Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3

Свиридов, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3"

На правах рукописи

Свиридов Алексей Владимирович

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ КАТАБОЛИЗМА ОРГАНОФОСФОНАТОВ У ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ АскготоЬайег $р. и ОсНгоЬаагит аШИгорс СРК 3

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2012

Работа выполнена в лаборатории микробной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущино

Научный руководитель доктор биологических наук

Леонтьевский Алексей Аркадьевич

Официальные оппоненты Бурьянов Ярослав Иванович

доктор биологических наук, профессор, Филиал Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, заведующий лабораторией

Кулаковская Татьяна Валентиновна

доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов

им. Г. К. Скрябина РАН, заведующая лабораторией

Ведущая организация Московский государственный университет

им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится « 29 » июня 2012 г. в 10 часов 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН. Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru, Автореферат разослан « ¿3 » ЦЦЛь^Л 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических паук Доронина Нина Васильевна

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ

БИБЛИОТЕКА _2012_

Актуальность проблемы

Неизбежным результатом технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты, содержащие прямую ковалентную связь углерод-фосфор (С-Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны накапливаться в окружающей среде. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов, могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты де-токсикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).

Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фосфонатов и применяется как действующий компонент популярных гербицидов (Roundup, Ground-Bio и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в среду превысили 800 тыс. тонн в год. По данным независимых исследований, ГФ способен сохраняться в почвах в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения и просачиваясь в водоемы. У животных ГФ может вызывать поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.

Метилфосфоновая кислота (МФК) — один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, крайне стабильна в окружающей среде и может сохраняться в почве в течение десятков лет, проявляя фитотоксические свойства.

В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов, загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов. Однако разработка подобных технологий затрудняется недостатком сведений об организации путей метаболизма фосфонатов.

Считается, что С-Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК, неспецифически расщепляется ферментным комплексом «С-Р лиаза», необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток. Известно единствен-

ное сообщение о возможном существовании разновидности С-Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как С-Р лиаза II). Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ, где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент глифосат-оксидоредуктаза с образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК). Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована. Путь дальнейшего метаболизма АМФК, связанный с разрывом С-Р связи, также неясен.

Дефицит знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование метаболизма синтетических фосфонатов бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и метилфосфоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов. Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка методов количественного и качественного анализа исследуемых фосфонатов и их метаболитов, а также методик измерения активности ферментов их деструкции.

2. Подбор объектов исследования - штаммов, обладающих наибольшей эффективностью деструкции в отношении изучаемых фосфонатов.

3. Изучение возможности адаптации штамма, выделенного под селективным давлением метилфосфоновой кислоты к утилизации глифосата.

4. Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммов-деструкторов.

5. Очистка нового фермента первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктазы.

6. Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

2 "12_

Научная новизна

Разработаны новые методы идентификации и измерения активности ферментов метаболизма ГФ и МФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрического определения, отличающиеся высокой достоверностью.

Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК (Achromobacter sp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ, к использованию этого соединения ках единственного источника фосфора. Адаптированный штамм Achromobacter sp. MPS 12А по показателям деструкции ГФ был близок к О. anthropi GPK 3.

Доказано существование двух С-Р лиазных систем с различающейся субстратной специфичностью: С-Р лиаза I разлагала МФК, С-Р ли аза II - ГФ.

Впервые выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: Achromobacter sp. MPS 12А разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С-Р лиазы II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у О. anthropi GPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и глиоксилат.

У О. anthropi GPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма АМФК, который включал стадии переаминирования и разрыва С-Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).

ГФ-оксидоредуктаза О. anthropi GPK 3 была впервые очищена до элек-трофоретически гомогенного состояния. Изучены ее основные характеристики, определен кофактор, выявлены параметры, способствующие повышению выхода фермента.

Практическая значимость

Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов их метаболизма отличаются универсальностью и могут применяться для об-

наружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов клеток и культуральной жидкости.

Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных ппаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.

Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих индукции ГФ-оксидоредуктазы у О. anthropi GPK 3, дают возможность подобрать условия, способствующие наибольшей экспрессии данного фермента.

Впервые полученные сведения об организации и распределении ферментных систем катаболизма фосфонатов у бактерий являются основой для разработки биотехнологий очистки и восстановления природных сред, загрязненных фосфонатами.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из 7 разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка. Библиографический указатель содержит 294 источника литературы.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 10th International UFZ-Deltares/TNO conference on soil-water systems «ConSoil 2008» (Milan, Italy, 2008), 12-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008),

5-я международная конференция «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008), Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008), Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Пущино-Тула, 2009), З"1 International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld 2009» (Lisbon, Portugal, 2009), Пущинская научно-практическая конференция «Системная биология» (Пущино, 2009), Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), 14-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2010), 2-й международный конкресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio» (Москва, 2010), VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК и 10 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных конференций.

Исследования поддерживались грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-00320 «Глифосат-оксидоредуктаза бактерии Ochrobactrum anthropi GPK 3» и в рамках проекта РНП 2.1.1.9227 «Создание ассоциаций грибов и бактерий для биодеструкции устойчивых гетероциклических соединений».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среды для культивирования бактерий. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду MS1 (Ермакова с сотр., 2008). Источниками фосфора служили МФК в концентрации 0,3 г/л, ГФ в концентрации 0,05-20 г/л в составе гербицида Roundup, 2-аминоэтилфосфоновая кислота (2-АЭФ) и АМФК в концентрации 0,2 г/л, неорганический фосфат (P¡) в концентрации 0,3 г/л. Источниками углерода служили глутамат натрия, сукцинат натрия, глицерин и глюкоза в концентрации 10 г/л.

Микроорганизмы. Использовали два штамма бактерий-деструкторов фосфонатов: Ochrobactrum anthropi GPK 3 (ВКМ B-2554D), выделенный из почв, загрязненных ГФ, и Achromobacter sp. MPS 12 (ВКМ В-2694), выделенный из сайтов загрязнения метилфосфоновой кислотой (МФК). При адаптации последнего к росту на средах с ГФ был получен деструктор МФК и ГФ Achromobacter sp. MPS 12А.

Условия культивирования. Выращивание культур проводили 1) в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалке при температуре 28 "С; 2) в ферментерах АНКУМ-2 (ИБП РАН, Россия) объемом 10 л при температуре 28 °С и интенсивности аэрации SO % от насыщения; 3) в герметически закрытых 15-мл пробирках с 5 мл среды.

Субклеточное фракционирование. Клетки фракционировали по мето-до Nossal и Heppel (1966) с модификациями: биомассу ресуспендировали в 40 мл 33 мМ Трис-HCI pH 7,65, добавляли 40 мл 33 мМ Трис-HCl pH 7,65, содержавшего 40% сахарозу и 100 мМ ЭДТА. После 10 мин инкубации при 22 °С клетки осаждали (18000 g х 5 мин) и отбирали фракцию периплазмы. Сферопласты разрушали с помощью ИБФМ-пресса при рабочем давлении 0,9 МПа. Гомогенат помещали в ледяную баню, вносили 100 Ед ДНКазы I, осаждали центрифугированием (120000 g х 1 ч, 4 °С). Отделяли супернатант с водорастворимыми белками цитоплазмы. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера 100 мМ Трис-HCl pH 7,65, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,001 мМ фенилметилсульфонилфторид с 2% Тритон Х-100 и инкубировали 30 мин при 22 "С. Суспензию осаждали (120000 g х 1 ч, 22°С), отбирали надосадочную жидкость.

Аналитические методы. Хроматографический анализ ГФ и его метаболитов в культуральных жидкостях, бесклеточных экстрактах и реакционных смесях проводили методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), получая ацильные, бен-зоильные и дансильные производные (Свиридов с сотр., 2011). Концентрацию фосфонатов и Р| измеряли спектрофотометрическим методом с малахи-

товым зеленым (НеББ апс! Бегт, 1975) после гидролиза С-Р связи персульфатом аммония (8с1ю\уапек апс! Уег51гае1е, 1990а).

Определение активности ферментов. Активность С-Р лиазы в интакт-ных клетках I определяли: 1) по выделению метана при культивировании бактерий на среде с МФК в герметичных пробирках (концентрацию метана измеряли методом газовой хроматографии с помощью калибровочной кривой); 2) по убыли МФК и накоплению Р; (определяли спектрофотометриче-ски по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого) (8ушс1оу е1 а!., 2012).

Активность С-Р лиазы II в интактных клетках идентифицировали по присутствию в бесклеточных экстрактах саркоэина, который обнаруживали методом ВЭЖХ в виде ацильных, дансильных и бензоильных производных (Свиридов с сотр., 2011).

Определение активности ГФ-оксидоредуктазы в субклеточных фрахциях О. атЬгор/ СРК 3 проводили 1) спектрофотометрическим методом по образованию окрашенного комплекса продукта реакции (глиоксилата) с фенил-гидразином (Свиридов с сотр., 2011); 2) методом ВЭЖХ, определяя концентрацию глиоксилата и АМФК (в виде производных) в реакционных смесях (вуимоу е! а/., 2012).

Убыль АМФК, образующейся при расщеплении ГФ глифосат-оксидоредуктазой, обнаруживали методом ВЭЖХ в реакционной смеси, содержавшей ГФ, бесклеточный экстракт, пиридоксаль-5'-фосфат и пируват натрия.

Активность фосфонатазы определяли по окислению НАДН в сопряженной реакции с алкогольдегидрогеназой, восстанавливавшей один из продуктов фосфонатазной реакции - ацетальдегид.

Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Белки бесклеточного экстракта осаждали сульфатом аммония до 80% насыщения, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в буфере 50 мМ Трис-НС1 рН 7,65, 100 мМ ЫаС1, 10 мМ MgCIl, 0,05 мМ ЭДТА и подвергали гель-фильтрации на колонке 8и-

perdex 200 (2,6 x 60 см). Активные фракции наносили на колонку Octyl-Sepharose (1x6 см), элюировали буфером, содержавшим 1 М сульфата аммония. Препарат затем подвергали гель-фильтрации на колонке Toyopearl HW-60 (1,6 х 100 см).

Характеристика ГФ-оксидоредуктазы. Денатурирующий электрофорез проводили по Laemmli (1970), белковые полосы проявляли по Fairbanks (1971). Нативный электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) с градиентом концентрации 4-10% в системе для кислых белков. Окрашивание белков проводили 0,2% раствором нитратом серебра в 0,4% растворе формальдегида.

Молекулярную массу (ММ) фермента определяли по электрофоретиче-ской подвижности и с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex 200, предварительно калиброванной с помощью набора Gel Filtration Molecular Weight Markers (Sigma, США).

Изоэлектрофокусировку проводили в 5% ПААГ в градиенте pH 3,0-10,0 с амфолинами фирмы Pharmacia (pharmalytes). Белковые полосы проявляли последовательной инкубацией геля в смеси уксусной кислоты, этанола и воды (19:25 :65), содержащей 0,1% CuS04 и 0,05% кумасси R-250. Изоэлектриче-скую точку определяли с помощью набора Calibration Kit for pi Determinations using Isoelectric Focusing Broad Range pi (pH 3-10) (GE Healthcare, США).

Определение зависимости активности ГФ-оксидоредуктазы от pH среды проводили спектрофотометрически в буфере Britton и Robinson (1931) в интервале pH 6,8-9,6.

Температурный оптимум фермента определяли спектрофотометрически в диапазоне 20-60 "С при термостатировании измерительной кюветы.

Термостабильность определяли путем инкубирования ферментного препарата при температурах 22, 25, 30, 40,45, и 50 °С в течение часа; измерения остаточной активности проводили через 5, 10, 15, 30 и 60 мин после начала инкубации.

Спектры поглощения препаратов ГФ-оксидоредуктазы и реакционных смесей в диапазоне 300-560 нм записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC (Япония). Апофермент отделяли от кофактора после инкубации в буфере 33 мМ Трис-HCl pH 8,05 с помощью ультрафильтрации.

Свободный кофактор получали кипячением препарата ГФ-оксидоредуктазы и анализировали методом ВЭЖХ на колонке Lichrospher 100 RP18 250 х 4 мм (Dr. Maisch, Германия) в подвижной фазе мегганол : 5 мМ ацетат аммония pH 6,0 (20: 80) с детектором оптического поглощения при 450 нм.

Значения К„ и Уош определяли с линеаризацией данных в координатах Хейнса-Вольф. Влияние ионов металлов изучали в реакционных смесях, содержавших очищенный ферментный препарат, 2 мМ ГФ и соли: MgCl2 в концентрации 1-20 мМ; NiCl2> C11SO4, МпС12, ZnCI2> FeS04, СоС12 в концентрации ЮмМ.

Ингибиторный анализ ГФ-оксидоредуктазы проводили в реакционных смесях, содержавших очищенный фермент, 2 мМ ГФ и глицин, саркозин, AgNOj, ФМСФ, р-хлормеркурийбензойную кислоту (рХМБ), МпС12, Q1SO4 в концентрации 0,1-4 мМ.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли с помощью реактива Брэдфорд (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в трех повторностях. На основании полученных выборок определяли стандартное отклонение и доверительный интервал при уровне значимости 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методов анализа ГФ и его метаболитов. Были предложены новые методы обнаружения и количественного определения ГФ и соединений, образующихся при его деструкции с помощью ВЭЖХ (табл. 1) и ТСХ (табл. 2). Получение ацильных, бензоильных и дансильных дериватов проб позволяло значительно снизить предел обнаружения, и достичь высокой до-

стоверности анализа. В рутинных экспериментах использовалось ацилирова-ние проб, требовавшее наименьших временных затрат. Бензилирование и дансилирование применялось для верификации полученных данных.

Отбор и характеристика штаммов-деструкторов фосфонатов. По результатам скринига лабораторной коллекции микроорганизмов были отобраны: 1) штамм Achromobacter sp. MPS 12, отличавшийся наибольшей эффективностью утилизации МФК (табл. 3); 2) штамм Ochrobactrum anthropi GPK 3 -лучший деструктор ГФ (табл. 3).

Таблица 1.

Анализ производных ГФ и его метаболитов методом ВЭЖХ

Ацил производные Бенэоилп роизводные Дансилпроиэводные

Соединение Время удержания, мин Предел обнаружения, нг/мкл Время удержания, мин Предел обнаружения, нг/мкл Время удержания, мин Предел обнаружения, нг/мкл'1

ГФ 19,97 0,60 43,16 0,36 4.73 0,16

АМФК 4,98 0,90 6,52 0,44 13,31 0,48

Свркозин 11,00 0,86 21,44 0,74 26,16 0.33

Глицин 9,20 0,40 19,73 0,36 14,67 0,29

Глиоксилат 5,40 0.76 5.40 0,76 н/о н/о

♦ н/о - не определяли

Таблица 2.

Хроматографическая подвижность и пределы обнаружения ГФ и его мета-

болитов методом ТСХ в немодифицированном виде и в виде дансилпроизводных

Без модификации Дансилпроизводные

Соединение Яг(%) Предел обнаружения, нг Rt (%) Предел обнаружения, нг

ГФ 33 ±1 600 32 ± 1 30

АМФК 25 ±1 500 49 ± 1 35

Саркозин 54 ±2 250 1

Глицин 64 ±2 200 23 ± 1 1

* Определение саркозина проводили методом двумерной ТСХ

Адаптация штамма Achromobacter sp. MPS 12 к ггилизаиии ГФ. В отличие от прочих изученных деструкторов МФК, не способных расти на средах с ГФ, у Achromobacter sp. MPS 12 был обнаружен крайне слабый рост на среде с этим фосфонатом (табл. 3), в связи с чем данный штамм был подвергнут адап-

тации к утилизации ГФ путем последовательных пассажей на жидких средах, содержавших данный фосфонат (рис. 1). После 8 пассажей ростовые характеристики Achromobacter sp. MPS 12 стабилизировались (рис. 1, 8). Адаптированная форма получила обозначение Achromobacter sp. MPS 12А (табл. 3).

Подобный эффект адаптации не описан в литературе и мог объясняться исходной генетической неоднородностью популяции Achromobacter sp. MPS 12, которая могла содержать незначительную долю клеток, способных утилизировать ГФ и получивших решающее конкурентное преимущество при росте на средах с данным фосфонатом.

Обнаружение активности С-Р ли азы I. Активность МФК-специфичной С-Р лиазы (обозначена нами как «С-Р лиаза I») обнаружена у всех исследованных штаммов по выделению метана при росте на среде с МФК, но не на среде с ГФ Выделение метана и убьшь МФК в среде были эквимолярными (табл. 4).

Таблица 3.

Ростовые характеристики О. anthropi GPK 3, Achromobacter sp. MPS 12 и MPS 12A при культивировании на средах с ГФ и МФК

Микроорганизм Источник фосфора в среде культивирования Максимальная биомасса, г/л Максимальная удельная скорость роста, час'1 Продолжительность лаг-фазы Удельная деструкция фосфонатов, иг/г биомассы

1 О. anthropi GPK 3 ГФ 2.8 0.12 22 51 ±б

2 Achromobacter sp. MPS 12 ГФ 0,25 0,03 60 1611

3 Achromobacter sp. MPS 12A ГФ 2.2 0.09 24 48 ±3

4 O. anthropi GPK 3 МФК 2.5 0.1 14 48 ±2

5 Achromobacter sp. MPS 12 МФК 3.4 0.13 19 57 ±2

б Achromobacter sp. MPS 12A МФК 2.7 0.12 20 50 ±2

Рисунок 1. Адаптация Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ в качестве единственного источника фосфора при последовательных пассажах культуры на жидких средах с 0,5 г/л ГФ. 1, 2, 4, б, 8 - номера пассажей; пунктирная линия - рост культуры MPS 12, полученной после 8 пассажа, на среде с МФК.

Таблица 4.

Утилизация ГФ и МФК при культивировании штаммов-деструктров в

герметичных пробирках в течение 24 ч

Штамм-деструктор Культивирование в среде с 0,3 г/л МФК Культивирование в среде с 0,5 г/л ГФ

Биомасса, г/л Метан, мкмоль/г биомассы* Потребление^ • МФК, мхмоль/г биомассы** Биомасса, г/л Потребление ГФ, мкмоль/г биомассы**

GPK3 0,8 293,0 ±35 270,1 ± 13 0,7 283,8 ± 3

MPS 12 1.6 418,0±3 426,9 ± 2 0.1 0

MPS 12А 1.4 446,0 ± 6 447,8 ±2 0,4 124,2 ±2

* Результаты гаэохроматографического анализа

** По данным спектрофотометричесхого измерения с малахитовым зеленым

Метаболизм ГФ исследованными штаммами. Деструкция ГФ у Achromobacter sp. MPS 12А и О. anthropi GPK 3 шла по двум метаболическим путям. Achromobacter sp. MPS 12А обладал ГФ-специфичной С-Р лиазой (обозначена нами как «С-Р лиаза II»), что подтверждалось наличием саркозина в бесклеточном экстракте при культивировании на ГФ, и метаболитов саркозина - глицина и формальдегида (табл. 5). У Achromobacter sp. MPS 12, не способного утилизировать ГФ, саркозин отсутствовал, а концентрация гли-

цина была значительно ниже. У О. anthropi GPK 3 основным метаболитом ГФ была АМФК (табл. S), что указывало на наличие ГФ-оксидоредуктазы, катализирующей первичную атаку ГФ (рис. 2, А).

Таблица 5.

Внутриклеточные концентрации ГФ и его метаболитов у штаммов Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и О. anthropi GPK 3

Соединение Штаммы

MPS 12 MPS 12А GPK 3

ГФ 0,5 ± 0,02 /икМ 0,9 ± 0,02 л»*М 0.1 ±0,002 мМ

АМФК 0 0 0,27 ±0,04 мМ

Глиоксилат 0 0 0,04 ±0,01 мМ

Саркоэин 0 0,28±0,01 мМ 0,04 ± 0,02 jw/fM

Глицин 0,13 ±0,04 мМ 0,57±0,09 мМ 0,09 ± 0,03 мМ

Формальдегид 0 0,08±0,02 jmkM 0,12 ± 0,02 .мкМ

Фосфонатазный путь минерализации ГФ у О. атИгорх СРК 3. В присутствии пиридоксаль-5'-фосфата и пирувата в бесклеточных экстрактах О. ап-1Игор1 СРК 3 наблюдалась убыль АМФК, образующейся при расщеплении ГФ (рис. 2, Б). Такие кофакторы указывали на реакцию переаминирования, ожидаемым продуктом которой должен был быть фосфоноформальдегид, близкий по структуре фосфоноацетальдегиду - субстрату фосфоноацетальде-гидгидролазы (фосфонатазы).

2.5 Z Z

1,5 f ? 2

к X

О. U 1 Ф х ш £

0.5 ? Е о 5 J X S

10 20 Время реакции, мин

ёя

ii а

Рисунок 2. Убыль ГФ и образование АМФК и глиоксилата в бесклеточных экстрактах О. ашИгор» йРКЗ. А - при рН среды 8,0 (буфер В); Б - при рН среды 8,5 в присутствии пирувата натрия и пнридоксаль-5'-фосфата. ♦ - Глифосаг, ▲ - АМФК; ■ - Глиоксилат.

Для проверки гипотезы об участии фосфонатаэы в деструкции ГФ, активность этого фермента измеряли в бесклеточных экстрактах О. атИгор/ йРК 3 выращенных на средах с Р» МФК, 2-АЭФ (предшественник фосфоно-ацетальдегида), АМФК и ГФ. В первых двух случаях активность фосфонатаэы не обнаружено, в остальных случаях она была практически идентичной (0,05±0,005 Ед/мг белка). Индукция фосфонатазы происходит: а) при отсутствии иных источников Р, и б) в присутствии подходящего субстрата. Тем самым подтверждалось предположение об образовании в ходе деструкции ГФ (и АМФК как его метаболита) субстрата, расщепляемого фосфонатазой с

образованием Р| и формальдегида.

HO-P-CHj-NH-CH;

Aehromobaetf ар. MPS 12А .--

Ochrobactmm anthropl GPK J |Гпифосат|

(otono 0,1% потребленного ГФ)

С-Р ЛЦВЗв II

Oc/irebaclrum anthropl GPK 3

ГпиЛосвт-океиЛомЛуктвза

* НзС—NH—CHj—CT

Сарюзии OH

HO—P—Chh—NHj ♦

H/3

СввкозцнотецДам

OR. --АМФК

Парумт

Глиоксиляг

Н-С.

Формальдегид

HjN-CH; Глицин

АмитувнФвмм

НО—Р'

он

iU п

Фоофоноформальдегнд

НО—Р—сн

¿и |МФК|

Achromobaetarap. MPS 12 Aehromobaetf ар. MPS 12А Ochrobaetn/m »nthropl GPK 1

ФосФоиатяза

С-РпиамI

н-с;

ЧН

Формальдегид

СН. Метай

Рисунок 3. Схема путей метаболизма фосфонатов у Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и Ochrobactrum anthropi GPK 3.

Таким образом, у О. апЖгор! ОРК 3 выявлен не описанный ранее путь полной минерализации ГФ, не связанный с экскрецией в среду культивирования АМФК, характерной для большинства известных деструкторов ГФ. Пути деструкции фосфонатов, обнаруженные у исследованных штаммов, представлены на рис. 3.

Влияние условий культивирования на активность ГФ-оксидоредуктазы. Удельная активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах О. ап-/Игор/ вРК 3 зависела от таких факторов, как тип источника углерода (рис. 4, А), фаза роста культуры (рис. 4, Б) и концентрация ГФ в среде. Получение биомассы для исследования ГФ-оксидоредуктазы проводили с помощью сред с глутаматом натрия в фазе замедления роста, так как при росте культуры на сукцинате натрия, несмотря на несколько большую активность фермента, наблюдали быстрое защелачивание среды, затруднявшее контроль рН, а также агрегацию клеток в результате образования слизистых капсул. Наибольшую активность ГФ-оксидоредуктазы наблюдали в лаг-фазе (рис. 4, Б), однако количество биомассы в лаг-фазе было недостаточным.

0,0012

| Е 3 0.0008

Я I:

- ^ 0.0004

5 _,

0,0000 —

Г пут» мат Глюком Глицерин Су кцинят

Источник углерода

0,15 2.00 4.20 4.90 Значение ОПди

Рисунок 4. Активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах О. ап/ИгорI йРК 3. А - Влияние источника углерода в среде; Б - Влияние фазы роста при культивировании на среде с глутаматом: лаг-фаза (0П*м*0,15), фаза экспоненциального роста (ОПзм^.ОО), фаза замедления роста (ОП]бош4.20), стационарная фаза (ОПзбо™4,90)

Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Использованная схема очистки позволила получить электрофоретически гомогенный препарат ГФ-оксидоредуктазы с

выходом 333% (табл. 6, рис. 5). ММ субъединицы, по данным денатурирующего электрофореза в ПААГ, составила 61,4 кДа (рис. 5, А), в то время как ММ нативного фермента составляла около 620 кДа (рис. 5, Б), что указывало на гомодекамерную структуру ГФ-оксидоредуктазы.

По данным изоэлектрофокусировки в ПААГ ГФ-оксидоредуктаза имела изоэлектрическую точку при рН 6,85 (рис. 6).

Таблица 6.

