Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК

Баранова, Ольга Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК"

На правах рукописи

БАРАНОВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И ИММУНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РНК ИЗ ТИМУСА, СВЯЗАННЫЕ СО СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФРАГМЕНТАЦИЕЙ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ РНК.

03.00.04.-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в лаборатории молекулярной иммунологии НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Бекман Эдит Мироновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Дндковский Николай Антонович доктор биологических наук Степанов Александр Семенович

Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. Н.А.Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова

Зашита состоится «_» 2004 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.057.01 при НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации по адресу: 119992, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1а

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке НИИ физико-химической медицины МЗ Российской Федерации

Автореферат разослан «_» марта 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

М.А.Мурина

Актуальность темы.

Проблема биорегуляции на сегодняшний день является одной из самых актуальных в биологии. В качестве регуляторных факторов в большинстве случаев рассматриваются вещества белковой природы. Однако существуют, хотя и разрозненные, данные о регуляторной функции другого класса макромолекул - РНК, в частности, речь идет о иммунорегуляции. Например, в работе Абрамова В.А с соавт. показано, что РНК, выделенная из головного мозга иммунизированных мышей стимулирует специфический гуморальный иммунный ответ [Абрамов В.А. и др., 1996]. При этом перенос информации осуществляется путём аксоплазматического транспорта, т.е. можно говорить что в данной ситуации РНК осуществляет функцию цитокина. В то же время РНК, полученная от неиммунизированных животных, не обладала указанным эффектом. С другой стороны, предыдущие исследования [Бекман Э.М., ГригорьевМ.Ю. и др., 1985] выявили, что введение экзогенных РНК in vivo и in vitro оказывает влияние на уровень транскрипции, причём, наиболее выраженный эффект вызывают низкомолекулярные РНК ( нмРНК: ~ 8,5-3 S РНК), получающиеся путем специальной- фрагментации (автолиза) высокомолекулярных цитоплазматических РНК (цРНК) [Бекман Э.М., Григорьев М.Ю., и др 1985]. Вполне возможно, что регуляция с помощью РНК включает in vivo механизмы подобные тем, что предложены Чипенсом с соавт. для белковых молекул [ЧипенсГ.И., Веретенникова Н.И. и др., 1990]. Согласно трёхуровневой модели биорегуляции белки синтезируются вначале в виде неактивных предшественников, которые затем путём ограниченного протеолиза превращаются в зрелые биологически активные молекулы. Последние, в свою очередь, с помощью ограниченного протеолиза могут фрагментироваться с образованием более низкомолекулярных регуляторных молекул. Известно, что аналогичная схема биосинтеза наблюдается в клетках для РНК. Есть основания предполагать, что продукты ограниченного пуклеолиза, образование которых прослеживается как in vitro при

расщеплении РНК [Бекман Э.М., Д е

n vivo,

например, при апоптозе клеток [Hou'¿e G., Doskeland S. et al, 1993; Houge G, Robaye В., et al, 1995], тоже играют существенную роль во внутри- и межклеточной регуляции. В этой связи закономерен наш интерес к нмРНК из центрального органа иммунной системы - тимуса - как возможным иммунорегуляторам.

С другой стороны, предварительные исследования, проведённые в нашей лаборатории, показали наличие иммунологической активности в рибонуклеиновых препаратах из тимуса. Эти результаты создают предпосылки для исследования рибонуклеинового препарата как потенциального лекарственного средства.

Цель работы: охарактеризовать физико-химические и иммунно-биологические свойства РНК из тимуса, полученных различными методами, и на этой основе рассмотреть специфическую фрагментацию высокомолекулярных цРНК.

В соответствии с этим поставлены следующие задачи:

1. Разработать адекватные поставленной цели методы выделения РНК из тимуса млекопитающих.

2. Изучить физико - химические свойства препаратов тимусных РНК.

3. Исследовать процесс автолиза тимусных РНК в модельных экспериментах и при апоптозе клеток, а также охарактеризовать получающиеся фрагменты.

4. Провести исследования иммуно-биологических свойств низкомолекулярных РНК из тимуса для выявления специфической активности потенциального фармпрепарата Риботим (РТ), содержащего эти РНК.

Научная новизна.

- В настоящей работе предложена модификация классического «фенольного» метода выделения РНК из тимуса, заключающаяся в осаждении на первой стадии выделения не перешедшего в водную фазу клеточного материала, что позволяет предотвратить выход ДНК в раствор.

- Предложен новый «детергентный» метод выделения РНК из тимуса с использованием в качестве главного денатурирующего агента ДДС - №.

Оценены величины молекулярных масс всех компонентов рибонуклеиновых препаратов из тимуса. Впервые охарактеризованы как «нативные» препараты цРНК, так и препараты с разным уровнем фрагментации высокомолекулярных «зрелых» молекул РНК.

- Исследован и проанализирован процесс автолиза цРНК в сравнении с данными по фрагментации высокомолекулярных «зрелых» молекул РНК при апоптозе лимфолейкозных клеток.

- В качестве основы для создания нового фармпрепарата предложен биоактивный рибонуклеиновый препарат из тимуса - Риботим, обладающий иммунотропными и регенерирующими свойствами.

Практическая значимость работы.

Обнаружение иммунобиологической активности тимусных РНК (и в первую очередь нмРНК) потребовало разработки нового технологичного метода их выделения. Предложенный в данной работе «детергентный» способ выделения РНК из замороженной ткани тимуса крупного рогатого скота позволяет получать препарат РТ в достаточных количествах для проведения доклинических испытаний и может быть внедрён в производство. На этот способ получено положительное решение от 20.08.96. о выдаче патента ВНИИГПЭ на «Средство «Риботим», обладающее иммунотропным действием и способ его получения». В рамках требований Фармкомитета по преклиническим испытаниям проведено исследование специфической активности данного препарата. Показано влияние РТ на Т — зависимое антителообразование и репаративные процессы в коже в моделях экспериментальной раны и ожога у крыс. Эти результаты, наряду с отсутствием острой токсичности при дозе, десятикратно превышающей терапевтическую, позволяют продолжить преклинические испытания РТ.

Проведенная в настоящей работе физико-химическая характеристика позволила получать тимусные рибонуклеиновые препараты определенного

состава и тем самым стандартизовать наработку РТ. В то же время, обнаруженная взаимосвязь между составом и биологической активностью дает возможность по-новому трактовать те биологические эффекты, которые вызывают уже известные препараты экзогенных РНК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Состав препаратов РНК из тимуса крыс, в основном, соответствует аналогичным препаратам из других животных клеток, в частности, из клеток печени и АКЭ мышей. В то же время высокомолекулярные РНК из тимуса в большей степени подвержены специфической фрагментации, которая может проявляться уже в процессе экстракции РНК из ткани.

2. Наблюдаемая фрагментация с различной степенью выраженности происходит воспроизводимым и специфическим образом также в модельных экспериментах автолиза и в условиях индуцированного апоптоза клеток.

3. Фрагментация высокомолекулярных цРНК протекает как многоступенчатый каскадный процесс, который по последовательности этапов и спектрам получающихся фрагментов носит сходный характер при всех исследованных условиях.

4. Образование смеси низкомолекулярных рибонуклеиновых компонентов в препарате Риботим является результатом многоступенчатой специфической фрагментации более высокомолекулярных цРНК. Наблюдаемый ограниченный эндонуклеолиз, по-видимому, имеет биологический смысл, а образующиеся фрагменты проявляют иммунобиологическую активность.

5. Обнаруженные иммуно-биологические свойства Риботима позволяют предложить его в качестве потенциального лекарственного средства со специфической активностью иммунотропного препарата, усиливающего репаративные процессы в коже.

Апробация работы.

1. Материалы, изложенные в диссертационной работе были представлены на Ьом Международном конгрессе по иммунореабилитации, Сочи-Дагомыс,

1994; П-ом Международном конгрессе по иммунореабилитации, Москва, 1995; П-ом Российском конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995; ^ой научной конфередции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», С-Петербург, 2001; \Г-ой Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», С-Петербург, 2002., VII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в журнале «Медицинская иммунология», 2003, т.5, №3-4, с. 191.

Публикации.

По теме диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, включая шесть тезисов докладов и две статьи в центральных журналах.

Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит ПО страниц машинописного текста, 10 таблиц и 18 рисунков. 1. Материалы и методы

РНК выделяли из тимуса крупного рогатого скота, тимуса крыс, клеток АКЭ мышей и из печени мышей.

Выделение препаратов РНК. РНК из печени мышей и клеток асцитной карциномы Эрлиха получали стандартным фенольным методом [Бекман Э.М., Денисенко М.Ф. и др., 1986]. РНК из тимуса мышей получали модифицированным фенольным методом. РНК из тимуса крупного рогатого скота (КРС) выделяли при помощи детергентного метода с применением ДДС-№ в качестве основного денатурирующего агента. [Бекман Э.М., Баранова О Л. и др., 2001].

Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически при 260 нм. Для оценки чистоты препарата измерения оптической плотности проводили также при 230 нм, 270 нм, 280 нм.

Автолитическую деградацию РНК проводили по методике, описанной в работе [Бекман Э.М., ДенисенкоМ.Ф. и др., 1986].

Определение количества РНК основано на модифицированном методе щелочного гидролиза [Бекман Э.М., ГригорьевМ.Ю. и др., 1985].

Электрофорез проводили на приборах для горизонтального и вертикального электрофореза (Белоруссия). Образцы РНК денатурировали в 7М растворе мочевины в формамиде (Merk, ФРГ). Препаративный электрофорез проводили на приборе для горизонтального электрофореза, используя 1,25%-ый агарозный гель. Электрофорез проводили при U=90B. I=45mA. Аналитический электрофорез проводили в ПААГе-7М мочевина 2,5%-ой, 8%-ой и 15%-ой концентрации в приборе для вертикального электрофореза при U=100B и I=55mA.

ЭФ для обнаружения фрагментов белка проводили в 12% ПААГ - ДДС -Na 1,5ч. при U = 100В, I = 55мА. [Остерман ЛЛ, 1983].

Изоэлектрофокусирование препаратов РНК проводили по стандартной методике [Остерман ЛЛ, 1983].

Гель-хроматограФия препаратов РНК. Препарат в количестве 3 мг. наносили на колонку 10x40 см с сефарозой 6В или сефадексом G-100. Элюент 0,2М NaCl. Фракции, собирали для дальнейшего анализа биологической активности.

Оценка уровня фрагментации нуклеиновых кислот в модельной системе проводили на лимфолейкозных клетках Р388 и клетках лимфомы EL4. Клетки извлекали на 7-8 день роста (Р388) и на 10 день (EL4), помещали в среду RPMI-1640 с добавлением ЮмМ HEPES рН=7,2; Юмкг/мл гентамицина и 10% бычьей сыворотки. Клетки инкубировали in vitro при 37°С до 24 ч. при концентрации клеток 1х10б/мл.

Тестирование межнуклеосомной деградации геномной ДНК проводили при помощи электрофореза в 1% агарозе и дифениламиновым (ДФА) методом.

Оценку фрагментации высокомолекулярной РНК при апоптозе проводили при помощи электрофореза в 2,5% ПААГе в денатурирующих условиях.

Определение биологической активности препарата проводили методом локального гемолиза (метод Ерне) [Gerne N.K., Nordin A.A. et al, 1963]. Мышей иммунизировали. 3%-ой суспензией эритроцитов барана внутрибрюшинно (по 0,5мг на мышь). Одновременно с антигеном животным подкожно вводили 0,1мл физиологического раствора (контроль) или исследуемый препарат. Дозы препарата 1,10 и 100 мкг/мышь. На 5-ый день после иммунизации мышей забивали и оценивали количество антителообразующих клеток в селезенке.

Исследование влияния препарата Риботим на репаративные процессы в коже. Препарат применялся как местное мазевое средство в виде гидрогеля на основе Регенкура (модифицированная карбоксиметилцелюлоза) или в форме инкапсулированного в лецитиновые липосомы РТ (200 - 400 мкг. РТ на 1 мл. мази). Степень регенерации кожи оценивали с помощью гистологических исследований биоптатов ран в динамике на 7, 17 и 22 сутки. Эксперименты проводили на моделях ожоговых и неинфицированных линейных ран у крыс.

Достоверность полученных результатов определяли при помощи U -критерия (Манна - Уитни) [Гублгр Е.В., Генкин А.А., 1973J. Результаты оценки выхода и чистоты РТ, а также его биологической активности представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. 2. Основные результаты исследований и их обсуждение. 2.1. Разработка методов выделения РНК из тимуса.

«Фенольный» метод выделения РНК Первоначальная задача заключалась в разработке адекватного поставленной цели метода получения РНК из тимуса. В качестве источника выделения использовали тимус крыс и мышей, а для получения РНК в препаративных количествах применялся тимус крупного рогатого скота. На сегодняшний день хорошо известен и широко используется метод «холодной» фенольной экстракции РНК из различных органов и тканей, в частности, печени, АКЭ и селезенки. Попытка применить классический "фенольный" метод привела к выходу ДНК в водную фазу даже на холоду, что резко повышало вязкость экстракта и делало невозможным дальнейшее выделение РНК. Возможно, данные трудности связаны со

спецификой клеток лимфоидной ткани, в частности тимуса. Воздействие такими сильными денатурирующими агентами, как фенол, быстро разрушает ядерную мембрану, что влечет за собой переход ДНК в раствор.

Удачно подобранной модификацией метода явилось осаждение центрифугированием не перешедших в водную фазу клеточных элементов после гомогенизации. Это позволило предотвратить выход геномной ДНК в водную фазу, и получить достаточное количество материала для изучения физико-химических свойств препаратов цРНК.

В предварительных исследованиях рибонуклеиновые препараты из тимуса проявили биологическую активность, что явилось предпосылкой для исследования их как потенциальных лекарственных средств. Последнее потребовало разработки более технологичного (без применения фенола и хлороформа) метода выделения РНК из тимуса, в связи с чем и был разработан т.н. "детергентный" метод.

"Детергентный" метод выделения РНК. В качестве основпого денатурирующего агента при использовании данного метода был применён додецилсульфат натрия (ДДС-№). Следует отметить, что первоначальная стадия выделения - гомогенизация, проводилась так же, как и при «фенольном» методе. Главное отличие состоит в том, что основным экстрагирующим агентом является детергент ДДС - действие которого способствует разрушению РНП-комплексов и выходу свободной РНК. Параметры выхода РНК, полученных разными методами из различных источников тимуса, суммированы в Табл. 1. Приведённые данные указывают на относительно высокий выход РНК из тимуса крыс при использовании «фенольного» метода. Это позволило получить рибонуклеиновые препараты в количествах, необходимых для изучения их физико-химических свойств. Использование «детергентного» метода приводит к более низкому удельному выходу целевого продукта, однако он вполне пригоден для выделения препаративных количеств РНК, особенно с учетом большого количества исходной биомассы - тимуса КРС.

Выход РНК из тимуса.

Препарат Выход РНК на 1 г исходного материала, мг

РНК тимуса коыс (фенольный 1,91 ±0,25

метод)

РНК тимуса ко.О.ск. С фенольный метол) 1,90 ±0,15

РНК тимуса кр.п.ск, Глетеогентный метод) 1,00±0,10

Таким образом, полученные результаты позволили приступить к физико-химической характеристике тимусных РНК, используя "фенольный" метод получения из тимуса крыс, и исследованию иммуно-биологических свойств, используя "детергентный" метод выделения РНК из тимуса КРС. 2.2. Физико - химическая характеристика препаратов РНК из тимуса.

Опенка чистоты и состава препаратов. Чистота полученных препаратов оценивалась спектрофотометрически по УФ-поглощению при 4 характерных длинах волн: 230нм, 260нм, 270нм, 280нм., а состав препаратов - методом последовательного гидролиза щёлочью, а затем кислотой. Полученные результаты свидетельствуют об удовлетворительной степени очистки препаратов РНК. Так, соотношения D260/280 и D260/230, в основном, не опускаются ниже величины 1,8. Состав выделенных препаратов приведен в Таблице 2.

Табл.2

Соотношение РНК: ДНК: белок

Из представленных результатов видно, что оба метода дают одинаковое содержание целевого продукта (РНК), но наблюдается некоторое перераспределение примесей.

2.3. Исследование препаратов РНК при помощи электрофореза в ПААГе различной процентной концентрации.

Основную информацию о составе рибонуклеиновых тимусных препаратов мы получили с помощью ЭФ в ПААГе. Известно, что применение гелей различной концентрации позволяет более полно оценить размеры отдельных рибонуклеиновых компонентов в смеси. Так, ЭФ в 2,5%-ом ПААГе дает картину всего спектра компонентов в широком диапазоне размеров от 28S РНК до 4S РНК. При этом есть возможность достаточно подробно проанализировать компоненты с молекулярными массами от 1660 до 700 кД (область между 28 и Ж рРНК). При электрофорезе в 8% - и 15%-ном ПААГе высокомолекулярные образцы РНК "не входят" в гель, зато наблюдается лучшее разрешение полос в области молекулярных масс от 63 кД до 16 кД и от 6,8 кД до 3,8 кД, соответственно.

Особенности тимусных рибонуклеиновых препаратов выявляли при сравнении с электрофореграммами цРНК из клеток печени и АКЭ мышей. Необходимо отметить, что ЭФ проводили в денатурирующих условиях (7М мочевина-формамид), при которых электрофоретическая подвижность РНК обратно пропорциональна lgM маркерных РНК [Остерман Л.А, 1983]. Для каждой представленной в работе электрофореграммы был построен график зависимости lgM маркерных РНК от величины ^ (характеризующей электрофоретическую подвижность), и по этому калибровочному графику определены величины РНК-компонентов. Всего было обработано более сорока электрофореграмм по собственным результатам и литературным данным. Исследование препаратов РНК при помощи ЭФ в 2.5% ПААГе в денатурирующих условиях. В этом разделе рассмотрены результаты электрофореза «фенольных» препаратов РНК. В Таблице 3. приведен полный спектр компонентов цРНК из тимуса крыс и КРС, который был выявлен в 2,5%

Табл 3.

Спектр рибонуклеиновых компонентов, полученный при обработке

результатов электрофореза в 2,5% ПААГе.

Коэфф. седимен тяцни. Л"и полосы Молекулярная масса М (кД) Примечания

288 1 1.660 6,22 Маркер

2 1 430 6,16

3 1.340 6,15

4 970 6,03

5 890 5,95

6 720 5,86

185 7 700 5,84 Маркер

8 588 5.75

9 398 5.60

10 347 5,54

11 309 5.49

12 245 5,38

13 210 5.3 ОтеугствлетвРНК тим\са крыс

14 177 5,24

15 148 5.17 Оплтсгв\ет в цР1 ПС печ и РНК тим крыс

16 128 5,10 Огсутств в цРНК печ и V РНК тем крыс

17 112 5,04 Огсутств\ет в иР1[К печени мышей

18 93 4,97 Следовые кол-ва иРНК печ к<ыш, нет в РНК ТИМ крыс

7,65 19 72 4,86

75 20 63 4,80

5,85 21 45 4,64 Маркер

5Э 22 35 4,56 Маркер

4,75 23 32 4,50

45 24 25 4,4 Маркер

Прим. Величина относительной ошибки при определении молекулярных масс получающихся компонентов составляет 2 -4 %

ПААге. Из данных, представленных на Рис 1, видно, что при выделении из свежей ткани тимуса крыс в условиях интенсивной очистки от белковых примесей (дополнительные депротеинизации, обработка ДЭПом и т.п.) получается препарат вполне сопоставимый с цРНК из печени (Рис 1, дорожки а и Ь). В обоих случаях содержатся характерные для нативных препаратов цРНК полосы 28S, Ж, 5S, 5^ и 4S РНК, а также некоторое количество минорных компонентов в области «легче» Ж РНК.

Рис 1. Электрофорез в 2,5% ПААГ

a) РНК печени мышей.

b) РНК тимуса крыс, выделенная фенольным методом.

48РНК

Несколько иную картину можно увидеть при исследовании в этих же условиях препаратов РНК из замороженного тимуса КРС: количества 288 и 188 рРНК снижены относительно аналогичного препарата печени и регистрируется накопление материала в более низкомолекулярной области (Рис 2, дорожка е, полосы 7-19). Другими словами, замораживание-оттаивание исходной биомассы приводит к начальной стадии фрагментации высокомолекулярных цРНК, что и проявляется в изменении ЭФ-картины. Существенно, что размеры продуктов фрагментации во многом совпадают с размерами минорных компонентов «нативных» препаратов (Рис 1, дорожка Ь, Рис 2, дорожка е).

Исследование препаратов РНК при помощи ЭФ в 8%-ом ПААГе в денатурирующих УСЛОВИЯХ. ДЛЯ подробного анализа рибонуклеиновых компонентов с молекулярной массой ниже 63 кД (78-48 РНК) был использован 8%-ый ПААГ. Электрофоретическая картина маркерных РНК подтверждает (Рис 3, дорожка ё), что в указанной области данная концентрация ПААГа дает лучшее разрешение: появляются две дополнительные полосы в промежутке между 78 и 5,88 РНК, и одна в интервале между 5,88 и 58, которые не детектируются в 2,5% - ом ПААГе. Из этого рисунка также следует, что при

а Ь с <1

285 рР|ПС

185 рРНК 8

1«

18 •

5 88РШС 5$ РНК 23

45Р1ПС

Рис. 2. Электрофорез 2,5% ПААГ.

a) Суммарная цРНК печени мышей;

b) Высокомолекулярная фракция цРНК печени мышей;

c) Автолизат образца (Ь) (1ч, 42'С, ЮмМ ); <1) Автолизат образца (Ь) (16 ч., комн. темп.);

е) Суммарная цРНК тимуса кр. рогатого скота, выделенная «фенольным» методом.

a b с d

5,8SPI1K

8 »

5SPIIK 11

4S FlflC

1S 19

Рис. 3. Электрофорез в 8% ПААГ

a) Лвтолизат (120 ч) uPIIK яг АКЭ;

b) Автолшат (72 ч) РНК тимуса крыс, полученный «фенольным» методом;

c) PIIK тимуса крупного рогатого скота, полученная «детергентным» методом;

d) Маркерные нмРНК.

а Ь с (1 е

> ' ' , .V

? г)

п. '1 'ь

* " сч {

г {

1 'I - !,'

' Л 1

I . >

л ( " V

285 рРНК

185 рР1ПС

12 14

1» 20

5.85 РНК 53 РНК 23

45 РНК

Рис. 4. Элекрофорез в 2,5% ПААГ.

a) Автолизат цРНК печени мышей (120 ч., 37°С, ЮмМ

b) Суммарная иРИК печени мышей.

c) Автолизат цРНК тимуса крыс (24 ч., 37°С, ЮмМ

(1) Автолизат цРНК тимуса крыс (48 ч., 37°С, ЮмМ Ме2*). е) Автолизат цРНК тимуса крыс (5 ч., 37°С, ЮмМ

и-

I !

< *

4 1 I

4 I

ЗЯБ РНК 3,6

55 РНК

4$ РНК

14 13

1«

г . ^

Рис. 5. Электрофорез в 15% ПАЛ Г

a) Маркерные нмРНК;

b) Автолизат (72 ч) РНК тимуса крыс, полученной «феиольным» метом;

c) Автолизат (120 ч) цРПК из АКЭ (фенольный» метод); (1) Автолизат (24 ч) РНК тимуса крупного рогатого скота, полученной «детсргентным» методом;

е) Автолизат (72 ч) РНК тимуса крупного рогатого скота, полученной едетергентным» методом;

I) Автолизат (120ч) РНК тимуса крыс, полученной «фенольным» методом.

использовании "детергентного" способа выделения РНК практически не удается обнаружить в препарате высокомолекулярных компонентов (дорожка с). Этот факт, наиболее вероятно, связан с особенностями метода выделения, самой существенной из которых является стадия нагревания до 93°С.

Из приведённых результатов вырисовывается следующая картина. При выделении РНК из различных тканей и разными методами происходит в той или иной степени специфическая фрагментация высокомолекулярных компонентов, причем налицо повышение уровня фрагментации высокомолекулярных образцов РНК (при прочих равных условиях) в ряду РНК из АКЭ->РНК из печепи-»РНК из тимуса. Усиленная фрагментация РНК, выделенных из лимфоидной ткани (по сравнению с цРНК из АКЭ), согласуется с результатами более ранних работ нашей лаборатории, в которых изучали соответствующие РНК из селезёнки и лимфатических узлов [Арион В.Я., Гребцова Л.Б. и др., 1982]. Необходимо отметить, что кроме подтверждения указанного явления на тимусной ткани, в настоящей работе удалось продвинуться в направлении идентификации получающихся фрагментов. Представлена полная характеристика спектров компонентов рибонуклеиновых препаратов при различных условиях выделения из разных источников. С целью моделирования процессов фрагментации РНК во время выделения из тимусной ткани были предприняты эксперименты по изучению этого процесса в модельных системах

Фрагментация высокомолекулярных образцов цРНК при автолизе. Данный раздел посвящен фрагментации высокомолекулярных цРНК в модельных системах при условиях, приближенным к физиологическим (см. Материалы и методы). При инкубации РНК в этих условиях наблюдается так называемый автолиз, сопровождающийся многоступенчатым

эндонуклсолитическим расщеплением высокомолекулярных образцов РНК, который, в конечном счёте, приводит к образованию смеси относительно низкомолекулярных РНК - фрагментов [Бекман Э.М., Денисенко М.Ф. и др.,

1986]. Прежде всего было показано, что при автолизе «фенольного» цРНК из тимуса крыс («нативный» препарат) в стандартных условиях в течение 24 часов получается смесь РНК с молекулярными массами от ~ 300 кД до ~ ЮкД, а при 48-часовом автолизе - с молекулярными массами от ~ 100 кД до ~ 10 кД (Рис 4, дорожки end, соответственно). Необходимо отметить, что аналогичный спектр компонентов из цРНК печёночной ткани мышей образуется через 120ч. автолиза (Рис 4, дорожки а и d).

Исследования автолизатов РНК, выделенных «детергентным» методом показали, что образующиеся при высоком уровне автолиза фрагменты имеют молекулярные массы менее 25кД (т.е. «легче» 4S РНК), и для их более чёткого разделения необходим ЭФ в ПААГе более высокой (чем 8,%) концентрации. С этой целью проведены эксперименты в 15% ПААГе. Показано, что после 24-часового автолиза «детергентной» РНК полосы в области тяжелее 4S РНК практически совпадают с картиной автолиза РНК из тимуса крыс и АКЭ, а в области легче 4S РНК появляется ряд дополнительных полос (или усиливаются имеющиеся, (Рис 5, дорожки Ь, с, d)). На данном рисунке также видно, что при более длительном автолизе наблюдается дальнейшая фрагментация с накоплением смеси фрагментов «легче» 4S РНК.

Рассмотренные выше эксперименты в модельной системе ставились с суммарными препаратами РНК, и процесс фрагментации высокополимерной РНК прослеживался путём сравнения ЭФ-грамм на соответствующих стадиях автолиза. Однако, несомненно, важно было показать «прямое» превращение высокомолекулярных цРНК в более низкомолекулярные. Опыт был проведён с использованием цРНК из печени мышей как наиболее хорошо изученного образца цРНК из животных клеток. Высокомолекулярные цРНК элюировали из 1%-го агарозного геля после проведения препаративного ЭФ подвергали автолизу, а затем проводили ЭФ в_2,5%-ом ПААГ - 7М мочевина. Показано, что автолиз препарата, содержащего, в основном, 28S рРНК, в течение 2 и 3 часов при 37°С не приводит к каким - либо видимым изменениям в электрофореграммах. В то же время после инкубации при 42°С в течение 1 часа

проявляются начальные стадии фрагментации высокомолекулярных цРНК, а после автолиза в течение 16 часов исходные полосы исчезают, и весь материал сосредотачивается в области РНК с молекулярными массами менее 400 кД (Рис 2, дорожки b,c,d). Примечательно, что многие из детектируемых полос (дорожка d) совпадают с теми, что обнаруживаются в автолизатах суммарных цРНК и частично автолизованных при выделении цРНК КРС (Рис 2, дорожка е, Табл 2., полосы 8,9,12-15, 20-21). Это свидетельствует об определенной универсальности процесса фрагментации.

При сравнении продуктов автолиза цРНК из АКЭ, печени и тимуса установлено, что спектры компонентов в автолизатах РНК из различных животных клеток практически перекрываются. Однако здесь также прослеживается вышеупомянутая тенденция: тимусные РНК фрагментируют существенно быстрее, чем цРНК из печени и АКЭ. Так, для получения сходных по составу автолизатов в случае тимусной цРНК требуется в 2 -2,5 раза меньше времени, чем при автолизе двух других препаратов (Рис 4, дорожки a и d; Рис 3, дорожки а и b). Если принять, что специфическая фрагментация при автолизе в какой-то мере моделирует процессы эндонуклеолитического расщепления при катаболизме РНК in vivo [Бекман Э.М., Григорьев М.Ю., 1988], то разница в скоростях фрагментации может быть связана со спецификой метаболизма РНК в разных клетках.

Не следует забывать, что в живых клетках РНК существует и функционирует в виде рибонуклеопротеидных комплексов (РНП). Так как при изучении тимусных препаратов мы всегда обнаруживали некоторое количество белковых примесей (даже после интенсивных процедур депротеинизации), то представляется информативным сравнить электрофоретические свойства белковых и РНКовых компонентов в одинаковых условиях.

Анализ белковых компонентов в препаратах РНК с помощью ЭФ в 12%-ом ПААГе в денатурирующих условиях. Следующая серия экспериментов выполнена для оценки размеров тех белковых компонентов, которые были обнаружены при анализе состава рибонуклеиновых препаратов. Нужно

отметить, что если в случае с "фенолыюй" РНК при электрофорезе практически не выявлено белковых компонентов, то в случае с "детергентной" РИК во всем спектре молекулярных масс (от 76кД до 12,5кД) детектировались белковые полосы. При этом у 8 из 20 белковых компонентов электрофоретическая подвижность совпадала с аналогичной величиной РНКовых компонентов. Вероятно, эти РНК-белковые связи настолько прочны, что ни процедура выделения, ни последующая обработка при денатурирующем электрофорезе не могут их полностью разрушить. Скорее всего, присутствие этих белков носит не случайный характер, а они являются частью РНП, в составе которых изучаемые РНК функционируют в живых клетках.

В последнее десятилетие в литературе появились данные о том, что при различных «критических» событиях в животных клетках: апоптоз, инфицирование вирусами, воздействие токсических агентов и т.п., происходит специфическое расщепление «зрелых» цРНК в составе РНП-комплексов; в случае 288 рРНК - в составе рибосом. Мы обратили внимание на то, что процесс этой фрагментации носит сходный характер с тем, что наблюдается при автолизе и экстракции РНК из ткани. Отсюда возникла идея сравнить процессы фрагментации высокомолекулярных цРНК при автолизе препаратов РНК, с одной стороны, и при апоптозе во время культивирования клеток - с другой.

2.4. Специфическая фрагментация нуклеиновых кислот при апоптозе.

В этой серии экспериментов использовали модельную тест-систему культивирования клеток ЕЬ4. Наличие индуцированного апоптоза устанавливали по показателям уровня межнуклеосомной деградации ДНК. Из интактных клеток выделяли цРНК, подвергали их автолизу и анализировали в денатурирующем ПААГ-электрофорезе. Полученные ЭФ-картины сравнивали с аналогичными ЭФ-картинами цРНК, экстрагированных из культивируемых клеток после индукции апоптоза. Продемонстрировано, что как при апоптозе, так и при автолизе, процесс фрагментирования начинается с эндонуклеолитического расщепления 288 рРНК и накопления фрагментов с

молекулярными массами 1340 (1380), 1100, 970, 890, 600 и 400кД, а далее происходит многоступенчатый эндонуклеолиз этих фрагментов с образованием более низкомолекулярных компонентов.

Рассмотренная в предыдущем разделе фрагментация высокомолекулярных образцов при выделении цРНК из тимуса происходит по аналогичной схеме. При относительно мягких условиях выделения частично фрагментирует 288 рРНК и накапливаются «средние» молекулы; при переходе к «жёстким» условиям - резко усиливается фрагментация «тяжёлых» и «средних» молекул и детектируется накопление низкомолекулярных компонентов. Таким образом, можно констатировать, что при выделении из ткани, при автолизе и при апоптозе клеток мы имеем дело с одними и теми же закономерностями специфического эндонуклеолитического расщепления РНК.

Одно из важных наблюдений при изучении размеров компонентов тимических рибонуклеиновых препаратов: спектры всех возможных фрагментов, образующихся в результате эндонуклеолиза при выделении из ткани и в модельных системах, в основном, совпадают. И более того, данное совпадение характерно и для аналогичных препаратов из других животных клеток (АКЭ, печени).

В этой связи весьма информативным выглядит сравнение размеров фрагментов высокомолекулярных цРНК, полученных в наших экспериментах, с размерами продуктов фрагментации тех же РНК в работах других исследователей. Анализ этих данных показывает, что, несмотря на совершенно различные причины, вызвавшие фрагментацию 288 рРНК, спектры получающихся фрагментов в значительной степени «перекрываются». Другими словами, во всех упомянутых случаях происходит воспроизводимым образом специфический эндонуклеолиз, и места разрывов фосфодиэфирных связей в цепи РНК, вероятнее всего, предопределены структурой этих РНК. В то же время, скорость фрагментации может зависеть от многих факторов: рН и ионный состав среды, температуры, присутствие определенных белков и т.п.

Таким образом, на примере 288 рРНК высвечивается общность процессов специфической фрагментации молекул цРНК, а также возникает вопрос о биологическом смысле такой фрагментации. По данным литературы, она может быть связана с клеточной биорегуляцией; в частности, расщепление 288 рРНК при апоптозе клеток выполняет регуляторную роль, влияя на биосинтез бежа [Houge G, DoskelandS. et ai, 1993; Houge G, Robaye В., et al., 1995]. Не меньший интерес должна вызывать другая сторона фрагментации - возможная биологическая роль получающихся фрагментов. 2.5. Иммуно-биологические свойства препаратов РНК из тимуса.

Характеристика иммунонологической активности в тесте Ерне. Для оценки иммунологической активности РНК из тимуса был использован метод локального гемолиза (тест Ерне), который позволил определить влияние препаратов на Т - зависимое антителообразование на пике иммунного ответа. Были испытаны препараты, различающиеся по составу РНК-компонентов, и показано, что при дозе Юмкг/мышь индексы стимуляции (I) составляют: для «нативного» препарата из тимуса крыс (1660-25кД) - 1,3+0,1; для его автолизатов (1 сут. и 3 сут.) - 1,6+0,1 и 2,1+0,2; соответственпо. Эффект «детергентного» препарата РТ, аналогичного по составу трехсуточному автолизату (24 компонента, 56-5кД), значимо не отличается: 1=2,3+0,3. В то же время препарат с молекулярными массами РНК компонентов от 14 до 5кД практически не активен: 1=1,1+0,1. Из этих результатов следует: при фрагментации высокомолекулярных компонентов с образованием определенного набора нмРНК происходит усиление иммунологической активности. Состав препарата РТ оптимален для выявления иммунорегуляторной функции РНК.

В отдельной серии экспериментов изучали зависимость эффекта стимуляции от дозы препарата РТ. Установлено, что стимуляция достоверно усиливается с повышением дозы от 0 до 10 мкг/мышь; а при дальнейшем увеличении дозы эффект возрастает незначительно (Рис 6А). Испытания низкомолекулярной фракции РТ (14-5кД) показали, что она не проявляет

иммунологической активности при дозах 1 и 10 мкг/мышь, а при дозе 100 мкг/мышь оказывает слабое стимулирующие действие (Рис 6Б; индекс стимуляции -1,2).

•■I-1---■————I—

Рис.6. Иммунологическая активность в тесте Ерне препарата Риботим из тимуса, содержащих спектр компонентов с молекулярными массами: А) От бОкД (при всех дозахр<0,01 по сравнению с контролем) ?

Б) Менее 12кД (при дозах 1 и 10 мкг/мышь р>0,05, при дозах ЮОмкг/мишь р<0,05 по сравнению с контролем).

Таким образом, результаты иммунологического тестирования выявили, что получение иммуноактивного препарата РТ связано со специфической фрагментацией «зрелых» РНК, а также, что есть некий нижний предел размеров нмРНК, способных существенным образом усиливать специфический иммунный ответ.

Исследование влияния препарата Риботим на репаративнъте процессы в коже. В качестве экспериментальной модели процессов регенерации были выбраны послойная неинфицированная линейная рана и ожоговая рана у крыс. Препарат применялся как местное мазевое средство в виде гидрогеля (на основе Регенкура) или в форме инкапсулированного в липосомы Риботима. Для объективизации результатов регенерации кожи был выбран гистологический метод исследования биоптатов ран в динамике на 7,17 и 22 сутки.

Эксперименты выявили в обеих моделях положительный эффект применения РТ для ускорения процессов регенерации кожи. Так, в случае линейных ран установлен ряд существенных отличий в опытных группах животных по сравнению с контрольными: происходит более быстрая эпитализация ран, наблюдается большая зрелость грануляционной ткани и в нарастающем эпителии обнаруживаются волосяные фолликулы.

Результаты применения РТ при ожоговых ранах указывают па то, что, как и в случае линейных ран, РТ вызывает значительное улучшение созревания соединительной ткани в ране. Попутно можно отметить различия, касающиеся ускоренного образования луковиц волосяных фолликулов в области применения мази с РТ. Полученные данные хорошо согласуются с результатами проведённого параллельно в нашей лаборатории исследования ожоговой болезни у крыс, получивших обширные термические ожоги [Семочкин СВ., Бекман Э.М. и др., 2001]. В этих экспериментах было продемонстрировано, что действие РТ на заживление ран коррелирует с влиянием на иммунологические показатели травмированных животных (восстановление миграционной способности лимфоцитов и функциональной активности фагоцитов), что, в конечном счёте, приводит к существенному сокращению сроков и улучшению «качества» процесса рубцевания.

Выводы.

1. Для экстракции РНК из тимуса предложена модификация классического «фенольного» метода, а также разработан новый, технологичный «детергентный» способ выделения. Показано, что оба метода позволяют получить рибонуклеиновые препараты удовлетворительной чистоты: содержание РНК - 90+3,5% в случае «фенольного» и 90+3,2% в случае «детергентного» методов выделения, количество ДНК - 8,5+0,9% и 5,0+0,8%, белка-1,5+0,5% и 5,0+0,4%, соответственно.

2. При помощи денатурирующего электрофореза в ПААГе 2,5%-, 8%- и 15%-ой концентраций подробно охарактеризовано распределение молекулярных масс компонентов тимусных рибонуклеиновых препаратов. Выявлены существенные различия в размерах компонентов в зависимости от способа получения: «фенольный» препарат цРНК представлен спектром компонентов в диапазоне от 288 до 48, тогда как в «детергентном» все компоненты находятся в области «легче» 78 РНК.

3. Продемонстрировано, что как во время автолиза в модельных экспериментах, так и при выделении РНК из ткани тимуса происходит

специфический ограниченный эндонуклеолиз высокомолекулярных образцов цРНК, и в ходе многоступенчатой фрагментации образуется смесь низкомолекулярных компонентов. Аналогичная картина наблюдается при индукции апопттоза во время культивирования клеток ЕЬ4.

4. Впервые в данной работе исследован автолиз не только в суммарных препаратах цРНК, но и в препаратах высокомолекулярных цРНК, экстрагированных из геля после электрофореза.

5. По элсктрофоретическим данным рассчитаны молекулярные массы компонентов рибонуклеиновых препаратов из тимуса и печени, а также продуктов фрагментации высокомолекулярных образцов цРНК. Сравнительный анализ спектров получаемых фрагментов и динамики фрагментации выявил общность процессов ограниченного эндонуклеолиза при самых различных условиях: выделение РНК из ткани, автолиз РНК, апоптоз клеток.

6. Показано, что тимический препарат Риботим обладает иммунобиологической активностью. Препарат достоверно повышает уровень Т -зависимого антителообразования на пике иммунного ответа в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мышь. Установлен дозозависимый характер действия препарата. Отмечено также положительное действие Риботима на репаративные процессы в коже: наблюдается значительное ускорение и улучшение «качества» заживления как в случае экспериментального ожога, так и в модели линейной раны у крыс.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Баранова О.А., Луканидина Т.А. «Новый иммунотропный препарат рибонуклеиновой природы из тимуса», Сборник трудов 1-го Международного конгресса по иммунореабилитации, Сочи - Дагомыс, 1994, с. 47.

2. Козодоев В.О., Баранова О.А., Бекман Э.М., Арион В.Я. «Комплексный подход к лечению аллергодерматоза», Сборник трудов 1-го Международного конгресса по иммунореабилитации, Сочи - Дагомыс, 1994, с. 77.

3. Бекман Э.М., Баранова О.А., Кассин В.Ю., Арион ВЯ. «Новый иммунотропный препарат из тимуса телят влияет на репаративные процессы в коже», Сборник трудов И-го Всероссийского Национального конгресса «Человек и лекарство», Москва, 1995, с. 55.

4. Сёмочкин СВ., Бекман Э.М., Баранова О.А., Арион ВЯ. «Регуляторпое влияние риботима на функциональную активность нейтрофилов при экспериментальной ожоговой травме», Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, т.131, №3, с. 306-309.

5. Сёмочкин СВ., Бекман Э.М., Баранова О.А., Арион ВЯ. «Иммунокоррекция препаратами тимуса компенсирует нарушения функциональной активности фагоцитов крыс после ожоговой травмы», Материалы V Региональной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в журнале «Медицинская иммунология», 2001, т.З, №2, с. 304.

6. Бекман Э.М., Баранова О.А., Власенко Р.Я., Арион В.Я. «Низкомолекулярные РНК из тимуса и их влияние на Т-зависимое антителообразование», Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, т.131, №10, с. 419-423.

7. Бекман Э.М., Баранова О.А. «Получение иммунотропного рибонуклеинового препарата из Риботим связано со специфической фрагментацией высокомолекулярных цитоплазматических РНК из тимуса», Материалы VI Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в журнале «Медицинская иммунология», 2002, т.4, №2, с. 348.

8. Бекман Э.М., Баранова ОЛ. «Общность путей фрагментации высокомолекулярных цитоплазматических РНК при апоптозе животных клеток и при автолизе препаратов РНК», Материалы VII Всероссийского научного форума с международным участием имени академика В.НИоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» в журнале «Медицинская иммунология», 2003, т.5, №3-4, с. 191.

Принято к исполнению 23/03/2004 Исполнено 24/03/2004

Заказ № 99 Тираж:75 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

- ß 3 2 (Г

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Баранова, Ольга Александровна

Список сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Многоуровневая система биорегуляции.

1.2. Рибонуклеиновые кислоты в регуляции процессов па уровне целостного организма.

1.2.1. Рибонуклеиновые кислоты в системе биорегуляции.

1.2.2. Рибонуклеиновые кислоты как модуляторы иммунного ответа.

1.2.3. Влияние экзогенных РНК на фенотипические свойства лимфоидных клеток.

1.3. Рибонуклеиновые кислоты в регуляции внутриклеточных процессов.

1.3.1. Влияние нмРНП на основные процессы, происходящие в клетке.

1.3.2. РНК—РНК взаимодействия и общность процессов эндонуклеотического расщепления РНК.

1.4. Роль эндонуклеотического расщепления высокомолекулярных цРНК.

1.4.1. Расщепление 28SрРНК при аутоиммунной патологии.

1.4.2. Фрагментация 28SрРНК в модельных системах при апоптозе.

1.4.2.1.В клетках нервной системы.

1.4.2.2. В опухолевых клетках.

1.4.3. Иные случаи фрагментации 28SpPIIK.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК"

Актуальность темы.

Общеизвестна важная роль, которую играет РНК в жизнедеятельности как отдельных клеток, так в цельном организме животных. Наиболее хорошо изучено участие различных классов РНК в реализации генной экспрессии при транскрипции, процессинге, трансляции и, соответственно, наиболее полно охарактеризованы рибосомные, матричные, транспортные РНК и их предшественники. В меньшей степени понятны функции стабильных ядерных и цитоплазматических низкомолекулярных РНК/РНП (нмРНК/нмРНП). И совсем мало изучена роль нмРНК, получающихся при фрагментации высокополимерных образцов клеточных РНК, в особенности это касается «зрелых» цитоплазматических РНК. В лаборатории молекулярной иммунологии НИИ ФХМ в течение длительного времени проводятся исследования РНК из различных органов и тканей животных и опубликованы существенные результаты по свойствам РНК из таких животных клеток как АКЭ, печень, селезенка, лимфотические узлы [3,5,6]. В этих исследованиях убедительно показано, что всем известная нестабильность максимально очищенных от примесей высокомолекулярных РНК, выражающаяся в потере «нативности» молекул РНК при различных манипуляциях в растворах (в том: числе, при экстракции из ткани и хранении) связана со специфическими эндонуклеолитическими расщеплениями этих РНК. При этом совокупность получающихся данных свидетельствует в пользу того, что места разрыва фосфодиэфирных цепей предопределены структурой фрагментирующих РНК. Настоящая диссертационная работа является продолжением этой серии исследований: в ней впервые систематически изучены свойства РНК из тимуса с позиций влияния специфической фрагментации на физико-химические и биологические свойства РНК, экстрагированных из этой ткани. Актуальность данного направления исследований получила подтверждение в появившихся относительно недавно публикациях об обнаружении специфического ограниченного эндонуклеолиза «зрелых» цРНК (прежде всего 28S рРНК) в животных клетках при самых различных экспериментальных условиях: индукция апоптоза, инфицирование вирусами, аутоиммунные состояния и т.п. Авторы этих публикаций активно обсуждают регуляторную роль наблюдаемой специфической фрагментации цРНК. Совсем недавно появились данные о «неканонических» свойствах РНК и РНП: обнаружение опухолевой РНК в плазме человека, РНК плода в материнской плазме, наличие аутоантигеных свойств у ядерных U-PHK и малых цитоплазматических Y РНК

48,60,61,114,115,119,132], которые позволяют рассматривать проблему фрагментации высокомолекулярных РНК не только с фундаментальной точки зрения, но и придают этой тематике прикладное значение.

Другой предпосылкой для выполнения представленной диссертации явились довольно многочисленные, хотя и разрозненные, данные о биологической активности экзогенных рибонуклеиновых препаратов как in vivo, так и in vitro [8,10,11,18,29,30,31]. В том числе есть ряд свидетельств о влиянии экзогенных РНК из тимуса на различные внутриклеточные процессы в животных клетках, а так же и на некоторые процессы, происходящие на уровне организма. В частности, показано, что тимусная РНК обладает способностью переносить иммунологическую информацию от клетки к клетке, причем фракцией, ответственной за иммуностимуляцию, оказалась низкомолекулярная (4S-6S) РНК [11,108]. Однако нет ясности в понимании механизмов наблюдаемых явлений, а также отсутствует однозначное мнение о том, какие именно РНК ответственны за тот или иной биологический эффект (в одних работах речь шла о высокомолекулярных «нативных», предположительно матричных РНК [20,29,30,31], в других — о нмРНК [108]. Из всего вышесказанного вытекают цели и задачи данной работы.

Цель работы: охарактеризовать физико-химические и иммунобиологические свойства РНК из тимуса, полученных различными методами, и на этой основе рассмотреть специфическую фрагментацию высокомолекулярных цРНК.

В соответствии с этим поставлены следующие задачи:

1. Разработать адекватные поставленной цели методы выделения РНК из тимуса млекопитающих.

2. Изучить физико - химические свойства препаратов тим.усных; РНК.

3. Исследовать процесс специфической фрагментации тимуснот,; РНК в процессе экстракции из ткани, в модельных экспериментам in vitro и при индукции автолиза, а также охарактеризовать получающиеся фрагменты.

Научная новизна.

- Предложены новые экспериментальные подходы для экстракции РНК с учетом специфики тимусной ткани.

Практическая значимость работы.

Обнаружение иммунобиологической активности тимусных РНК (и в первую очередь нмРНК) потребовало разработки нового технологичного метода их выделения. Предложенный в данной работе «детергентный» способ выделения РНК из замороженной ткани тимуса крупного рогатого скота позволяет получать препарат РТ в достаточных количествах для проведения доклинических испытаний и может быть внедрён в производство. На этот способ получено положительное решение от 20.08.96. о выдаче патента ВНИИГПЭ на «Средство «Риботим», обладающее иммунотропным действием и способ его получения». В рамках требований Фармкомитета по преклиническим испытаниям проведено исследование специфической активности данного препарата. Показано влияние РТ на Т - зависимое антителообразование и репаративные процессы в коже в моделях экспериментальной раны и ожога у крыс. Эти результаты, наряду с отсутствием острой токсичности при дозе, десятикратно превышающей терапевтическую, позволяют продолжить преклинические испытания РТ.

Проведенная в настоящей работе физико-химическая характеристика позволила получать тимусные рибонуклеиновые препараты определенного состава и тем самым стандартизовать наработку РТ. В то же время, обнаруженная взаимосвязь между составом и биологической активностью дает возможность по-новому трактовать те биологические эффекты, которые вызывают уже известные препараты экзогенных РНК.

Положения, выносимые на защиту.

1. Состав препаратов РНК из тимуса крыс, в основном, соответствует аналогичным препаратам из других животных клеток, в частности, из клеток печени и АКЭ мышей. В то же время высокомолекулярные РНК из тимуса в большей степени подвержены специфической фрагментации, которая < может проявляться уже в процессе экстракции РНК из ткани.

4. Образование смеси низкомолекулярных рибонуклеиновых компонентов в препарате РНК из тимуса - Риботиме - является результатом многоступенчатой специфической фрагментации более высокомолекулярных цРНК. Наблюдаемый ограниченный эндонуклеолиз, по-видимому, имеет биологический смысл, а образующиеся фрагменты проявляют иммунобиологическую активность.

Апробация работы.

Материалы, изложенные в диссертационной работе были представлены на 1-ом Международном конгрессе по иммунореабилитации, Сочи-Дагомыс, tm 1994; П-ом Междунородном конгрессе по иммунореабилитации, Москва, 1995; П-ом Российском конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 1995; V-ой научной конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге», С-Петербург, 2001; VI-ой Всероссийской конференции «Дни иммунологии в Санк-Петербурге», С-Петербург, 2002, VII-ом Всероссийском нучном форуме с международным участием им. академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санк-Петербурге», С-Петербург, 2003. Публикации.

Структура и объём диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 116 страниц машинописного текста, 11 таблиц и 19 рисунков.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Баранова, Ольга Александровна

Выводы.

L Для выделения РНК из тимуса предложена модификация классического «фенольного» метода, а также разработан новый, технологичный способ выделения с применением ДДС - Na в качестве основного денатурирующего агента. Показано, что оба метода позволяют получить рибонуклеиновые препараты удовлетворительной чистоты: ъортношениг PHK'AW ' бепок составило, 00% :3,Sy. • ll90 г/о :соот&ргпс/7?в.енУО'.- ~ . ' !. . '' . - . .' -л

2. При помощи денатурирующего электрофореза в ПААГе 2,5%-, 8%- и 15%-ой концентраций подробно охарактеризовано распределение молекулярных масс компонентов тимусных рибонуклеиновых препаратов. Выявлены существенные различия в размерах компонентов в зависимости от способа получения: «фенольный» препарат цРНК представлен спектром компонентов в диапазоне от 28S до 4S, тогда как в «детергентном» все компоненты находятся в области «легче» 7S РНК.

3. Продемонстрировано, что как во время автолиза в модельных экспериментах, так и при выделении РНК из ткани тимуса происходит специфический ограниченный эндонуклеолиз высокомолекулярных образцов цРНК, и в ходе многоступенчатой фрагментации образуется смесь низкомолекулярных компонентов. Аналогичная картина наблюдается при индукции апоп тоза во время культивирования клеток EL4.

5. По электрофоретическим данным рассчитаны молекулярные массы компонентов рибонуклеиновых препаратов из тимуса и печени, а также продуктов фрагментации высокомолекулярных образцов цРНК. Сравнительный анализ спектров получаемых фрагментов и динамики фрагментации выявил общность процессов ограниченного эндонуклеолиза при самых различных условиях: выделение РНК из ткани, автолиз РНК, апоптоз клеток.

6. Показано, что химический препарат Риботим обладает иммунобиологической активностью. Препарат достоверно повышает уровень Т -зависимого антителообразования на пике иммунного ответа в диапазоне доз от 1 до 100 мкг/мышь. Установлен дозозависимый характер действия препарата. Отмечено также положительное действие Риботима на репаративные процессы в коже: наблюдается значительное ускорение и улучшение «качества» заживления как в случае экспериментального ожога, так и в модели линейной раны у крыс.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Баранова, Ольга Александровна, Москва

1. Абрамов В.В., Абрамова Т.Я. Ассиметрия нервной, эндокринной и иммунной систем. Новосибирск, «Наука», 1996, с 25-29.

2. Абрамов В.В., Егоров Д.Н., Вердосанидзе К.В., Козлов В.А. Нервная и иммунная системы в канцерогенезе. Новосибирск, 1998, с 27-30.

3. Арион В.Я., Гребцова Л.Б., Короткова М.Н., Бекман Э.М. Обнаружение «скрытых» рибонуклеаз в высокоочищенных препаратах РНК. Молекулярная биология, 1982, т. 16, с. 201-209.

4. Арион В.Я., Зимина И.В., Лопухин Ю.М. Современные взгляды на природу и клиническое использование тимических препаратов. 1997. Russ. J. Immun. v. 2, p. 157-166.

5. Бекман Э.М., Григорьев М.Ю., Гутникова М.Н. и др. Аутолитическая деградация РНК: влияние аутолизатов и нативных препаратов пре мРНК на уровень транскрипции в модельных системах in vitro и in vivo. Биохимия. 1985, т. 50, с. 1843-1851.

6. Бекман Э.М., Денисенко М.Ф., Григорьев М.Ю., Арион В.Я. Автолитическая деградация РНК: влияние различных факторов на динамику процесса. Молекулярная биология., 1986, т. 20, с. 527-535.

7. Бекман Э.М., Григорьев М.Ю. Рибозимы: РНК РНК-взаимодействия и эндонуклеолитическое расщепление. Успехи биологической химии., 1988, т. 29, с. 113-121.

8. Белоус A.M., Годин A.M., Панков Е.Я. Экзогенные нуклеиновые кислоты и восстановительные процессы. М., Медицина, 1974.

9. Белохвостое А.С., Климов Н.А. Участие нуклеиновых кислот в иммунном ответе. Успехи современной биологии, 1980, т. 89, с. 189-204.

10. Блинов М.Н., Луганова И.С. Рибонуклеиновые кислоты как модуляторы иммунного ответа. В сб. Молекулярные механизмы клеточного гомеостаза. Новосибирск, «Наука» 1987, с. 182-195.

11. Блинов М.Н., Луганова И.С., Владимирова А.Д., Бубнов А.Н. Влияние ксеногенной тимусной РНК на пролиферацию лимфоцитов больныххроническим лимфолейкозом. В кн.: Труды I Всероссийского съезда гемотологов и трансфизиологов. Ленинград, 1980, с. 27-29.

12. Волков Е.М., Полежаев Г.И. Влияние денервации и возможные механизмы нейротрофического контроля хемочувствительной и электрогенной мембран скелетных мышечных волокон. Успехи физиологических наук. 1982. т. 13, №3, с. 9-30.

13. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. JL, Медицина 1973. с. 136.

14. Дудич Е.И., Семенкова JI.H., Дудич И.В., Николаева М.А., и др. Изучение процесса апоптоза раковых клеток, индуцированного а-фетопротеином. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2000, т. 130, №12, с. 604-612.

15. Евтеева И.Н., Куличкова В.А., Миттенберг А.Г., Волкова И.В. Новая эндорибонуклеазная активность 268-протеосом из клеток линии А-431. Цитология. 2000, т. 42, №7, с. 675-679.

16. Егорова М.В., Шапошникова В.В., Нариманов А.А., Кудрявцев А.А., и др. Действие экстракта из корней синюхи голубой (polemonium coeruleum L.) на опухолевые клетки. Российский онкологический журнал. 1998, №1, с. 45-48.

17. Земсков В.М., Лидак М.Ю., Земсков В.М., Микстайс У.Я. Низкомолекулярная РНК: получение, гидролиз и применение в медицине. Рига. 1985.

18. Ильницкая С.И. Фенотипическая модификация опухолевых клеток под влиянием экзогенных РНК. Автореферат дисс. канд. биол. наук., Новосибирск. 1988.

19. Ильницкая С.И., Николин В.П. Повышение противоопухолевой резистентности мышей путём антигенной модификации опухолевых клеток препаратами РНК. Экспериментальная онкология. 1993, т. 15, №3, с. 36-39.

20. Константинова И.М., Волкова И.В., Евдонин A.JI., Ермолаева Ю.Б. и др. Тканеспецифичность субъединичного состава и ЭФР-зависимые измерения набора субъединиц 208-протеасом. Цитология. 2000, т. 42, №7, с. 665-668.

21. Константинова И.М., Ветцкер Р., Петухова О.А., Чесноков И.Н. Онтогенез. 1997, т. 28, с. 171-177.

22. Куличкова В.А., Волкова И.В., Туроверова Л.В., Евтеева И.Н. Специфические ДНК-связывающая и эндорибонуклеазная активности прочно связанных с хроматином малых РНП. Молекулярная биология. 1999, т. 33, №5, с. 764-771.

23. Миттенберг А.Г., Куличкова В.А., Медведева Н.Д., Волкова И.В. и др. Характеристики эндорибонуклеазной активности протеасом из клеток линии К562. II. Анализ нуклеолиза специфических мРНК протеасомоми. Цитология. 2002, т. 44, №4, с. 357-363.

24. Невинский Г.А., Канышкова Т.Г., Бунева В.Н. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии. Биохимия. 2000, т. 65, вып. 11, с. 1473-1487.

25. Николин В.П. Экспериментальное и клиническое исследование противоопухолевого действия препарата рибонуклеиновой кислоты. Автореферат дисс. канд. мед. наук. Новосибирск. 1973.

26. Николин В .П., Ильницкая С.И., Вишневецкий С.Н., Мертвецов Н.П. Влияние экзогенной поли (А)+мРНК на антигенные свойства и рост клеток опухоли Кребс-2. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1992.

27. Николин В.П., Ильницкая С.И., Попов Н.А., Мертвецов Н.П. Индукция наследуемых изменений в антигенной структуре опухолевых клеток экзогенной поли (А)+мРНК. Экспериментальная онкология. 1994, т. 16, с. 335-341.

28. Пальцев А.А. Полиморфно-ядерные лейкоциты. В кн. Воспаление. Руководство для врачей. Под редакцией Серова В.В., Паукова B.C. М., Медицина, 1995, 640 с.

29. Сёмочкин С.В., Каргина И.Б., Бекман Э.М., Арион В.Я. «Иммунокоррекция препаратами тимуса при экспериментальной ожоговой травме», International J. on Immunorehabilitation, 1999, №12.

30. Саркисов Д.С., Пальцин А.А., Колкер И.И. Архив патологии. 1986. №12. с. 6-13.

31. Сёмочкин С.В., Бекман Э.М., Баранова О.А., Арион В.Я. «Регуляторное влияние риботима на функциональную активность нейтрофилов при экспериментальной ожоговой травме», Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 2001, т.131, №3, с. 306-309.

32. Слепцова JI.A., Аксёнова Н.Н., О межклеточной передаче информации в процессе иммуногенеза. IV. Сравнительная характеристика температурно-солевых фракций РНК клеток селезёнки контрольных и иммунных крыс. Цитология. 1974, XVI, 1147-1152.

33. Чипенс Г.И., Веретенникова Н.И., Вегнер Р.Э., Гниломёдова Л.Е., Розенталь Г.Ф. Структурные основы действия пептидных и белковых иммуномодуляторов. Рига, «Зинатне», 1990, с. 42, 49, 105, 243.

34. Archer S. Induction of T-cell specific antigen on bone marrow lymphocytes with thymus RNA. Immunology, 1978, v. 34, p. 123-129.

35. Banerjee S, An S, Zhou A , Silverman R, Makino S. Rnase L-Independed Specific 28S rRNA Clevege in Murine Coronovirus-Infected Cells. Journal of Virology, Oct. 2000, p. 8793-8802.

36. Baneijee S, An S, Makino S. Specific 28S rRNA Clevege in Murine Coronovirus-Infected Cells. Adv Exp Med Biol 2001, v. 494, p. 621-626.

37. Berstain RM, Bunn CC, Hughes GRV et al. Cellular protein and RNA antigens in autoimmune disease. Mol Biol Med 1984; 2: 105-20.

38. Biggiogera M, Bottone MG, Martin ТЕ, Uchiumi T, Pellicciari C. Still immunodetectabl nuclear RNPs are extruded from the cytoplasm of spontaneously apoptotic thymocytes. Exp. Cell Res. 1997, 234, p. 512-520.

39. Biggiogera M, Bottone MG, Pellicciari С. Nuclear RNA Is Extruded from Apoptotic Cells. Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 46, 9991006, Sep. 1998.

40. Biggiogera M, Pellicciari С Heterogeneous ectopic RNP-derived structures (HERDS) are markers of transcriptional arrest. FASEB J, 2000, v. 14, p. 828834.

41. Bonfa E, Parnassa AP, Rhodes DD et al. Antiribosomal S10 antibodies in humans and MRL/lpr mice with systemic lupus erythematjsus. Arthritis Rheum 1989; 32: 1252-61.

42. Bunn CC, Bernstain RM, Mathews MB. Autoantibodies against alanyl-tRNA synthetase and tRNA coexist and are associated with myositis. J Exp Med 1986; 163:1281-91.

43. Burd G.B., Dreyfuss G. Science. 1994. V. 265. p. 615-621.

44. Cai C., Guo H., Schroeder R., Punzalan C., Kuo P. Nitric Oxide-Dependent Ribosomal RNA Cleavage Is Associated with Inhibition of Ribosomal Peptidyl Transferase Activity in ANA-1 Murine Macrophages. J. of Immunology, 2000, 165: 3978-3984.

45. Casiano C.A., Martin S.J., Green D.G., Tan E.M. Selectiv cleavage of nuclear autoantigens during CD95(Fas/APO-l)-mediated T cell apoptosis. J.Exp.Med. 1996, 184, p. 765-770.

46. Chang D., Maraia R.J. J. Biol. Chem. 1993. V. 268. p. 6423-6428.

47. Chen Y., Bhoopalam N., Yakulis V., Heller P. Changes in lymphocyte surface immunoglobulins in myeloma and effect of an RNA-containing plasma factor. Ann. Internal Med., 1975, v. 83, p. 625-631.

48. Chomcznsky P., Sacchi N. Singl-step method of RNA isolation ba acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. 1987. Anal. Biochem. v. 162, p. 156-159.

49. Course R.J., de Boer H.A., Nomura M. Cell. 1986. v. 44. p. 197-205.

50. Coux О., Tanaka K., Goldberg L. Annu. Rev. Biochem. 1996. v. 65. p. 801-847.

51. Covacci R., Bruzzese N., Sgambato A., Di Francesco A. et al. Magnesium restriction induces granulocytic differentiation and expression of p27KIPI in human leukemic HL-60 cells. 1998. J. Cell. Biochem. 70: 313-322.

52. Davies R.V. Biosci. Rep. 1984. v. 4, p. 3-22.

53. Davis T.L., Firulli A.B., Kinniburgh A.J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. v. 86. p. 9682-9686.

54. Deckwerth T.L., Johnson E.M. Temporal analysis of events associated with programmed cell death (apoptosis) of sympathetic neurons deprived of nerve growth factor. 1993. J. Cell. Biol. 123: 1207-1222.

55. Degen WGJ, van Aarssen Y, Pruijn GJM, Utz PJ, van Venrooij WJ. The fate of U1 snRNP during anti-Fas induced apoptosis: specific cleavage of the U1 snPNA molecule. Cell Death Differ. 7, 70-80.

56. Degen WGJ, Pruijn GJM, Raats JMH, van Venrooij WJ. Caspase-dependent cleavage of nucleic acids. 2000. Cell Death and Differ. 7, 616-627.

57. Del Prete, M Julieta et all. Degradation of cellular mRNA is a general early apoptosis-induced event. FASEB J, 2002, Dec. 16(14), p. 2003-2005.

58. Delic J., Coppey-Moisan M., Magdelenat H. Gamma ray-induced transcription and apoptosis-associated loss of 28S rRNA in interphase human lymphocytes. 1993. Int. J. Radiat. Biol. 64, 39-46.

59. Dobrzelewski J, Milewska Z, Panusz H. Effect on transcription of low-molecular-weight RNA from calf thymus chromatin. 1980. Acta. Biochim. Pol. 27(2): 75-87.

60. Dragunow M., Preston K. The role of inducible transcription factors in apoptotic nerve cell death. 1995. Brain Res.Rev 21, 1-28.

61. Dreyfuss G., Philipson L., Mattaj I.W. Ribonucleoprotein particles in cellular processes. J.Cell.Biol. 1988 v.106. p.1419-1425.

62. Dubnau G., Struhl G. Nature. 1996 v. 379. p. 694-699.

63. Elkon K.B., Parnassa A.P., Foster C.L. Lupus autoantibodies target ribosomal P proteins. J. Exp. Med. 1985; 162: 459-71.

64. Elkon K., Shelly S., Parnassa A. et al. Identification and chemical synthesis of a ribosomal protein antigenic determinant in systemic lupus eruthematosus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986; 83: 7419-23.

65. Fan L., Yakovlev A., Faden A. Site-specific cleavage of 28S rRNA as a marker of traumatic brain injury. 1999. J. of Neurotrauma. V. 16, №5, p. 357-364.

66. Fodstad O., Olsnes S. Studies on the accessibility of ribosomes to inactivation by the toxic lectins abrin and ricin. 1977. Eur. J. Biochem. v. 74, 209-215.

67. Francoeur A.M., Peebles C.L., Heckman K.J. et al. Identification of ribosomal protein autoantigens. J. Immunol. 1985; 135: 2378-84.

68. Gerne N.K., Nordin A.A. Science, 1963, v. 140, p. 405.

69. Giancomoni D., Yakulis V., Wang S.R. et al. In vitro conversion of normal mouse lymphocytes by plasmacytoma RNA to express idiotipic specifities on their surface characteristic of the plasmacytoma immunoglobulin. Cell Immunol., 1974, v. 11, p. 389-400.

70. Greenhalgh D.A., Parish J.H. Effect of 5-fluorouracil combination therapy on RNA processing in human colonic carcinoma cells. 1990. Br. J. Cancer 6, 415419.

71. Heller P., Bhoopalam N., Chen Y., Yakulis V. The relationship of myeloma «RNA» to immune response. In: Immune RNA in Neoplasia. N.Y.: Acad. Press, 1976, p. 223-233.

72. Hitl W., Wolf D.H. Trends Biol Sci. 1996. v. 21. p. 96-102.

73. Hoet R.M., Weerd P.D., Gunnewiek J.K. et al. Epitope regions on U1 small nuclear RNA recognized by anti-Ul RNA-specific autoantibodies. 1992. J Clin Invest 90: 1753-62.

74. Helene C., Toulme S. Specific regulation of gene expression by antisense; sense and antigene nucleic acids. 1990. Biochem. Biophys Acta. 1990. v. 1049. p. 99125.

75. Holmberg L., Melander Y., Nygard O. Probing the structure of mouse Ehrlich ascites cell 5,8S, 18S and 28S ribosomal RNA in situ. 1994. Nucl. Asids. Res. v. 22, p. 1374-1382.

76. Holmberg L., Nygard O. Release of ribosome-bound 5S rRNA upon cleavege of the phosphodiester bond between nucleotides A55 in 5S rRNA. 2000. v. 381. n. 11. p. 1041-1046.

77. Houge G., Doskeland S.O., Вое R., Lanotte M. Selective cleavage of 28S rRNA variable regions V3 and V13 in myeloid leukemia cell apoptosis. 1993. v. 315, n. l,p. 16-20.

78. Houge G., Robaye В., Eikhom T.S., Golstain J. et al. Fine mapping of 28S rRNA sites specifically cleaved in cells undergoing apoptosis. 1995. Molecular and Cellular Biology. V. 15, n. 4, p. 2051-2062.

79. Houge G., Doskeland S.O. Divergence towards a dead end? Cleavage of the divergent domains of ribosomal RNA in apoptosis. 1996. Experientia. (52), p. 963-967.

80. Katzmann Y., Giacomoni D., Yakulis V., Heller P. Characterization of myeloma «RNA» to immune response. 1976. In: Immune RNA in Neoplasia. N.Y.: Acad. Press, p. 223-233.

81. King K.L., Jewel C.M., Borthner C.D., Cidlowski J.A. 28S ribosome degradation in lymphoid cell apoptosis: evidence caspase and Bcl-2-dependent and independent pathways. 2000. Cell Death Differ v. 7, p. 994-1001.

82. Kobayashi S., Higashi N., Suzuki K., Goto S. et al. J. Biol. Chem. 1992. v. 267, p. 18291-18297.

83. Kramerov D.A., Tallib S.V., Shamyatsky G.P., Georgiev G.P. Nucleic Acids Res. 1990. v. 18, p. 4499-4505.

84. Lafarga M., Lerga A., Andres M.A., Polanco J.I. et al. Apoptosis induced by methylazoxymethanol in developing rat cerebellum: organization of the cellnucleus and its relationship to DNA and rRNA degradation. 1997. Cell and Tissue Research. 289: 25-38.

85. Lamon E.W., Bennet J.C. Antibodies to ribosomal ribonucleic acid (rRNA) in patients with systemic lupus erythematosus (SLE). 1970. Immunology, 19: 43942.

86. Larson D.E., Xie W., Glibetic M. et al. Coordinated decreases in rRNA gene transcription factors and rRNA synthesis durind muscle cell differentiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 7933-7936.

87. Lee R.C., Rhonda L.F., Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-4. 1993. Cell. V. 75, n.3, p. 843-854.

88. Lei H, Furth E. et all A program of cell death and extracellular matrix degradation is activated in the amnion before the onset of labor. J Clin Invest 1996, Nov 1, 98 (9), p. 1971-1978.

89. Lockshin R.A., Zakeri Z. Programmed cell death: early changes in metamorphosing cells, v. 72 p. 589-596.

90. Lundberg U., West A.B., Altman S. Characterization of RNA with unusual electrophoretic mobility from tissues of patients with Crohn's disease. 1995. FEBS Letters, v. 371, p. 345-350.

91. Maraia R.J., Driscoll .Т., Bilyeu Т., Darlington G.J. 1993. Mol. Cell. Boil. V. 3, p. 4233-4241.

92. Maraia R.J., Zasloff M., PlotzP., Adeniyi-Jones S. 1988. Mol. Cell. Biol. V. 7, p. 4433-4440.

93. Martins de Sa C., Grossi de Sa M.-F., Akhayat O., Broders F. et.al. 1986. Mol. Biol. v. 187 p. 479-493.

94. McKinnon R.D., Danielson P., Brow M. N. D., Bloom F.E. et al. 1987. Mol. Cell. Biol. v. 7, p. 2148-2154.

95. Michelotti E.E., Michelotti G.A., Aronsohn A.I., Levens D. 1996. Mol. Cell. Biol. v. 16, p. 2350-2360.

96. Michot В., Hassouna N., Bachellerie J.P. Secondary structure of mouse 28S rRNA and general model for the folding of the large rRNA in eukaryotes. 1984. Nucl. Acids. Res. v. 12, p. 4259-4279.

97. Mylonas P.G., Matsouka P.T., Papandonioii E.V., Vagianos C. et al. Growth hormone and insulin-like growth factor I protect intes cells from radiation induced apoptosis. 2000. Mol. Cell. Endocrinol. V. 160. n. 1-2. p. 115-122.

98. Nakamura K. The prolifiration of plasma cells from mouse bone marrow in vitro. II. Stimulation of IG-producing cells by an RNAse sensitive thymocyte homogenat. 1976. Cell Immunol, v. 25, p. 163-172.

99. Noller H.F. Ribosomal RNA and translation. 1991. Annu Rev Biochem. v. 60, p. 191-227.

100. Nowak R. Science. 1994. v. 263, p. 608-610.

101. Olmo N., Turnay J. et al. Cytotoxic mechanism of the ribotoxin flr-sarcin. Induction of cell death via apoptosis. 2001. Eur. J. Biochem. v. 268, p. 21132123.

102. Payao S.L.M., Smith M.A.C., Winter L.M.F., Bertolucci P.H.F. Ribosomal RNA in Alzheimer's disease and ageing. 1998. Mechanism of ageing and development, v. 105, p. 265-272.

103. Petit F., Jarrouss A.S., Boissonnet G., Dadet M.N. et al. Mol. Biol. Reports. 1997. v. 24, p. 113-117.

104. Poon Leo L.M., Leung Tse N., Lau Tze K., Lo Y.M.Dennis. Presence of fetal RNA in maternal plasma. Clinical Chemistry. 2000 v. 46, p. 1832-1834.

105. Poon Leo L.M., Leung Tse N., Lau Tze K., Lo Y.M.Dennis. Circulating fetal RNA in maternal plasma. PNAS. 2001 v. 945, p. 207-210.

106. Radzioch D., Clayton M., Varesio L. Interferon-alpha -beta and -gamma augment the levels of rRNA precursors in peritoneal macrophages but not in macrophage cell lines and fibroblasts. 1987. J. Immunol, v. 139, p. 805-812.

107. Rajagopalan L.A., Malter J.S. Progr. Nucleic. Acids. Res. Mol. Biol. 1997. v. 56, p. 257-286.

108. Roy G., Mercure S., Beuvon F., Perreault JP. Characterization of stable RNAs intestinal tissues of individuals with either Crohn's disease or ulcerative colitis. 1997. Biochem. Cell. Biol. v. 75, p. 789-794.

109. Rutjes SA, van der Heijden A, Utz PJ, van Venrooij WJ, Pruijn GJM. Rapid nucleolytic degradation of the smoll cytoplasmic Y RNAs during apoptosis. J. Biol. Chem. 1999, 274, 24799-24807.

110. Ryskov A.P., Ivanov P.L., Kramerov D.A., Georgiev G.P. Nucleic. Acids. Res. 1983. v. 11, p. 6541-6548.

111. Samali A, Gilje B, Doskeland SO, Cotter TG, Houge G. The ability to cleave 28S ribosomal RNA during apoptosis is a cell-dependent trait unrelated to DNA fragmentation. Cell Death Differ. 1997,4, p. 289-293.

112. Sandvic K., van Deurs B.O. Toxin-induced cell lysis: protection by 3-methyladenine and cycloheximide. 1992. Exp. Cell. Res. v. 200, p. 253-262.

113. Sato Т., Uchiumi Т., Kominami R. et al. Autoantibodies specific for 20-Kdal ribosomal large subunit protein L12. 1990. Biochem. Biophys. Res. Commun. v. 172, p. 496-502.

114. Sato Т., Uchiumi Т., Ozawa T. et. al. Autoantibodies against ribosomal protrins found with high frequency in patients with systemic lupus erythematosus with active disease. 1991. J. Rheumatol, v. 18, p. 1681-1684.

115. Sato Т., Uchiumi Т., Arakawa M., Kominami R. Serological association of lupus autoantibodies to a limited functional domain of 28S ribosomal RNA and to the ribosomal proteins bound to the domain. 1994. Clin. Exp. Immunol, v. 98, p. 3539.

116. Saxena S.K., Ackerman E.J. Microinjected oligonucleotides complementary to the alpha-sarcin loop of 28S RNA abolish protein synthesis in Xenopus oocytes. 1990. J. Biol. Chem. v. 265, p. 3263-3269.

117. Saxena S.K., Rybak S.M., Winkler G. et.al. Comparison of Rnases and toxins upon injection into Xenopus oocytes. 1991. J. Biol. Chtm. V. 266, p. 2120821214.

118. Scherrer K., Bey F. Progr. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 1994. v. 49, p. 1-64.

119. Schoeniger L.O., Jelinek W.R. Mol. Cell. Biol. 1986. v. 6, p. 1508-1519.

120. Sell S., Mendelsohn J. Transfer of specific immunity with RNA. 1978. Arch. Pathol. Lab. Med. v. 102, p. 217-222.

121. Silva JM, Rodriguez R, Garcia JM, Munoz С et all. Detection of epithelial tumour RNA in the plasma of colon cancer patients is associated with advanced stages and circulating tumor cells. Gut. 2002. v. 50, p. 530-534.

122. Strub K., Gall G., Busslinger M.L. EMBO J. 1984. v. 3, p. 2801-2807.

123. Tanaka K. J. Biochem. 1998. v. 123, p. 195-204.

124. Toszyski D.P.W., Steitz J.A. EMBO J. 1991 v. 10, p. 459-466.

125. Uchiumi Т., Traut R.R., Elkon K., Kominami R. A human autoantibody specific for unique 28S ribosomal RNA inhibits the interaction of elongation factors la and 2 with ribosomes. 1991. J. Biol. Chem. v. 266, n. 4, p. 2054-2062.

126. Wightman В., Ha I., Ruvkun G. Cell. 1993. v. 75, p. 855-862.

127. Wilusz J., Keene J.D. Autoantibodies specific for U1 RNA and initiator methionine tRNA. 1986. v. 261, p. 547-572.

128. Zhang J., Liu W. The mechanism of action of trichosanthin on eukaryotic ribosomes RNA N-glycosidase activity of the cytotoxin. 1992. Nucl. Acids Res. v. 20, p. 1271-1275.

129. Автор выражает глубокую признательность с.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии Р.Я.Власенко и в.н.с. кафедры челюстно-лицевой хирургии ММА им. Сеченова В.Ю.Кассину за выполнение части работы по определению иммуно-биологической активности.

Информация о работе

Баранова, Ольга Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Физико-химические и иммуно-биологические свойства РНК из тимуса, связанные со специфической фрагментацией высокомолекулярных РНК - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы