зоотоксинов. Горький: Изд-во Горьк. гос. ун-та, 1984. С. 3-10.

12. А. с. 1219091 СССР, МКИ 4 А 61 М 5/00. Устройство для введения лекарственных растворов / Орлов Б.Н., Ошевенский Л.В.. Крылов В.Н. Опубл. в 23.03.86. Бюлл. №11.

13. А. с. 1278924 СССР, МКИ 4 G09 В 23/28. Способ моделирования аритмии сердца / Орлов Б.Н., Крылов В.Н., Ошевенский Л.В. Опубл. 23.12.86. Бюлл. №47

14. А. с. 1468537 СССР, МКИ 4 А 61 М 1/0. Способ получения ада амфибий и устройство для его осуществления / Ошевенский Л.В.. Кустов Л.М., Крылов В Н. Опубл. 30.03.89. Бюлл. № 12.

15. Крылов В.Н., Парин С.Б., Корягин A.C., Ошевенский Л.В. Зоо-токсины в патофизиологии и медицине // Сб. .Биология, экология, биотехнология и почвоведение /ред. кол. — А.Н.Тихонов и др.- М: Изд-во Моск. ун-та, 1994. С. 59-64.

16. Ошевенский Л.В.. Кустов Л.М., Сабурцев С. А. Технология получения лекарственного сырья от амфибий // Тезисы докладов. Первая конференция герпетологов Поволжья. Тольятти, 1995. С. 43-44.

17. Патент РФ № 2068697 МКИ6 А 61 К 35/56. Средство обладающее кардиостимулирующим действием / Крылов В.Н., Вальцева И.А., Давыдов В.Ф., Ошевенский Л.В.. Пегерсоне Э.Ю., Батова P.C., Лаздынь A.A., Бояринов Г.А. и Синицын Л.Н. Опубл. 10.11.96. Бюлл. № 31.