Таблица очистки ГФ-оксидоредуктазы

Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, ФЕ Удельная активность, Ед/мг белка Выход, '/• Степень очистки

Бесклеточный экстракт 510,000 0,43 0,0008 100,00 1,00

Высаливание 384,000 0,40 0,0010 93,28 1.24

Бирегс)ех 200 2.970 0,36 0,1227 85,08 146,10

Ойу^ерИагок 0,214 0,29 1,3765 68,82 1638,66

Тоуореаг! НУ/-60 0.082 0.13 1.5833 33,26 1884,92

Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы имел максимумы оптического поглощения, характерные для флавофермёнтов (рис. 7, 1). Кофермент реакции (рис. 7, 2) был идентифицирован как ФАД методом ВЭЖХ. Связывание ФАД с молекулой фермента имело нековалентный характер: кофермент десорбировался в относительно мягких условиях (кипячение, денатурация мочевиной, инкубирование в буферах с низкой ионной силой) без проведения реакций пептидолиза, необходимых для выделения ковалентно связанного ФАД (Ме^шег, 1998). Восстановления активности после инкубации апофер-мента в буферах, содержавших различные концентрации ФАД, не происходило. Причиной этого, по-видимому, была характерная для многих флаво-ферментов крайне низкая стабильность апофермента, лишенного кофактора, приводящая к необратимому изменению структуры активного центра (НеШ е/а/., 2003).

Рисунок 5. ПААГ-электрофорез очищенного препарата ГФ-оксидоредуктазы. А Денатурирующий электрофорез в 10% ПААГ; М1 - белки-маркеры: фосфорилаза В (97 кДа), БСА (66 кДа), овальбумин (45 кДа), карбоангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа), а-лакто альбумин (14,4 кДа); окрашивание кумасси. Б - Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом концентрации 4-10%; М2 - белки-маркеры: тироглобулин (669 кДа), ферритин (440 кДа), катал аза (232 кДа), лактггдегидрогеназа (140 кДа); Окрашивание нитратом серебра. 1,2- Очищенный препарат ГФ-охсидоредухтазы.

Рисунок 6. Изоэлектро фокусировка ГФ-оксидорсдукгазы. М - белковые маркеры (р1): амилогликознцаэа (3,50), соевый ингибитор трипсина (4,55), (5-лактоголобулин А (5,20), бычья карбоангидраза В (5,85), карбоангидраза В человека (6,55), кислая цепь миоглобина лошади (6,85), щелочнал цепь миоглобина лошади (7,35), кислая цепь лектина чечевицы (8,15), средняя цепь лектина чечевицы (8,45), щелочная цепь лектина чечевицы (8,65), трипсиноген (9,30); 1 - ферментный препарат

Участие ФАД в реакции расщепления ГФ было продемонстрировано при инкубации фермента в присутствии субстрата без доступа кислорода. При этом наблюдали изменение максимумов поглощения, что указывало на восстановление ФАД (рис. 7, 4) (Рес1ои1 е! сЛ., 2009). Данный эффект нивелировался в присутствии убихинона <3-10.

0,06

3 0,05 ■ ^

/Ч-?

\ ,А / *\\ V" V --- \1

300

400 500

Длина волны, нм

Рисунок 7. Спектры оптического поглощения ГФ-оксидоредуктоы и ее кофактора: 1 - холоферменг, 2 - кофактор (ФАД); 3 - после инкубации холофер-мента в анаэробных условиях в присутствии субстрата; 4 - апофермент

600

ГФ-оксидоредуктаза обладала относительно узким диапазоном оптимальных значений рН (рис. 8); максимальная активность наблюдалась при значении рН 8,05

Рисунок 8. Зависимость активности ГФ-оксидоредуктаэы от рН среды в буфере ВпПоп-ЯоЫгеоп

Помимо ГФ, фермент проявлял активность в отношении иминодиацета-та (ИДА) и фосфонометилиминодиацетата (ФИА). Для ГФ, ИДА и ФИА были определены основные кинетические константы (табл. 7). ИДА был лучшим субстратом и обладал наибольшим сродством к ферменту. Высокое значение К,,, для ФИА могло объясняться наличием у этого соединения третичного азота и дополнительной фосфонометильной цепью, в отличие от ИДА, что могло затруднять узнавание ФИА активным центром ГФ-оксидоредуктазы.

Таблица 7.

Кинетические характеристики ГФ-оксидоредуктазы

Субстрат К„, мкМ V,»,,, Ед/мг белка Увив/Ки

ГФ 211 3.68 0,17 • 10'"

ИДА 107 4,64 0,43 • 10-'

ФИА 2450 1.67 0,68 • 10"'

Температурный оптимум активности ГФ-оксидоредуктазы был равен 40 °С (рис. 9, А); время полуинактивации в этих условиях составляло около 60 мин (рис. 9, Б).

Температура, вС Время, мин

А Б

Рисунок 9. А. Температурный оптимум глифосат-оксидоредуктаэы. Б. Термостабильность фермента: Ш - 30 °С; ♦ - 40 "С; А - 45 "С; • - 50е С; х- 60 «С.

Ингибиторами ГФ-оксидоредуктазы были ионы Ag+, Си2+, Мп2+, а также р-хлормеркурийбензоат (рХМБ), атакующий прежде всего тиоловые группы белков. Весьма слабыми конкурентными ингибиторами являлись глицин и саркозин. Впервые описано субстратное ингибирование фермента при больших концентрациях ГФ (табл. 8).

Ионы металлов (К^2+, Х^*, №2+) могли оказывать не только ингибиру-ющее, но и активирующее действие на ГФ-оксидоредуктазу (рис. 10). Процесс расщепления ГФ шел быстрее всего в присутствии М£С12, оптимальное значение концентрации которого составляло 10-15 мМ. Реакция ускорялась в меньшей степени в присутствии №С12 и гпСЬ (рис. 10). Ионы Ре2+ и Со2+ заметного влияния на скорость реакции не оказывали (данные не приведены).

Таблица 8.

Значения 1С50 для различных ингибиторов ГФ-оксидоредуктазы

Соединение Глифосвт Глицин Саркоэин рХМБ Ав Си1* Мп1*

IC», мМ 14.8 22,9 11,3 0,7 0,6 1,4 0.8

Учитывая данные о способности ГФ связываться с активным центром алкогольдегидрогеназы через атом цинка (Жемчужин и Горобец, 1989), можно предположить, что различия во влиянии металлов на активность ГФ-оксидоредуктазы зависят от константы устойчивости возникающих комплексов ГФ-металл-фермент, которые могут как облегчать связывание субстрата в активном центре, так и препятствовать катализу. Так, в присутствии ионов Си2+ и Мп2+, ингибирующих ГФ-оксидоредуктазу, ГФ образует устойчивые комплексы с рядом органических функциональных групп (Barrett and McBride, 2005).

120 100 ; 80

I 60 -I

: 40

20 H 0

123456789 10

Рисунок 10. Активирующее действие ионов некоторых металлов на - -процесс расщепления глифосата ГФ-оксидоредуктаэой. 1 - контроль; 2 - 10 мМ гпС12; 3 - 10 мМ №С12; 4 - 1 мМ М^Ь; 5 - 5 мМ М§С12; 6 -10 мМ М^Ь; 7 - 15 мМ М{£12; 8 -30 мМ МяСЬ; 9 -10 мМ + 10 мМ ЫС12; 10 - 10 мМ МбС12 + 10 мМ гпС12.

выводы

1. Разработаны качественные и количественные методики ВЭЖХ- и ТСХ-анализа глифосата и его метаболитов, включая их ацил-, бензоил-, дансилпроизводные. Предложен новый спектрофотометрический экспресс-метод измерения активности глифосат-оксидоредуктазы, основанный на образовании фенилгидразона глиоксилата как продукта реакции.

2. Деструктор метилфосфоновой кислоты Achromobacter sp. MPS 12 был впервые адаптирован к потреблению глифосата как источника фосфора; биодеструктивные характеристики адаптированного штамма MPS 12А были близки к таковым у О. anthropi GPK 3.

3. Доказано существование у бактерий двух С-Р лиазных систем, специфичных для разных субстратов: С-Р лиаза I (расщепление метилфосфоновой кислоты) и С-Р лиаза 11 (расщепление глифосата).

4. Изучение путей катаболизма фосфонатов у бактерий показало, что ме-тилфосфоновая кислота и глифосат у Achromobacter sp. MPS 12А расщеплялись, соответственно, С-Р лиазой I и С-Р лиазой И, а у О. anthropi GPK 3 - С-Р лиазой I и глифосат-оксидоредуктазой.

5. Впервые идентифицирован путь катаболизма глифосата с участием гли-фосат-оксидоредуктазы, продукт которой - аминометилфосфоновая кислота, минерализовался по ранее не описанному метаболическому пути с участием аминометилфосфонат-специфичной аминотрансферазы и фосфонатазы.

6. Впервые очищен до гомогенного состояния и охарактеризован фермент первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктаза. В нативной форме фермент являлся гомодекамером (ММ 620 кДа); ММ субъединицы 61,4 кДа; кофактор ФАД; оптимум pH 8,05, температуры - 40 eC; pi 6,85; ингибиторы рХМБ, Ag+, Cui+, Mn1+.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН Винокуровой

H. Г. и K.X.H. Зеленковой Н. Ф. за помощь в создании методов анализа орга-нофосфонатов и синтез фосфоноацетальдегида, а также д.б.н. Моргунова И. Г. за помощь в разработке метода измерения активности фосфонатазы. Автор глубоко признателен к.б.н. Ермаковой И. Т. и д.б.н. Леонтьевскому А. А. за помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение ее этапов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи

I. Свиридов А. В., Зеленкова Н. Ф., Винокурова Н. Г., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Новые подходы к идентификации и определению активности ферментов деградации глифосата. Биохимия. 2011. № 6. С. 880-887.

2. Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Биодеструкция глифосата почвенными бактериями: оптимизация процесса культивирования и способ сохранения активной биомассы. Микробиология. 2012. № 1.С. 48-55.

3. Sviridov, А. V., Shushkova, Т. V., Zelenkova, N. F.p Vinokurova, N. G., Morgunov, I. G., Ermakova, I. Т., Leontievsky, A. A. Distribution of Glyphosate and Methylphosphonate Catabolism Systems in Soil Bacteria Ochrobaclrum an-thropi and Achromobacter sp. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 97. P. 787796.

Тезисы

1. Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Обнаружение и очистка нового фермента первичной атаки органофосфона-тов - глифосат-оксидорелуктазы. Сб. тез. 12-й международной школа-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2008. Пущино. С. 104-105.

2. Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Ремедиация загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных биопрепаратов. Материалы 5-й международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности». 2008. Пущино. С. 108-109.

3. Свиридов А. В., Шушкова, Т. В., Ермакова, И. Т., Леотьевский, А. А. Разработка научных основ для создания методов ремедиации загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных препаратов. Сб. тез. международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2008. Пущино. С. 78.

4. Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Метаболические пути деструкции глифосата у почвенных бактерий. Сб. статей всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 2009. Пущино-Тула. С. 84-85.

5. Sviridov А. V., Leontlevsky А. А. Enzymes of phosphonales metabolism in soil bacteria. Abstr. 3rf International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld 2009». 2009. Lisbon. httpy/\v\vw.fonnatex.org/biomicroworld2009/abstracts/htni'l 67.htm

6. Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Биохимические основы разработки микробных препаратов для ремедиации загрязненных органофосфонатами почв. Сб. тез. Пущинской научно-практической конференции «Системная биология». 2009. Пущино. С. 34-35.

7. Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Характеристика нового фермента первичной атаки органофосфонатов - глифосат-оксидоредуктазы. Сб. тез. 14-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». 2010. Пущино. Т. 1. С. 59-60.

8. Свиридов А. В. Глифосат-оксидоредуктаза — новый фермент первичной атаки органофосфонатов. Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010». 2010. Москва. С. 62-63.

9. Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Глифосат-оксидоредуктаза: новый фермент деструкции органофосфонатов у бактерий. Сб. тез. 2-го международного конгресс-партнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio». 2010. Москва. С. 161-162.

10. Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Пути утилизации глифосата почвенными штаммами-деструкторами Ochrobactrum anthropi GPK 3 и Achromo-barter sp. MPS 12А. Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2011. Москва. С. 59-60.

Подписано в печать:

18.05.2012

Заказ № 7382 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

1 6248

гон300"""1

2011355453

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Свиридов, Алексей Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фосфонаты - соединения с прямой связью углерод-фосфор.

1.1.1. Биогенные фосфонаты.

1.1.2. Синтетические фосфонаты, их свойства и применение.

1.2. Глифосат.

1.2.1. Опасность глифосата для окружающей среды и здоровья человека.

1.2.2. Воздействие глифосата на бактериальную микрофлору.

1.2.3. Экологические последствия широкого применения глифосата.

1.2.4. Культурные растения, устойчивые к действию глифосата.

1.2.5. Разработка технологий биодеструкции глифосата.

1.3. Бактерии-деструкторы фосфонатов и их физиология.

1.4. Ферментные системы метаболизма фосфонатов и их регуляция.

1.4.1. Фосфонопируватгидролаза и фосфоенолпируватфосфомутаза.

1.4.2. Фосфонатаза.

1.4.3. Фосфоноацетатгидролаза.

1.4.4. С-Р лиаза.

