Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическая регуляция биосинтеза целлюлазы и ксиланазы Cerrena unicolor 062 и Piptoporus betulinus ИБК-327

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физиологическая регуляция биосинтеза целлюлазы и ксиланазы Cerrena unicolor 062 и Piptoporus betulinus ИБК-327"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ П УЗИЯ . ИНСТИТУТ БИОХИМИИ РАСТЕНИЯ имени С.В.ДУРМИШЦДЗЕ

На правах рукописи' 577.15 : 582.28

ТУСИГОИЛИ ХАТУНА АЛЬБЕРТОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РЕГУЯ5ЩИЯ БИОСИНТЕЗА ЦЕЛЛКШАЗЫ Й КСИЛАНАЭЫ : ,= СЕ1ШЕНА 1ШС0Ш? 062 И РХРТОРОКиБ ВЕТШЛМиЗ ИБК-327

. 03.00.04 -биохимия - 03 ; 00.07, - микробиология

, 1 Автореферат 1 диссертация на соискание ученой степени кандидате биологических наук

-ТБИЛИСИ - 1582

Работа выполнена в лаборатории биоконверсии растительных субстратов Института биохимии растений им. С.Б.Дурмишидэе АН г, /зии.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник В.И.Элисашвили

Научный консультант: доктор биологических наук, академик АН РГ, профессор Г.И.Кееситадэе

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, член-корр.

АН РГ, профессор Н.Г.Алексидзе доктор химических наук А.П.Синицьш

Ведущая организация: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Защита диссертации состоится ^1992 г. в (0 ""Час. на заседании специализированного совета К 007.04.01 в Институте .биохимии растений АН Республики Грузия по адресу: 380053,. Тбилиси, аллея Давида.Агмашенебели, 10-й км.

С диссертацией .можно ознакомиться в библиотеке - Института биохимии растений АН РГ.

А

Автореферат разослав О (2>~4 1982 г.

Ученый секретарь спец элизированного совета, ,,—.

// г! ¿¿¿сФ

кандидат биологических наук .А'! - Ч М^В. Бендианишвили

ВВЕДЕНИЕ

,. Актуальность проблемы. Проблема биокоивэрсии лииюцеллгалозно-го сырья рассматривается в настоящее время в глобальном масштабе из-за необходимости защиты окружающей среда от растительных отходов сельского хозяйства и промьшлап.;оети, а также благодаря возможности получения различит физиологически активных веществ и энергии. Наиболее адаптированными к росту па растительных субстратах являются высша базидиалькыэ грибы, обладающие. широким набором Гидролитических' и. окислительных ферментов и высокой проникающей способность» в субстрат.'В связи с этим они все больше привлекают вникание исследователей как продуценты форматов, а также белка пищевого и кормового, достоинства. . .'

Биосинтез и свойства " йкгрмонтоз, _ катализирующих гидролиз целлюлозы:!« гемицеллюлозы.изучены у зеська узкого круга высыих базм-диомицетов. Отсутствуют деяние о фер1аак;гативиой активности грибов, принадлежав»« к различным систематическим и экологическим группам. Поэтому необходим гаирокий поиск новьи активных продуцентов ферментов, а тякае оптимизация условий - их :культивирования и изучение закономерностей биосинтеза целлюлаэ и ксиланаз для разработки научных основ псщучёяия ферма.чтоп.

: Цель' и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении целлюлазной и ксилавагной активностей; высших .базцдиомицетов при биоконверсии;раЙтитеЛьвых•отходов, н регуляции биосинтеза - этих ферментов у отобрайных продуцентов.' БЫЛИ:поставлены следующие задачи: - провести скрининг базидкскицетоз, способных продуцировать целлюлазуи ксиланазу и /обогащать расть.. ельный субстрат грибным белком;

- подобрать растительный субстрат, 0беепечиваю1чий : рост грибсв и образовааие целлззлазы и «силаназы;

. определить условия культивирования отобранных продуцент-, благоприятсвуищие образованию целевых продуктов; : - : ,,

- изучить регулятораые мехаииэмы биосинтеза целлюлазы и кс яанаэы Сеггепа ип!со1ох ,(162' и &1р*ррогив ЬоШИпиз ИБК-32?:...';■■'". Научная ■ «озизньработы. Впервыа оррведеиы сравнительные ■ , следования роста -у. ■ аепла^адной "и * :ксиланазнйй: /"ы«ивн9ег«Й ;~вчив .;базидиомицетов ррч глувидаи?»и ("И») '.йсх

^ резко» . лозы ОВД).'--ц ч,0о»аран»''.*

Способность« бко^баверсии растительных: субстратов, обогащению , >йротей»50н м образованию:ферментов! - Полудевы нош»" данные>о физис лого-биохимических особенностях дзревораэрушахедих грибов. Показан ^возможность '4»1эиалогическойг; регуляции л ферментативной. а?стирвоот - баэидиоиицетсв.. Установлено, что целлюлазы и '. ксиланазыл Сеггвп. , ип1оо1ог 062, р1рЛ,орогис ЬеЬиНпиа ИБК-327,РЬ1еЬ1й"гас|1£Са- 79 ! ! Р1виго1из.-за11бпив '0449 рвлйются. йн,ауци(^ьным» фермвйтамиЛ оиутв; :.-крторьк."под^ржея^катабрлитнойгрвпрессда глюк&эой.'V •• А-'. ;*

Практическая значимость работы.' Отобраны. ,воше : сравнительна . .;быстрораст-уйиэ,йтаммы'бэзйдйом'ицетое. вве-

и йротбина ^ ^ :целесаобраЗвооть

:..'.,-...исрсть^ованияГуОа'?. и -цж-в ^чест^ еу^стратрв''ДlW^•^^paв^ввив^»lи^cpo6-. ного протеина и ферментов^ Получение результаты являются научным вкладом & информационный банк данных .коллекции культур высших ■■ е>азидиалъных грибов. : * ■ .-.■..■

. Апробация работы; Результ&ты исследований шли доложены на . конференции микробиологов Закавказских республик "Современные достижения микробиологии и биотехнологии"' (Тбилиси', 1889>, на II Рес-- - публиканейой конфор-ециии ''Микробиология в селыжомхозяйстве" (Кишинев 1В91), на мевдунЬр, симп. "СеПисоп-в1"(Нью-Орлеан, - США, ■ 1291),, наВсес.сккп. "Ишеёнбриоя'знзимол.'' {Москва>-1§81 >. ;'..■"/ Публикации. По материалам • диссертации опубликовало шесть

забот в отечественных и зарубежных изданиях.

