Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физическое картирование хромосомных перестроек у E. coli, затрагивающих ген уридинфосфорилазы и рибосомные опероны

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Физическое картирование хромосомных перестроек у E. coli, затрагивающих ген уридинфосфорилазы и рибосомные опероны"

Научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

На правах рукописи

НИКОЛЬСКАЯ ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

ФИЗИЧЕВНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ ПЕРЕСТРОЕК У Е. coli, ЗАТРАГИВАЮЩИХ ГЕН УРИДИНФООФОРИЛАЗЫ Н РИБОСОМНЫЕ ОПЕРОНЫ

03.00.15 — Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1992

, Работа выполнена в Научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Научный руководитель — кандидат биологических наук А. С. Миронов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Каменева С. В.; кандидат биологических наук Складнее Д. А.

Ведущая организация — Институт микробиологии и эпидемиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН России.

Защита диссертации состоится 1 декабря 1992 г. в 14 часов на заседании специализированного совета Д.098.12.01 при НИИ генетики и селекции промышленных, микроорганизмов по адресу: Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

Автореферат разослан 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

В. И. ЩЕРБАКОВА

злы гадзз? .текьь.

Сргагскгация хромосомы энтарсЗактерий достаточно консервативно в огнсязшлт расположении генов и расстояния нежлу ними. Прямое . сравнение'генетических карт E.coll и S.typliimuriuia подтверздаэт эполюхсгстгую стабильность бактериальной кромосомы.

В то кэ врокя, . ряя э.чспари!!внталь!й1Х данных свидетельствует о " тон, что xpo'tocoiSftiQ мутгцга! вогкик&ат у бактерия с достаточно высокая частотой. Основный кзхактамсм ¡зогтишопенигс хромосомных пэрсотроек является '.герашжп ироссннгопзр tiusrty повторяющиеся гонолопгшзяш послзг-онательностет-к!, присутствующими в. , 6а;стер»алы!0П хрсиосома: риЗосокиыми олэрокаки, кодирующими рквосоилыэ РНК, IS-злекентш-ш а rhe-лоеусаки. Неравная гомолог! гчи ал рекомбинация мегсл'." повторами приэзднт к образованию далсцкя, дупликгыиЛ, иняерскЯ и траяелокаикП с различной частотой:.

Инверсии, в отличив от другая.хромосомных перестроек являются наиболее тедкими реяокЁинакиоиными событиями. Присутствий в геноме инсерцношшк элементов топа транспозона Тп 10 существенно увеличивает частоту всзнтнивеиия крсиосокзак перестроек, в том число si инверсия. <?

Изучение механизмов. л::*ап.\-: а основа раз -ичных хромосомных изменения, треЗуат создания системы отбора путантов, имеющих хромосомные перестройки. Сзлвктиаизя модель, предяойеннап для игу чеши экспресс»« гена уркдиифосфорилагы (Hironov, Sukhodolets 1S79; Иироноа 1932), окаэалг.оь удобкоя для выявления мутантов о различными хромосомными перестройками.

В то ко время, т^хгдишгонные генетические натоды изучения хромосомных мутаций, трудоемки и не всегда тоЧ'Ш. В свяги с этил особое значение приобретает разработка методов.физического картирования хромосомных нзрестроек о использованием современной генноинженернчд методологии, о частности. Фракционирования крупных Фрагментов ДНК в перекликом электрическом поле, или пульс-

электрофореза (ПЭ$).

. «

Цель и аада :и исслеподкшя. .

Цель» настотцей работ.) было дальнеПзсе изучение полученной ранее икЕерсии INVI (Кулакаускос, Миронов, Сукодолей, 1986) генетическими и физическими методам:!

Следующей Ьелыо работы являлось исследование двух серий мутантов-производных итамнов Hfrll и W3110, полученных с помокыэ селективной модели. основанной на повышении экспрессии гена -udp в геноме deoA metE::Тп10.

Б соотиетстБии с поставленными целями было необходимо выполнить следующие задачи: получить коллекцию нутантов с повышенной экспрессией гена udp; освоить методы физического, картирования еактериал!)кых хромосом; определить размеры Notl-фрагментов рестрикции контрольных отаммев АМ174 и АМ2150 и сопоставить их с Физической картой штамма E.coli К-12 АВ1157 (Smith et al., 1S87).

В канной работе предложен новый биективный метод отбора мутантов с хромосомными перестрелками с использованием транспоэона . TnlO и с слеши tu, папраелгнпой на повышение экспрессии гена udp. С помотъга зтого метода получен ряд мутантов, содержащих уникальные хромосомны® перестройки.

Осуществлено физическое картирование данных перестроек и предложены схемы ророяткых рекокбинаыионных события, леяадих в основа этик гэнтжных мутаций.

В процесса работы сопоставлен размеры üatl-фрагментов рестрикции контрольных итекиоа E.coli с описанными в литература данными (Sadth et el., 1987), при »том выявлены отклонения в количестве и велишше некоторых фрагментов.

Уточнена физическая карта E.coli К-12 а области 05-26" минуты генетической карты. Показано, что ген ро1Л, отнесенный ранее 0 {Eraith efc ol.» 1987) к-Uotl-фрагмекту S. локализован но фрагменте Т физической нарты хромосомы E.coli. Установлен порядок расположен;«! генов «dp и ггпА, находлютхея, соответственно, на Фрагментах S и Т физической карты E.coli.

Проседей анализ серии лабораторных ттеимою та БКШ! ВНШгекэтика. выявлена определенная гетерогенность втокнов в отношении количества и локализата! риЗосомиьк опвронов.

Диссертация состоит да введения, обзора литературы, посватанного хромосомным перестройкам бактериального генома.

иетодическоп части, экспериментальной части, обсуждения результатов, еъгоодов и списка цитируемой литературы- Диссертаи^«. содержит 29 рисунков и 5 тавлиц.

Материалы исследования по теиэ диссортлшт опубликованы о двух статьях, а также докладывались на школа-семинаре о г. Рига (1990), и на международных конференциях а Колд-Сгрюн—Харбор (1901), Кей-стоул (1992). Нагериалы диссертации был» предотаплены на семинаре отдела молекулярной га нетики КШ!генетнха.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

нх генотипы приведены в табл. 1.

Тр^»1г:гту|ят<?н11ид ркргччия^т^ с использованием фаГА Р1 проводили

по стандартно?» методика (Киллер, 1Э76)

рул^п-здектрот-орда образцов ДНК проводил»« с покавьх» аппарата в

о

контурным расположением электродов фирмы Ша М (Москва) а 0,25 -0,5-кратном буфере ТЕК при температуре а 1,0-1,15 агароэиом геле.

блоках осуществляли по поди$.ша<рованной натодиае Смит (ЙаКЛ еЪ а1., 1938)

Ряса-пл*ж<л К??" ^ Клпдя>; эндону&яеаэанн рестрикции И

проведение пуягл-алактрофореэв проводили, как описано ранее (5аИ:Ь еЬ а1., 1307} с не?5олкв;тн. модификациями.

Упикдт^м'ур* /\ (атйишарт молекулярного, леса для

макрорестрикздюниого картировмпш), готовили по типовой методике эапеаднйя частиц фага в присутствии протеинаэы К ШаСЬе« о! а1, 1868)

ЩЧ траасч-ормация плазгашлоС! ЛНК,

Сеуэер^гкгридгпацыа, ЕЫпяг.чния плззинллоп ДНЙ осуществлялись по (Намйатяо м др.,1034).

Таблица 1. Штаины E.coli, использованные в работе.

Штамм Генотип

1) ABÍX57 . thirl lcuB6 lacYl galK2 nial«i ху15 mtll ргоЛ62 hieL4 гроЬЗ! tsx33 supE4l.

2) АМ174 CKfrH) thi thyA dcoC tísoAl matE::TnlO

3) СМ973 из AM174, thl thyA deoC deoAl isetE::TnlO IHVlCmotE'. rrnD]

4) АМ2119 ИЗ.АИ174, thi thyA deoC deoAl ncstE::XnlO IHVlSSEmatE'.rmD]

5) АИ2131 из AM174,thi thyA dcoC deoAl tnetE: :TnlO . INViSOIostE* ,«аизаестгго]

6) АМ2138 иэАИ174, thi thyA deoC deoAl rriotE: :TnlO IiiV161[nQtî2'.rrnD3

7) АМ2141 из AM174, tai thyA tísoC dsoAl astE: :TnlO llíVieSCmetS* ,rrn5}

8) AÎ12144 из ÀM174, thi thyA decC dsoAl wotE: :TniO ЮТ163СюоъВ-,ггп03

9) AH215CI CV3110) thyA dooC tíooAl aratE::TnlO

10) АМ21Ы из AM2150, IKV/2UP30 UUV{mofcE*, rrnE/D" )' DU?«rrnF".udp-rMiS/D*)3

11) AM21ÍÍ2 • '.из AK2150, 1.ЙУ/КЗР31 ÏIHVtœetE*. rrnS/D*) ■'■DU?{rrnF*,udp-rroE/D*>3 .

12) ЛИ2153 . .из AM21S0, SiN/ШЗЗ ÏIHVJœotE*> rrnS/D') ÜU?(rrnF*.udp-rrnS/D* )3

14) АМ2154 ' »з .AM21S3» ItiV/ШРЗб nr.VtnetE-, rrnS/D') DUPÍ rrnF" ,wdî>-rr«S/D" ) 1 '

15) АВ2463 из АВ11Б7. гссМЗ

IS) W4032 ргоЗ tax7û reíAl spoTl tsstBl

17) W1485 ГgalK2 leuBS reí Ai thil snatBl

18) CAÍ 85 aupESS(nu ) =gintJSS lacZ13fO ) lacI22 rslAl .epoTl «1« S>01

19) СА265 . BupFCS{ou +)=tyrT6S laoZS6 trp49 rolAl epoTl POl

20) СА266 oupDS7(ou +)=eor037 iac25S tr?49 relñl tipoTl POl

21) С600

22) РЗ

23) PIО

24) PS73

25) Р3473

25) "53 27) Ш?Э 23) ЕЮ

thi thr leu lacY ■

bio relAl epoTl raetBl PO 23

thrl leuSG lacYl sup544 rfbDl thil

touA21 P0>8 nalB16( )

thrl aral3 leuES touA2 lacYl supE44

£ai6(gal) rfbDl galP63 malTl xyl? mt'lA2 thil

thyASS polAl daoC2 1!ЩrrnD-rrnE)

thrl leuES lacYl supE44 rfbDt thil

relAl spoTl thil 1ае42 P042

touA22 garBiO cmpB627 relAl■pitlO epoTl.

inetE'T2 P02A

СОДЕРЖАНИЕ РАБОХП.

В данной работе предлоЕ»на селективная нояелъ, позволяющая отбирать мутаитоз с райличныки яромосдкньпт перестройками, ocuoEajmaJi на повышении экспрессии гена uclp гз геиоие, соде^ваиил инсерции транспозона ТпЮ.

Фер:гент урндинфосфори^аса (УД;1) ката/г.гзируст обратимую реакцию фосф^роляза уриянпа и имеет небольшую (2S) специфичность а отношении тикина - В условиях конститутивного синтеза 1'ДФ способна ноипланептиросать ауксотрофнссть по тамидину, вызванную мутацией в гене кгмиккнфоефорилагы (deoA), на <рспо отсутствия crarresa de novo (нутаки* thyA). Селекция на ам.вхтивнО'» усвоыма тимипз у таких штгмков позволяет отбирать клоны с nouKCimiof экспрессией гена udp (мутанты по гену релресеора СуШ, ¡громс-гор-оператор кс'тститутивнкэ кутан-, ы по гену udp, мутанты с дупликацией гзна udp).

С лругоп стороны, кзнестно, что при 3i:ctiKr:«ni ТпЮ из баитериал.' ной хро::оесми ^огут cSparjo писаться ин гарсии п релецгот соседнюю участкор хромосомы.г.эзяина. 'Jthh свойством ТпЮ мы ЕОСПОЛЬЗОВаЛИ" j длт получен'Ч муТв»ГГОО ХрО.юсонныки ne^>eorpoK?-.EU.'H, ^¡.чгсомспъж к усиления 5.».сп^»осии гена udp'.

: Исходная штамп СМ922 (UiyA deoA '.зоС metf : :TnlO) имел инсерцию TnlO в даотальной части гена metE, соседнего с геном udp. В нем проводили отбор форм, способных к росту на среде с тимином и, однЪе^еиенно, теряютих устойчивость к Тс. Тем самим.. вели отоор

Форм, у которых усиление экспрессии гена иаР произошло за счет перестрой;:«, приводяпей к подстановке данного гена под контроль чужого правильно ориентированного сильного промотора (рис 1).

С ломомью дак.юго иетода отбора Были получены две серии • мутзнтных штаммов-производных !Кг!1 (7 независимых мутантов) и N3110 (4 неэависпмнх мутанта). Все мутанты - производные НГгН кроме АМ2131 (ГЫ7/ТКЫ60> „иеяи одинаковые перестройки, идентичные инаарсии ГНУТ (Кулакаускае и др.. 1986). та«», АМ2131 содеряп-инверсию/трбнслоиош™. Вое мутанта - производные «3110 имели одинаковые хромосомные перестройки - инверсии/дупликации.

И

опС С1Д

-I-1—

85

) Тп5 ,-ТпЮ

-Уь

\ Тс I

V / \ /

сгр вп>Е \ /

_«-г»-»-

74 13

гпФп

О

/гпФ

аг55- гт Тп5 гС Е сгй

- - - феГЕЗагаай ■■■■» ' —

I-- о.о2--J

£6

йгдО ~69

уЫ -2(Г9::ТП1О V-

Рис. 1. Схема образования инверсии 1Ж/1 и ее генетическое

картирование.а).Генетическая карта хромосомы исходного атомма АМ174; в) Генетическая карта хромосомы инверсионного мутанта СМ973. Цифры мевду столпами указывают величину сцепления маркеров при трансдукции.

Генчтичясчоа киптиипряга^ инверсии 1НУ-1.

На первом этапе работы мы провели более таатеяькоэ генетическое картирование инверсия IVI. Для установления границы сегмента хромосомы, захватываемого инверсией ЮТ1 в районе 71-72 гам, мы воспользовались карьерой вгоЕ, располозеш«_-м мегду генами грзВ и ггпО. Мутация агоЕ была перенесена с пснокьа трансдуктм фагом Р1 из птаммо АТ700 з геаом мутанта ИГЛ (итамм Д'.!2237), я качества селектируемого маркера использовали инсершпэ сувО::Тп5. Среди трансдуктаитоа Суо удалось отс5ре.т»> формы, несущие нуташпэ агоЗ. Этот факт, укагывае-', на то, что ген аго2 вовлечен а кнверсиа ЮТ1, так как, в противном случае, скопление кезду Ис.ркеракн агоЕ и суаО долено было нарушиться. С этим заялачением согласуйся результаты четырехфакторных трансдумуюнии:! скрееиваний с участием фага -РЗ., вырапенного на доиорном итамме СНЭЭ1 грвЗ СЕя-г) ис1р::Тт\5 а!£Э: :Тп10 и реципиента Л!'1021 агой (ТаВл. 2).

Таблица 2. Картирование пограничной. оЗластп агоЕ - ис!р с п^иодкэ четырехфа!:ториых трансдуаиионны» еарешамшЯ..

Донор Реципиент Сележи-рус. ¡г^пкер

Рек.ок5кнакт1вле Число транс С...Г- агоЕ ийр

СМЭ91 '.-и 201

гре2(БП-Г ) ыоЕ иёр::Тп5 а1£9«:Тп10 '

Тс-г

Г '

а в г в г

I."

Всего:

35 25 ■ 2Э 1

19 2 0 1

112

+

+

+

В этих скрещиваниях отбирали рэконбинаити Тс1" по маркеру транспозоне ТпЮ (з1£Э: :Тп10), локализованного дистальнея гена ис1р (см. рис. 1)1 Трансдухтантг» ТсГ анализировались на наследование

с

неселектируемьгх маркеров ис!р, агоЕ к граЕ (2рг). Результаты, представленные в табл. 2, подтверждают локализацию гена агоЕ менду маркерами грвЕ I!. ис!р и позволяют установить следующий порядок маркеров на пограничном сегменте инверсии ШУ1: гроЕ - агоК - ис!р -'zlí9::' Тп'Ю. Такое, располояение генов подтверждается

- ' V*

результатам]! рештрокльпс трехфакторнцх трансдукционных скрещиваний реципиента АИ1626 ¿№/-1 агоЕ ис1р: :Тп5 г1£9::Тп10 с донором ЛМ1623 1№/-1, в которых реком8иыамтное потомство ЛгоЕ+- и ОДр+ анализировалось на наследование иеселектируекых маркеров (Табл. 3). •

Таблица 3. Картирование пограничной области агсЕ-исЗр с помошь» •трехфакторнызс трансдукцдашшх скрещиваний.

Сзлекти-Лонор Реципиент руекыЯ Маркер

Неселектирускые маркеры

Число тронс-яуктситов

АМ1623 . ЙМ1625 ЮТ-1 1№/-1 агоЕ ис1р::Тп5 а!£9::Тп10

ЛгоЕ+

Шр+

1Мр+ Тс-о иар- тс-г 1Ир+ Тс-г 0<3р- Тс-о

Всего

АгоЕ+ Тс-а АгоЕ- Тс-г ЛгоЕ+ Тс-г АгоЕ- Тс-в

Всего

ВО 14 24 6

124

80 1 <56

138

Высокая частота совместной трексдукиии маркеров огоЕ и исЕо свидетельствует с том, что граница инверсии проходит п непосредственней близости сг нар;'.сра агоЕ, т.о. примерно в районе локализации сие рана ггпЕ>. Поскольку экспрессия гена ийр у мутанта с инвэрсиьй 1НУ 1, в отличие от коютольного штамма, зависит от скорости роста бактерий {Кулакаускас с соавт. 1986). можно предположат», что гранила инверсии скорее всего проходит внутри

оперона rrnD. При этом терминаторы транскрипции оперона rrnD остаются вне raaepcrai, тогда как прокоторы оперона rrnD располагаются перед геном udp,'обеспечивая ого повышенную «кспрессио sa счет сквозной транскрипции.

Для картирования протипополокного по отношении к гену-udp uoina инверсии IïiV-1 мы использовали кнсерщпо траиспозона Тп5 в промотор-проксимальном участке гена nietB, который в результате инверсии должен перемечаться в район 72 мкн, а также маркер argG::Tn5, расположенный на 63 >-г.тн хромосома, т.е. вне инверсии, (см. рис. 1). С этой целью были сконструированы гатамкы АМ2217, содержаний инверсна.IHVI и инсерцде argG::Tn5, который использовали э качестве реципиента и итамм АК2222, сояеркеггдй кнперсию IKVÎ и ннсерцию metS::Tn5, который служзо! допорол для получения препарате Фага T4(GÎ7). Последний попользовал« вместо Фага Р1 по топ причине, что предполагаемое расстоянии между маркерами MetE и argG в геноме инверсионного мутанта должно составлять около 3 te m, т.о. превышает емкость ç>ara Pl. При анализе трансдуктаитов Агс+ полученных в'скредизании T-KGT7 )ЛМ2222 х АМ2217 выяснилось, что ZX из и?« обнаруживают устойчивость и каязмицину. т.е. вклвчагт иисерцию донора netE: :Тп5, расположенную на краю инвертированного.Фрагмента хромосомы. Таким образом, полученные дмгныз подтсерадпат заключение о том, что противоположный udp коней инверсии IHV-1 локализуется в районе 72 мин на хромосомной карте В.coll.

ttonSop пптинялмтдк, услогпп для, раамлвняя liotX-арагкеитов

рястрикнин хромогонм K.enH t: nnwoiimm ПЯФ.

Методической задачей данной работы являлось освоение методов физического картирования бактериальной хромосомы, в' частности пульс-электрофореза и Сауэерн-гиоридизации с макрорестрикционными Фрагментами ДНК, разделенными с помощью ПЭФ. Подбор эффективных условий разделения рестрикционных фрагментов ДНК с помоаью. ПЭФ мы проводили применительно к отечестгенному прибору "Диапульс", поэтому некоторые параметры ПЭФ отличаются от описанных в литературе.

Основным вариабельным параметром ПЭФ является время пульса (Тр). Опытным путем нам удалось подобрать соответствующие значения

Тр, позволяющие» увидеть изменившиеся NotI-фрагменты рестрикция хромосомной ДНК полученных нами мутантов с различными хромосомными перестрой«ами.

При Тр, равном 20 секунд, происходит разделение фрагментов размером ст 20 тпи до 290 тпн.

При времени пульса 40 секунд эффективно разделяются наименьцме Фрагменты в диапазоне 20-150 тпн и фрагменты размером 340-500 тпн. Фрагменты среднего размера (150-340 тпн) при этск мигрируют совместно, не разделяясь.

При времени пульса ВО се;:унд наиболее Эффективно разделяются Фрагменты, лежащие в области приблизительно от 350 до 650 тпн. Следует отметить, что при значениях Тр, превышающих 60 секунд, о качестве маркеров размерен используются хромосомы S.cereviaiae. Поскольку хромосомы этого еггамиа на лульсэлектрофорограмме выглядят а виде довольно широких полос, возрастает погрешность в определении размера макрорестрикциониых фрагментов исследуемых ДНК.

Наконец, при Тр, равном S0 секунд и/или 100 секунд, происходит разделении наибольших HotI-фрагментов хромосомная ДНК E.coli в диапазоне £00-1000 тпн.

Нам удалось установить оптимальное время пульса, при котором происходит разделение фрагментов, затронутых перестройками у ггол'учешших нами мутантов. Для определения размеров "верхних" Фрагментов штаммов-произтзодных АМ2150 (W3110) проводили ПЭФ с временем пульса, равным ВО, SO it 100 секунд. Размеры остальных Hotl-рестрикционнкх фрагментов определяли при вренени пульса 20 секунд.

Получение и'сопоставление-Макрпрпстрикштчннх портретов

Прежде чем приступить к физическому картированию инверсионных мутантов, было необходимо получить макрорестрикционные портреты хромосом родительских штеммов АМ174 и W311^ и сопоставить их с Физической картой штамма АВ1157 (Smith et al, 1987). Препараты нативной хромосомной ДНК этих штаннов расщепляли рестриктазой Hot! и разделяли в 1% агарозном геле с помощью ПЭФ при различном времени пульса. Результаты определения размеров Not!-фрагментов

ДНК трех штакноа: АВ1157, АМ174 и АМ2150 (производный ттакмй W3110) суммированы в теол. 4.

Таблица 4. Сравнение UotI-ФрагкептоЕ хромосомной ДНК из штаммов АМ174, АК2150 и АВ1157.

Размеры Фрагментов, выделенных чертой, подтверждены Саузери-гибридизаыией. Фрагменты,■присутствующие п АМ174 и АМ2150 (по сравненно е А.В1157) обозначены С).

11 03означение Размеры Hotl-фрагментов (тпн)

Motl-фрагментов АВ1157 АМ174 АМ2150

1 А 1000 1000 810",440*

2 В, С 360,360 .330 360,360

3 D.E.P 263,250 268 220',207' 267' 290-.267

G.H.I 255,245 253,2*240 250,231*

200 231*,230" 210

4 J 210 214'

5 L 203 205. 20S

6 M 190 190 190

7 К 160 160 160

а H 130 130 130

а O.P.R 106.100 109,100 106,100

95 95 95

10 S.T.U 43.43,40 43,43,40 43,43,40

il V 20 20 20

Кок следует из данных табл. 4, штамм АМ174 имеет в измененных Фрагментов по сравнению с контрольный штаммом АВ1157, однако эти различия не превышают 2-ЗХ. Интересу.-ошив «ас фрагменты А и S,которые предположительно могут выть затронуты инверсией, у обоих отаммов одинакг-вы, т.е. геном штамма АМ174 а этом отношении соответствует дикому типу. Как и ожидалось, солее существенные отличия в подоютностн фрагментов наблюдаются у штамма АМ2160, который содержит природную инверсию хромосомы между оперонами rrnD и ггпЕ. В соответствии с предполагаемым механизмом образования

этой инверсии (см. рис. 3) на пульсэлектрофореграмме ЛНК этого штамма пропадает самый крупный Фрагмент А(1000 тли) и появляются два новых Фрагмента А*(В10 тпн) и Н*(440 тпн)

ФиЪЫПГ.КСР! ;;артнроп.^гип хг>омаг.ан штямкпа-прон-згэгслных HfrH с

Для удобства физического картирования были сконструированы два дополнительных вгтамма: АМ2217 и АМ2237, имевших инсерции Тп5 в гены агбб и сув<3, соответственно (сн. рис. 2 с,(3). В соответствии с предполагаемой схемой образования инверсии IНV1 штамма СМ373 (рис. 2), расщепление хромосомной ДНК отого штамма рестриктазой МоЫ должно приводить"« возникновению двух новых Фрагментов: А* (750 тпн) и в' (290 тпн) вместо А (1000 тпн) и Б (43 тпн), характерных для хромосомы штамма дикого типа (АМ174).

ггпО т«1Е и<1р

К.т. ' •■••С т»т ....................|»> ■ I «и......... т\т I

' I

ггпО'^амйС гглО^/ийр

0.1373

А750 ЧК>0. ^290 т43 И240

дмггзг _у

с- ттт» икмцищищщщии"! '1 > ■ Оп «м тевшкжвхж

А*750 '-го О ^210 =¿5 *43 'Ьдо

^ дмгг(7 ,

А"соо. *Ъо *-гоо Б"гзо т<з "г<о

Рис. 2. Схематическое изображение физической карты хромосом штаммов: а) АН174 (дикий тип); Ь) СМ973 (ЮТ1); с) АМ2237 (1»Ш су ей: :Тп5); сП АМ2217 (1»Ш аг^::Тп5). Показано расположение маркеров на НоЬ1-фрагментах, Фракционированных ПЭФ.

»

Поскольку ДНК Тп5 содержит сайт узнавания рестригстазы Но1;1, у штамма АМ2237 Фрагмент Б* должен расцепляться на два субфрагментз 8"(210 тпн) и З-" (80 тпн), а в штамме АИ2217 фрагмент А'(750 тпн) должен расщепляться на два су©?рагме1гта размером А"(600 тпн) и А*" (150 тпн) (см. рис. 2).

На пульсэлектрофореграмме, полученной при времени пульсп 90 сек, происходит разделение "верхних" НоЫ-фрагиентов ДНК. V ртакма дикого типа АМ174 фрагмент А имеет размер 1000 тпн; у штаммов СМ973 и АМ2237 этот фрагмент имеет размер 750 тпн, а у штамма АМ2217 - 600 тпн. ...

Для определения локализации гена исЗ?, а такие опорснов ггп после обработки ДНК инверсионных мутантов рестриктазой КоЬХ и получения соответствуют» пульсэлектрофореграм.чм проводили опита по Саузерн-гибридизации с использованием а качестве специфических зондов ДНК плаэмид рШ>8 (ис!р) н рКК3535 (ггпВ)..

Пульсэлектрофореграмиа 1!оЬ1-рестриктов ДНК гатамиов СН973, АМ174 и АМ2237 и результаты соответствующей Сауэерн-гггбридизацпи с зондом рЩ)7 идр показывают, что у штамма емкого т!.-па /.¡1174 ген'исЗр локализуется на фрагменте 3 (43 гги). У птамма СЯЭ73 сн перепевается на фрагмент £'{290 тпн),-тогда как в случав штамма АМ2237 ген ийр гибрияизуется с фрагментом 00 тпн, что согласуется с представленной на рис. 2 схемой. Именно с этк* Фрагмегггом обнаруживает гибридизацию зона рКК3535, содермагзй! оперон ггпЗ, что подтвер:кдает присутствие промотор-нрокеккального участка оперона ггпй в составе инворсил ИГЛ. Э то леэ время, я соответствии со схемой образования инверсии 1Н'.'1 {рио. 1), ' . дистальная область оперона ггпй остается вне ««версии» о чем свидетельствует гибридизация зонда рКК3535 с фрагментом 150 тпн

. Данные, полученные с покошыз ПЗФ и Саузерн-гпЕЬилгаации, подтверждают схему образования тявореии ЮТ1, продетавленну» на рис. 1 и рис. 2, а также свидетельствуют о те»,, что граница этой инверсии проходит внутри сперонь ггпО. При этом прсиотор-проксимальныя участок грпЮ оказывается перемввэниым в район локализации гена ийр. тогда пак дистальная часть оперона, содержащая терминаторы транскрипции, остается скэ инверсии.

Для физического картирован!21 друпс: инварсношоес мутантов -производных штамма ЛМ174 ташгэ использовали Саузяри-гтЯридаэаш»

Но11-Фрагментов с зондом рКК3535. Все мутанты, за исключением АМ1231, обнаруживают одинаковый профиль гибридизации, полностью совпадающий с мутантом СМЭ73. На основании этих данных можно за ключить, что.6 из 7 независимо полученных мутантов содержат инверсии, идентичные инверсии ЮТ1 штамма СМ973. -

^и-чтяское уАртцроппци»- хромосомных перестроек, у мутантов - >

Штамм НЗНО содержит природную штерсня хромосомы между оперонами ггг>Е> и ггпЕ, в результате которой направление транскрипции гена ис_р меняется на противоположное по сравнению со штаммом дикого типа (рис 3).

Отбор инверсионных мутантов у птаммов - производных Н3110 проводили по схеме, использованной при получении описанных выло мутактов-ггроизводних штамма Н£гН с нормальным порядком генов на хромосоме. .С этой целью в геном ютанма И3110 с покояью трансдухции Фагом были последовательно юведены мутации ЪЬуА и йеоА, необходимые для проведения селекции на усиление экспрессии гена ийр, а также »«нсерция юеЬЕ::Тп10, которая индуцирует образование хромосомных перестроек. В итога Сил сконструродан штамм АК2150, используемый для получения инверсионных, мутшгго».

В результате проведенной селекции от штамма АМ2150 били получены 4 независимых мутанта (АМ2151-АМ2154) с фенотипом, характерным для олисвшшх ешо инверсионных мутантов с повытеной онспросиией гена ийр. Мутщгш-прсизводаыо НЗИО анализировались с понооыз методов физического картирования (ПЭ5> и Сауэерн-гмвриднэации с зондами, содержащими клонированные гены ийр и ГГпВ). С помощью этих методов были получены следующие результаты.

V исходного втамна АМ2150 ген ийр находите« на фрагменте Б (43 тем), в то врекякак у асах четырех мутантов наблюдается гибридизация зонда ри<13(и<]р) о двумя другими Фрагментами: размере] около 360 тпи н 35 »». Помимо этого, зонд рКК3535 (ггпВ) также выявляет у мутантоа новые Фрагмент, содержащие опероны ггп: Фрагмент 120 тли и фрагмент 35 тля

Появление новых НоЫ-Фрагнентоп, содержащих гены ис1р и ггп . . может выть объяснено генетическими перестройками хромосомы мутантных штаммоп, гипотетическая схема которых представлена на

рис.3. В соответствии с этоя схемой на первом этапа в геноме штамма ЛМ2150 происходит инверсия между сайтом интеграции транспозона ТпЮ в гене шегЕ и гибрвдным оперсном ггпО/Е (рмс.З с). На втором этапе происходит неравнь'й кроссинговер иеаду

»'<-1£ '! >,? Г.» к ГГГ ~ .

ТГ

АЮ00 Ч'ОО -Ч.< "41 "С'<0

; . '

ггнр^О г <-" \ «1Г(» |»«1С ч С

----- ~Г —,— . о. 1С "Г"

¿з с!Ь' I' : . —> I ,

Т4Э Ь43 игоо "¡10

I I

ггпСУУ . |тпА I пи/г »>е 1 НУ г г г.?/!'.

"г" 'г- **— «пс -->-—

¿±э 1 / лгд сзхйгз

а*8ю .' гхз я'зсо '•гоо "со

С/1)

309

мЛр/ггиВ/Е/А ' ГТ(10*Р гтл | : Ыр^ггпйгГ. .

7~ -7- : -г— «г<е -—■-■

i ... i гЬ '—" irji.il.i ,'уд

А с«о чз Т35 ^зео 'гоо "5го .

Рис. 3. Схематической изображение Физической карты хромосомы штаммов: а) АМ174 {дикий тип); Ь) АМ2150 (Н3110); а также механизм образования хромосомной перестройки в мутанте ДИ2151 (1!№/ТиР 30 Ке) как результата двух последовательных событий; шшзрски (с) и дупликации С а)- Показано располояениа маркеров на ^оЪГ-Фрагмен-тах, разделяемых о поиосъю 035.

к г

' перемещенным в район локализации гена udp участком гибридного опероиа rrnD/E и оперонои гггА, который приводит как к дупликации гена udp а состава фрагментов 360 тли и 35 тли, так и к дупликации участков опарона ргпЛ и гибридного оперона rrnD/E (рис. 3 d,e). В результате этих двух последовательных ccSuTun образуется генетическая перестройка, присутствующая в геноме мутатов ЛМ21Ы-ЛН215<1.

Таким образом, » генома штамма ЛМ2150 проведение селегаши па усиление экспрессии гена udp, так же, как и в случае штампа ЛИ174, приводит к отбору инверсий, а которые вовлекаются оперони, контролирующие сынт з рибоссмальных РНК. Направление этих инверсий определяется относительной ориентацией гена udp и оперонов rrn по отношении к catín' инициации репликации хромосомы (oriC).

В генома штаммов с гюрмольнык порядком генов на хромосоме (/¿1174) tvicuepciut происходят и направлении против часовой стрелки относительно геиа udp, тогда tte¡r.. в геноме штаммов-проадводных VI3110 г по часовой стрелке. Крона того, инпэрсин, образуемые в геноме ЛН2150 сопроважаамтся дупликациями Фрагмента хромосомы между опоронамн rrnD/E н ггал.

Следует отпатить, что во всзх исследованных случаях образовашю инверсий, согласно предполагаемому иехашгаму (см рис. 1, 2 и 3) .. должно сопровождаться нарушением це-лосшчсти отдельных оперонов rrn(. Дл* патучеты дополнительных докалате.-.ъстг., свидетелъстпуюизи о наличии структурных «аруввшш в пределах отдельных rrn оперонов мы воспольавалксь методом физической идентификации rrn оперонов, предложенным в работе Хилла с соавторами (Hill, Gray 1038; Petes, Hill ЮЗв).

Физическоа' кпртнполаниа кг^чпг.пьпт* п°т»»г-трпек метпппм

Хилла. л

Нетод физической идентификации оперонов rrn основан на том, чт! ни один из 7 оперонов rrn E.coli на содержит сайтов узнавания для рестриктаз Bacilli u Patl. Поэтому фракционирование с помощью обычного электрофореза суммарной хромосомной ДНК E.coli, обработанной атики Ферментами и последующая гибридизация с РНК ил ДНК.зондами позволяет четко идентифицировать все 7 rrn оперонов.

Результаты гибридизации зонда рКК3535 с BamHI/PetX фрагментами

хроиосомноЛ ЯНК гтверсиогашх мутантоз СМ973, А1!21о1, АМ2151, »^сходных штаммов AM 17*1 и ЛМ2150, а таюте контрольного штампа ABl157 свидетельствуют о том, что в результате хромосомных перестроек у иутантних штаккоо происходит нарушение соответствующих rm-опероноз. V этапиоз дикого типа (ABl 107 и ЛМ174) распределение ггп-опероноп соответствует литературным данным (Hill, Gray 1900). У штамма ЛМ2150 вместо полос, соответствующим оперонам rrrD и ггпЕ появляются дез■ноете полосы, соответствующие гибридным опгрсисм rrnD/E и хтпЕ/D. У мутанта АМ2151 в отличие от родительского штзкка ЛП2150, пропадает полоса, соответствующая гибридному.оперону rrnD/K, но пслвляется новая полоса более;. низкого молекулярного сеса. V мутшгга СИ973 пропадает полоса, соотпстствгвшпй оперону rrtsD и пслилявтся новая полоса с еяе более низким молекулярный песий. Что касается мутанта AK213L, то у него гропаг.ает полоса, соотистстпующая оперону ггпВ, и появляется новая полоса, распстохекнзя в jioftone локализации полос опероноо rrriG и rrnC. Пол-Винные данные полностью ;

подтверждает преллокешше выго схемы обрлг.опани-~ хромосомных ' перестроек в HHPiрсио!и»д:'. мутачтах (рис. 2, ;<ис. 3), а также убедительно свиг.м дельспзуот о Hapjwwä» целостности' различных оперонов ггп о r*Hc«f этих мутантов.

В ходе описании;; выше экспериментов. удался» уто'пздть «»«ческу» карт;; К.coli Is области B5-G6 икиуты генэтичссш»! аарты, не . картировтп«-:Л 'я работ« Ruith с соавторами (lSt$7). В стоп районе : кпходятся да«, глентичт1 к НоЫ-Фрагманга pacrptntvinr S Т, имеющие оданаковгя размер 43 тел. Порядок геиет.ччеевмг. неркеров, нзхсдяпихся в этой облает»'., слсдуюш»?л: llvG- taetK- u.lo- polA-rrnA. Оба зонда- содерга^ие гаа«1ромш«е ггчп» Vdv и гтоВ, гибридизумтся с донныни BotI-фрагментам!. При этом перестройки, затрагав'змг.гте ген udp, не нэнечят локализацию «.рггмента. содержащего опером гггА. Сл"лсватель;и~>, гони xtdp п vir А маркируют, соотг.етстзенкс, HotI-фрагменты 3 и Т, устанавливая их порядок на хромоссмг С.coli. Ген роЗЛ, о->чесе."!'чП Смтгг « соаогг>ра»'и (Smith. 1567) к «догивкту S, по г'шаш лш'.'ш, с~рот«»аэ всего, просится на фрагменте Т.

фгутояркпа каингшяаикя зшоиосомиыя нзменоний..итанма /:Н2131 -" С помощью П&Ь и Саузерн-гнбридизации с зондам PÍÍK2535 (ггпВ) удалось установить лишь то, что хромосомные перестройки у данного штамма затронули опзрои ггпВ (исчезает фрагмент разкером 240 тан) it привели "Л появлению нового фрагмента размером 180 тпн, который гибрмдазуется с зондом рКК3535.

Гибридизация по Хнллу BamiII/PctI-фрагпентов хромосомной ДНК птенца АМ2131 с тем не эсндон Taitse продсшоистрироЕола исчезновение оперона ггпВ.

Кроле того, на а .-ограде в paitaste локализвцгы полос, соответствующих опероиам rrnQ it ггпС, появилась дополнительная полоса. Точность метода Хилла не позволяет конкретно установить, какой из этих двух опероиов подвергся перестройке. Teti не менее, мокло предположить, что, если все перестройки с участием ТпЮ происходят по одному принципу, серогтисе ¡зеего, затронуты опэроны ггпВ и rrnG, поскольку они имеют лротшзополо&ное направление транскрипции.

Подтверждением етого предположения слугит Соузерн-гиЗридизания по методу Хидда ШяШ-фрагнзитов жроиосшюоА ßfK нутантных штаииоп с зокдеи j?KX3535. V втаыивч /«¡кого lima АБ1157 и ЛМ174 четко виш-п. 7 пкjoc, соответствуй^!« илдкв»ит/с/гьнкм оперонвм ггп, полученным при cSpECo'nie тотальной хре-- лсоглоП ДНК штаммов рестриг.тазоп Uaidil. Расположила полос совпадаем с описанный п литературе (НИЗ efc al., isao).

У. штамма АИ2131 пропашет полс-си, соотсатстпую-дне опероиам rrnG И ггпВ н пояплается гибридная полоса, расяилонгешгая- между полосат: ггпС и ггпЕ.

На основанш! полученных дагтгыл, на пр'-длэаали схему, объясняющую перестройки, прои^-лпедшиа ¿i хромосома шталма АМ2131 (рис. 4).

В соотЕетствгш с данной схемой, на первом элле рекомбинаиионных ср&п>'й о .-вкоии ).»>a№¡u АИ17-» происходит инверсия между протизот.ол.лип и.'прапл^нльо.л onepoi".ни ггпЗ и ггпВ (рис. 4 Ъ). На втором fr¿ не происходит нето- - ш ранние рем между гибридны», опвроном miíi/9 и ес-ггсм интртацни транспозона Тг» 10 в гене matE (рис. 4 с). В результата такой частичной рэииверсии образуется

транслокация участка хромосомы, заключенного между гибридным сперонон ггпВ/С и последовательностью транспогона Тп 10, а тшикэ изменяются размеры трс:: !1оЯ-фрап:снтов рестрикции хромосомы данного штамма: Е, 3 и Н.

N71

ппй

шшайа

Е 250

Чооз

ипЭ опС тпв1Еийр «тпА ггт>В ггпЕ ':2С9 й« ТИЗ 11'

2ИГ.

I

КГ/

гтща

Е *>е>п

Н'

269

1-пД ис!р_тс(!£ >

СП Т

ГГПС/В 1ГПЕ

спС ггпС/СггеЕ _{ 4-

=а шшт '-гея Н-,

Л/42/3/ (ГУ//7М МО)

Рис. Л. Схематнч'»сков гчсСраяеииэ .дозичвопой карты храмовой

штаммов: а) ..¡¿17.1 (о-иГ г:1'1), с) Л112151 {1!Г//ТВЫ60), а такко к-зяаинзи сЗре^вакия хромосомной пэревтройЮ! в хроиосо:« !!утант;'. №-131 как гсэулчтатл .><чух последователь --ас: собып«* :мняерсш> (а) п частичной рсинверст», результатом котором «вдьзтея транслокацня (с). Показано расположение марпсрся «га НоН-фрагпентах хроносомц, Фракционированных П21>.

На пульсэлектрсл.ореграмме tlotl-рестрикционных фрагментов хромосом ¡.1Т".'1Мов -производных Hfríl, помимо четко Еыравекного нового фрагмента весом 180 тпн (фрагмент-Н~), присутствует и два ■других, образозаптихсгг в 1»ззультате данных перестроек, фрагмента: Фрагмент размером 55 тпн, соответствующий фрагменту В*-и фрагмент '^размером £30 тпп, ссэтвотстеую!.".!й фрагменту Е*.

'Гагат образом. даиице, полученныь с помощью ПЭФ, Саузерн-габрндмзаини Ü метода Хилла, полностью соответствуют друг другу, а их мнт<,рлрнтация у;тодмвг:с-тся в раи>:.и предложенной гипотетической схемы образовышп' хромос-'.иних n'-i-естроес у мутакта АМ2131.

: ' ' ВЫГОДЫ.

1. ОтраЕ^та:-! нетод отюра муч¿".поп E.coli, несущих хромосомные • nspecri сзйкм . Селекция на усиление экспрессии г?на udp в геноме

deoA mütE::TnlO позволяет изолировать хромосомны* перестройки, □атр.-.гппающие рибосокные оперони. Пр'.1 помощи данного метода ..получена две седом мутактои - производных bt&mmos Hfrtt и W3110.

2. ТЦ-эведеио фнзическоо картмрованмэ ют-версн* i IHV I; предположения .о причине изменения характера регуляцгл гена

.. V-РШ'.имфосфорилозы, вследствие инверс.ни попадающего под контроль (*'ген/1 rrnD, поятчерядеио Физическими методами.

о. Мс-тс.^ж ПЭФ ъияилет природа различных хромосомны:; tiépecnW'A. и определена протяженность инверсий в геноме мутантов -произво/аал; втьимст Hi'rlt и И 3110. Пока-зно, что во веек иослз/'Э8в>Шь> елучг.-.- ••: в образование; инверсий вовлечь .и оперони рг.Зрсомяих PI-üc. Уст':нрпя.-5но, что один конец инверсии находится внутри гез'.ч metE, другой - внутри различишь рибэсс-'.ишх огг.рот'св.

'1. Ни годом Хилла подтверждено нарушали. • целостности 1,'НШ1ьидуал!!1ых ггп-о1".-т5онов у различных ышер :исч них чутш.гом; сочетание ь-ого метода с пульс-злектрофорезом позролмло установил Природу хрсмосс тзчых изменений штамма &Н2131 (XUV 160).

5. Уточнена физическая карта П.coli в области G5-6Ö" минути генетической карты. Показано, что ген ц'-р находится на Фрагменте ¡3. а гены r-rnA и ро!Л - на ц , -згценте Т llotl-пульсэлектрофореграмки.

6. Установлены размеры Uotl-pecTpuKiuscifiaix фрагментов контрольного штамма Л!! 174, определены различна п размера;; Фрагментов штампов AÎ1174, АП2150, АВ1157. • ■ ■

7. С помскью метода Уллла выявлена определенная гетерогенность в отношении количества и локализации piiSocose-nct опероноп ряда лабораторных штаммов из коллекция ИПЯ1Генй-гак.а.

рзЕотад:. •

1. Миронов Л. С., Пастухова Т. Л., Никольский Ю. В. »ФоиштеЛн

Н. Ю. 19S0. Генетическое и физическое метиросише хромосомных перестроек, вызываказг; усиление зкс;!рессин гена udp у К.call К-12. 4 Всесоюзная вяола-Ьешшар молода« ученых "Пэротэктивныз • ' направления и иовыз методы в иолзкуляриоп Огологда". Рига, стр. 16

2. Mironov А., T. lîikolDkoyn, 'in. îîikolEjr/, S. Kulakauskao, M. Fonstein. 19Э1. TnlO prenoted chrornoaotoal rearranseaisnfcc causing fusions between the uridine phoaphorylase csna and ribotsomal MJA operono in Escsrichia coll. "Molecular biology of Îiîcteria and. Phages", Cold Spring Harbor Laboratory, i<old Spring Havbor, Uew York, p. 130 . . '

3. !!. Fenotein, A. liircnov, and T. HiJ:olo3v.ya. 1SS2. targe scale rsarrageacnto of the E.coli genome, cwiee'i by reccsj&lnation between RîiA opérons end TnlO, integrated upstrsaa o£ t'ne w!p ¡¡sui. Journal of Cellular Biochssiotry, Supplement l£8, p. 81

4. Mironov A. S., iUJiolehaya Т. А., 1Ш:с1сЬу Vît. ?.. KuleUcauakao

5. T., "ел г; te in li. "Tu. 10Э2. Fusions between udi- ribocomal MU ' genes in Eaoîiorichia coll promoted by TnlO. 6s09%iee, » ttv-tsnt.