1.4.5. Утилизация ГФ по С-Р лиазному пути.

1.4.6. Ранние попытки выделения активной С-Р лиазы in vitro.

1.4.7. Гены С-Р лиазного оперона.

1.4.8. Роль фосфита в С-Р лиазной реакции.

1.4.9. Исследования отдельных компонентов С-Р лиазы.

1.4.10. Разнообразие ферментных систем, кодируемых генами оперонаphn.

1.4.11. Регуляция экспрессии генов phn.

1.5. Глифосат-оксидоредуктаза.

1.6. Прочие пути деструкции глифосата.

1.7. Методы идентификации фосфонатов и продуктов их метаболизма.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Использованные реактивы.

2.2. Микроорганизмы и их культивирование.

2.2.1. Объекты исследования.

2.2.2. Условия культивирования.

2.3. Получение бесклеточных экстрактов.

2.3.1. Фракционирование биомассы О. аЫгЪорг вРК 3.

2.4. Аналитические методы.

2.4.1. Спектрофотометрический анализ убыли фосфонатов в среде культивирования.

2.4.2. ВЭЖХ-анализ ГФ и продуктов его деструкции.

2.4.3. ТСХ-анализ ГФ и его метаболитов.

2.5. Методы определения активности ферментов.

2.5.1. Определение активности С-Р лиазы 1.

2.5.2. Определение активности С-Р лиазы II.

2.5.3. Определение активности щелочной фосфатазы и ее способности отщеплять ортофосфат от ГФ и МФК.

2.5.4. Определение активности глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы.

2.5.5. Определение активности глифосат-оксидоредуктазы.

2.5.6. Обнаружение метаболизма АМФК ферментами О. апЙ1гор1 йРК 3.

2.5.7. Определение активности фосфонатазы.

2.6. Очистка и характеристика глифосат-оксидоредуктазы.

2.6.1. Очистка фермента.

2.6.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.6.3. Определение молекулярной массы нативного препарата ГФ-оксидо-редуктазы.

2.6.4. Изоэлектрофокусировка.

2.6.5. Определение оптимума рН и стабильности фермента.

2.6.6. Идентификация ФАД как кофактора ГФ-оксидоредуктазы и спектральные исследования.

2.6.7. Определение стехиометрии потребления кислорода при расщеплении ГФ

2.6.8. Определение кинетических свойств ГФ-оксидоредуктазы.

2.6.9. Определение субстратной специфичности.

2.6.10. Оценка влияния металлов и ингибиторов на активность ГФ-оксидоредуктазы

2.6.11. Стабилизация ферментного препарата при хранении.

2.7. Определение концентрации белка.

2.8. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Разработка новых методов анализа фосфонатов, продуктов их метаболизма и ферментов катаболизма фосфонатов.

3.1.1. ВЭЖХ-анализ ГФ и его метаболитов.

3.1.2. ТСХ ГФ и продуктов его метаболизма.

3.1.3. Спектрофотометрическое измерение активности ГФ-оксидоредуктазы

3.2. Выбор бактериальных штаммов - деструкторов МФК и ГФ.

3.2.1. Адаптация штамма Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ.

3.3. Идентификация путей катаболизма фосфонатов у изучаемых штаммов.

3.3.1. Метаболизм МФК штаммами Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и Ochrobactrum anthropi GPK 3.

3.3.2. Метаболизм ГФ штаммами Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и О. anthropi GPK 3.

3.3.3. Активность щелочной фосфатазы у штаммов-деструкторов фосфонатов.

3.3.4. Глифосат-оксидоредуктазная активность и метаболизм образующейся АМФК в бесклеточных экстрактах О. anthropi GPK 3.

3.3.5. Активность фосфонатазы в клетках О. anthropi GPK 3, выращенных на средах с различными источниками фосфора.

3.6. Очистка и характеристика ГФ-оксидоредуктазы О. anthropi GPK 3.

3.6.1. Влияние способа дезинтеграции биомассы, источников углерода, фазы роста культуры и концентрации ГФ на активность глифосат-оксидоредуктазы.

3.6.2. Определение субклеточной локализации фермента и отработка условий дезинтеграции биомассы.

3.6.3. Очистка фермента.

3.6.4. Молекулярные свойства ГФ-оксидоредуктазы.

3.6.5. Определение кофактора глифосат-оксидоредуктазной реакции.

3.6.6. Каталитические свойства глифосат-оксидоредуктазы.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Новые методы идентификации ГФ и его метаболитов.

4.2. Изученные штаммы-деструкторы фосфонатов.

4.3. Метаболизм МФК исследованными штаммами.

4.4. Адаптация Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ.

4.5. Путь метаболизма ГФ штаммом О. anthropi GPK 3.

4.6. ГФ-оксидоредуктаза О. anthropi GPK 3.

4.7. Очистка и характеристика ГФ-оксидоредуктазы.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3"

Актуальность проблемы

Одним из последствий технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты - органические производные фосфоновой кислоты, содержащие прямую связь углерод-фосфор (С-Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны сохраняться в окружающей среде в течение длительного времени. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов, применяются как антибиотики, пламегасители, смазки, хелатирующие добавки. Они могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты детоксикации фосфорор-ганических отравляющих веществ (ФОВ).

Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фос-фонатов, являясь действующим компонентом популярных гербицидов (Roundup, Ground-Bio, Glycel, Ураган и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в среду превысили 800 тыс. тонн в год и продолжают возрастать. Крупнейшие производители ГФ приводят доказательства его экологической безопасности, но по данным независимых исследований, ГФ способен обратимо сорбироваться в почвах и сохраняться в них в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения в сублетальных дозах и просачиваясь в водоносные пласты и поверхностные водоемы. ГФ также может оказывать тератогенное действие на животных, вызывая поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.

Метилфосфоновая кислота (МФК) — один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, может накапливаться в почвах, прилегающих к соответствующим предприятиям и местам захоронения обезвреженных ФОВ. Данное соединение крайне стабильно в окружающей среде и способно сохраняться в почве в течение десятков лет, при этом МФК обладает фитотоксическими свойствами.

В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов, загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов, обладающих ферментными системами, способными разрывать С-Р связь.

Разработка подобных технологий биодеструкции затрудняется недостатком сведений об организации путей метаболизма этих соединений. Считается, что С-Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК, неспецифически расщепляется ферментным комплексом «С-Р лиаза», необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток и пото7 му доступным для изучения лишь гп vivo. Известно единственное сообщение о возможном существовании разновидности С-Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как С-Р лиаза II), однако эти исследования не получили развития. Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ, где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент глифосат-оксидоредуктаза с образованием характерного метаболита - аминометилфосфоновой кислоты (АМФК), все еще содержащей С-Р связь. Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована. Путь дальнейшего метаболизма АМФК, предполагающий разрыв С-Р связи, также неясен.

Дефицит необходимых знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также количественного и качественного анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование с их помощью метаболизма синтетических фосфонатов бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и метилфос-фоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов.

Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:

4. Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммов-деструкторов.

5. Очистка нового фермента первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктазы.

6. Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.

Научная новизна

Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК {Achromobacter sp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ, к использованию этого соединения в качестве единственного источника фосфора. Адаптированный штамм Achromobacter sp. MPS 12А по показателям деструкции ГФ был близок к О. anthropi GPK 3.

Впервые было выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: деструктор МФК Achromobacter sp. MPS 12 после адаптации к потреблению ГФ разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С-Р лиазы II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у О. anthropi GPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и глиоксилат.

У О. anthropi GPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма продукта деструкции ГФ - АМФК, включавший стадии переаминирования и разрыва С-Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).

ГФ-оксидоредуктаза О. anthropi GPK 3 была впервые очищена до электрофоретиче-ски гомогенного состояния. Изучены ее основные молекулярные и каталитические характеристики, определен кофактор реакции, а также выявлены факторы, способствующие повышению выхода фермента.

Практическая значимость

Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов их метаболизма отличаются своей универсальностью и могут применяться для обнаружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов клеток и культуральной жидкости.

Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных высокоактивных штаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.

Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих индукции ГФ-оксидоредуктазы у О. аыЬгорх вРК 3, дают возможность подобрать условия, способствующие наибольшей экспрессии данного фермента.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Свиридов, Алексей Владимирович

выводы

1. Разработаны качественные и количественные методики ВЭЖХ- и ТСХ-анализа гли-фосата и его метаболитов, включая их ацил-, бензоил-, дансилпроизводные. Предложен новый спектрофотометрический экспресс-метод измерения активности гли-фосат-оксидоредуктазы, основанный на образовании фенилгидразона глиоксилата как продукта реакции.

3. Доказано существование у бактерий двух С-Р лиазных систем, специфичных для разных субстратов: С-Р лиаза I (расщепление метилфосфоновой кислоты) и С-Р лиаза II (расщепление глифосата).

4. Изучение путей катаболизма фосфонатов у бактерий показало, что метилфосфоно-вая кислота и глифосат у Achromobacter sp. MPS 12А расщеплялись, соответственно, С-Р лиазой I и С-Р лиазой II, а. у О. anthropi GPK 3 - С-Р лиазой I и глифосат-оксидоредуктазой.

5. Впервые идентифицирован путь катаболизма глифосата с участием глифосат-оксидоредуктазы, продукт которой - аминометилфосфоновая кислота, минерализовался по ранее не описанному метаболическому пути с участием аминометилфосфо-нат-специфичной аминотрансферазы и фосфонатазы.

6. Впервые очищен до гомогенного состояния и охарактеризован фермент первичной атаки глифосата - глифосат-оксидоредуктаза. В нативной форме фермент являлся гомодекамером (ММ 620 кДа); ММ субъединицы 61,4 кДа; кофактор ФАД; оптимум рН 8,05, температуры — 40 °С; pi 6,85; ингибиторы/?ХМБ, Ag+, Cu2+, Mn2+.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам ИБФМ РАН Винокуровой Н. Г. и к.х.н. Зеленковой Н. Ф. за помощь в создании методов анализа органофосфона-тов и консультации по их практическому применению, а также за синтез фосфоноацеталь-дегида, д.б.н. Моргунову И. Г. за помощь в разработке метода измерения активности фос-фонатазы и ценные советы по методам очистки белков, к.б.н. Шушковой Т. В. за помощь и консультации по работе с микроорганизмами-деструкторами фосфонатов.

Также автор благодарит к.б.н. Лауринавичюса К. С. за помощь в определении концентрации метана, д.б.н. Степную О. А. за консультации по способам выделения периплазмы, д.б.н. Меденцева А. Г. за советы по идентификации кофактора ГФ-оксидо-редуктазной реакции, к.б.н. Лисова А. В. и к.б.н. Лисову 3. А. за помощь и консультации в очистке ГФ-оксидоредуктазы.

Автор глубоко признателен к.б.н. Ермаковой И. Т. и д.б.н. Леонтьевскому А. А. за неоценимую помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение ее этапов, а также всем сотрудникам Лаборатории микробной энзимологии ИБФМ РАН за дружескую атмосферу, благожелательное отношение и поддержку.

Особую благодарность автор хочет высказать Сердечной А. И., а также своим родителям и родственникам за внимание, поддержку и заботу.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Свиридов, Алексей Владимирович, Пущино

1. Вершинина, О. А., Знаменская, JI. В. Pho регулоны бактерий. Микробиология. 2002. № 5. С. 581-595.

2. Досон, Р., Эллиот, Д., Эллиот, У., Джонс, К. Справочник биохимика. «Мир». 1991. Москва. С. 279.

3. Ермакова, И. Т., Шушкова, Т. В., Леонтьевский, А. А. Микробная деструкция органофос-фонатов почвенными бактериям. Микробиология. 2008. Т. 77. С. 689-695.

4. Жемчужин С. Г. Глифосат и методы его анализа. Агрохимия. 1985. № 1. С. 121-126.

5. Жемчучин С. Г., Горобец Р. П. Спектрофотометрическое определение нанограммовых количеств гербицида глифосата с использованием фермента алкогольдегидрогеназы. Ж. Ан. Хим. 1989. № 4. С. 741-744.

6. Кишор, Г. М., Бэрри, Д. Ф. Молекула выделенной двунитевой ДНК, молекула рекомби-нантной двунитевой ДНК и способ получения генетически трансформированных растений. 2001. Патент Российской Федерации 2168544.

7. Кононова, С. В., Несмеянова, М. А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами. Биохимия. 2002. Т. 67. С. 220-233.

8. Кононова, С. В., Трутко, С. М., Лауринавичюс, К. С. Обнаружение С-Р лиазной активности в бесклеточном экстракте бактерий Escherichia coli. Прикладная биохимия и биотехнология. 2007. № 4. С. 437-442.

9. Кравцов, И. С., Янов, С. Н., Дармов, И. В., Ковтун, А. Л. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты. Хим. Биол. Безопасность. 2006. Т. 30. С. 3-11.

10. Кузнецова, Е. М., Чмиль, В. Д. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков. Современные проблемы токсикологии. 2010. № 1. С. 87-95.

11. Матыс С. В., Лауринавичюс, К. С., Несмеянова, М. А. Разложение метилфосфоновой кислоты и его физиологическая регуляция у Escherichia coli. Микробиология. 1996. № 4. С. 481-487.

12. Медведь, Т. Я., Кабачник, М. И. Ацилирование аминоалкилфосфиновых и аминоалкил-тиофосфоновых кислот. Известия Академии наук СССР. Отделение химических наук. 1955. №6. С. 1043-1047.

13. Огородникова, С. Ю., Головка, Т. К. Влияние метилфосфоновой кислоты на растения пелюшки. Агрохимия. 2005. № 4. С. 37-41.

14. Протасова Jl. Д., Ларина Г. Е., Спиридонов Ю. Я., Раскин М. С., Абубикеров В. А. Фито-санитарный мониторинг парового поля и адаптация сорняков к раундапу и либерти. Агрохимия. 2008. № 4. С. 59-72.

15. Савельева Е. И., Радилов А. С., Кузнецова Т. А., Волынец Н. Ф. Определение метилфос-фоновой кислоты и ее эфиров как химических маркеров фосфорорганических отравляющих веществ. Журнал прикладной химии. 2001. № 10. С. 1671-1676.

16. Чкаников, Д. И., Римаренко, Л. В., Макеев А. М., Назарова Т. А. Анализ остатков глифо-сата в растениях. Агрохимия. 1987. № 4. С. 117-123.

17. Шушкова, Т. В. Биодеструкция глифосата почвенными бактериями. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук. 2010. Пущино

18. Adams, M. A., Luo, Y., Hove-Jensen, В., He, S.-M., van Staalduinen, L. M., Zechel, D. L., Jua, Z. Crystal structure of PhnH: an essential component of carbon-phosphorus lyase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 2008. V. 190. P. 1072-1083.

19. Agricultural chemical usage 2007 field crops summary. United States department of agriculture. 2008. www.nass.usda.gov

20. Alferness, P. L., Iwata, Y. Determination of glyphosate and (aminomethyl)phosphonic acid in soil, plant and animal matrices, and water by capillary gas chromatography with mass-selective detection. J. Agric. Food. Chem. 1994. V. 42. P. 2751-2759.

21. Archer, T. E., Stokes, J. D. Residue analysis of glyphosate in blackberries by high-performance liquid chromatography and postcolumn reaction detection. J. Agric. Food. Chem. 1984. V. 32. P. 586-588.

22. Avila L. Z., Loo. S. H., Frost, J. W. Chemical and mutagenic analysis of aminomethylphosphonate biodégradation. J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 6758-6764.

23. Avila, L. Z. Draths, К. M., Frost, J. W. Metabolites associated with organophosphonate C-P bond cleavage: chemical synthesis and microbial degradation of 32P.-ethylphosphonic acid. Bioorg. Med. Chem. Lett. V. 1. P. 51-54.

24. Avila, L. Z., Bishop, P. A., Frost, J. W. Hydrocarbon and phosphate triester formation during hemolytic hydrolysis of organophosphonium ions: an alternate model for organophosphonate biodégradation. J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 2242-2246.

25. Baldwin, M. W., Braven, J. 2-aminoethylphosphonic acid in Monochrysis. J. Mar. Biol. Ass. U. K. 1968. V. 48. P. 603-608.

26. Balthazor, T. M., Hallas L. E. Glyphosate-degrading microorganisms from industrial activated sludge. Appl. Environ. Microbiol. 1986. V. 51. P. 432^134.

27. Barrett, K. A., McBride, M. B. Oxidative degradation of glyphosate and aminomethylphosphonate by manganese oxide. Environ. Sci. Technol. 2005. V. 39. P. 92239228.

28. Barrett, K. A., McBride, M. B. Phosphate and glyphosate mobility in soil columns amended with roundup. Soil Sci. 2007. V. 172. P. 17-26.

29. Barry, G. F., Kishore, G. M. Glyphosate tolerant plants. 1998. United States patent 5776760.

30. Bazot, S., Lebeau, T. Simultaneous mineralization of glyphosate and diuron by a consortium of three bacteria as free-and/or immobilized-cells formulations. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 77. P.1351-1358.

31. Benachour, N., Sipahutar, H., Moslemi, S., Gasnier, C., TRavert, C., Seralini, G. E. Time- and dose-dependent effects of Roundup on human embryonic and placental cells. Arch. Environ. Contain. Toxicol. 2007. V. 53. P. 126-133.

32. Branum, M. E., Reardon, J. T., Sancar, A. DNA repair exicision nuclease attacks undamaged DNA. A potential source of spontaneous mutations. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 2542125426.

33. Britton, H. T. K., Robinson, R. A. Universal buffer solutions and the dissociation constant of veronal. J. Chem. Soc. 1931. P. 1456-1462.

34. Bujacz, B., Wieczorek, P., Krzysko-Lupicka, T., Golab, Z., Lejczak, B., Kavfarski, P. Organophosphonate utilization by the wild-type strain of Penicillum notanum. Appl. Environ. Microbiol. 1995. V. 61. P. 2905-2910.

35. Burns, A. J., Tomkins, D. F. The determination of N-(phosphonomethyl)glycine in formulation and technical samples by high pressure liquid chromatography. J. Chromatogr. Sci. 1979. V. 17. P. 333-335.

36. Caldinelli, L., Pedotti, M., Motteran, L., Molla, G., Pollegioni, L. FAD binding in glycine oxidase from Bacillus subtilis. Biochimie. 2009. V. 91. P. 1499-1508.

37. Carson, D. B., Heitkamp, M. A., Hallas, L. E. Biodégradation of N-phosphonomethyliminodiacetic acid by microorganisms from industrial activated sludge. Can. J. Microbiol. 1997. V. 43. P. 97-101.

38. Castle, L. A., Siehl, D. L., Gorton, R., Patten, P. A., Chen, Y. H., Bertain, S., Cho, H.-J., Duck, N., Wong, J., Liu, D., Lassner, M. W. Discovery and directed evolution of a glyphosate tolerance gene. Science. 2004. V. 304. P. 1151-1154.

39. Cessna, A. J., Darwenet, A. L., Townley-Smith. L., Harker, K. N., Kirkland, K. J. Residues of glyphosate and its metabolite AMPA in field pea, barley and flax seed following reharvest application. Can. J. Plant. Sci. 2002. V. 82. P. 485-489.

40. Chen, C-M., Ye, Q-Z., Zhu, Z., Wanner, B. L., Walsh, C. T. Molecular biology of carbon-phosphorus bond cleavage. J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 4461-4471.

41. Chen, K. Research report on Chinese glyphosate industry. China Research and Intelligence. 2009. www.shscri.com

42. Chen, R.-F., Wang, H.-H., Wang, C.-Y. Translocation and metabolism of injected glyphosate in lead tree (Leucaena leucocephala). Weed Sci. 2009. V. 57. P. 229-234.

43. Chen, W., Mulchandani, A. The use of live biocatalysts for pesticide detoxification. Trends Biotechnol. 1998. V. 16. P. 71-76.

44. Clark, L. L., Ingall, E. D., Benner, R. Marine organic phosphorus cycling: novel insights from nuclear magnetic resonance. Am. J. Sci. 1999. V. 299. P. 724-737.

45. Cook A. M., Daughton, C. G., Alexander, M. Phosphonate utilization by bacteria. J. Bacteriol. 1978a. V. 133. P. 85-90.

46. Cook, A. M., Daughton, C. G., Alexander, M. Phosphorus-containing pesticide breakdown products: quantitative utilization as phosphorus sources by bacteria. Appl. Env. Microbiol. 1978b. V. 36. P. 668-672.

47. Cook, R. J., Misono, K. S., Wagner, C. Identification of the covalently bound flavin of dimethylglycine dehydrogenase and sarcosine dehydrogenase from rat liver mitochondria. J. Biol. Chem. 1980. V. 259. P. 12475-12480.

48. Cordeiro, M. L., Pompiliano, D. L., Frost J. W. Degradation and detoxification of organophosphonates: cleavage of the carbon to phosphorus bond. J. Am. Chem. Soc. 1986. V. 108. P.332-334.

49. Costas, A. M. G., White, A. K., Metcalf, W. W. Purification and characterization of a novel phosphorus-oxidizing enzyme from Pseudomonas stutzeri WM88. J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 17429-17436.

50. Dalrymple, B. P., Peters J. M., Vuocolo T. Characterisation of genes encoding two novel members of the aldo-keto reductase superfamily. Biochem. Int. 1992. V. 28. P. 651-657.

51. Daughton, C. G., Cook A. M., Alexander M. Biodégradation of phosphonate toxicants yields methane or ethane on cleavage of C-P bond. FEMS Lett. 1979a. V. 5. P. 91-93.

52. Daughton, C. G., Cook, A. M., Alexander, M. Bacterial conversion of alkylphosphonates to natural products via carbon-phosphorus bond cleavage. J. Agric. Food Chem. 1979b. V. 27. P. 1375-1382.

53. Daughton, C. G., Cook, A. M., Alexander, M. Phosphate and soil binding: factors limiting bacterial degradation of ionic phosphorus-containing pesticide metabolites. Appl. Env. Microbiol. 1979c. V. 37. P. 605-609.

54. Davis, B. J. Disc Electrophoresis-II. Method and application to human serum proteins. Ann New York Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.

55. Devai, I., Felfoldy, L., Wittner, I., Plosz, S. Detection of phosphine: new aspects of the phosphorus cycle in the hydrosphere. Nature. 1988. V. 333. P. 343-345.

56. Dick, R. E., Quinn, J. P. Control of glyphosate uptake and metabolism in Pseudomonas sp. 4ASW. FEMS Lett. 1995a. V. 134. P. 177-182.

57. Dick, R. E., Quinn, J. P. Glyphosate-degrading isolates from environmental samples: occurrence and pathways of degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995b. V. 43. P. 545-550.

58. Dousset, S., Chauvin, C., Durlet, P., Thevenot, M. Transfer of hexazinone and glyphosate through undisturbed soil columns in soils under Christmas tree cultivation. Chemosphere. 2004. V. 57. P. 265-272.

59. Duke, S. O. Glyphosate degradation in glyphosate-resistant and -susceptible crops and weeds. J. Agric. Food. Chem. 2011. V. 59. P. 5835-5841.

60. Dumora, C., Lacoste, A.-M., Cassaigne, A. Phosphonoacetaldehyde hydrolase from Pseudomonas aeruginosa: purification properties compared with Bacillus cereus enzyme. Biochim. Biophys. Acta. 1989. V. 997. P. 193-198.

61. Dumora, C., Lacoste, A.-M., Cassaigne, A., Mazat J.-P. Allosteric regulation of phosphonoacetaldehyde hydrolase by n-butylphosphonic acid. Biochem. J. 1991. V. 280. P. 557559.

62. Dumora, C., Lacoste, A.-M., Cassaigne, A., Mazat, J.-P. Allosteric regulation of phosphonoacetaldehyde hydrolase by n-butylphosphonic acid. Biochem. J. 1991. V. 280. P. 557559.

63. Dumora, C., Lacoste, A.-M., Cassaigne. A. Purification and properties of 2-aminoethylphosphonate: pyruvate aminotransferase from Pseudomonas aeruginosa. Eur. J. Biochem. 1983. V. 133. P. 119-125.

64. Dumora, C., Marche, M., Doignon, F., Aigle, M., Cassaigne, A., Crouzet, M. First characterization of the phosphonoacetaldehyde hydrolase gene of Pseudomonas aeruginosa. Gene. 1997. V. 197. P.405-412.

65. Dunhill, R. H. The manufacture and properties of phosphonic (phosphorus) acid. Australian Plant Pathology. 2003. V. 19. P. 138-139.

66. Ehrmann, M. The periplasm. ACM Press. 2007. Washington, DC. P. 378.

67. Eisenman, H. C., Frases, S., Nicola, A. M., Rodrigues, M. L., Casadevali, A. Vesicle-associated melanization in Cryptococcus neoformans. Microbiology. 2009. V. 155. P. 3860-3867.

68. Eisenman, H. C., Mues, M., Weber, S. E., Frases, S., Chaskes, S. Gerfen, G., Casadevali, A. Cryptococcus neoformans laccase catalyses melanin synthesis from D- and L-DOPA. Microbiology. 2007. V. 153. P. 3954-3962.

69. Ermakova, I. T., Kiseleva, N. I., Shushkova, T., Zharikov, M., Zharikov, G. A., Leontievsky, A. A. Bioremediation of glyphosate-contaminated soils. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2010. V. 88. P. 585-594.

70. Errey, J. C., Blanchard, J. S. Functional annotation and kinetic characterization of PhnO from Salmonella enterica. Biochemistry. 2006. V. 45. P. 3033-3039.