Структура и объем рзботи. Диссертация изложена иа стрзни-дах машинописного текста, содержит 26 таблиц и £ рисунков. Работа :остоит из. введения, обзора литература, экспериментальной - части, зключшощей описание объектов, методов и результатов исследования, обсуждения результатов, вмводов и списка цитированной литературы, соторый эключает /?Сссилс,':, из них 71 - на русском языке.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

. Объектами исследования слоили 15 птгммов виспшх базидизльных грибов из коллекций Ботанического института им.-в. Л. Комарова ; г.Санкт-Петербург), института ботаники им. Н.Г.Холодного (г.Киев) л института.риохкиии растений им. С.В.Дурмишидзе (г.Тбилиси).

. . Посевной материал виращивали в течение 5-7 суток на качалке, ;авершакщей 200 об/мин, -в колбг-х на 750 ил, содержащих среду . еле- -ЗУкдего состава (г/л): глюкоза - 10.0; !1Н4('03 - 2.0; КН2Р0л - 0.6; 1а2НР04 - 0.2; МвЗО^ х 7Нг0 - 0.5; 2пЗОв х 7Н30 - 0.001; ЕеБ04 х 'На0 - 0.0005; СаС12 х 2На0 - 0..06; дроетевой экстракт - 1.0; рП ;реды 5,8-6.0. Мицелий гомогекиэирогали и суспензию использовали з качестве посевного материала.

Твердофазную ферментацию (ТФФ) проводили е колбах па 100 мл, годэржащих 4 г по абсолютно сухому весу (АСВ) опилок обрезков виноградной лозы (размер частиц 0.5-2 мм), увлажненных 12 мл указанной, ваше -среды без источника углерода. По скончании ТФФ часть.проросшей грибным мицелием. биомассы высуиивали,при 55° для 'определения в.ней протеина и целлюлозы, а остальную биомассу четырежды промывали 20 мл дистиллированной воды и с .'яимали. Экстракты цен-грифугировали, фильтровали через стеклянные фильтры й использовали а качестве источника фермэотоз.

. Глубинное культивирование грибов при проведении скрининга

осуществляли в колбах на 750 мл, содержсдах 100 мл указанно*" еьаа среда с 4% ОВЛ или ЦЖ. По окончании культивирования , растить . ...:о-белковый продукт ферментации-(РБП) центрифугированием отделяли от культуральной кидкости.

Регуляцию биосинтеза ферментов изучали, культивируя Бсэидио-мицеты в колбах на 250 мл, содержащих 2Z мл указакнсй выше синтетической среда с источниками углерода.

В биомассах определяли содержание 'протеина по методу.Къельделя с использованием реактива Цесслера и коэффициента 6.25: Для определения истинного протеина биомассу предварительно" "обрабатывали 0.51'. трихлоруксусной кислотой в течение 15 мин на кипящей водяной ьаве, центрифугировали, промазали 86%-ным спиртом, и „высушивали (Терихитарова, Шульга, 1874). Содержание целлюлозы в Биомассах определяли по Апдеграфу (Updegraff, 19S9). Содержание белка в экстрактах.из биомасс или в культуральной жидкости определяли по методу Бредфорда (Brsdford, 1976).

Ксиланазную и карбоксиметилаэиую (КМЦаэную) активности определяли стандартными методами I'JPAC (Ghose et al., 1831). Зпдогло-каназную активность определяли такае вискозиыетрически ■ ( Клесов к др., 1960). Для определения ß-глккозидазней и А-ксилозкд-ззной активностей использовали 2 нМ растворы n-нктрофенил- -1)-глюкопирано-эида и п-нитрофенил- -D-ксилопираноаида в 0.05 М ацетатном буфере с pH «.5 (Poutsneri, Puls, 1988).

' . ' РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

"СКРИНИНГ ВЫСШИХ ЕАЗВДИОМИЦЕТОВ - ПРОДУЦЕНТОВ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ФЕРМЕНТОВ ПРИ БКОКОИЗЕРСИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ СУВСТРАТОВ.

Твердофазная ферментация ОВЛ базигуюмицетами "-показала, что исследованные грибы в значительной степени отличаются между собой

по способности к разложению субстрата и про >щии (ферментов. , Содержание истинного протеина:в продуктахферме«геями достигало 3.9-4.7Х через 7 суток и 4.6-6.38 - через 14 суток Т4Ф., Убыль цаллюло-

' ' ■'■"•Л. . ' . ' Таблица .1.

' Внеклеточная ферме(ггатийная "вктиЕНость высшст баэидиомицатов .; при ТЕордсфаапой фермеитацин оРреэкогз виноградной лози.

—.1 1 1 м—1—;——— : .■ Культура гг"5а . - Сутки Эндоглюиа-■-'■■ 'наэа. • Ксилаигза, , &-глюкоэи-даза.

ея/г' КН

,С»цп1оо1ог.032 - 7 1.8 - 33.0 , 428 ..

■.' ■ ''.■ V . •'. ■ ': 4.2 , • .", оо.о, - С38

С.еоргЛиз ИБК-137 ,« 7 3.7 ■• 1.5 85

14 :: : . ' ?.3 ■,V' . го.б . 102

С.риЬевсепз 0663 ': 7 ^ ■■ /' з .1 11.3 . - 119

14 , ;: 9.1 .. 15.0 ■ : 534

; 0.чавгеАпа* 0101 "" .■ 7 : 12. э 4.1 : 417 ■

У / - .■..'•"'.•' /14 . 33.9 ; 17 •5 1 ЗСО

С .оопГгагоЕ.г 0208 . 7 '"'-• ./. 3.0 .' 1.8 86

■ ■".' ' ■" ,. ■ • • 44 , •'■ 11.0 10.9 -271

Р лгй1ик1рез КБК-3 7 - 2.В - . " . 3.4

•14 ' 2.1 / • ,■• 21.0 ; 122

1 ,р1п1со1а 0755 .. ' ' .7 - '-' ' 10.1 , . . 11.3 23Ё

и 7 ,12.8 , '■ • 10, 1 242

Н.огвайео ;ИБХг73 , •. 7 1.3 '. ; ' ЛЗ-.'Э'-, ' 74

14 • . 2.3 4.7 " 121

РЬ.сЬгуЕозрор1и» ЖР-1 т. , - 4,8 ¡5. ¿5 37

14 7.7 , •, 40,2 . 243 , .

РЬ.га<На1а 79 . ' : 7 ': 0.4 ' 4.7 28

14 . 21.4 •■':, 11-3 137 '

4Р.Ьвеи11пив:ИБК-.327- " ■ 7 17.7 3.5 - ' ' " 226

14 ■■;■;: 50.0 .'.-'■ , -14.0 - 339 -

Р.б81гва1из ИБК-105 7 0.9 8.3 37

- •''"' ■•' ■'•. Г.. Л" - '. " 14 10.4 3.2 133

Р.озггва1и® ИБК-191 7 1.8 1.7 - , 54

..'■'■' ■ . 14 . ■ 3.1 ■ У 3.2' 43

7 1.2 4.2 -82 ..'

14 2.2 3,5 . -72

''£)!'.-о&авипе -ИВК-86 7 1.-5 2.4 181

14 •. . • 7.о : ■4Л 03

-••о" -

зы за две недели культивирования РЬ:сЬгуЕозрог1иш ИБР-1, РЬ.гас11а-Ча 78 и Р.з&Иёппа 0449 составил 21.5-22.6% от исходного г- '¡эряа-ния & ОВД. Слабо разлагали целлюлозный компонент ОВЯ С.сьз&Ьш

' ■.' Л: ' ■ "' ' ■ ■ . Таблица 2.

Внеклеточная ферментативная ечтивность высших базидиомидэтов

при глубинном культивировании в присутствии обрезков .....

виноградной лозы и цитрусового кома.

-• . Зедоглзоквназа,ед/ил Ксиланаза>ед/кл

Культура гриба Сутки . .4 овя ■ • • : гал ■ . ..V ЦЖ

С.игиср1ог 082 в ■■ .о.1 ; ■ ' 0.4 . : .0.9 3.4

■ ';12 . - С.2 "• • р.з . 1,.г / 5.2

С.соааг.иэ ИБК-137 8 ■■ - <0.1 <0.1 "Чч О.г Ч ' 1.4

. 12 ■ 0.1 у 0,1 1.2 •,.• 0,8

.С.риЬсгсепв 0663 "' ■ 8. ' "•,. 1.2 " 1.5 'Ч о.1 ,, 3.0

гг 3.7 - "2.3 ' : 0.5 - 2.2

0,«иегс1г.а 0101 . 6 ч 0.3 ■ 0.3 "'. Ч 0.3 0.3*

:• 12 Ч 0.7 'Ч 1.1 0.5 • 0.1

р .'соп г г агвза. 0286• •: \"8 ■'"'*' 0.3 '*. ' 0.5 0.? 0.2

12 ■-.:. 1.9 '• '• 1.3 . ..:. о.1 0.9

5! Ле1и11рез ;ИБК-б.," : ! '" 8 . 0.1 ''Ч 0.1 1.0

'4-12 .0.8 ' 0.5 : ■ о.1 Ч Ч 1^2

Р;р1п1ори0785 . .. 8 Ч 0.1 ., о.г • 0.5 1.7

12 -:' • 0.Э '■■' 0.3 ■' ■.-'-. 0.4 ■'•;' 2.1

М > охрабев 'КБХ~7в~:Ч • 8 ' <0.1 <0.1 , 0.1 ; 0.8

* . ; ' , .' '12. о.г ; ; 0.8 : 0.2 л -/ 1.1

Р1>.сЬгубозрог1ис ЛБР- 1' ' 8 ' 0.5 0.7 ;ч 0.6 0.2

■12 1.3 ^. 1.3 - Ч ; 1.0 .4 : ; 0.2

Ph.radista.78' Ч 0.7 0.6 ' ' 0.5 0.5

'..'' ' ' 1.8 ■ . .. 2.5 " 0.1 ' .-' 1.1

; РЧЬе^оНпис. И2К-327 . , 4-4,8'.4 0.3 ■■- 0.3 ' '. 0.4 0.3

12 Ч 0.7 г.О .*;• :-Ч 0.3 . . 0.7

.' - 8 : 0.3 <0.1 0.8 , 0.6

;'Д2 .4 - 1.4 • 1.3 .' " ч ол - 1.8

Р.ойЬгеа£ив-. ИВК-191 ' 8 <0.1 <0.1 2.5

' .-'12 . ■ . 0.1. <0.1 0.4 - '- 5.6

•Р„.в»Нйпйв 0^46 .' - , 8 - <0.1 0.2 . 0.3

-<12 . 0.1 '• ; 0.3 ' 0.1 . 5.4

БЪ;, срювипе. ИЁЙ-86 .' 8 ''.-. : о.8 <о,1Ч - V '" '2.0

••• 12 0.2 - 0.3 0.8. 3.1

ИБК-137 и P.betulinus ИБК-327 - 5.8-6.3*.

Тем не менее, в культуре гриба, вызывающ?!! : í>ypy:o гниль древесины - P.betulinus ИБК-327, была выявлена игшвысиая эндоглюка-яазная активность - 53 ед/г FBn (таблица 1). Самая высокая ксила-назная, а такяе Ji-глюкозидазнав активности обнаружены при фермен тации ОВЛ культурой С.unicolor 062.

культивирование базидиомицетов а глубишшх условиях в присутствии' ОВЛ- в качестве ростового субстрата позволило увеличить содержание протеина в продуктах ферментации до 8-9Í. Наиболее активно разлагали целлюлозный компонент ОВЛ C.conatua KSK-137, С.pubes-cena 0663, fh.ohrysosporíusi ИБР-1 и P.ostróatus ИБК-191 - 30.4-34.8Х - за 12 суток культивирования. Однако кэ этих культур высокая аядоггаокавазн'ая активность была выявлена только у .C.pubeseens 06ВЗ (3.7 ед/ил) и Ph.chrysosporiun ИБР-1 (таблица 2), Ксиланазная активность базидиомицетов э этих условияк культивирования оказалась сравнительно низкой.

Для большинства исследованных бззмлиомицэтсв ЦК оказался превосходным субстратом длл роста. Содсрягкие истинного протеина в продуктах Ферментации-за. 8-12 суток культивирования возрастало с в до 15-17*. Целлюлоэолитическая"активность наибольшей била в культуре C.pubesoens CSS3,.которая разлагала около 505! целлюлозы за 12 суток роста И: проявляла каивысшу» эадоглюканаяную активность (таблица 2). Высокая-эндоглюканазная активность била шявлена также в культура P.betolin'js ИБК-327, 'хотя убыль целлюлозы за 12 дней выращивания-гриба составила лишь 20.9%. Ксиланазная активность С15еди исследованных базидиомицетов наибольшей была, в культурах C.unioo-ior 082 и P.ostreatuo KEK-1S1.

.Полученные данные свидетельствуют о том, что грибы, разлагающие "дрейесину по тйпу бурой - гнили,* отличаются слабым ростом и сравнительно низкойинтенсивносгыо разложения обоих растительных

субстратов. Возможно, это объясняется резким подкислен дам пит, тельных сред, иногда вихе рН 3, что может снижать проду.. vo и а тивность фариентоз, а также их инактивацию.. Твердофазная .фермент, ци» ОВЛ этши организмами обеспечивает их сравнительно высок; целлюлазную и;ксиланазную активности.. ~Базидиомицаты,. выэкваювд . белую гниль, древесины,, одинаково хорошо, растут ори всех исслздс ванных услоеинх культивирования, хотя их ферментативная активносп • варьирует в -очень' широких пределах.: -Наконец, ■ надо • отметить, \ - ч-з уровень ферментативной- активности грибоз -в ■ значительной . степей -зависит от продолжительности .их культивирования.- • ',".'•'.","'

-,.' ТЕЕРДОФАЗЯАЯ ФЕРМЕНТАЦИЯ ОБРЕЗКОВ ВИНОГРАДНОЙ ЛОЗЫ КУЛЬТУРОЙ , .. :■ • CE8BENArUiJieOLOR 062. " ^ 1 ;

: '' ,- . . На "первом этапе работа мы -проследили за • ятааникоЯ, роста - i И. ферментативной активности;гриба. Результата зтих опытов -показала, . что в-таченив'первых двух суток культивирования гриб растет сргл-:: иктельно медленно, , давая прирост - протеина на 0.2Х. - В ^последующи; ', - даре - суток - прирост протеина" составлял ужэ',0»®*; и *. к -«12-15 - суткау : . культура. по-сутдестау, -достигала, стационарной фазы роста, хотя не', значительней приростТпрйтеина наблюдался и ».врсладуюаде дни, достигая 7,6Хчарез 2вдней Ферментации. Деградация целлюлозы начиналась в цервые дни культивирсгиния гриба и игиболоо интеисизно вро-исходштав течение- первой недели ТСФ. 9а это,время. С,unicolor -082 разлагала около 13Х неллкзлозы, тогда как в течение второй седели -около 8", а за дее последующие недели ферментации - лишь 5Х целлго-•лозы of исходногр её-,'содержания"»,субстрате.- ,.•'•'•

КСилиг азная' активность культурьг быстро возрастала после - ино~ ; кулячки «среды, достигая первого ^аксииума -/ 50.9 ед/г растительно-белковой, биомассы г . на ,дев«1ый день Ориентации, áiPteM,к 12 сут-ксн, снижалась д?„34 .7 eji/r;. К, этому,- времени '.' целлюлозная актив-

- U -

юсть культуры достигала своего максимума - 24,/ ед/г. Через lí ;уток культивирования гриба ксиланаэнзя активность ¿-г-тигала своего второго максимума - 48 ед/г, -а через 21 день ферментации -гретьего - 44.8 ед/г, после чэго к 30 суткем культивирования постепенно снижалась. Уровень КНЦаэяоп активности также осциллировал а процессе твердофазной ферментации, демонстрируя три максимума, которые по .времени совпадали с периодами падения ксилгназной АКТИВНОСТИ культуры.

• .Дополнительные, помимо содержащегося в СВЛ, источники азота вдиь в небольшой степени стимулировали рост С.unicolor 062 (таблица 3). Однако аспг-гагин и пептон на 40—12% стимулировали продукцию

Таблица 3.

Ферментативная активность С.unicolor 062 а зависимости от .^источника азота при твердофазной ферментации обрезков виноградной'лозы (п~3),

Истиньай протеин, X

Ксн-*.аназа, ед/г РБП

1сточния азота Сутки

ед/г FEÍl

Соатроль .7 4. 1 + 0,02 . 16.7 + 0.42 37 3.0

14 ' 4. S + 0.02 ■14.4 + 0.84 • 67 + 7.3

21 .. 'i- . 7 + о.ог 20.6 + 2.61 72 + 9.7

1Н.Н0, 7 . 4. .5 + 0.10 18.7 + 1.09 63 Э.9

14' 4. .8 0. 14 12.9 + 0.34 ВС + 5.8

21 5. ,2 + 0. 12 25.7 + 0.83 60 + 8.4

тл)ггол 7 4, ,6 + 0.05 21.1 0.63 90 + 7. 5

, 14 '.- '5. .1 + 0.04 12.4 + 1.40 • 10S + 5.8

- 21 . . s. .3 + 0.17 2S.2 + 0.54 42 í 5. 7 ■

Солодовый •7 4. ,6 0.58 . 17.6 + 2.29 ' 46 + 7.8

жстракт -.'14 4\ .9 + 0.W 14.3 + 0.70 56 í 1.6

21 5- 3 + р. 13 31.5 + 1.71 S4 8.9

Зептон 7 4. 9 + 0.05 , 22.0 + 3.57 éo' + 4.6

14 5. 3 + 0.10 14.3 + 1.08 121 + 6.4

21 5. 8 + 0.00 "30.1 + 1.40 71 + Э.9

"идролизат 7 .. 4. 8 * 0.05 18.7 + 1.78 . 54 + 1.9

сазеина 14 5. Э + 0.06 1Ü.S 0.89 ' . 131 z 4.2

21 • 5. 6 + 0.03 . 20.7 + 1.60' 88 í 7.8

^спарагин 7 4. 9 + 0.04 23.7 + 1.51 ■ 47 + 4.2

14 5. 5 + 0.10 14.2 + 0.04 '96 + 3.5

21 5. В + 0.27 ' 20.1 + 0.46 66 + 4.1

КМЦазы по сравнении с контролем через 7 суток ТФФ. На., асемй и вень активности этого фермента был выявлен через три недели рос гриба в средз с пептоном и гидролизатом казеина. Эти se азотсоде аащие соединения благоприятствовали накоплению ксиланзэпой акта кости.

Далее исследоваЛи роль л^-кометаболизируекык дополнительн источников углерода, способных оЗеспачивать интенсивный рост грк с начала культивирования, - глюкозы, целлобиозы. а также авице (в концентрации 200 и 600 мг/4 г ОВД)- на рост, и .фермзнтатива активность С.unicolor 062. С этой целью в качестве . растительно, субстрата для роста гриба использовали проавтоклагироэанные 8 ди> тиллировакной боде и отмытые от экстрактивных веществ ОВЛ.

Было установлено, что культивирование С.unicolor 0Е2 на сдал той лсзе снижает рост гриба и обогащение субстрата протеином t сравнению с необработанными ОВЛ. Из испытанных источников угд£ро; только глюкоза и, в меньшей степени, целлобиоза в небольшой степе ни повышали содержание протеина в РБП. Внесение глгокозы, 600 мг/4 ОВЛ целлобиозы и в еще большей степени авицела снижало . скоро« разложения целлюлозы, при этом репрессирующий эффект этих ведест усиливался с повышением их концентраций в среде.

КОДаэная, ксиланазная и $ -глюкозидазная активности во. врем роста гриба в присутствии небольших концентраций глюкозы и цвлг.о биоэы, по-существу, оставались на уровне контроля. В то ке Bpt-мл повышенны«- концентрации Сахаров подавляли ферментативные активное ти в течение первой и второй недель ТСФ. Однако чореэ 21 день фер КАНтац:«-: ОВЛ урезки активностей ферментов р 2-3 раза повышались п; сравиению с контролем, видимо, после исчерпания легкометаболизи-руемых Сахаров в питательной с раде. S отличие от глюкозы и целлобиозы, авицел стимулировал продукции всех ферментов на протяжении всего периода ТФФ ОВЛ!

Было такие установлено, что присутсж ■■ t кээх-скяых фенольни;; соединений отражалось сущгстееппмм образе*! яг твердофазно'* ферментация субстрата в процессе роста С.unicolor 062. Банилиа, п такзе индулин АТ в концентрации 0.1 н.Ч/4 Г ОВЛ з значительной степени подавляли разложение целлюлоэи, а а присутствии ьаратрилового спирта и. (¡»рулевой кислоты наблодапссь усилеянэ разложения этсго компонента ОВЛ. КМЦазкзч и кснланмиая активности C.uiicolcr 0S2 в присутствии этих соединений коррелировали с йеллюлозслитическоЛ активностью культуры.

ИССЛЕДОВАНИИ МЕХАНИЗМОВ БИОСИНТЕЗА Ц£.'1ГЮЛА?Ч И КСИЛАНАЗЫ C.UHICOLOR 062 И Р.B57ÜLIHUS КБК-327.

Для того, чтобы определить, являгатся ли синтез нсс.гедуэмых ©ера^нтов индуцируемым или констктутовтм. вазидиомип-этн культивировали ва синтетической срздэ, содержащей различив® источники углерода в концентрациях' 0.5 и 1.0Х. Дьяяые, гсгеастгвлекяие с табли-

Таблица 4.

Селлюлазкал активность С. unicolor 062 а зависимости от :-:с?с;к;'ка углерода в питательной среде.

Источник

КМЦаза,

Зкдоглюканаг

В-глюкозидаза,

углерэда ед/мл од/мл ед/м

Концентрация, % 0.3 1 .0 0. .3 1 . .0 о _ 3 1 . 0

Азицел 3 0.1 0. .7 0. . 2 .0 .3 0 11 . 5

0 2.1 2. .9 1. .5 2. .0 18. 2 15. 9

КМцеллюлоэа 3 <0.1 0, .3 <0. . 1 <0. 1 19. ,9 п. . 4

3 0.2 0. ,2 0. 1 0. 'з 1. 9 0"

Ксилан 3 <0.1 0 0. . 1 <0. ,1 0 £

8 0.5 0. . 1 0. 1 <0. . 1 6. .6 2 . .2

Целлобиоза 3 <0.1 0. .1 0. ,2 0. .2 2 .9 1 . 1

8 0.3 0. . 1 0. 1 <0. . 1 7, .3 2. . О

Глюкоза 3 <0.1 п, .1 0 . 1 <0. , 1 с 0. .4

8 <0.1 0 0 0 7 . . 4 0

Ксилоза 3 0 0. 2 <0. .1 <0. . 1 7 .3 2 .6

8 0 0 0 0 2. .0 3. . 2

Маннит 3 0 0 • 0 0 3 .7 2 .3

8 0 0 0 0 7. .4 0

, це 4, показывают, что только авицел обеспечивает высокие "'¡Цазну!

и эндоглюкаыазную активности С.unicolor 062. ^-Глюкозидазк...rf ак-. тивность была гиявлена во всех вариантах опыта, хотя ее уровеш

• Таблица 5.

-Целлюлазнал и ксиланазная активностиР.Ье^Ипив ИБК-327 в зависимости от источника углерода в питательной среде.

Источник Сутки • КМЦаза, - Ксиланаза, глюкозидаза.

углерода ед/мл ед/ил ед/кп-

Концентрация ' 0.3 1.0 0.3 , 1. 0 -•- 0.3 1.0

Авицел 5 0. .12 0.07 0.20 0.07 15, .3 5.5

8 0. .10 ■ 0. 08 : 0.03 0. 78 16. 2 11.4

КМцеллюлоза S 0. .10 - 0, ,44 0.34 0. г44 9. .5 . 12.1

8 0. 03 д. 18 0.10 ■ 0. 65 -48. .5 56.2

Ксилан. 5 0 0. 27 . - 0.27 .- о! .81 4. .6 7.8 '

8 0 ■ 0; .42 0.46 0. ,76 75. .3 25.9

Цел^.'обиоза 5 0. ,90 1. .28 : 0.30 0. ,58 ■ ц. .5 6.9

8 0. 82 , 3. 55 0,12 2. ,84 .21. .0 • 15,2

Глюкоза . 5 0 0. 11 ■- 0,12 0. . 27 ••:. 8. ,1 6.3

8 0 0. .16 0.11 ,83 7 .а 8.5.

Ксилоза - 5 0 0, .27; 0.20 ■ 0. .49 5, .4 8.1

8 0 ■ 'О- 11 .0.08 0. .47 7, .5 8.8

Маннит 5 0. .14 - о: .06 ' Q.13 0. .18 : 8 .5 13.9

в 0.10 0.04 0.20 0.11 - 12.6 25.6

варьировал в зависимости о?., источника углерода и времени культиви рования гриба.

Иная картина имела место в культуре Р.Ье^Нпив ИБК-327. Авицел, а также КМЦ, оказались слабыми индукторами целлюлаэы. Наибольшая КМЦазная активность культуры была выявлена во .время роста гриба в срер- с целлобиозой <таблица Ъ). Уровень активности1 фермента возрастал с увеличением концентрации целлобиозы в среде. Интересно отметить, что КМЦазная активность Р.Ь^иИпив ИБК-327 в среде с лактозой оказалась: выше, чем в средах с целлюлозой. Ксила-

назная'и р-глскогидаэаая активности культу] л существенно но >•'.■-;.....

-цялись в зависимости от- источника углерода в средо для рост., гриба. : ';.'"'-'-- ' -

Представленные в таблицах 8 и 7 данные позволяют сделать- заключение, что целлюлозы и ксилачазы РЬ.ггсНа1а 7Я и Р.зп11бпаЕ 0448 являются индуцируеными ферментами.. Авицел обеспечивает , наибслкиую .активность этих Ферментов У; - обоих, базидиомицетов. Специфическая КШазная активность, например, РЬ. гас) .70 в среде с евицелом -С. 25 ед/кг протеина - в 31 раз правшала аналогичный- показатель в среде с. г.иоконатом- натрия и в 179 раз - р среде с ': кашзитом. , По. видиксму, .|>-гл:скоэппаза у РЬ.га<31а1а 7.9. -является таете ',индуцируе-!'мам; фёрментси, тогда как У Р.ваНапиз 0419 • ноаститутивпым. .

Таблица 6.

■ аеЛпгйЛаэиая Н ксклзтазная актквг.-оста РЬ.гагНаЬо 79 в зависимости ' . . .'от {.'сточниха, углерода в стэде (3 суток - куяотивиргазавия);

'..-,., Кстсчвд.ч ' 1 / . . Прирост углерода (0.75Х) прсугшна.^

КМЦага» ..-Ксиланяга, Р-ксилозкяазз, е д / м Л

<Авицел - ККцэллгалоза■ уХсилан • . ' "Целпоб!!оза '. ■Глюкоза ■ Макнит Глшоиат Яа '■

9.С •8.4

12.4

14.8

12.9

14.5 12.1

2.41 о. аз 0.39 0.23 0.08 * 0.02' 0.10

1.25 0.13 0,41 0.11 -0,04 ■0:09 0.10

25.7 10.7 15.0 3.1 =1.4 2.3 3.9

',';;-.' '•'.'.'.' " • ■ ' ' Таблица. 7.

^Цйллзолазная.и. ксилакаэиая' ¡активности . Р.гаЗДбпив 0440 в зависимоо-./-.,, ти от источника углерода в среде.С8 суток.культивирования).

•.ЧИгточник ¡ .. прирост " ' углерода (0.751):протеивП-иг

- ККЦйза, , Ксилапаза, "¿$-ксилозидаза,

- - '■■'-•- С 'Д / м л

"Авицзл , •' КМцеллкилоза '. Ксилан '■•"•.,'. г Целяо5иоза . Глюкоза -- Наияит •Глаконат На ..

.6.1 5.8 8.5 0.7 ,8.4 5.-1 7.7

0.59 '0.34 .. •0.1В 0.23 0.04 0.03 б/. 0В

'"-.1.42 0.49 .".' 0.81 ; 0.17 . 0.07 0Л0 0.18

1.3

2.3 1.0

4.4 1.2

•5.1 ' 3.4

1. со

0. 75 О. 50

- - 0.25

¿ 2 3 4 5 6 7 8 9

Протеин биомассы, мг Рис. 1, Индукция КМЦазной активности Cerrena unicolor 062. Культивирование гриба проводили aá средах с: 1 - 0.ЭХ, маннита» 2 -IX маннита, 3 - О.ЗХ маннита + IX авицела, 4 - IX маннита + IX евицсла, Ь - 0.3% маннита + IX авицела-на 5-й день, культивирования, 6 - 1% маннита + 1% авицела на 5-й дзнь культивирования.

2.0 i .5

. :.о

• ' 0.5

' JL 2 : 3 4 5 6 7 8

~ ■ ''- Протеин биомассы, кг

?.. Катаболитнай репрессия синтеза.КМЦазы С.unicolor 062. Культивирование гриба проводили в средах с: 1) - 'ТК-^авицела, - 1% аькцела + 2) 0.2Х глюкозы, 3) 0.4X глюкозы, 4) 0.8Х глюкозы.

.X; 'Х-';' > 3' .-.--4."-/.' 5 6 7 '•''*.' - -. . , ■ Протеин-биекзсиг, . ' . -

Рис. 3, Катаболитная репрессия синтеза КМЦазы С.ип1со1ог 062 ири добагигаяш'шсредне 1» езнк&ла *<1) 0.2» (2), 0.4% (3) . или

гтре ■'• - " ■■'.-•"- ' " ,.

(4) глюкозы перез жга дйЯ-;культивиров.-»!ия,гри£а. .

■'■0.15

оло

'. 0.05

о.оо»-

Рис. йад'/кция и катаболиткая -репрессия .синтеза' эвдоглюканазы раотупгай, з .присутствии: - I- о;52 накнита, . 2 - <1) ; 0;35Г 'целйобиозы (И)» 3 0;ЗХ Ц; через'2 дчя^ - 4 - (2) +

;0.1Х- глюкозы (Г) через2 рая, 5 ,* 0.18 Г'через 5 суток рос-

та, б - (3) + о. IX г через .5 суток.роста. '.'• -

■ '. •,'..' •' Таблица -

. Индукция целлгалазыР.ЬвСиИпиЕ ИБК-327.

Вариант сутки биомасса, .КМЦаза,: Ксиланаза, {^глвкознца

опыта , ед/мл ' -гея/ил за,ед/мл

0.5Х каинита 5 . 5а ; 0.12 : 0.33', 24.7

.10. : 0.16 ; о.зз 28.2

0. ЬХ наннита + ., 5 , 0.39 , 0.22 5.0

0.IX целлобиозы 10 61 0.86 •• 0.82 . . '.'■'-■ 7-2

0.5% манниТа +•" Ь : 68 1.50. С.45 17.8

С.-ЗХ; целлобиозы 10 . . .51 2.28 , 0.82 V 8.3 .'"' '

С.5Х маынита +' 5 ..' 67 . ■■ 2.18 . 0.60 17.8 .'■',-.

15 целлобиозы.■, ю : ' 70 .•> 1.78 ' .' 0.41 16.8

- . 1 . Добавление овицола в концентрации IX в культуру С.ип1со1о ' -р8 2, • растущую в - ррисутстэйи.,0.3 ..или 1.0* >маннита,>с' с^мог^оVначал культивирования •'• гриба.,:. Индуцировало ' .синтез ' КМЦазы /и^ кей^аназ: < рис.1). однако внесение целлкуюзы чореэ'5 " сутож роста культур ! , индуцировало сшгтез фергазнтов лишь в варианте опыта -с Ь. УХ мании та. ;в культу]рвд^студай--.б*присутствии,хшивподм ,'ривте-' КМЦазы'.не1 происходило.4V' суток,;,л'в<?сл©- ; доба»ивайо авицела, ;видимо,; из-за ирисутствия. лагкометаболлзируеиого источйи-.'. ко утлорода. . ' ,..;'/.,-- />..'■-'<.''' ...■''.'" ''■■:{'.-..

. „гда»^''.^ р/4 ид'и,0.8£ в ■••и

;, 'авицела с.''самого, начала культи^рования ¡гриба-: вызывало;- репрессию .,- синтеза целл«5лаэы и ксилараэы^ (рис. 2 ) •"..Глюкоза ..в ^концентрации 0.2Х К не -фа^вицвк^О^Х ^.глю-

козы в] растущую культуру Л двое ;еутрк поела циркуляции) .такаге : рёаресЁмр^а/Ю'^ияе^{'дфих. ^учая*, репрессия , была тем продолзительнее. чем выше была концентрация глюкозы в пи-■ "'тательной ср'з:1э.7" - . . " ' -'

й отнзвении Р..Ье1и11пиЗ ' КБК-327 показаво, что - Добавление - целлобйоэы щ кул^гуру, - ^стуаду»?'«Ф^с}гтсяс8ии'11ай^г^/,мвдйдаир»1№,

- IS -

синтез'цоллюлазы, но не р-глюкозидазк, » а г>5олывой стс^лг1 усиливает еиатсгэ хсзманагы (таблица 8, рис. i). ИлдуциругщиЯ эффект целлсбиоэьг возрастает с увеличением кош миграции дискхарида в i.седе. . Синтез целлдалази P.tetulinuí; ИБК-327 подяч'Г'.'ен катаболитной репрессии глюкозой (рис. 4).

Энесенне актийоягцина Д в кснцентрац.чи 10 мчг/мл или ужло-гехсимцда в конг.-.'йтрации 20 мкг/мл в среду с яоллобиоеой с самого начала кулътишрсч>акия Р.betulinus ИБК-327 или s растущую культуру (через 3 дня после инокуляции) полностью подавляло еиссинтеэ цэл-яюяази. Это свидетельетвозало о та% что секрация цгыиздаэы в окружаювую срозУ связана с de novo синтезом фермеята..

7 • . ;П 11 В О Д И.

1. э результат;; скризоа-з адз. .¿цснуюзгов устааовлени существ«!«::*"; отгичиа исжд) 15 "t¡«.mke!í;i грибоз, прияадлезааулх Различным c«.rfe>«T:<4ecimM. и экологическим 'группам, я "х поеообас?-тк к утилизации и Сбогадда-ет ррот^жсм растительных субстрат«» и продукция Ф®р;:ьатов кзлллчаэясго и хснлаяазпого комплекссп.

лены базидиомицати - прод;ц-здти «;едгамаз и ксмладиз. По-

казано, что фер^актятивкая активность грибов загасит от способа культивирования и растительного субстрата, в присутствии которого ~;jps:5HSa'3Tca продуцент.

2. Нссладэяада даиаЧика ТФ© ОЗЛ. Ьыпвлелз осцилляция активностей феркеятов, при этом три пи;«, -цвплшаэаой активности совпадали о пь'РГод1>;я паДегзия ::силаназной активности С.unicolor 952.

3. Показана гсгиожкесть Физиологической рзгуляври фермевта-тигчой активности ca3!ííi¡;0tiMqcToa. депсля телькыз источники азота -г;",арслизат казекпа и пептон - и 'дополнительные к содержащемуся в ОЭЛ источник углсрсдэ - аведол - стимулировали продукцию цолляло-литичаскнх и хсиланолити'г&сеих фэркяктоз С.unicolor 062.

Экзогенные фенольные соединения - ванилин и индулин AT в концентрации 0.1 мМ/4.г ОВЛ в небольшой степени подавляли целл*,. ли-тическу».активность С.unicolor 062.

4 . Установлено, что в культурах Cerrena unicolor .062. Phlebia radiata 79,. Pleurotos salignüs 0¿49 целлюлаэа и ксиланаэа:являются индуцируемыми ферментами, наибольшая активность которых выявляется в средах с <звицелои. В культуре Piptoporus betulinus ИБК-Э27 целлюлаэа - индуцибельной фермент,-а ксиланаза - конститутивный. Индуктором целлюлазы является цаллобиоэа, индуцирующий эффект которой возрастал с увеличением концентрации дисахарида в средэ.

Сделан вывод о том, что (3-глюкоэидаэа и ß-ксилозидазы. иссле-. дованных. грибов являются кеЗнститутнввыми ферментами. .'

5. Синтез целлюлазы и ксиланаэы С.unicolor 062 и целлюлазы Р.betulinus ИБК-327 подверженкатаболитиой репрессии глюкозой. Эффективность и продолжительность репрессии синтеза ферментов зависит от концентрации глюкозы и времени ее добавления,в культуру..

6. Акпшомицин д и циклогексимид полностью подавляют синтез целлюлазы. сделан вывод о том, что секреция фермента связана с de novo синтезом целлолазьг в результате индукции.

По., теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Тусишвили Х.А., Циклаури Н-Л- Эндоглюкавазная активность баз^диомицетов. . Материалы, конф. микробиол. Закавказ. респ. '. "Совр. дрстиж., мйкробиол..и биотехлол.Тбилиси, Мецниереба, -1089, . С.

107-108. * . '

- V ■ ■■■ '■■'.-.■■■-.•.-

£2.;SlisEshvili V.l., Zakariasbvili N.G., Kachlishvili Е.Т., JUknadze ЙЛ)., r:rishvili Kh. A.,. Glonti K.M., Pittskhalaishvili D.O.-,- Datuashvili E.A: Regulation of lignocellulolytic activity of basidibnycetes-during bioconversibn of plant -^ubstiartes. Russian Rjochen. Bioteehnol. , 1981» V;,'.P. 91.

;. -'8;. -ТУСИЯВЦЯИ Д. ; Кикяацэе M., Дяохадзд È. ; И.« '.-Датуа

- явили 'е.,, Качлишвили,Е..,'; Элисаивили В. сЦвляялаэаая и кейлавазная • активности ваэидиальнахгрибов при"еиоконварсии обрззхов виноград-

■ ной лозы и.нитрусовьк.отходов. Тезисы докл, II pôcn.' коиф/ "КИКрО-«иология s с/х',, хюйдаев,\Отйида»,"-1891,: b.vlîS

-,.'. у •.•4у.'*:9лнсашв11яи;!>®>И.-.' ■• -.Закаривазвияи-' ,П".Г., ' Качлиашили Е.т., 'Кикиадза М.Оч ".Туситеили X. А.Глонти-;Н.Й,, -Пирпхгхлаишзили, Д.О; .'Ренгуляция лигнонеллилолитической активности базидиоииц^тоз при

■ биоконверси» растительных субстратов. Тез. Докл, "VII Всес. сикп. ' ^^ИЮнивряая.'энэийсм.", îM.V.'yï9^,fv<s'.\31.. .:'••» •

'■f'S';-' В > ieà'4 hv i i i ' -V. -I .v": zakariashv'iii-1 Я Я.'-в;'," Tus.ishvili Kh.A. • Plant ï»H mateïials as theresourcea for lignocellJlol-j-tic enzyaes ' prédu^tion b^ bieidioinyeetes.' "Cellulose' Й1", Raw ûrleari, 1991,

' ■ >.:• „элксашвили В.ît.,. Глонти H.M., Еачлгагвилн Е.Т. , ■ Кикнадзе •• M, О. ; -.'Тусиквкли : X. А., Отбор : .гмсшнх. еази^иомицетоя- V г . продуцентов .."белка и.:ферментов.. Леикл'.' биохимия и ^кррбяоя. i ..1992,' ' - .