Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фитотоксические метаболиты Botrytis cinerea Pers. Образование, свойства, биологическая активность

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фитотоксические метаболиты Botrytis cinerea Pers. Образование, свойства, биологическая активность"

8 АВГ 1394

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного

На правах рукописи

РУБЕЖНЯК Ирина Георгиевна

ФИТОТОКСИЧЕСКИЕ МЕТАБОЛИТЫ BOTRYTIS CINEREA PERS. ОБРАЗОВАНИЕ, СВОЙСТВА, БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: доктор биологических наук A.M. ЗАЙЧЕНКО доктор биологических наук Л.П. ТРОШИН

Кие is - 1994

Работа выполнена в отдела .Физиологии и систематики микромицв-*ов Института микробиологии и вирусологии ш. Д.К.ЗаОолотногоЖН Украины

Научныа руководители: .

доктор биологических наук А.М.Зайчзнко,

доктор биологических наук Л.П.Грошик

Официалышз оппоненты:

Доктор биологических наук Л.Д.Варбанец Кандидат биологически наук И.П.Мисюренко

Водуцая организация;

Украинский аграрный университет МСХ и П Украины

ЗЬцота диссертации состоится "Л/" 1994 г.

в /¿'""часов на заседании специализированного соаата Л 016.06.01 при Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного АН Украины по а^асу: 252143, Киав-14^, ул. Заболотного, 154

С диссортациэ» мокно ознакомиться в библиотека Института микробиологии и вирусологии и?.;. Д.К.Заболотного АН Украины

Автореферат разослан " /О " -и/сыЛ- 1994 г.

Учены?! езкратарь

Специализированного ученого совета "*

кандидат биологических наук Л.М .Пурша

ОВЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Botrytis cinerea Pers. широко распространен в природе, но преимущественно встречается в регионах с влажным климатом. Он является факультативным паразитом, порадеет свьтае ?00 видов культурных и дикорастущих растений из различных с?мрйств. (пасленовых, бобовых, зонтичных, крестоцветных, сложноцветных), у которых вызывает скручивание и опадание листьев, цветов и гниение плодов. Болезнь развивается не только в период вегетации, но и после уборки урожая. В.cinerea является наиболее агрессивным возбудителем кагатной гнили капусты, гнили сахарной свеклы и моркови.

Среди поражающих факторов гриба чаще всего отмечают его высокую ферментативную активность - неполитическую, амилолити-ческуи, протеолитическую ( Рубин, 1953; Picol, 1965; Domsoh, Gams, 1969; ИгЬалек et al., 1978 ), а также способность к образовании щавелевой, лимонной и ряда других органических кислот (Рубин и др., 1964; Kamoen et al., 1974), некоторых метаболитов, таких как ботридкаль (Fehlhaber et al., 1974;), фитотокси-ческих полисахаридов (Аксенова, 1962; Аксенова и др.,1964; Vannel,1991).

Однако, текие исследования выполнены преимущественно на отдельных штаммах и не дэмт четкого представления о токсигенном потенциале вида в целом.

Остается не выясненным механизм фунгистатического и, в большинстве случаев, фитотоксического действия, не изучена токсикология вида и его потенциальная опасность для окружающей среды. Актуальной представляется разработка методов выделения фитотоксических метаболитов (ФТМ) 8. oinerea, их идентификация и возможное применение в селекции растений in vitro.

Цель и задачи работы. Цель» настоящей работы было изучение ФТМ В. cinerea, особенности их образования, свойств и биологической активности. Достижение поставленной цели предусматривало решение ряда конкретных задач:

- отобрать на основе полученных данных наиболее активные культуры;

- разработать метод выделения ФТМ, изучить их некоторые физико-химические свойства и биологическую активность, включая возможность использования их в качестве селективных маркеров

- г -

при выведении устойчивых сортов растений;

- изучить некоторые аспекты механизма фитотоксического действия выделенных метаболитов.

Основные положения, которые выносятся на защиту. В результате выполнения поставленных задач сформулировано ряд положений, основные из которых выносятся на вапдату:

1. Исследуемые штаммы В. cinerea характеризуются идентичным компонентным составом. Отмечаемые различия носят количественный характер.

2. Из иультуральннх фильтратов В. cinerea 109815 выделено в кристаллическом виде два вещества. На основании сравнительного анализа полученных данник и данных, имекящвспя в литературе, можно утверждать, что вещество D? является новым, ранее неизвестным для этого гриба, фитотоксическим метаболитом.

3. Впервые покарано, что ФТМ В. cinerea могут быть использованы в качестве селективных агентов при получении устойчивых сортов винограда методом культуры ткани in vitro.

4. Разработан метод выделения ФТМ В.ciñeres.

Научная новизна работы характеризуется следующим:

- Впервые с использованием большого числа штаммов исследо-Еан токсигенный потенциал В.cinerea. Показана идентичность компонентного состава токсических метаболитов исследуемых птзммое.

- Отработаны условия синтеза ФТМ, в том числе и 14С~0ТМ, наиболее активными штаммами .

- Проведена частичная идентификация отдельных компонентов фитотоксического комплекса д. cinerea. Выделенные вещества отличаются от известных ранее.

- Изучена антибиотическая и фитотоксичеекая активность ФТМ В.cinerea.

- Фитотоксичеекая активность метаболитов В.cinerea связана с действием на синтез пигментов, что, по всей видимости, определяется их способностью ингибировать синтез белка.

- Впервые показана принципиальная возможность использования ФТМ В.cinerea для селекции устойчивости винограда in vitro.

Практическое значение работы состоит в том, что изучение токеигеяных свойств штаммов В.cinerea позволяет реально оценить потенциальную опасность этих грибов для сельскохозяйственного производства.

Изучение ФТМ В.cinerea и особенностей их действия на рас-

тения открывает широкую перспективу использовэния их для селекции устойчивых сортов растений, поражаемых этим грибом.

Апробация работа. Материалы диссертационной работы были представлены на конкурсе фундаментальных работ института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного АН Украины(Киев,1994).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 6 глав, обсуждения результатов, выводов, списка цитированной литературы.

Работа изложена на 126 машинописных страницах ( учетный текст - 88 страниц), включает 5 таблиц, 3Q рисунков, а также библиографический указатель из 119 источников литературы, в тем числе 99 работ иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА

Botrytis cinerea Pers. (обзор литературы).

В данной главе, представленной 4 разделами, дается общая характеристика метаболитов В. cinerea и их биологическая активность. Рассмотрены некоторые особенности биологии гриба, его распространение в природе, некоторые аспекты выделения, химического строения и свойств токсических веществ. Рассмотрены ги1-потезы механизма патогенеза В. cinerea.

Один из разделов посвящен использованию токсинов грибов в методе культуры ткани для получения устойчивости к болезням.

Подчеркивается недостаточность сведений относительно биологии В. cinerea и его токсических веществ и дается критический анализ литературных данных по изучаемой проблеме. Очерчиваются перспективные направления исследований.

Глава Z. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования, В настоящей исследовании было использовано 36 штаммов Botrytis cinerea Pers. Краткая их характеристика представлена в табл. 1.

Выделение и идентификация культур грибов проводилась различными исследователями, и в наие распоряжение они были предое-

Таблица I

Список исследуемых штаммов Botrytis cinerea

» н т 8 пп 8 •f tl « ш н « № Ü т а м м о в!1 и »♦ и Год и место выделения

"■■T'U I. «1 16093 1991, семена подсолнечника, У1фЮ1ИЗР

2. 16094 1990, озимая пшеница, стейель, УкрНШЗР

3. 127 1991, воздух, Ташетрополитен, Узбекистан

4. 107 1991, почва, глубина 5-15 ск, Киевская обл.

б. Зл 1984, чешуя лука, плодоовощная база, Киев

б. 2389 1991, почва, лесхоз, Ново-Шепеличи, Киевская обл., 10 км зона ЧАЭС

7. 225В 1990, почва, Киевская обл.

8. 2356 1991, лесная почва, глубина 8-10 см, Рожны, Киевской обл., 10 км зона ЧАЭС

9. 73600 1991, листья каштана конского (опад), Киев

10. ■ 2246 1986, почва, .глубина 5 см, очисные сооружения, г. Саки, Республика Крым "

11. 2353 I9SI, лесная почва, глубина 8-10 см, Чистога-новка, Киевской обл.

12. 2219 1991, почва, лесхоз, Ново-Шепеличи, Киевская обл., 10 кы зона ЧАЭС

13. 16083 1990, стебель тоштов, ВЛНХ, Киев

14. 15809 . 1963, зегегто^ющив растения сахарной свеклы,

15. 2307 IS69, шелуха лука, плодоовощная база, Киев

16. 15970 1986, привой винограда, Молдова

17. 15969 1986, стебель огурцов, тепличное хозяйство «Совки", Киевская обл.

16. 109615 1972, листья винограда, Республика Крым

19. 15973 1986, лук репчатый, плодоовощная база, Киев

20. 16063 1990, основа стебля сорго, Молдова

21. 16052 то, почва ризосферы шалфея, Ц?БС АНУ, Киев

22. б/и 1991, г.8ньшень, Боярка, Киевской обл.

23. гр •7,уч. I ГУ91, II II 11 II |> II II И II

24. гр .1, лис 60 1991, II II II II II II II II - II

25. rp.64,yv.I 1991, И II И II 11 II II II II

тавлечы главным образом из музея отдела физиологии и систематики микромицетов старшим научным сотрудником И.А.Элланской. Штамм (109816) был получен из лаборатории биотехнологии Института винограда и вина "Мэгарач" УААН (Ялта).

Методы культивирования?. Исследуемые штаммы В. cinerea культивировали, в зависимости от поставленной цели, либо поверхностным, либо глубинным способом.

Штаммы В. cinerea в большинстве случаев культивировали в колбах Эрленмейера на 0,7 л, содержащих 0,1 л жидкой среды, состоящей из виноградного сусла, разбавленного в 2 раза водой, pH Б,8 ( за исключением случаев, оговоренных особо) . Вырашва- . ние проводили при температуре ?.6-2в°С в течении 12 суток, что отрабатывалось в предварительных экспериментах.

•Засев проводили суспензией конидий, полученных путем смыва соответствующей культуры № суточного возраста на виноградном пусло-агаре стерильной водопроводной водой. Густота засева - 2 х 107, конидий /мл.

В динамике культивирования исследуемых штаммов определяли: биомассу (весовым методом после высушивания ее при 106° С до постоянного веса), выход ФТМ (весовым методом после очистки). Продуктивность процесса токсинообразования за исследуемый период рассчитывали с учетом полученных параметров и выражали в мг/r мицелия.

Хлореллу культивировали глубинным способом на качалке (в темновом режиме или при освещенности 4000 лк) по методике, предложенной Zaich<?nko et al. (1989).

Физико-химические методы анализа. Для изучения физико-химических характеристик индиввдуалных компонентов ФТМ В. oinerea использовали ряд общепринятых методов.

Содержание отдельных элементов определяли при помощи качественных реакций ( сера, галогены), а также микроаналитических количественных методов (углерод, водород, азот) /Черонис, 1960/.

гН-ЯМР спектры регистрировали при помощи НИР-спектрометра "Jeol" FX-60 (H-IOO.1 Mite, (СОэ)г CD) с использованием в качестве внутреннего стандарта фляорокеросина при температуре 22°С .

Качественный моносахаридный состав образцов изучали при помощи метода ГГОС в виде ацетатов полиолов. Обработку образцов

проводили согласно Albershein (1976). Анализ осуществляли на газовом хроматографе "cnrom-5" (Чехия), с пламенно-ионизационным детектором на колонке (3,0 х 1,2 мм) с 3%-ным неопеятклгди-коль-сукцинатом на хромсорбенте W (60-80 меш) при режиме хрома-тогрэфии 170-20Q0 M (5 0 с/мин).

Для определения аминокислотного состава образцы гидролизо-вали 6N HCl в течение 20 часов, а затем определяли на аминокислотном анализаторе Biotronik L0-50Q1 (Германия).

Биохимические методы анализа. Исследуемые пигменты (хлорофшшы айв, каротинояды) экстрагировали абсолютным ацетоном, а их содержание рассчитывали по уравнениям, составленным на основании экспериментально полученных удельных коэффициентов Хольма-Ееттштейна /Полевой, Максимова, 1978/ с использованием спектрофотометра "Beckman" DU-8B /Австрия/, Все определения проводили через 30 часов после посева, что соответствовало середине логарифмической фазы роста хлореллы в условиях эксперимента. В отдельных опытах отрабатывали действующие концентрации ФТМ.

О действии ФТМ на синтез белка и Нуклеиновых кислот судили по включению /3Н/-лейцина (40 MBq, 1080 mkCi)/"Изотоп", С-Пе-тербург/ и 2-14С-аденина (40 MBq, 1097 mkCi)/MTA IZOTOP INÏEZETE, Budapest/, соответственно. При этом использовали методику, описанную Рязановой с сотр.(1982).

Радиоактивность образцов на фильтрах "Synpor" N б /Чехия/ измеряли с помощью жидкостного сцинтиллеционного спектрофотометра "Beckman" 8700 /Австрия/. В качестве сцинтиляционяой жидкости использовали смесь ЖС-1.

Поглощение 14С-ФТМ клетками Chi. vulgaris изучали, используя метод, предложенный Röder, Gräfe (1985), с некоторыми нашими модификациями, который предусматривает использование мече -ных метаболитов.

14С-ФТЫ получали путем культивирования В. cinerea в стандартных условиях с добавлением в среду 1-14С-ацетата (80 MBq, 2160 mkCi) /"Изотоп", С-Петербург/ с активностью 216 mkCi/мл, который вносили на 4-е сутки культивирования. Суммарная активность препарата ©ТЫ, выделенного из культуралъных фильтратов В. cinerea, составляла 1,47 х 106 имп/мин (22,4 мг).

Методы изучения биологической активности ФТИ. о биологи-

ческой активности выделенных препаратов ФТМ судили на основании научения их антибиотических и фитотоксических свойств. Препараты ФТМ растворяли в этаноле таким образом, чтобы конечная концентрация его в исследуемой системе не превышала 0,1%.

В настоящем исследовании были использованы 2 штамма фито-патогенных бактерий( Erwmia carotovora sub. sp. carotovora 8982 и Clavibaoter michiganense 13), а также 1Б итвммов дрожжей, относящихся к 14 видам и 8 родам, а татаке 28 штаммов грибов, относящихся к 23 видам и 11 родам. Среди них были как фи-топатогенные, так и токсигенные для человека и животных виды.

Оценка фитотоксической активности исследуемых препаратов проводилась методом дисков с использованием тест - системы Chi. vulgaris 62 (Еилай, 1682).

Наряду с этим, фитотоксическая активность метаболитов В. cinerea оценивалась при использовании в качестве тест-объектов ряда высших растений, представителей различных семейств, а также культуры ткани винограда m vitro.

Исходным материалом для получения культуры каллусной ткани служили интенсивно растущие зеленые побеги винограда, которые после стерилизации диоцидом высаживали на безгормональкую среду Murashig'e-Scoog (1962) с добавлением гумата натрия (10мг/мл). Высаженные эксплантаты культивировали при 23-28°С и освещенности 2000-2500 лк.

30-40-дневные побеги длиной 4-5 см служили исходным материалом для выращивания каллусной ткани винограда. Каллус выращивали из черешка листа виноградного растения в чашках Петри на среде Schenka-Hildebrant (1972) при 28°С без освещения. Через 30-40 дней первичный каллус пересаживали на свежую среду и культивировали в тех же условиях. Характеристикой роста служил прирост ткани аа 3 недели, который расчитывали по формуле (%)t

ter-ifun- иг,)/к]-Mo

где -ftf^ - конечная масса каллуса и - начальная масса каллуса.

■ Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ И

ТОКСИГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА. ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ.

, г

В литературе крайне мало данных о токсических метаболитах

В. cinerea , и такие исследования, как правило, выполнялись на отдельных штаммах (Bradshov et al.,1960; Fehlhaber et al.,1974; Weimar et al., 1979; Culter et al., 1988) и не дают достаточного основания для суждения о токсигенном потенциале вида в целом.

На первом этапе ставилась задача сравнительной оценки ток-сигенных, а также некоторых других свойств исследуемых штаммов грибов ( выход биомассы и суммы внеклеточных метаболитов и др.) с целью отбора наиболее активных из них. Компонентный состав фитотоксичееких веществ изучали, используя метод тонкослойной хроматографии (TGX) в системах эфир:толуол (1:1) и эфир:ацетон (11:1).

Результаты этой части исследований кратко можно сформулировать так:

- биомасса исследуемых штаммов варьирует от 6,0 до 9,0 г/л, хотя для большинства из них граница этих колебаний существенно уже (8,2 - 7,9 Г/л);

- выход токсических метаболитов характеризуется определенным постоянством для большинства штаммов (67,0-174,0 мг/л); в то же время штаммы 16093, 2307 и гр.7 уч.1 образуют ФТМ на уровне 204~<?06 мг/л, а штаммы 2358, 1Б969 и, особенно 16970, характеризуются очень высоким выходом ФТМ (860 мг/л);

- высокой продуктивностью процесса токсинообразования характеризуются гаммы 2358 и 15970 ( 84,7 и 113,6 мг/л, соответственно)

- выход ФТМ не коррелирует с их высокой токсичностью в отношении Chi. vulgaris;

- штаммы 16093, 15973, 16093 и 16052 проявляют высокую активность препаратов как иэ мицелия, так и культурапьных фильтратов. Не прослеживается какой-либо взаимосвязи между образуемой биомассой, выходом токсина и источником выделения штаммов, хотя все высокоактивные штаммы, отобранные для дальнейших исследовании, были выделены иг филосферы различных растений.

Исследование компонентного состава ФТМ мицелия и культурам ных фильтратов методом ТСХ обнаруживает строгое постоянство их качественного состава. В то же время отмечаются существенные различия- в количественном содержании отдельных компонентов. Так, ФШ мицелия (эфир: толуол, 1:1) у всех без исключения штаммов тгредставлеш 9 компонентами, среди которых вещества с Rf

0,18; 0,30 и 0,72 характеризовались высоким содержанием. В то же время в системе эфир: ацетон (11:1) обнаруживается И компонентов, а по количественному содержанию существенно выделяются компоненты с Rf 0,79 и 0,92.

ФТМ ив культуральных фильтратов обнаруживают высокое содержание компонентов с Rf 0,18; 0,30; О,ВО; 0,72 (эфир: толуол, 1:1); а в системе эфир : ацетон (11:1) - 0,19 и 0,70.

Глава 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ В.CINEREA ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

До настоящего времени не проводилось сравнительных исследований штаммов В. cinerea при различных способах культивирования о использованием различных сред, хотя такие работы представляются весьма важными как в плане возможной отработки оптимальных режимов токсинообравования, так и в плане сравнительной оценки потребностей различных штаммов. С целью получить ответ на этот вопрос и была предпринята попытка изучения некоторых физиологических параметров отобранных нами наиболее активных штаммов.

Эта часть исследований выполнялась в Э этапа. На первом иэ них проводилась сравнительная оценка этих штаммов (109816, лис.80, 16093 и 16973) при культивировании на четырех различных средах: виноградном сусле, минеральной синтетической среде (МСС) (Kimura et al., 1989), а также среде Чапека либо с глюкозой (20г/л), либо с сахарозой (24 г/л) в качестве единственного источника углерода и рнергии (Бивай, 1982).

На втором этапе проводилась оценка наиболее активного штамма 16093 при поверхностном и глубинном культивировании, и на третьем - исследовали активность штамма 109816 в оптимальном для него режиме культивирования.

Основные результаты этих исследований в сжатой форме можно представить так:

- выход биомассы и особенно ФТМ у исследуемых штаммов при культивировании на различных средах существенно варьирует, а высокая продуктивность токсинообразования, за некоторым исключением, коррелирует с высокой активностью препаратов в отношении Chi. vulgaris;

- высокой фитотоксической активностью на всех исследуемых

срздзх обладает штамм 16093, выделенный ив семян подсолнечника, а среда Чапека с сахарозой - является оптимальной для синтеза ФТМ 16093, лис-. 80 и 109816, хотя и оказалась менее благоприятной для их роста; среда с виноградным суслом обеспечивала более высокую активность препаратов из штамма 15973;

- более высокая активность препаратов из штаммов 16093 и 1Б973 может быть связана с повышенным синтезом более активных компонентов, о чем свидетельствуют и хроматографические данные;

- компонентный состав препаратов ФТМ как из мицелия, так и кудьтуражьних фильтратов характеризуется строгим постоянством на всех исследуемых средах, в то время как количественное содержание отдельных веществ существенно варьирует (рис.1);

- глубинное культивирование исследуемых штаммов обеспечивает Солее низкий уровень синтеза ФТМ, а сроки получения максимального выхода не. дают существенного выигрыша. Стабильность компонентного состава препаратов ФТМ сохраняется, хотя вариации в их количественном содержании существенно выше.

Строгое постоянство качественного состава ФТМ в мицелии и культурапьных фильтратах при различных способах культивирования и на различных средах, с определенными оговорками, дает нам основание рассматривать данное свойство в качестве видового признака В. cinerea Pers.

ФТМ В. cinerea, как показывает анализ кривых роста и биосинтеза, не являются типичными вторичными метаболитами, поскольку образование их коррелирует с периодом активного роста мицечия.

Глава Б. ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОЙ ПРИРОДЫ НЕКОТОРЫХ ТОКСИЧЕСКИХ МЕТАБОЛИТОВ В. CINEREA

Как уже отмечалось ранее, набор изученных биологически активных веществ В. cinerea ограничивается ботридиалем и его производными, микоспоринам-2, цинереарином и некоторыми другими веществами. В то же время, исключительно широкий спектр растений- хозяев, а такяэ разнообразие повреждающих эффектов гриба дают основание предполагать наличие существенно большего арсенала метаболитов, причастных к фитопатологическому процессу. Думается, что существующие ограничения в значительной мере определяются недостаточностью ваших знаний в этом вопросе.

/^вещества содержатся в следовые количества

Ч11У ЯНЯЦНТЙЛЬНН* KnnnOfiiTPRft* 1—^

ЧУ значительных количествах

! 11 • ! 4 ! • к 1 м ! к {А|{ к к \М

00 ООО П О о % <®<®

^ОООФ^ФФО^Ф^ООО

& Оо О ООО с о

<Ш ШФФООООО® ФООООООООФФОФФФФ ®000000 0 00000@®0 оооаоооооооОО ООо О 00QОООоОО0ОФООФ

фО0 О О Оо О ОО О оо Ооо

с

@о0Оо оо 00 ООО о оо о

Г 2,3 A t £-4 1 2,3 > f-4 f 2-4 Н I 2 f-4

ИТ

0.I

-,--р-I--—

гит. 109&5 I лис.60 » 16093\ 1$9Гв !

I г I I 11

Рис. I. Схема хроматографического разделения ММ из культуральных фильтратов и мицелия накоторнх штаммов Ъ-сипвлгои , выращенных на различных средах •

I - виноградное сусло; 2 - среда МСС; 3- среда Чапэка с глюкозой; 4 - среда Чапека с сахаровой.

К - культуральный фильтрат; М - мицзлий

- 12 -

В попытке восполнить этот пробел мы и предприняли серив исследований относительно выделения иэ В. cinerea веществ, обладающая фитотоксическим действием.

В предварительных исследованиях было показано, что нульту-ральные фильтраты В. cinerea проявляют фитотоксический аффект лишь при существенной их концентрации, что указывало на незначительное содержание активных метаболитов.

С другой стороны, выделение полксахаридных фракций такжа не дало желаемых результатов, поскольку все препараты, полученные согласно метода Vannel et al. (1991), не проявляли фито-токсической активности в отношении Cnl. vulgaris.

В этой ситуации для выделения активных веществ нами был использован принципиально иной подход.

В. 1 Выделение ФТМ

Для экстракции ФТМ использовали 6 л культурального фильтрата В. oinerea 7-суточного возраста.

Ниже приводится общая схема выделения ФТМ В. oinerea, предложенная нами:

Культур&льный фильтрат Экстракция хлороформом (1:6, трижды)

Упаривание (вакуум) Жидкость-жидкостное перераспределение (ацетояит^ил:гексаи) Упаривание (вакуум) Растворение^ хлороформе Дегидратация^(безв. N32S04) Упаривание (вакуум) Препарат-с&рец (Б,63 г) Ступенчатая колоночная хроматография (силикагель, Ист. ак-ти, 100/160 мкм)

Процедура экстракции ФТМ иэ мицелия была аналогичной, за исключением того, что его предварительно замораживали в жидком азоте и затем тщательно растирали в фарфоровой ступке.

Выход фракций из колонки контролировали по содержанию в них сухих веществ после упаривания, а также при помощи ТСХ на пластинках "Silufol" UV-254 (KavalHer, Чехия) и тест-системы Chi. vulgaris.

Наряду с этим, осуществляли У®-детекцию веществ, дающих специфическое свечени» при 254 нм.

Визуализацию пятен на ТС5С-пластинках осуществляли путем , опрыскивания их 6%-ным раствором ФМК в этаноле.

Характерный профиль злюции метаболитов В. cinerea 109816 представлен на рис. 2, в котором просматривается В отчетливых пиков содержания веществ ( А, В, С, 0 и Е). Фракция А не проявляла биологической активности и в дальнейшем не исследовалась. Фракции В, С, DHE обладали различной степенью биологической активности в отношении Chi. vulgaris.

Менее активные полярные фракции подвергались хроматографи-ческому исследование в системе эфир:толуол (1:1), а Солее полярные - в системе зфир:ацетон (11:1). Биоавтография полученных фракций показала, что активностью в системе эфир:толуол (1:1) обладали вещества с Rf 0,43; 0,60; 0,60 и 0, 74, слабо активными оказались вещества с Rf 0,18; 0,20; 0,30. Во второй системе активность проявляли лишь вещества с Rf 0,76 и 0,92 (рис.З),

Путем кристаллизации из диэтилового эфира в кристаллическом виде были получены 2 индивидуальных вещества : Ее и D? с выходом ВО и 40 мг, соответственно.

В. 2 Некоторые физико-химические и спектральные характеристики выделенных соединении. В связи с необходимостью идентификации метаболитов В. oinerea i£38l5 проводили изучение ряда физико-химических и спектральных характеристик полученных веществ (см. главу 8).

Было показано, что они состояли из углерода, водорода, ' кислорода и азота. Сера и галогены не были выявлены.

Последующая гН-ЯМР спектроскопия указывала на структурную близость этих веществ, двхщих общий дублетный сигнал я области 6.28 м.д,, синглетный сигнал в области 4.fit> м.д. и общий квартетный сигнал в области 2.16 м.д. Отмечались различия веществ в области 3.0-4.4 м.д.

Сопоставление полученных спектральных характеристик с эталонными указывало на возможность отнесения зтих веществ к ве-. ществам гликоаидной природы. При этом предполагалось, что агли-коновые фрагменты исследуемых веществ различаются. В случае вещества Be он представлен стероидной структурой, что в последствии было подтверждено при помощи реакции Либермана-Бурхарда (Филиппович и др,, 1976), а в случае D? - веществом белковой природы, на что указывала проба с нингидрином.

Последующую работу проводили с веществом D? . Изучение мо-

= 2SD1

80 f

■i - Выход ФТМ ;

£ - epum&mokcutieckaSL OK-Tb.

/у// фракции

Vue. 2. ПросрилЬ эмоции ФТМ В.cinerea J09&15

I I )

NW <¡p p a fr и, &

Puc.3. T5uoa6moepazjjjxz отдельных фракций <РГМ Ja. cinerea f098fS

<Ш зона задержка роста чУ aht. vu Égares GZ..

носахаридного состава покарало, что отнесение его к гликозидам беэосновзтельно, так как в нем не обнаруживался при помощи ГЖХ ни один ив таких Сахаров как глюкоза, галактоза, манноза, ксилоза, арабиноэа, рибоза, фукоза, рамноза и зритроза .

При изучении аминокислотного состава вещества D7 достоверно удалось показать лишь присутствие лизина.

ИК-спектры вещества D7 обнаруживали полосы поглощения 3600, 3330 - ЗУ40, S8SÜ- 2940 си"1, соответствующие валентным колебаниям группировок -ОН, -NHa, -СН3, -CH« -, -С00-СН3 .

В тоже время, незначительное поглощение в области 1600-1600 см"1 указывало на присутствие в молекуле ароматической структуры, что подтверждается также данными УФ спектроскопии .

Сравнительный анализ полученных данных с данными для известных метаболитов В. cinerea дает основание утверждать,- что компонент D? является новым, ранее неизвестным для В. cinerea, веществом.

. Глава 6. ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФТМ В. CINEREA

Несмотря на широкое распространение В. cinerea в природе , о биологической активности образуемых им метаболитов известно крайне мало. Имеются сообщения об антибактериальной и фунгиста-тической активности двух сееквитерпеноидных метаболитов - бот-ридиаля и ботридактона (Fehlhaber et si., 1974; Weimar et al., 1979). Другое вещество - цинереарин, в значительной степени йн-гибировало рост этиолированных кодеоптилеи пшеницы. Однако никакого эффекта не отмечалось на интактных тепличных растениях бобов и табака, в то время как на растениях кукурузы наблюдали хлорозы и некрозы (Culter et al., 1988).• Сообщается также о выделении двух полисахаридных фракций, . ингибврущих рост зеленых растений винограда in vitro (Vannel et al.,1991).

Ограниченность сведений относительно биологической активности метаболитов В. cinerea, а также выделение новых веществ явились предпосылкой изучения некоторых аспектов биологического действия выделенных нами ФТМ В. cinerea.

в.1 Антибиотические свойства. С целью получения дополнительной информации Еыделенные препараты испытывали на антибиотическую активность в отношении некоторых Фитопатогенных бакте- . рий, патогенных и токсигенных грибов, а также сапрофитных дрол-

жевых штаммов.

Показано, что комплекс ФТМ штамма 109816, обладает четко выраженным фукгистатическим действием в отношении ряда токси- . нобразувщих грибов (Asp. fumigatus, Р. urtioae, D. toxioum, M. verrucaria, M. roridum), известных причинных агентов ряда мико-токсикоэов человека и сельскохозяйственных животных.

Существенными различиями в чувствительности к ФТМ характеризовались исследуемые представители фитолатогенных фузариев. Так, все изученные виды секции Discolor ( F. gibbosum, F. graminearum, F. sambuoinum, F.oulmorum) активно подавлялись исследуемыми концентрациями ФТМ, в то же время F. sporotrichiella оказался к ним нечувствительным, а изученные виды секции Elegans (F. cxysporum, F. moniliforme) и Martiella (F. javantoum, F. solалi) существенно различаются по чувствительности.

Факт повышенной чувствительности представителей фитопато-генных фузариев к метаболитам В. cinerea 10S815 представляется весьма интересным в свете их способности вызывать корневые гнили злаков и зернобобовых, а также других заболевании (Билай, 1988).

Исследуемые фитопатогенные бактерии Е. carotovora sub. sp. carotovora ( возбудитель гнили моркови) и Cl. michiganense (возбудитель рака томатов), довольно активно подавляются ФТМ В. oineroa. В то же время, большинство дрожжевых штаммов оказались нечувствительными к исследуемым концентрациям ФТМ. Исключение сосгавляют штаммы Trichosporon cutaneum, а также Kluyveromyces marxianus var. maraianus.

В свете полученных данных вызывает большой интерес характер действия отдельных компонентов фитотоксического комплекса, включая и их действие на растения.

6.2 Фитотоксическое действие. Изучались фитотоксические свойства метаболитов, выделенных из куль тур альных фильтратов штамма 109816. Использовали широко распространенный метод биопроб на семенах. Исследовано действие токсических метаболитов на прорастание семян гороха, кукурузы, редиса, огурцов и пшеницы. Результаты этих исследований свидетельствуют об избирательности их действия яв всхожести, рост проростков и корней .

Малочувствительными оказались семена огурцов, хотя и здесь наблюдался незначительный эффект подавления роста корней иссле-

дуемыми концентрациями ФТМ ( на 10-3%). В то же время концентрации 500, 200, и особенно 50 мкг/мл, оказывали стимулирующий эффект на проростки огурцов.

Таким образом, препарат ФТЫ 109В15 имеет ярко выраженный фитотоксический эффект по отношении к ряду растений - представителей различных семейств.

Наряду с биопробой на семенах, для изучения фитотоксической активности метаболитов В. cinerea использовали каллуснуп культуру винограда in vitro двух сортов»: Изабелла (устойчивый) и Подарок Магарача (неустойчивый).

На рис.4 представлены данные, свидетельствующие о том, что концентрация 2,2 мг/мл кигибировала рост как устойчивого , так и неустойчивого сортов. При этом наблюдали покоричневеике каллуса, что указывало на его гибель. Малая концентрация (0,01 мг/мл среды) стимулировала рост каллуса обоих сортов, видимые различия отмечались на средах с концентрациями 0,55-0,13 мг/мл. Су' щественные различия в росте каллуса наблюдались при использовании концентрации ФТМ 0,27 мг/мл . Прирост массы каллуса сорта Изабелла достигал контрольного (92%), в то время как у сорта Подарок Магарача - 36Х, что убедительно иллюстрирует фитотокси-ческий эффект препарата штамма 109816 в культуре ткани in vitro.

Полученнне различия в росте камуса устойчивого и неустойчивого сортов при культивировании на среде, содержащей 0,27 мг/мл ФТМ, доказывают принципиальную возможность использования их для селекции устойчивости у растений винограда in vitro.. Учитывая широкое распространение В. cinerea, а также способность его поражать значительный круг хозяев, вполне естественно предположить и возможность селекции устойчивости у ряда важных для народного хозяйства растений.

Глава 7. ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ СТОРОН МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ ФТМ В. CINEREA

Как известно, с момента проникновения патогена в ткани растения-хозяина происходят физиологические и биохимические изменения, проявляющиеся в нарушении процессов фотосинтева, дыхания, азотного обмена и т.п. О таком действии метаболитов В. cinerea в литературе имеются крайне скудные сведения. Так, при

% НО

во

МО

Сорт иИзабелла"

Сорт иПодарок Магарача"

К

~г Ъ Ъ 5~

-МП

23 Ч

Рис. 4. Действие различных концентраций ФШ В. сспегасс 109915 на рост каллусной ткани винограда устойчивого (Изабелла) и неустойчивого (Подарок Магарача) сортов.

К - контроль} I - 2,2 мг/мл; 2-0,55 мг/мл{ 3 - 0,2? иг/мл; 4 - 0,13 мг/мл; 5-0,01 ыг/мл среды

% W

ÍOO

б о 20

Балок

да

К 1 2, 3 12, 3 4- 12 3 4-

Рис. 6. Включение ^-лейцина и 2-14С-аденина в белок и нуклеиновые кислоты QJtí, 62.

К - контроль; I - JOO мкг/мл; 2 - 250 мкг/мл; 3 - 376 мкг/кл: 4 - 500 мкг/мл.

изучении действия Фракции органических кислот, выделенных из культуральннх Фильтратов В. cinerea, Рубин и Ладыгина (1964) показали, что происходит изменение вязкости протоплазмы и увеличение размеров пластид, а цинереарин, по данный Culter et al. (1988), вызывал хлорозы у растений табака.

Это, пожалуй, единственные работы такого плана, которые к тому же не Дакт ответа на вопрос о механизмах- повреждающего . действия. Учитывая это, мы предприняли более обстоятельные исследования, касающиеся изучения некоторых сторон биохимических механизмов действия ФТМ В. cinerea.

7.1 Инг.чбироваиие синтеза пигментов. При отработке некоторых параметров культивирования Chi. vulgaris, используемой нами в качестве модельной системы для изучения биохимических механизмов фитотоксического действия, был отмечен факт обесцвечивания клеток водоросли при внесении в среду метаболитов В. cinerea. Изучению некоторых особенностей проявления этого эффекта и посвещен настоящий раздел.

Выло показано, что в диапазоне концентраций от 25 до 75 мкг/мл при культивировании хлореллы яа автотрефной среде в условиях освещенности ингибирование роста весьма несущественно, и трудно провести границ между 30 и 50%-ными действующими концентрациями.

Наряду с этим, в параллельных экспериментах было показано, что эффект обесцвечивания хлореллы является также функцией концентрации ФТМ. При ятом анализ характерных спектров изменения поглощения отдельных пигментов доказывает лишь различия чисто количественного характера без какого-либо влияния на качественный состаЕ пигментного комплекса.

Более обстоятельное изучение синтеза отдельных компонентов улорофиллов обнаруживает, что культивирование хлореллы на автотрофной среде в условиях освещенности и в присутствии исследуемых концентраций ФТМ увеличивает синтез хл.а приблизительно на 20%. В отношении хл.в такой эффект отмечается лишь для начальной концентрации ФТМ, в то время как все последующие вызывают незначительное, но пропорциональное ингибирование синтеза. Аналогичный, но более выраженных эффект, отмечен и в отношении синтеза каротлноидов.

Культивирование хлореллы на гетеротрофной среде в темновом режиме влечет за собой активирование синтеза исследуемых пкг-

ментов Солее низкими концентрациями ФТМ к пропорциональное ингибирование - более высокими.

Особого внимания заслуживает сравнительный аналиа действующих концентраций исследуемого препарата ФТМ в отношении роста и синтеза пигментов, который обнаруживает несовпадение этих величин в отношении аналогичных эффектов. Так, влияние ФТМ на синтез пигментов оказалось более выраженным, чем в отношении роста Chi. vulgaris.

Развитие "альбинизма" у Chi. vulgaris, а также у некоторых высших растений под влиянием микотоксинов отмечали ряд исследователей (Schoentel et al., 1965; Singh et al., 1973; Zaiohenko et al., 1989 ). Имеется ряд публикаций, обобщенных в обзоре (Dashek , Lewelüyn, 1983), относительно механизмов, при помощи которых микотоксины вызывают отклик у растений, особенно в системе in vitro. Этот эффект микотоксинов связывают с влиянием на потребление аминокислот, синтез хлорофиллов, активность некоторых ферментных систем, рост, прорастание, синтез белка и нуклеиновых кислот и т.п.

Что касается метаболитов В. cinerea, то такие сведения в доступной литературе отсутствуют, и в этой связи возможность участия белок-синтеэирующей системы Chi.vulgaris в нарушении синтеза пигментов как функции ингибирования ФТМ представляется нам наиболее привлекательной, что и побудило нас к более обстоятельному изучению этого вопроса.

7.2 Действие ФТМ В. cinerea на синтез макромолекул в модельной системе Chlorella vulgaris 62.

Как видно из данных, представленных на рис.Б, увеличение концентрации ФТМ в исследуемых системах сопровождается пропорциональным ингибированием включения меченных предшественников как в белок, так и нуклеиновые кислоты. В то же время .начальные концентрации ФТМ в 100 мкг/мл ( в случае синтеза белка) и 100-250 мкг/мл (в случае синтеза ДНК) оказывают стимулирующий (на 34-40%) эффект на синтез этих полимеров. В случае синтеза РНК активирующего действие ФТМ не отмечалось. Концентрация ФТМ в 600 мкг/мл почти полностью подавляла синтез как белка, так и нуклеиновых кислот.

Обращает на себя внимание существенное различие концентраций ФТМ, вызывающих как ЗОХ-ное, так и 507.-ное ингибирование процесса. Так, в случае синтеза белка ЗОЖ-ная ингибиругощая кон-

центрация ФТМ находится в пределах 2 ¡50 мкг/мл, в то время как в случае ДНК - она существенно виге, а в случая РНК - существенно ниже. Это указывает на различную чувствительность отдельных звеньев белок-синтезирующей системы СП!., vulgaris к ФТМ В. cinerea. Такой характер действия в отношении белок-синтезирую-щей системы хлореллы был установлен ранее и для токсических метаболитов другой химической природы (Tugai et al., 1989; Zaichenko et al., 1989).

Говорить в данном случае о специфичности действия ФТМ в отношении функционирования белок-синтезирующей системы Chi. vulgaris не представляется вогможньм. Однако сам факт такого эффекта может указывать на вероятность связи его с ингибйрова-нием синтеза хлорофиллом зэ счет нарушения синтеза белок-пигментных комплексов, на что тага«.? указывалось ранее.

7.3 Поглощение 140-РТМ клетками Chi.vulgaris. Анализ данных, изложенных выше, дает-основание предполагать, что различие действующих концентраций ФТМ, вызывающих сходный эффект, может быть связано с различной способностью их поступать в клетки хлореллы. С учетом изложенного, в настоящем разделе приводится данные относительно поглощение 14С-ФТМ В. cinerea отмытыми клеточными суспензиями Chi. vulgaris.

Проведенные яеми исследования доказывают транспорт 14С-ФТМ из среды во внутриклеточное пространство. Однако он незначителен и составляет 8,472 в варианте без азида натрия и 7,127. - в варианте с азидом натрия от общей исходной радиоактивности.- •

В то же время, при изучении баланса радиоактивности различных фракций можно отметить, что значительный процент ее приходится на фракцию, отмываемую с поверхности интактных клеток (около 50,8% в варианте без ааида натрия и 30,б* - в варианте с азидом натрия). Высокий процент радиоактивности остается связанным с клеточными фрагментами (36,6% и 61,7Х, соответственно) .

Как уже отмечалось, радиоактивность, поступающая во внутриклеточное пространство, весьма незначительна. С учетом этого, можно предположить высокую активность компонентов фиготокскчес-кого комплекса, способных в незначительных концентрациях в клетке вызывать нарушение таких процессов как синтез белка и нуклеиновых кислог, синтез пигментов и др.

Как нам кажется, такие данные, полученные для ФТМ В,

cinerea впервые, вносят определенные коррективы и в наши представления о механизме повреждающего действия микотокшнов в фи-топатологкческом процессе.

ВЫВОДЫ

1. На основании.ростовых и физиолого-биохимических параметров проведена комплексная оценка 25 штаммов В. cinerea, выделенных из различных источников. Показано, что штаммы с высоки! выходом фитотоксических метаболитов (ФТМ) характеризуются и высокой продуктивностью процесса токсинообразования, однако, высокий выход ФТМ не коррелирует с их активностью в отношении Chi. vulgaris 62. Осуществлен отбор наиболее активных культур. Лучшими оказались штамму 109815, 16093, лис.80 и 15973, выделенные из филосферы различных растений.

2. Показано, что комплекс метаболитов В. cinerea включает 11 веществ, 8 ив которых обладают фитотоксическим действием. Качественный состав компонентов не претерпевает изменений в зависимости от источника выделения штаммов, способов их культивирования, а также состава исследуемых сред. Отмечаемые различия носят лишь количественный характер.

3. Разработан метод выделения как комплексного препарата ФТМ, так и отдельных его компонентов. Он предусматривает экстракцию активных веществ хлороформом, последующую их очистку при помощи жидкость-жидкостного перераспределения (н-гек-еан-ацетонитрил) и ступенчатую колоночную хроматографию.

Основные фиготоксические метаболиты - вещества Ве и D7 -получены в кристаллическом виде. Показано, что они состоят из углерода, водорода, кислорода и азота, не содержит серы и галогенов.

4.. Вещество D? при помощи ГМХ ве обнаруживает наличия ни одного из таких моносахаридов как глюкоза, галактоза, маннога, ксилоза, арабшюэа, рибоза, фукоза, рамноза, эритроза. R тоже время, в нем достоверно обнаруживается лизин.

ЙК-спектры вещества D7 указывают на валентные колебания ОН-групп (3500 см-1), на асимметричные и симметричные колебания Ш£>-групп (3330 и 3240 см-1), -СЯз и -СН*- групп (2860 и 2940 см"1), группировки - С00-Шз I 1730 и 1235 см"1). Поглощение в области 1600-1500 см-1 указывает на присутствие в молекуле ве-

щества D7 ароматической структуры, что подтверждают .также данные УФ-спектроскопии.

Сопоставление полученных данных с таковыми для известных метаболитов В. cinérea показывает, что вещество D7 является новым, ранее не известным для зтого гриба.

5. Метаболиты Р. cinerea обладэдт ярко выраженным фитоток-сическим действием в отношении ряда растений. Показано ингибирование всхожести и прорастания семян пшеницы, кукурузы, гороха, - редиса, огурцов. Установлена концентрационная зависимость отмеченного эффектэ.

В экспериментах на каллусной культуре ткани неустойчивого (Подарок Магарача) и устойчивого (Изабелла.) сортов винограда показана принципиальная возможность использования ФТМ e.cinerea для отбора резистентных растений in vitro. Существенные различия в росте каллуса отмечаются при селективной концентрации ФТМ (0,27 мг/мл), когда прирост массы каллуса сорта Изабелла достигает 9?.%, а сорта Подарок Магарача - 36%.

6. Установлено, что метаболиты В. olnerea, наряду с фито-токсическкмя, обладают антибактериальными свойствами в отношении некоторых фитспатогенов (Е. carotovora sub. ?р. carotovora, Cl. miohigánense), а такие аятифунгальными свойствами-в отношении широкого нэбора фитопатогенннх (Fusarium graminearum, F. gibhosum, F. culmorum, F. satibucinum и др.) и токсигенных (D. toxicum, M. verrucaria, M. roridum, Asp. fusnigatus, P, urtioae и др.) грибов. 1 '

7. Установлено явление обесцвечивания клеток хлореллы, связанное с нарушением синтеза пигментов под влиянием ФТМ В. cinerea. Эффект как ингибирующего, так и активирующего действия определяется используемой концентрацией токсических метаболитов и в значительной степени зависит от других условий инкубации (освещенность, состав среды и т.п.).

Параллельное ингибирование включения 3Н-лейцина и 2-14С-аденина в белок и нуклеиновые кислоты, несмотря на различия действующих концентраций, молет указывать на возможную связь в подавлении этих процессов.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Еолынкин В.А,.Рубежняк И.Г. Выведение устойчивых сортов

- ?А. -

винох'рада с использованием культура тканей ситро// Научно-технический прогресс в производстве посадочного материала винограда и плодояых культур (Тбилиси, март 1987 г.): Тег. докл.-Тбилиси: Мецниереба,1987. С.44-45.

2. Еолынкш H.A., Рубежняк И.Г. Еыведение устойчивых сортов винограда с использованием культуры тканей "ин еит-ро"// 10-я Респ. научно-практ. конфер. молодых уч. (Махачкала, октябрь 1987 г.): Теэ. докл. - Махачкала, 1987. -С. SO.

3. Рубежняк И.Г. Использование культуры тканей для изучения устойчивости винограда к патогенным грибам'/ Ускорен. науч.-техн. прогрес. в плодовод, и виноградарстве и задачи молодых ученых (Алма-Ата, 1987 г.): Тез. докл.- Алма-Ата: 1997. - С.ЭТ.

4. Рубежняк И.Г. Фитотоксические фракции культуральной жидкости гриба В. cinerea// Актуален, пробл. воздел, и перераб. винограда (Ялта, апрель 1990 г.): Теэ. докл. -Ялта: Алугат. типогр.,1990. - С.86-87.

6. Рубежняк И.Г., Трошин Л.П., Эайченко A.M. Токсигенный потенциал Botrytis cinerea Pers.// Микробиол. журн. -1993. - В5, N 4. - С.81-86.

6. Рубежняк И.Г., Трошин Л.II., Зайченко A.M. Сравнительная характеристика некоторых штаммов Botrytis cinerea Pers..культивируемых на различных средах// Микробиол. журн. - 1993. - 65,N 4. - О. 87-91.

7. Рудышин С.Д., Болынкин В.А., Рубежняк И.Г. Культура ткани ин витро как метод и объект исследования устойчивости винограда к патогенам// Пробл. вопросы произЕ.винограда и продукт, его преработки. (Ялта, апрель 1988 г.): Тез. докл. - Яята:ВНМ ВйПП "МАГАРАЧ", 1988. - С.7.