71. Eschenburg, S., Kabsch, W., Healy, M. L., Schönbrunn, E. A new view of the mechanisms of

72. UDP-iV-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase (MurA) and 5-enolpyruvylshimikate-3135phosphate synthase (AroA) derived from X-ray structures of their tetrahedral reaction intermediate states. J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 49215-49222.

73. Fairbanks, J., Steek, T. K., Wallach. D. F. Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane. Biochemistry. 1971. V. 10. P. 2606-2617.

74. Fischer, R. S., Berry, A., Gaines, C. G., Jensen, R. A. Comparative action of glyphosate as a trigger of energy drain in eubacteria. J. Bacterid. 1986. V. 168. P. 1147-1154.

75. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colourimetric determination of phosphorus. J. Biol. Chem. 1925. V.66. P.375-400.

76. Fitzgibbon, J. E., Braymer H. D. Cloning of a gene from Pseudomonas sp. PG2982 conferring increased glyphosate resistance. Appl. Env. Microbiol. 1990. V. 56. P. 3382-3388.

77. Fitzgibbon, J., Braymer, H. D. Phosphate starvation induces uptake of glyphosate by Peudomonas sp. strain PG2982. Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1886-1888.

78. Fleisch, H. The role of bisphosphonates in breast cancer: development of bisphoshonates. Breast Cancer Res. 2002. V. 4. P. 33-34.

79. Freedman, L. D., Doak, G. The preparation and properties of phosphonic acids. Chem. Rev. 1957. V. 57. P. 479-523.

80. Freeman, S., Pollack, S. J., Knowles, J. R. Synthesis of the unusual metabolite carboxyphosphonoenolpyruvate. Cloning and expression of carboxyphosphonoenolpyruvate mutase J. Am! Chem. Soc. 1992. V. 114, p. 377-378.

81. Frost, J. W., Loo, S., Cordeiro, M. L., Li, D. Radical based dephosphorylation and organophosphonate degradation. J. Am. Chem. Soc. 1987. V. 109. P. 2166-2171.

82. Gard, J. K., Feng, P. C. C., Hutton, W. C. Nuclear magnetic resonance timecourse studies of glyphosate metabolism by microbial isolates. Xenobiotica. 1997. V. 27. P. 633-644.

83. Glass, R. L. Liquid chromatographic determination of glyphosate in fortified soil and water samples. J. Agric. Food. Chem. 1983. V. 31. P. 280-282.

84. Gomi, K., Horiguchi, T. Purification and characterization of a new enzyme, JV-alkylglycine oxidase from Cladosporium sp. G-10. Biochim. Biophys. Acta. 1999. V. 1429. P. 439-445.

85. Goodman, D. B. P., Davis, W. L., Jones, R. G. Glyoxylate cycle in toad urinary bladder: possible stimulation by aldosterone. Proc. Natl. Acad. Sci. 1980. V. 77. P. 1521-1525.

86. Gougler, J. A., Geiger D. R. Uptake and distribution of N-phosphonomethylglycine in sugar beet plants. Plant Physiol. 1981. V. 68. P. 668-672.

87. Graaf, de R. M., Visscher, J., Schwartz, A. W. A plausibly prebiotic synthesis of phosphonic acids. Nature. 1995. V. 378. P. 474-477.

88. Hallas, L. E., Adams, W. J., Heitkamp, M. A. Glyphosate degradation by immobilized bacteria: field studies with industrial wastewater effluent. Appl. Environ. Microbiol. 1992. V. 58. P. 12151219.

89. Hallas, L. E., Hahn, E. M., Korndorfer, C. Characterization of microbial traits associated with glyphosate biodégradation in industrial activated sludge. J. Ind. Microbiol. 1988. V. 3. P. 377385.

90. Handler, P., Bernheim., M. L. C., Klein, J. R. The oxidative demethylation of sarcosine to glycine. J. Biol. Chem. 1941. V. 138. P. 211-218.

91. Harkness, D. R. Bacterial growth on aminoalkylphosphonic acids. J. Bacteriol. 1966. V. 92. P. 623-627.

92. Hassan-Abdallah, A., Bruckner, R. C., Zhao, G., Jorns, M. S. Biosynthesis of covalently bound flavin: isolation and in vitro flavinylation of the monomeric sarcosine oxidase apoprotein. Biochemistry. 2005. V. 44. P. 6452-6462.

93. Hefti, M. H., Vervoort, J., van Berkel, W. J. H. Deflavination and reconstitution of flavoproteins. Tackling fold and function. Eur. J. Biochem. 2003. V. 270. P. 4227-4242.

94. Herrman, K. M., Weaver, L. M. The shikimate pathway. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1999. V. 50. P. 473-503.

95. Hess, H. H., Derr, J. E. Assay of inorganic and organic phosphorus in the 0.1-5 nanomole range. Anal. Biochem. 1975. V. 63. P. 607-613.

96. Hidaka, T. Seto, H. Comparison of two C-P bond-forming enzymes involved in the biosynthesis of bialaphos. Agric. Biol. Chem. 1990. V. 54. P. 2467-2468.

97. Hidaka, T., Imai, S. Seto, H. Biosynthesis mechanism of carbon-phosphorus bond formation. Isolation of carboxyphosphonoenolpyruvate and its conversion to phosphonopyruvate. J. Am. Chem. Soc. 1989. V. Ill p. 8012-8013.

98. Hidaka, T., Imai, S., Hara, O., Anzai, H., Murakami, T., Nagaoka, K., Seto, H. Carboxyphosphoenolpyruvate phosphonomutase, a novel enzyme catalyzing C-P bond formation. J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 3066-3072.

99. Hildebrand, R. L., Henderson, T. G. Phosphonic acids in nature. The role of phosphonates in living systems. C. R. C. Press. 1983. P. 5-30.

100. Holt, J. S., Powles, S. B., Holtum, J. A. M. Mechanisms and agronomic aspects of herbicide resistance. Annu. Rev. Plant Mol. Biol. 1993. V. 44. P. 203-229.

101. Hon, T., Horiguchi, M., Hayashi, A. Biochemistry of natural C-P compounds. Maruzen, Ltd. 1984. Tokyo. P. 116-122.

102. Horigane, A., Horiguchi, M., Matsumoto, T. Metabolism of 2-amino-3-phosphono 3-14C. propionic acid in cell-free preparations of rat liver. Biochim. Biophys. Acta. 1979. V. 584. P.254-260.

103. Horiguchi, J. S., Kandatsu, M. Ciliatine: a new aminophosphonic acid contained in rumen ciliate Protozoa Bull. Agric. Chem. Soc. Japan. 1960. V. 24. P. 565-570.

104. Horiguchi, J. S., Kandatsu, M. Isolation of 2-aminoethane phosphonic acid from rumen protozoa. Nature. 1959. V. 187. P. 901-902.

105. Hove-Jensen, B., Rosenkrantz, T. J., Zechel, D. L., Willemoes, M. Accumulation of intermediates of the carbon-phosphorus lyase pathway for phosphonate degradation in phn mutants of Escherichia coli. J. Bacteriol. 2010. V. 192. P. 370-374.

106. Hu, J-Y., Chen, C-L., Li, J-Z. A simple method for the determination of glyphosate residues in soil by capillary gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection. )K. Ah. Xhm. 2008. №4. C. 406-410.

107. Huang, J., Su, Z., Xu., Y. The evolution of microbial phosphonate degradative pathways. J. Mol. Evol. 2005. V. 61. P. 682-690.

108. Imazu, K., Tanaka, S., Kuroda, A., Anbe, Y., Kato, J., Ohtake, H. Enhanced utilization of phosphonate and phosphite by Klebsiella aerogenes. Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 3754-3758.

109. Iqbal, S., Parker, G., Davidson, H., Moslehi-Rahmani, E., Robson, R. L. Reversible phase variation in the phnE gene, which is reauired for phosphonate metabolism in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 6118-6123.

110. Jacob, G. S., Garbow, J. R., Hallas, L. E., Kimack, N. M., Kishore, G. M. Metabolism of glyphosate in Pseudomonas sp. strain LBr. Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 2953-2958.

111. Jacob, G. S., Schaefer, J., Stejskal, E. O., McKay, R. A. Solid-state NMR determination of glyphosate metabolism in Pseudomonas sp. J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 5899-5905.

112. James, C. Global review of commercialized transgenic crops: 2002 feature Bt maize. International service for the acquisition of agri-biotech applications, ISAAA Briefs, no. 29 (ISAAA, Ithaca, NY, 2003).

113. Jiang, W., Metcalf, W. W., Lee, K-S., Wanner, B. L. Molecular cloning, mapping and regulation of Pho regulon genes for phosphonate breakdown by phosphonatase pathway of Salmonella typhimurium LT2. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 6411-6421.

114. Jin, J., Mazon, H., van dan Heuvel, R. H. H., Heck, A. J., Janssen, D. B., Fraaije, M. W. Covalent flavinylation of vanillyl-alcohol oxidase is an autocatalytic process. FEBS Journal. 2008. V. 275. P. 5191-5200.

115. Job, V., Marcone, G. L., Pilone, M. S., Pollegioni, L. Glyxine oxidase from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 2002. V. 277. P. 6985-6993.

116. Kafarski, P., Lejczak, B., Forlani, G. Biodégradation of pesticides containing carbon-to-phosphorus bond. ACS Sym. Ser. 2001. V. 777. P. 145-163.

117. Kamat, S. S., Williams, H. J., Raushel, F. M. Intermediates in the transformation of phosphonates to phosphate by bacteria. Nature. 2011. V. 480. P. 570-573.

118. Kandatsu, M., Horuguchi, M. The occurrence of ciliatine (2-aminoethylphosphonic acid) in the goat liver. Agric. Biol. Chem. 1965. V. 29. P. 781-782.

119. Kandatsu, M., Horuguchi, M., Tamari, M. The incorporation of ciliatine (2-aminomethylphosphonic acid) into lipids of the rat liver. Agric. Biol. Chem. 1965. V. 29. P. 779780.

120. Kataoka H., Horii K., Makita M. Determination of the herbicide glyphosate and its metabolite (aminomethyl)phosphonic acid by gas chromatography with flame photometric detection. Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 195-199.

121. Kawai S., Uno B., Tomita M. J. Chromatogr. Determination of glyphosate and its major metabolite aminomethylphosphonic acid by high-performance liquid chromatography after derivatization with p-toluenesulphonyl chloride. 1991. V. 540. P. 411-419.

122. Keese, P. Risks from GMO due to horizontal gene transfer. Environ. Biosaf. Res. 2008. V. 7. P. 123-149.

123. Kennedy, K. E., Thompson, G. A. Jr. Phosphonolipids: localization in surface membranes of Tetrahymena. Science. 1970. V. 168. P. 989-991.

124. Kertesz, M., Elgorriaga, A., Amrhein, N. Eveidence for two distinct phosphonate-degrading enzymes (C-P lyases) in Arthrobacter sp. GLP-1. Biodégradation. 1991. V. 2. P.53-59.

125. Kim, A. D., Baker, A. S., Dunaway-Mariano, D., Metcalf, W. W., Wanner, B. L., Martin, B. M. The 2-aminoethylphosphonate-specific transaminase of the 2-aminoethylphosphonate degradation pathway. J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 4134-4140.

126. Kim, A., Kim, J., Martin, B. M., Dunaway-Mariano, D. Isolation and characterization of the carbon-phosphorus bond-forming enzyme phosphoenolpyruvate mutase from mollusk Mytilus edulis. J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 4443-4448.

127. Kishore, G. M., Barry, G. F. Glyphosate tolerant plants. International patent W092/00377. 1992.

128. Kishore, G. M., Jacob, G. S. Degradation of glyphosate by Pseudomonas sp. PG2982 via a sarcosine intermediate. J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 12164-12168.

129. Kishore, G. M., Shah, D. M. Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides. Ann. Rev. Biochem. 1988. V. 57. P. 627-63.

130. Kitteredge, J. S., Roberts E. A carbon-phosphorus bond in nature. Science. 1969. V. 164. P. 37-42.

131. Kitteredge, J. S., Roberts, E., Simonsen, D. G. Occurrence of free 2AEP in the sea anemone, Anthopleura elegantissima. Biochemistry. 1962. V. 1. P. 624-625.

132. Kolowith, L. C., Ingall, E. D., Benner, R. Composition and cycling of marine organic phosphorus. Limnol. Oceanogr. 2001. V. 46. P. 309-320.

133. Krzysko-Lupicka, T., Strof, W., Kubs, K., Skorupa, M., Wieczorek, P., Lejczak, B., Kafarski, P. The ability of soil-borne fungi to degrade organophosphonate carbon-to-phosphorus bond. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1997. V. 48. P. 549-552.

134. Kudzin, Z. H., Gralak, D. K., Drabowicz, J. Luczak, J. Novel approach for the simultaneous analysis of glyphosate and its metabolites. J. Chromatogr. A. 2002. V. 947. P. 129-141.

135. Kulakova, A. N., Wisdom, B. G., Kulakov, L. A., Quinn, J. P. The purification and characterization of phosphonopyruvate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond cleavage enzyme from Variovorax sp. Pal2. J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 23426-23431.

136. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. V. 227. P. 680-685.

137. LaNauze, J., Coggins, J. R., Dixon, H. B. F. Aldolase-like imine formation in the mechanism of action of phosphonoacetaldehyde hydrolase. Biochem. J. 1977. V. 165. P. 409-411.

138. LaNauze, J., Rosenberg, H., Shaw, D. C. The enzymic cleavage of the carbon-phosphorus bond: purification and properties of phosphonatase. Biochim. Biophys. Acta. 1970. V. 212. P. 332-350.

139. Landau, M., Ivey, C., Riehm, J. P. D-Glucose-6-phosphate dehydrogenase from the cysts of the brine shrimp, Artemia salina leach. The effects of certain ions and coenzymes. Compar. Biochem. Physiol. B. 1980. V. 66. P. 147-150.

140. Lee, K-S., Metcalf, W. W., Wanner, B. L. Evidence for two phosphonate degradative pathways in Enterobacter aerogenes. J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 2501-2510.

141. Lerbs, W., Stock, M., Parthier, B. Physiological aspects of glyphosate degradation in Alcaligenes spec, strain GL. Arch. Microbiol. 1990. V. 153. P. 146-150.

142. Levesque, C. A., Rahe, J. E. Herbicide interactions with fungal root pathogens, with special reference to glyphosate. Annu. Rev. Phytopathol. 1992. V. 30. P. 579-602.

143. Lioi, M. B., Scarfi, M. R., Santoro, A., Barbieri, R., Zeni, O., Berardino, D. D., Ursini, M. V. Genotoxicity and oxidative stress induced by pesticide exposure in bovine lymphocyte cultures in vitro. Mutation Res. 1998. V. 403. P. 13-20.

144. Liu, C.-M., McLean, P. A., Sookdeo, C. C., Cannon, F. C. Degradation of the herbicide glyphosate by members of the family Rhizobiaceae. Appl. Env. Microbiol. 1991. V. 57. P. 1799-1804.

145. Loo, S. H., Peters, N. K., Frost, J. W. Genetic characterization of an Escherichia coli mutant deficient in organophosphonate biodégradation. Biochem. Biophys. Research Communications. 1987. V. 148. P. 148-152.

146. Lovdahla, M. J., Pietrzyk, D. J. Liquid chromatography and postcolumn indirect detection of glyphosate. J. Chrom. A. 1992. V. 602. P. 197-204.

147. Low, F. L., Shaw, I. C., Gerrard J.A. The effect of Saccharomyces cerevisiae on the stability of the herbicide glyphosate during bread leavening. Letters in Applied Microbiology. 2005. V. 40. P. 133-137.

148. Lund-H0ie, K., Friestad, H. O. Photodegradation of the herbicide glyphosate in water. Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1986. V. 36. P. 723-729.

149. Maile J. R., Fischesser G. J, Anderson, M. M. TLC separation of organic phosphoric acid derivatives. J. Chromatogr. 1977. V. 132. P. 366-368.

150. Makino, K., Kim, S-K., Shinagawa, H., Amemura, M., Nakata, A. Molecular analysis of the cryptic and functional phn opérons for phosphonate use in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 2665-2672.

151. Malik, J. Barry, G., Kishore, G. The herbicide glyphosate. Biofactors. 1989. V. 2. P.17-25.

152. Mann, R. M., Bidwell, J. R. The toxicity of glyphosate and several glyphosate formulations to four species of southwestern Australian frogs. Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1999. V. 36. P.193-199.

153. Maria, N. de, de Felipe, M. R., Fernandez-Pascual, M. Alterations induced by glyphosate on lupin photosynthetic apparatus and nodule ultrastructure and some oxygen diffusion related proteins. Plant Physiol. Biochem. 2005. V. 43. P. 985-996.

154. Matys S. V., Laurinavichus, K. S., Krupyanko, V. I., Nesmeyanova M. A. Optimization of degradation of methylphosphonate analogue of toxic pollutants with direct C-P bond by Escherichia coli. Proc. Biochem. 2001. V. 36. P. 821-827.

155. Matys, S. V., Kuzmina, N. M., Laurinavichius, K. S., Nesmeyanova, M. A. Effect of environmental factors on degradation of the C-P bond of methylphosphonate by Escherichia coli cells. Proc. Biochem. 2004. V. 39. P. 1063-1071.

156. McAuliffe, K. S., Hallas, L. E., Kulpa, C. F. Glyphosate degradation by Agrobacterium radiobacter isolated from activated sludge. J. Ind. Microbiol. 1990. V. 6. P. 219-221.

157. McGrath, J. W., Wisdom, G. B., McMullan, G., Larkon, M. J., Quinn, J. P. The purification and properties of phosphonoacetate hydrolase, a novel carbon-phosphorus bond-cleavage enzyme. Eur. J. Biochem. 1995. V. 234. P. 225-230.

158. McMullan, G., Harrington, F., Quinn, J. P. Metabolism of phosphonoacetate as the sole carbon and phosphorus source by and environmental bacterial isolate. Appl. Env. Microbiol. 1992. V. 58. P. 1364-1366.

159. McMullan, G., Quinn, J. P. Detection of a novel carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of and environmental Pseudomonas fluorescens isolate. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. V. 184. P. 1022-1027.

160. McMullan, G., Quinn, J. P. In vitro characterization of a phosphate starvation-independent carbon-phosphorus bond cleavage activity in Pseudomonas fluorescens 23F. J. Bacteriol. 1994. V. 176. P. 320-324.

161. McMullan, G., Watkins, R., Harper, D. B., Quinn, J. P. Carbon-phosphorus bond cleavage activity in cell-free extracts of Enterobacter aerogenes ATCC 15038 and Pseudomonas sp. 4ASW. Biochem. International. 1991. V. 25. P. 271-279.

162. Metealf, W. W., Wanner B. L. Involvement of the Escherichia coli phn (psiD) gene cluster in assimilation of phosphorus in the form of phosphonates, phosphite, P, esters and P,. J. Bacteriol. 1991. V. 173. P. 587-600.

163. Metealf, W. W., Wolfe, R. S. Molecular genetic analysis of phosphite and hypophosphite oxidation by Pseudomonas stützen WM88. J. Bacteriol. 1998. v 180. P. 5547-5558.

164. Mewies, M., Mclntire, W. S., Scrutton, N. S. Covalent attachment of flavin adenine dinu-cleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN) to enzymes: the current state of affairs. Prot. Sei. 1998. V. 7. P. 7-20.

165. Miller, D. S. Nucleoside phosphonate interactions with multiple organic anion transporters in renal proximal tubule. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 2001. V. 299. P. 567-574.

166. Moore, J. K., Braymer, H. D., Larson. A. D. Isolation of Pseudomonas sp. which utilizes the phosphonate herbicide glyphosate. Appl. Environ. Microbiol. 1983. V. 46. P. 316-320.

167. Morais, M. C., Baker, A. S., Dunaway-Mariano, D., Allen, K. N. Crystallization and preliminary crystallographic analysis of phosphonoacetaldehyde hydrolase. Acta Cryst. D. 2000a. V. 56. P. 206-209.

168. Morovjan, G. Fekete, J., Repasi, J. Determination of glyphosate and some related compounds by ion-exchange high performance liquid chromatography. J. Liq. Chromatogr. 1995. V. 18. P. 3219-3232.

169. Mortl, M., Diederich, K., Welte, W., Mollas, G., Motteran, L., Andriolo, G., Pilone, M. S., Pollegioni, L. Structure-function correlation in glycine oxidase from Bacillus subtilis. J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 29718-29727.

170. Motohashi N., Nagashima H., Parkanyi C., Subrahmanyam B., Zhang Guo-Wen. Official multiresidue methods of pesticide analysis in vegetables, fruits and soil. J. Chromatogr. 1996. V. 754. P. 333-338.

171. Murakami, T., Anzai, S., Satoh, K., Nagaoka, K., Thompson, C. J. The bialophos biosyn-thetic genes of Streptomyces hygroscopius: molecular cloning and characterization of the gene cluster. Mol. Gen. Genet. 1986. V. 205. P. 42-50.

172. Murata, K., Higaki, N., Kimura, A. A microbial carbon-phosphorus bond cleavage enzyme requires two protein components for activity. J. Bacterid. 1989. V. 171. P. 4504-4506.

173. Murata, K., Higaki, N., Kimura, A. Carbon-phosphorus hydrolase: functional association of two different proteins for the enzyme activity in Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 1989. V. 53. P. 1419-1420.

174. Murata, K., Higaki, N., Kimura, A. Carbon-phosphorus hydrolase: some properties of the enzyme in cell extracls of Enterobacter aerogenes. Agric. Biol. Chem. 1989. V. 53. P. 1225-1229.

175. Murata, K., Higaki, N., Kimura, A. Detection of carbon-phosphorus lyase activity in cell free extracts of Enterobacter aerogenes. Biochem. Biophys. Research Communications. 1988. V. 157. P.190-195.

176. Nafziger, E. D., Widholm J. M., Steinrucken H. C., Killmer, J. L. Selection and characterization of a carrot cell line tolerant to glyphosate. Plant Physiol. 1984. V. 76. P. 571-574.

177. Nakashita, H., Seto, H. A microorganism with both abilities to form and cleave C-P bonds. Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 2913-2915.

178. Nakashita, H., Shimazu, A., Seto, H. A new screening method for C-P compound producing organisms by the use of phosphoenolpyruvate phosphomutase. Agric. Biol. Chem. 1991. V. 55. P. 2825-2829.

179. Nishiya, Y., Imanaka, T. Purification and characterization of a novel glycine oxidase from Bacillus subtilis. FEBS Lett. 1998. V. 438. P. 263-266.

180. Nossal, N. G., Heppel, L. A. The release of enzymes by osmotic shock from Escherichia coli in exponential phase. 1966. J. Biol. Chem. V. 241. P. 3055-3062.

181. Obojska, A., Lejczak, B., Kubrak, M. Degradation of phosphonates by Streptomyces isolates. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V. 51. P. 872-876.

182. Obojska, A., Ternan, N. G., Lejczak, B., Kafarski, P., McMullan, G. Organophosphonate utilization by the thermophile Geobacillus caldoxylosilyticus T20. Appl. Env. Microbiol. 2002. V. 68. P. 2081-2084.

183. Ornstein, L. Disc Electrophoresis-I. Background and Theory. Ann New York Acad. Sci. 1964. V. 121 p. 321-349.

184. Parker, G. F., Higgins, T. P., Hawkes, T., Robson, R. L. Rhizobium (Sinorhizobium) meliloti phn genes: characterization and identification of their protein products. J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 389-395.

185. Pedotti, M., Ghisla, S., Motteran, L., Molla, G., Pollegioni, L. Catalytic and redox properties of glycine oxidase from Bacillus subtilis. Biochimie. 2009. V. 91. P. 604-612.

186. Pedotti, M., Rosini, E., Molla, G., Moschetti, T., Savino, C., Vallone, B., Pollegioni, L. Glyphosate resistance by engineering the flavoenzyme glycine oxidase. J. Biol. Chem. 2009. V. 284. P. 36415-36423.

187. Penaloza-Vasquez, A., Mena, G. L., Herrera-Estrella, L., Bauley, A. M. Cloning and sequencing of the genes involved in glyphosate utilization by Pseudomonas pseudomallei. Appl. Env. Microbiol. 1995. V. 61. P. 538-543.

188. Pipke, R., Amrhein, N. Carbon-phosphorus lyase activity in permeabilized cells of Arthrobacter sp. GLP-1. FEBS Lett. 1988a. V. 236. P. 135-138.

189. Pipke, R., Amrhein, N. Degradation of the phosphonate herbicide glyphosate by Arthrobacter atrocyaneus ATCC 13752. Appl. Env. Microbiol. 1988b. V. 54. P. 1293-1296.

190. Pipke, R., Amrhein, N. Isolation and characterization of a mutant of Arthrobacter sp. strain GLP-1 which utilizes the herbicide glyphosate as its sole source of phosphorus and nitrogen. Appl. Env. Microbiol. 1988c. V. 54. P. 2868-2870.

191. Pipke, R., Amrhein, N., Jacob, G. S., Schaefer, J., Kishore, G. M. Metabolism of glyphosate in an Arthrobacter sp. GLP-1. Eur. J. Biochem. 1987a. V. 165. P. 267-273.

192. Pipke, R., Schulz, A., Amrhein, N. Uptake of glyphosate by Arthrobacter sp. Appl. Env. Microbiol. 1987b. V. 53. P. 974-978.

193. Pizzul, L., Castillo, M. del P., Stenstrôm, J. Degradation of glyphosate and other pesticides by ligninolytic enzymes. Biodégradation. 2009. V. 20. P. 751-759.

194. Pline-Srnic, W. Physiological mechanisms of glyphosate resistance. Weed Technol. 2006. V. 20. P. 280-300.

195. Pollack, S. J., Freeman, S., Pompliano, D. L., Knowles, F. R. Cloning, overexpression and mechanistic studies of carboxyphosphoenolpyruvate mutase from Streptomyces hygroscopicus. Eur. J. Biochem. 1992. V. 209. P. 735-743.

196. Pratley, J., Baines, P., Eberbach, P., Incerti, M., Broster, J. Glyphosate resistance in annual ryegrass. Proceedings of the 11th annual conference of the grassland society of NSW. The Grassland society of NSW Inc., Orange, Australia, p. 122.

197. Quinn, J. P., Kulakova, A. N., Cooley, N. A., McGrath, J. W. New ways to break an old bond: the bacterial carbon-phosphorus hydrolases and their role in biogeochemical phosphorus cycling. Environ. Microbiol. 2007. V. 9. P. 2392-2400.

198. Quinn, J. P., Peden, J. M. M., Dick, R. E. Carbon-phosphorus bond cleavage by grampositive and gram-negative soil bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 283-287.

199. Quinn, J. P., Peden, J. M. M., Dick, R. E. Glyphosate tolerance and utilization by the microflora of soils treated with the herbicide. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1988. V. 29. P.511-516.

200. Ratner, B. S., Nocito, V., Green, D. E. Glycine oxidase. J. Biol. Chem. 1944. V. 152. P. 119-133.

201. Richard, S., Moslemi, S., Sipahutar, H., Benachour, N., Seralini, G.-E. Differential effects of glyphosate and roundup on human placental cells and aromatase. Environ. Health Prospect. 2005. V. 113. P. 716-720.

202. Rosenberg, H., LaNauze, J. The metabolism of phosphonates by microorganism. The transport of aminomethylphosphonic acid in Bacillus cereus. Biochim. Biophys. Acta. 1967. V. 141. P. 79-90.

203. Rueppel, M. L., Brightwell, B. B., Schaefer, J., Marvel, J. T. Metabolism and degradation of glyphosate in soil and water. J. Agric. Food. Chem. 1977. V. 25. P. 517-528.

204. Sandberg, C. L., Meggitt, W. F., Penner, D. Absorption, translocation and metabolism of 14C-glyphosate in several weed species. Weed Sci. 1980. V. 20. P. 195-200.

205. Sarkar, M., Hamilton, C. J., Fairlamb, A. H. Properties of phosphoenolpyruvate mutase, the first enzyme in the aminoethylphosphonate biosynthetic pathway in Trypanosoma cruzi. J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 22703-22708.

206. Schilling, B. S., Harker, K. N., King, J. R. Glyphosate can reduce glyphosate-resistant canola growth after individual or sequential Applications. Weed. Technol. 2006. V. 20. P. 825-830.

207. Schink, B., Friedrich, M. Phosphite oxidation by sulphate reduction. Nature. 2000. V. 406. P.6791.

208. Schowanek, D., Verstraete, W. Phosphonate utilization by bacterial cultures and enrichments from environmental samples. Appl. Environ. Microbiol. 1990a. V. 56. P. 895-903.

209. Schowanek, D., Verstraete, W. Phosphonate utilization by bacteria in the presence of alternative phosphorus sources. Biodegradation. 1990b. V. 1. P. 43-53.

210. Seidel, H.M., Freeman, S., Seto, H., Knowles, J.R. Phosphonate biosynthesis: isolation of the enzyme responsible for the formation of a carbon-phosphorus bond. Nature. 1988. V. 335. P. 457-458.

211. Selvapandiyan, A., Bhatnagar, R. K. Isolation of a glyphosate-metabolising Pseudomonas'. detection, partial purification and localization of carbon-phosphorus lyase. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1994. V. 40. P. 876-882.

212. Seto, H., Kuzuyama, T. Bioactive natural products with carbon-phosphorus bonds and their biosynthesis. Nat. Prod. Rep. 1999. V. 16. P. 589-596.

213. Shinabarger, D. L., Braymer, H. D. Glyphosate catabolism by Pseudomonas sp. strain PG2982. J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 702-707.

214. Shushkova, T., Ermakova, I., Leontievsky, A. Glyphosate bioavailability in soil. Biodégradation. 2010. V. 21. P. 403-410.

215. Siehl, D. L., Castle, L. A., Gorton, R., Keenan, R. J. The molecular basis of glyphosate resistance by an optimized microbial acetyltransferase. J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 11446-11455.

216. Simeonova, D. D., Wilson, M. M., Metcalf, W. W., Schink, B. Identification and heterologous expression of genes involved in anaerobic dissimilatory phosphite oxidation by Desulfotignum phosphitoxidans. J. Bacteriol. 2010. V. 192. P. 5237-5244.

217. Spira, B., Silberstein, N., Yagil, E. Guanosine 3',5'-bispyrophosphate (ppGpp) synthesis in cells of Escherichia coli starved for Pj. J. Bacteriol. 1995. V. 177. P. 4053-4058.

218. Sprankle, P., Sandberg, C. L., Meggitt, W. F., Penner, D. Separation of glyphosate and possible metabolites by thin-layer chromatography. Weed Sci. 1978. V. 26. P. 673-674.

219. Talbot, H. W., Johnson, L. M., Munnecke, D. M. Glyphosate utilization by Pseudomonas sp. and Alcaligenes sp. isolated from environmental sources. Current Microbiol. 1984. V. 10. P. 255-260.

220. Ternan, N. G., McGrath, J. W., McMullan, G., Quinn, J. P. Review: Organophonates: occurrence, synthesis and biodégradation by microorganisms. World J. Microbiol. Biotechnol. 1998a. V. 14. P. 635-647.

221. Ternan, N. G., McGrath, J. W., Quinn, J. P. Phosphoenolpyruvate phosphomutase activity in an L-phosphonoalanine-mineralizing strain of Burkholderia cepacia. Appl. Env. Microbiol. 1998b. V. 64. P. 2291-2294.

222. Ternan, N. G., McMullan, G. The utilization of 4-aminobutylphosphonate as sole nitrogen source by a strain of Kluyveromyces fragilis. FEMS Lett. 2000. V. 184. P. 237-240.

223. Ternan, N. G., Quinn, J. P. In vitro cleavage of the carbon-phosphorus bond on phosphonopyruvate by cell extracts of an environmental Burkholderia cepacia isolate. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998a. V. 248. P. 378-381.

224. Ternan, N. G., Quinn, J. P. Phosphate starvation-independent 2-aminoethylphosphonic acid biodégradation in a newly isolated strain of Pseudomonas putida, NG2. Syst. Appl. Microbiol. 1998b. V. 21. P. 346-352.

225. Torriani, A. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatases by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1960. V. 38. P. 460-469.

226. Torstensson, L. The Herbicide Glyphosate. Butterworths. 1985. London. P. 137-149.

227. Trickey, P., Wagner, M. A., Jorns, M. S., Mathews, F. S. Monomeric sarcosine oxidase: structure of a covalently flavinylated amine oxidizing enzyme. Structure. 1999. V. 7. P. 331-345.

228. Tsunoda, N. Simultaneous determination of the herbicide glyphosate, glufosinate and bialaphos and their metabolites by capillary gas chromatography-ion-trap mass spectrometry. J. Chrom. A. 1993. V. 637. P. 167-173.

229. Villareal-Chiu, J. F., Quinn, J. P., McGrath, J. W. The genes and enzymes of phosphonate metabolism by bacteria, and their distribution in the marine environment. Front. Microbio. 2012. V. 3.P. 1-13.

230. Vrtis, J. M., White, A. K., Metcalf, W. W., van der Donk, W. A. Phopshite dehydrogenase: an unusual phosphoryl reaction. J. Am. Chem. Soc. 2001. V. 123. P. 2672-2673.

231. Wackett, L. P., Shames, S. L., Venditti, C. P., Walsh, C. T. Bacterial carbon-phosphorus lyase: products, rates and regulation of phosphonic and phosphinic acid metabolism. J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 710-717.

232. Wackett, L. P., Wanner, B. L., Venditti, C. P., Walsh, C. T. Involvement of the phosphate regulon and the psiD locus in carbon-phosphorus lyase activity of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 1987. V. 169. P. 1753-1756.

233. Wanner, B. L. Bacterial alkaline phosphatase clonal variation in some Escherichia coli K-12 phoR mutant strains. J. Bacteriol. 1986. V. 168. P. 1366-1371.

234. Wanner, B. L. Phosphorus assimilation and control of phosphate regulon. In: Neidgardt, F. C. (ed.) Escherichia coli and Salmonella. Cellular and molecular biology. ASM, Washington D.C. 1996. P. 1357-1381.

235. Wanner, B. L., Boline, J. A. Mapping and molecular cloning of the phn (psiD) locus for phosphonate utilization in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 1186-1196.

236. Wanner, B. L., Metcalf, W. W. Molecular genetic studies of a 10.9-kb operon in Escherichia coli for phosphonate uptake and biodégradation. FEMS Lett. 1992. V. 100. P. 133-140.

237. Wanner, B. L., Wilmes-Riesenberg, M. R. Involvement of phosphotransacetylase, acetate kinase and acetyl phosphate synthesis in control of the phosphate regulon in Escherichia coli. J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 2124-2130.

238. Warren, W. A. Biosynthesis of phosphonic acids in Tetrahymena. Biochim. Biophys. Acta. 1968. V. 156. P. 340-346.

239. White, A. K., Metcalf, W. W. Microbial metabolism of reduced phosphorus compounds. Ann. Rev. Microbiol. 2007. V. 61. P. 379-400.

240. White, A. K., Metcalf, W. W. Two C-P lyase opérons in Pseudomonas stutzeri and their roles in the oxidation of phosphonates, phosphite and hypophosphite. J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 4730-4739.

241. Whittaker, M. M., Whittaker, J. W. A tyrosine-derived free radical in apogalactose oxidase. J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 9610-9613.

242. Williams, G. M., Kroes, R., Munro, I. C. Safety evaluation and risk assessment of the herbicide Roundup and its active ingredient, glyphosate, for humans. Reg. Toxicol. Pharmacol. 2000. V. 31. P. 117-165.

243. Wilson, M. M. Characterization of reduced phosphorus metabolism in Alcaligenes faecalis WM2072 and Xanthobacterflavus WM2814. PhD Thesis. 2006. Univ. 111. Urbana.

244. Wilson, M. M., Metcalf, W. W. Genetic diversity and horizontal transfer of genes involved in oxidation of reduced phosphorus compounds by Alcaligenes faecalis WM2027. Appl. Env. Microbiol. 2005. V. 71. P. 290-296.

245. Winans, S. Transcriptional induction of an Agrobacterium regulatory gene at tandem promoters by plant-released phenolic compounds, phosphate starvation, and acidic growth media. J. Bacteriol. 1990. V. 172. P. 2433-2438.

246. Xiang, W.-S., Wang, X.-J., Ren, T.-R., Ju, X.-L. Expression of a wheat cytochrome P450 monooxygenase in yeast and its inhibition by glyphosate. Pest. Manag. Sci. 2005. V. 61. P. 402-406.

247. Yakovleva, G. M., Kim, S.-K., Wanner, B. L. Phosphate-independent expression of the carbon-phopshorus lyase activity of Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P.573-578.

248. Yang, K., Metcalf, W. W. A new activity for an old enzyme: Escherichia coli bacterial alkaline phosphatase is a phosphite-dependent hydrogenase. PNAS. 2004. V. 101. P. 7919-7924.

249. Zablotowicz, R. M., Reddy, Krishna N. Impact of glyphosate of the Bradyrhizobium japonicum symbiosis with glyphosate-resistant transgenic soybean: a minireview. J. Environ. Qual. 2004. V. 33. P. 825-831.

250. Zeleznick, L. D., Myers, T. C., Titchener, E. B. Growth of Escherichia coli on methyl-and ethylphosphonic acids. Biochim. Biophys. Acta. 1963. P. 546-547.

251. Zhang, G., Allen, K. N., Dunaway-Mariano, D. Enzymatic synthesis of radiolabeled phosphonoacetaldehyde. Anal. Biochem. 2003a. V. 322. P. 233-237.

252. Zhang, G., Dai, J., Lu, Z., Dunaway-Mariano, D. The phosphonopyruvate decarboxylase from Bacteroides fragilis. J. Biol. Chem. 2003b. V. 278. P. 41302-41308.

253. Zhang, G., Mazurkie, A. S., Dunaway-Mariano, D., Allen, K. N. Kinetic evidence for a substrate-induced fit in phosphonoacetaldehyde hydrolase catalysis. Biochemistry. 2002. V. 41. P. 13370-13377.

254. Zhang, Q., van der Donk, W. A. Answers to the carbon-phosphorus lyase conundrum. ChemBioChem. 2012. V. 13. P. 627-629.

Информация о работе

Свиридов, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Пущино, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Ферментные системы катаболизма органофосфонатов у почвенных бактерий Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы