Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биодеструкция глифосата почвенными бактериями

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Биодеструкция глифосата почвенными бактериями"

На правах рукописи

Шушкова Татьяна Валентиновна

БИОДЕСТРУКЦИЯ ГЛИФОСАТА ПОЧВЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03.01.06 — Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино-2010

004608304

Работа выполнена в лаборатории микробной энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель: доктор биологических наук

A.A. Леонтьевский

Официальные оппоненты: заслуженный деятель науки, доктор

биологических наук, профессор JI.A. Головлёва

доктор биологических наук Н.Д. Ананьева

Ведущая организация: Московский государственный университет,

факультет почвоведения

Защита диссертации состоится « -fS » 2010г.

в JO часов ¿УОмин. на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещен на сайте http://www.ibpm.ru Автореферат разослан « У у » ^¿¿'¿bAs' 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук

В.М. Вагабов

Актуальность проблемы

Одним из последствий развития современной цивилизации является загрязнение окружающей среды ксенобиотиками. Среди наиболее опасных загрязнителей - органофосфонаты (ОФ), фосфорорганические соединения, характеризующиеся наличием прямой углерод-фосфорной (С-Р) связи. ОФ необычайно устойчивы к химическому и физическому воздействию из-за особых свойств С-Р связи в их структуре. ОФ входят в состав гербицидов, антибиотиков, пламегасителей, ингибиторов коррозии, часто используются как хелатируюгцие добавки к детергентам и являются продуктами химической нейтрализации фосфорорганических отравляющих веществ, таких как зарин, зоман, УХ.

Самый известный представитель этого класса соединений, глифосат (ГФ), является основой множества гербицидов, зарегистрированных более чем в 120 странах под различными торговыми марками (Раундап, Граунд Био, Ураган, Глисол и др.). Хотя производители приводят доказательства безопасности гербицидов на основе ГФ, независимыми исследователями было показано, что ГФ изменяет почвенную экосистему, влияя на состав и активность микрофлоры, увеличивает восприимчивость культурных растений к болезням, способствует аккумулированию тяжелых металлов в водных экосистемах и оказывает вредное воздействие на гидробионтов. При попадании в организм млекопитающих он приводит к нарушениям функций ряда органов. Остаточные количества ГФ способны сохраняться долгое время в растениях, плодах, рыбе и других продуктах питания. Он может накапливаться в почве вследствие сорбции и миграции и сохраняться в ней в течение нескольких лет. В такой ситуации особую актуальность приобретают способы очистки и восстановления природной среды, загрязненной ОФ. Из-за устойчивости этих соединений к физико-химическим воздействиям, внимание исследователей привлекают микроорганизмы, способные к их биодеструкции путем разрыва С-Р связи.

Как правило, при разрушении ГФ природными микробными сообществами почвы и воды происходит его трансформация до аминометилфосфоната (АМФК), по-прсжпему содержащего С-Р связь. Известны лишь отдельные штаммы-деструкторы, способные минерализовать АМФК. Деструктивный потенциал и общая эффективность таких штаммов не всегда высоки, поэтому поиск и выделение новых штаммов-деструкторов, а также повышение их активности весьма актуальны, причем, в первую очередь, для создания современных биотехнологий ремедиации почвы и воды, загрязненных ГФ.

Сведения о физиологических особенностях штаммов-деструкторов ОФ ограничены. Дефицит таких знаний также сдерживает разработку технологических приемов очистки окружающей среды от ГФ, основанных на использовании потенциала природных микроорганизмов-деструкторов. Поэтому приоритетными задачами являются изучение физиологических условий проявления максимальной деструктивной активности микроорганизмов в отношении ОФ, особенно ГФ, разработка приемов повышения их потенциала и способов применения на практике.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка способа биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

В соответствии с этим решались следующие задачи:

1. Выделение и отбор штаммов-деструкторов глифосата из загрязненных почв.

2. Оптимизация условий культивирования штаммов-деструкторов глифосата.

3. Изучение взаимодействия глифосата с почвой.

4. Оценка деструктивной активности отобранных штаммов в почве в условиях микрокосма.

5. Изучение биодеструкции глифосата и изменение токсикологических показателей почвы в полевых условиях.

6. Изучение условий хранения биомассы штаммов-деструкторов. Научная новизна

Из почв с многолетним загрязнением органофосфонатами выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ГФ и метилфосфоновой кислоты (МФК). Наиболее активный из них, ОскгоЬаМгит аШкгорг ОРК 3, был способен к росту в среде с концентрацией ГФ до 10 г/л. В отличие от многих известных штаммов отобранные нами бактерии обладали способностью минерализовать токсикант без накопления АМФК, как продукта трансформации, содержащего устойчивую С-Р связь. Показана способность штаммов-деструкторов выживать и сохранять деструктивную активность в почве при высоком уровне загрязнения ГФ, в десять раз превышающем рекомендуемые нормы применения гербицида.

Путем оптимизации условий культивирования (голодание посевного материала по фосфору, исходная концентрация ГФ, значение рН и рОг и др.) эффективность деструкции ГФ была повышена в 2,5 раза.

Впервые была проведена комплексная оценка процесса ремедиации загрязненной ГФ почвы, включающая как убыль ГФ при интродукции бактерий-деструкторов О. аШкгорг вРК 3 и АсИготоЬааег Бр. К^ 16 с учетом сорбции и

миграции токсиканта, так и изменение экотоксикологических характеристик загрязненной почвы. Показано восстановление биологической активности почвы в результате биоремедиадии. Изучение биодеструкции ГФ интродуцированными штаммами, как в лабораторных, так и в полевых условиях проводилось впервые.

Практическая значимость

Создана коллекция бактерий-деструкторов, способных разрушать разные типы С-Р связи, которые могут использоваться для создания технологий очистки объектов окружающей среды от ОФ различной структуры. Микроорганизмы, отобранные для внесения в почву, непатогенны для теплокровных животных, не обладают фито- и интегральной токсичностью и могут использоваться в процессе биоремедиации без ограничений. Разработаны способы улучшения деструктивных свойств штаммов, выделенных из окружающей среды.

Подобраны стабилизаторы, внесение которых в биомассу штаммов-

о

деструкторов позволяет сохранять их высокую деструктивную активность при комнатной температуре в течение 50 суток.

В лабораторных и полевых экспериментах доказана эффективность применения выделенных микроорганизмов, АсЬготоЬас1ег эр. К^ 16 и О. агпкгорг ОРК 3, для биоремедиации почвы, загрязненной ГФ. В условиях периодического культивирования наибольшую эффективность как деструктор ГФ показал штамм О. аЫкгор'г БРК 3, тогда как в экспериментах с интродукцией штаммов в почву, особенно в полевых условиях, лучшим деструктором оказался АсИготоЬаШг ер. К^ 16. Получен акт полевых испытаний по биоремедиации почвы, проведенных на специально выделенных участках Серпуховского района Московской области в летний период 2006,2007 гг.

Полученные сведения о процессах сорбции ГФ и его вертикальной миграции в почве, а также степени участия природного микробного сообщества в деструкции токсиканта позволяют более точно оценивать эффективность интродукции штаммов-деструкторов и риски при обработке почвы гербицидами на основе ГФ.

На основе проведенных исследований впервые разработан способ очистки почв, загрязненных ГФ (заявка на получение патента РФ N2 2009105432 «Штамм бактерий АсИготоЬаМег Бр. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы»).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы и приложение.

Работа изложена на 128 страницах, содержит 20 таблиц, 16 рисунков и четыре схемы. Библиографический указатель содержит 197 источников литературы.

Апробация работы н публикации

Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 8th International Conference on Contaminated Soil "ConSoil 2003" (Gent, Belgium, 2003), Международная конференция «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), Международный научный семинар «От экологических исследований к экологическим технологиям» (Миасс, 2006), Международная конференция «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск. Белоруссия. 2006), 10* International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms (Prague, Czech Republic. 2006), 10th International Conference on Soil-Water Systems (Milano, 2008), Пятая международная конференция «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008), Пятый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), III International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology (Lisbon, 2009) и VIII Международной специализированной выставке «Мир биотехнологии 2010» (Москва, 2010). По материалам диссертации опубликовано 4 статьи из списка, рекомендованного ВАК, заявка № 2009105432 на получение патента РФ и 15 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных конференций.

Исследования поддерживались грантом Федерального агентства по науке и инновациям Минобрнауки России (программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006 г.г.») «Биотехнологии для защиты окружающей среды» Госконтракт № 43.073.1.1.2502 от 31.01.2002 г, грантом МНТЦ № 1892.2 «Создание новой технологии биоремедиации почв, загрязненных фосфорорганическими ядохимикатами, с помощью микроорганизмов-деструкторов», грантом РФФИ 09-04-00320 «Глифосат-оксидоредуктаза бактерии Ochrobactrum anthropi GPK 3».

Ряд исследований проводили совместно с НИЦ ТБП (Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов Федерального медико-биологического Агентства России, г. Серпухов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среды для культивирования бактерий. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду MS 1 (Ермакова и др., 2008). Источниками фосфора служили МФК (Aldrich, США) в концентрации 300 мг/л или ГФ в

концентрации 500 мг/л в составе гербицида Граунд Био, 36 % водный раствор («Техноэкспорт», Россия), аналогичного по составу препарату Раундап (Roundup, «Monsanto», США). Источник углерода, глутамат натрия, вносили в концентрации 10 г/л.

При изучении влияния источника азота на эффективность разложения глифосата использовали: 1) глутамат натрия в тех вариантах, где он одновременно служил источником азота и углерода; 2) сукцинат натрия в качестве источника углерода во всех других случаях, 3) хлорид аммония, нитрат калия, нитрат аммония, мочевину, глифосат в качестве источников азота. Концентрацию источников азота рассчитывали исходя из содержания азота в них равного 1 г/л, что соответствовало его содержанию в 10 г/л глутамата натрия.

Выделение микроорганизмов-деструкторов ОФ. В работе использовали образцы почв, загрязненных ГФ (Краснодарский край), отходами химического производства, содержащими алкилфосфонаты, а также почву, инокулированную биопленкой очистных сооружений (г. Шиханы, Саратовской обл.).

Микроорганизмы-деструкторы получали методом накопительных культур:

- в стеклянной колонке с почвой, инокулированной биопленкой очистных сооружений. В колонку в течение двух лет периодически вносили раствор МФК в возрастающей концентрации от 0,05 до 0,5 г/л. Затем почву, отобранную с разной глубины, суспендировали и делали высевы из разведений на твердую среду LB.

- путем длительного компостирования почвы, загрязненной алкилфосфонатами (два образца) или ГФ (три образца) с внесением в нее МФК (0,4 мг МФК/г почвы) или ГФ (2,4 мг ГФ/г почвы) при температуре 28 °С в течение трех месяцев. Затем 10 г почвы инкубировали в жидкой среде MS1 с МФК или ГФ и глутаматом натрия. Суспензию последовательно пересевали один раз в неделю, проводя, таким образом, пять пассажей. Отселектироваиные штаммы высевали на агаризованную среду LB и выделяли чистые культуры деструкторов.

- путем внесения свежеотобранного образца загрязненной ГФ почвы (три образца) непосредственно в жидкую среду MS 1 с ГФ и глутаматом натрия. Суспензию последовательно пересевали в свежую жидкую среду, проводя, таким образом, 12 пассажей, после чего отселектироваиные штаммы высевали на агаризованную среду LB для выделения чистых культур.

Отбор штаммов-деструкторов ОФ проводили в условиях периодического культивирования в колбах на качалке (180 об/мин) при 28 °С в жидкой минеральной среде MS 1 с МФК и ГФ. Критерием отбора служило количество

биомассы, получаемое в этих условиях: в среде с МФК биомасса бактерий не ниже 1 г/л, в среде с ГФ биомасса выше 0,5 г/л.

Деструкторы хранили в коллекции на косяках с минеральной средой с ГФ или МФК, в качестве источников фосфора при +4 0 С.

Активность выделенных штаммов оценивали по количеству биомассы, выросшей в жидкой среде MS 1, и по эффективности деструкции, которую рассчитывали как отношение потребленного ОФ (МФК или ГФ) к количеству сухой биомассы (мг0ф/г). Пересчет ОП на вес сухой биомассы проводили согласно коэффициенту 0,5 г биомассы/ед. ОП56о, полученному экспериментально.

Инокулят для экспериментов выращивали в течение 3-4 суток на агаризованной среде MS 1 с ОФ, затем клетки смывали в стерильную колбу с жидкой средой без источника фосфора, добавляли глутамат натрия в качестве источника углерода и инкубировали суспензию двое суток на качалке при 28 °С для голодания клеток по фосфору.

Таксономическую принадлежность штаммов-деструкторов осуществляли по морфологическим, культуральным и физиологическим признакам согласно определителю Берджи (1984 г.), а также на основе анализа первичных нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК.

Сохранение жизнеспособности и деструктивной активности биомассы, предназначенной для внесения в почву, обеспечивали введением стабилизаторов в предварительно сконцентрированную микробную суспензию с титром 10lo-10'2 КОЕ/мл. Суспензии хранили в закрытых пробирках при температуре 28 °С, 4 °С и комнатной температуре. В процессе хранения контролировали гитр жизнеспособных клеток. Эффективность деструкции при разных способах хранения (оптимальные стабилизаторы, температура комнатная и +4 °С) определяли в условиях периодического культивирования в среде MS 1 с ГФ.

Концентрацию неорганического фосфора определяли

спектрофотометрически по образованию комплекса фосфомолибдата с малахитовым-зеленым в кислой среде (Hess and Derr, 1975).

Количество общего фосфора в жидких пробах определяли этим же методом после гидролиза культуральной жидкости с персульфатом аммония (400 г/л) в течение одного часа (Schowanek and Verstraete, 1990). Содержание МФК и ГФ в культуральной жидкости рассчитывали по разнице в количестве общего и неорганического фосфора в пробе, вводя коэффициенты пересчета - 3,1 для МФК и 5,45 для ГФ.

Содержание общего фосфора в клетках определяли после сожжения биомассы с хлорной кислотой (Новиков, 1990).

Анализ ГФ в культуральной жидкости проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе фирмы LKB 2150 и колонке Repro-Gel Н, 9 mkm, 250 х 8 mm (Dr. Maisch, Германия). Состав подвижной фазы 0,01 N серная кислота, температура 65 °С, длина волны на УФ детекторе 206 нм, время удерживания ГФ R,=19,8 мин (Зеленкова и Винокурова, 2008). В качестве стандарта использовали ГФ (Fluka, Германия).

Анализ метаболитов деструкции в культуральной жидкости проводили методом ВЭЖХ в условиях, указанных выше. Метаболиты дериватизировали (ацилировали), добавляя к 100 мкл пробы 10 мкл уксусного ангидрида и 2 мкл триэтиламина. Стандартами служили полученные вышеописанным способом ацильные производные аминометилфосфоновой кислоты (АМФК, Sigma, Германия), саркозина (ДиаМ, Россия). Время удерживания АМФК Rt=4,9 мин, саркозина Rt=l 1,0 мин.

Количественное определение ГФ в почвенных экстрактах проводили методом ВЭЖХ как описано выше. ГФ извлекали из почвы экстракцией IN NaOH (Borjesson and Torstensson, 2000). При подготовке проб к анализу экстракты предварительно освобождали от механических примесей фильтрованием, очистку от гуминовых веществ осуществляли осаждением 20% серной кислотой с последующим отделением осадка.

Наличие глутамата натрия в среде контролировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинах Silufol (LaChema, Чехия) с последующим проявлением 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне, сопоставляя с Rf стандарта в системе п-бутанол - уксусная кислота - вода (12:3:5). Rf глутамата натрия был равен 0,3.

Отбор перспективных микроорганизмов-деструкторов ГФ в почве

проводили на основе: оценки деструктивного потенциала в почве, биотестирования на культуре дафний, проверки фитотоксичпости (как описано ниже). Изучение безопасности штаммов для лабораторных теплокровных животных (мыши, крысы) было проведено в соответствии с международными требованиями, по следующим показателям: вирулентности (LDS0), токсичности, токсигенности, диссеминации во внутренних органах экспериментальных животных. Токсикологические исследования штаммов и почвы в лабораторных и полевых экспериментах проводили совместно с НИЦ ТБП (г. Серпухов).

Изучение сорбции ГФ проводили со свежеотобранными в окрестностях г.г. Серпухова и Пущико (Московская обл.) образцами двух типов незагрязненных почв: дерново-подзолистой среднесуглинистой (ДП, рН 7,1; С0?г - 1 %; содержание глины - 39,8 %; песка - 16,1 %, ила - 25,4 %, обменного фосфора - 4,5 мг РгСУЮОг) и серой лесной легкоглинистой (СЛ, рН 7,0;Сорг - 1,6 %; содержание глины - 54,5 %; песка - 1,3 %, ила - 30,0 %, обменного фосфора - 17,5 мг Р2О5/ЮОГ). В качестве источника ГФ использовали препарат Граунд Био.

Для численной характеристики процесса сорбции изотермы, полученные в почвенной суспензии в диапазоне концентраций ГФ от 50 мг/л до 8 г/л, аппроксимировали с помощью уравнения Фрейндлиха: СТ=К(СЖ"", где Сж (мг/л) -концентрация ГФ в жидкой фазе, Ст (мг/кг) -содержание ГФ в твердой фазе.

Для определения количества сорбированного почвой ГФ в экспериментах в условиях микрокосма и полевых опытах, сначала извлекали растворенный ГФ путем встряхивания 25 г образца с 25 мл дистиллированной воды и последующим центрифугированием. Далее проводили экстракцию сорбированного ГФ из твердой фазы щелочью.

Для интродукции в почву микроорганизмы выращивали в условиях периодического культивирования в колбах на качалке (для лабораторных опытов) или в биореакторе Анкум-2М с рабочим объемом 6 л (для полевых экспериментов) в минеральной среде с 250 мг/л ГФ и 10 г/л глутамата натрия. В середине экспоненциальной фазы роста биомассу отделяли центрифугированием, дважды промывали минеральной средой без источника фосфора, суспендировали в этой же среде с добавлением 10 г/л глутамата и инкубировали на качалке в течение двух суток для голодания по фосфору. Для интродукции в почву готовили микробную суспензию с титром 3-5 х 108 КОЕ/мл и вносили из расчета 1 л/м2поверхности, что составляло 107-108 КОЕ/г почвы.

Биодеструкцию ГФ в условиях микрокосма изучали с участием аборигенных микроорганизмов, присутствующих в используемой ДП почве и при интродукции в нее бактериальных штаммов-деструкторов АсИготоЬШег Бр. К§ 16 и О. аыкгор'1 вРК 3. ГФ вносили в составе гербицида Граунд Био (50-60 мг ГФ/кг почвы, 100 л гербицида/га, 10-кратное превышение нормы, рекомендуемой для одноразового использования при уничтожении сорняков), распределяя его по всей поверхности. Дополнительный источник углерода в почву не вносили. Для определения содержания ГФ, интегральной токсичности, фитотоксичности, дегидрогеназной активности отбирали пробы из всего объема почвы в стакане. Для определения КОЕ из усредненных проб проводили высев на чашки с агаризованной

минеральной средой MSI с ГФ (титр деструкторов ГФ) или со средой LB (общее число микроорганизмов). Число КОЕ рассчитывали на 1 г воздушно-сухой почвы (в.с.п.).

Изучение миграции ГФ по вертикальному профилю проводили в почвенной колонке с ДП почвой (d = 8,5 см, h = 40 см с отверстием для отвода воды в нижней части) с внесением штаммов О. anthropi GPK 3 или Achromobacter sp. Kg 16. Загрязнение почвы ГФ проводили из расчета 100 л/га (60 мг/кг). Определение концентрации ГФ проводили на 0, 7 и 21 сутки эксперимента в образцах с глубины 0-10 см, 10-20 см, 20-30 см. Экстракция ГФ из почвы и метод анализа описаны выше. На 10 сутки опыта проводили увлажнение почвы, имитирующее ливень, фильтрат анализировали на содержание ГФ.

Биорсмсдиацию почвы, загрязненной ГФ, в полевых условиях проводили путем интродукции штаммов О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 через 72 часа после внесения гербицида Граунд Био (100 л препарата/га, 60 мг ГФ/кг почвы). Дополнительный источник углерода в почву не вносили. Продолжительность опыта 28 суток.

Интегральную токсичность почвы, загрязненной ГФ, оценивали по токсичности водных экстрактов для лабораторной культуры дафний в динамике опыта.

Фнтотоксичность загрязненной почвы определяли в лабораторных условиях на проростках овса по стандартной методике. Измерение морфометрических показателей проводили через 5 суток.

Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью статистического пакета Excel. В таблицах и на рисунках приведены данные трех типичных опытов, где каждое значение есть среднее арифметическое между биологическими повторностями (M=Lm,/n). Среднее (стандартное) квадратичное отклонение считали по формуле о = V Е(гп; - M)2/n -1. Относительное стандартное отклонение не превышало 12 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Отбор активных штаммов-деструкторов органофосфонатов

В результате работы по отбору микроорганизмов-деструкторов ОФ из 40 выделенных культур была сформирована коллекция из 13 наиболее активных штаммов. Определена эффективность деструкции ГФ или МФК этими микроорганизмами (табл. 1) и таксономическая принадлежность пяти наиболее активных штаммов. Сравнение неполных первичных нуклеотидных

последовательностей генов 16S рРНК показало, что исследуемые штаммы МРК 7, MPS 12, Kg 16 относятся к роду Achromobacter, штамм GPK 1 - Achromobacter xylosoxidans, штамм GPK 3 к Ochrobactrum anthropi.

Таблица 1.

Сравнительная оценка деструкции ГФ и МФК отобранными микроорганизмами

Штамм Источник фосфора в накопительной культуре Рост в среде с ОФ

МФК ГФ

Биомасса, г/л И.Ч1 Эффективность деструкции, мгмфк/г Биомасса, г/л Г' Эффективность деструкции, МГгф/г

GPK 1 ГФ 2,3 0,08 33±4 1,5 0,06 26±5

Kg 16 ГФ 2,3 ОД 52±6 2,0 0,04 36±6

GPK3 ГФ 2,7 0,16 49±7 3,3 0,10 56±5

GPK 2 ГФ 2,1 0,07 н/о 1,8 0,04 н/о

MGPK4 ГФ 2,2 0,04 н/о 1,2 0,05 н/о

МРКЗ ГФ 1,9 0,07 49±7 Сл н/о

Km 11 ГФ 1,9 0,04 41±2 Сл. н/о

МРК 7 ГФ 2,5 0,1 48±2 Сл. н/о

МРК 8 ГФ 2,1 0,08 33±2 Сл. н/о

Sm51 МФК .2,2 0.07 50±5 Сл. н/о

MPS 10 МФК 2,3 0,08 39±2 Сл. н/о

MPS 11 МФК 2,2 0,12 52±3 Сл. н/о

MPS 12 МФК 2.4 0,16 47±3 Сл. н/о

Примечания: Сл.- слабый рост (биомасса не выше 0,2 г/л), н/о - не определяли, ц - удельная скорость роста

Предварительное изучение полученных изолятов показало, что они могут быть разделены на две группы:

1) Штаммы, выделенные под селективным давлением МФК или ГФ, способные расти без специальной адаптации только на МФК, в среде с ГФ их биомасса не превышала 0,2 г/л.

2) Штаммы, выделенные под селективным давлением ГФ, но растущие как на МФК, так и на ГФ.

Таким образом, ГФ, как единственный источник фосфора, без предварительной адаптации могли использовать только те микроорганизмы, которые длительное время находились в загрязненной гербицидом почве. Не было выделено штаммов, которые росли в среде с ГФ, но при этом не использовали в качестве единственного источника фосфора МФК.

Самым высоким деструктивным потенциалом в условиях периодического культивирования обладал штамм ОскгаЬаМгит аШкгор! СРК 3, который к тому же не выделял в среду культивирования продуктов, содержащих С-Р связь. Принимая во внимание эти характеристики, его использовали в последующих эксприментах.

В таблице 2 приведены данные, которые позволяют сравнить этот штамм с описанными рацее микроорганизмами.

Таблица 2.

Сравнение деструктивной активности штаммов по отношению к Глифосату в условиях периодического культивирования

Штаммы Концентрация ГФ в среде, мг/л Потребление ГФ, мг/л

Ochrobactrum anthropi GPK 3 150 150

500 223

1000 250

Pseudomonas sp. PG2982 (Moore el al, 1983) 150 80

Flavobacterium sp. (Balthazor and Hallas, 1986) 150 150 (до аминометилфосфоната)

Arthrobacter sp. GLP-1 (Pipkee/a/., 1987) 17 13

Geobacillus caldoxylosilyticus T20 (Obojska ei al„ 2002) 150 100 (до аминометилфосфоната)

Анализ литературных данных позволил сделать вывод, что в исследованиях, проводимых с деструкторами ОФ, основное внимание уделялось изучению физиологических характеристик этих микроорганизмов, их способности разлагать различные виды ОФ, механизмов разрушения таких соединений.

2. Оптимизация условий культивирования ОсЬгоЪа&гит аШкгор1 вРК 3 с целью повышения деструктивной активности

Проведен выбор источников азота и углерода, оптимальных для роста и деградации ГФ. Глутамат натрия как источник углерода, и глутамат натрия и хлорид аммония, в качестве источников азота были наиболее эффективны (данные не представлены). Ни один из выделенных микроорганизмов не использовал ГФ как единственный источник углерода и азота.

Использование ГФ при подготовке инокулята в сравнении с ортофосфатом и МФК увеличивало степень его утилизации в опыте в два раза (табл. 3).

Таблица 3.

Рост О. апЛгорг СРК 3 и потребление ГФ при выращивании инокулята в среде с разными источниками фосфора

Определяемые параметры Источник фосфора для наращивания инокулята

ГФ МФК Ортофосфат

Источник фосфора в опыте

ГФ

Биомасса, г/л 2,4 1,5 1.2

Потребление ГФ, мг/л 128±15 79±4 57±8

Основываясь на данных литературы о том, что длительное голодание клеток микроорганизмов по фосфору способствует увеличению потребления ГФ, было влияние продолжительности голодания инокулята по фосфору на его биодеградацию. Показано, что при наличии источника углерода биомасса «голодающих» по фосфору клеток за 48 часов увеличивалась как по числу КОЕ, так и по ОП56о при снижении внутриклеточного содержания фосфора с 1,4 до 0,6 %. При увеличении продолжительности голодания до 96 часов, число КОЕ резко уменьшалось вследствие их лизиса, хотя по показаниям ОП560 эти изменения не отражались (рис. 1). Таким образом, для получения жизнеспособного посевного материала голодание не следовало проводить более 72 часов.

Рисунок 1. Изменение биомассы инокулята и содержания фосфора в клетках О. аЫкгорг СРК 3 в процессе голодания по фосфору. 1 - биомасса, КОЕ/мл; 2 - биомасса, ед. ОГЬбо; 3 - содержание общего фосфора в клетках, %.

УЬыль 1Ф и эффективность его деструкции при периодическом культивировании в среде с ГФ за весь период культивирования заметно увеличивались при использовании «голодных» по фосфору клеток (табл. 4).

Использование посевного материала после 48 часов голодания позволило увеличить потребление ГФ (мг/л) на 27 % и эффективность деструкции (мг/г) на 30 %. Максимальная биомасса в стационарной фазе не зависела от времени голодания инокулята, так как ее нарастание лимитировалось количеством источника углерода.

Таблица 4.

Влияние продолжительности голодания посевного материала на рост культуры О. аш/ггор! и её способность к деструкции ГФ

Продолжительность голодания, ч Биомасса, г/л КОЕ, Ю10 кл/л Убыль ГФ, мг/л Эффективность деструкции ГФ

мг/г биомассы мкг/108кл

0 2,95 772 176 60 22,8

24 2,85 769 207 73 26,9

48 2,85 728 223 78 30,7

72 2,95 814 197 67 24,2

96 3 716 146 49 20,4

Изучение динамики содержания фосфора в клетках показало, что при использовании инокулята, голодавшего по фосфору в течение 48 часов, количество

О 50 100

Продолжительность голодания, ч

общего фосфора в клетках увеличивалось оно убывало до 1,2 % по мере нарастания

7 - \ 2

Время, ч

с 0,6 % до 1,7 % в период лаг-фазы, затем биомассы (рис. 2).

Рисунок 2. Динамика роста и изменение содержания общего фосфора в клетках О. апМгорг вРК 3.1- биомасса, ед. ОШбо,; 2 - биомасса, КОЕ/мл; 3 - содержание общего фосфора в клетках, %.

Следовательно, фосфор, запасенный в начальный период, использовался в логарифмической фазе роста на синтез клеточных компонентов, что подтверждалось результатами изменения содержания общего фосфора в клетках в разные фазы роста культуры.

Определение концентрации ГФ, ингибирующей рост культуры проводили в диапазоне от 0,05 до 10 г/л. При начальной концентрации ГФ 0,05 г/л рост бактерий прекращался вследствие полного потребления источника фосфора при избытке глутамата натрия. В средах с концентрацией ГФ 0,25 г/л и выше лимитирующим рост фактором было исчерпание источника углерода, поскольку при дополнительном его внесении рост изучаемой культуры и деструкция токсиканта возобновлялись. Высокие концентрации (свыше 5 г/л) не ингибировали рост изучаемой культуры (рис. 3, А). Эффективность деструкции ГФ возрастала с увеличением его исходной концентрации (рис. 3, Б). Накопления ортофосфата или аминометилфосфоната в культуральной жидкости не обнаруживали.

Продолжительность, ч Концентрация ГФ, г/л

Рисунок 3. Влияние исходной концентрации ГФ на рост (А) и эффективность деструкции (Б) О. апЛгор1ОРК 3. (А) Концентрация ГФ в среде 1 - 0,05 г/л, 2 - 0,25 г/л, 3 - 0,5 г/л, 4-10 г/л.

Можно предположить, что высокие концентрации ГФ (5, 10 г/л), создавая селективное давление на клеточную популяцию в условиях отсутствия других источников фосфора, способствовали адаптации клеток, что приводило к увеличению эффективности деструкции.

Культивирование в биореакторе Анкум-2 позволило исследовать влияние значения рН и аэрации на рост О. ап&гор'1 ОРК 3. В зависимости от значения рН среды происходило изменение физиологических характеристик культуры (табл. 5):

- продолжительность лаг-фазы удлинялась от 16 (рН 6,0) до 37 ч (рН 8,0);

- общая продолжительность культивирования до перехода культуры в стационарную фазу возрастала от 48 (рН 6,0) до 80 ч (рН 8,0);

- максимальная удельная скорость роста, равная 0,14 ч"1, была отмечена при рН 7,0, тогда как при рН 8,0 она была значительно ниже - 0,09 ч"1;

- биомасса бактерий в слабощелочной среде была в два раза ниже, чем в нейтральной или слабокислой среде.

Таблица 5.

Влияние рН и аэрации на рост и эффективность биодеструкции ГФ при культивировании штамма бактерий О. ап11ггор1 ОРК 3 в биореакторе

pH; аэрация % Лаг-фаза, ч Переход в стационарную фазу, ч Макс. биомасса, г/л Убыль ГФ, мг/л Эффективность деструкции ГФ в динамике роста, мг/г биомассы

1* II III IV

6,0; 50-60 16 48 3,6 444 500 (0,03) 173 (0,08) 115 (0,12) 123

7,0; 50-60 28 60 3,5 461 400 (0,03) 196 (0,10) 132 (0,14) 132

8,0; 50-60 37 80 1,8 263 690 (0,02) 230 (0,07) 109 (0,09) 146

7,0; 10-20 20 60 3,4 415 440 (0,02) 261 (0,07) 100 (0,12) 122

* -1 - лаг-фаза; II - переход от лгг-фазы к фазе экспоненциального роста; III - логарифмическая фаза роста; IV - весь период от начала культивирования до перехода в стационарную фазу роста. В скобках даны значения удельной скорости роста р., ч"соответствующие указанным периодам культивирования.

Изменялась также и деструктивная активность культуры: при рН 6,0 и 7,0 количество потребленного ГФ составило 444 и 461 мг/л, тогда как при рН 8,0 - 263 мг/л. При изменении интенсивности аэрации в диапазоне от 10 до 60 % от насыщения биомасса бактерий и эффективность деструкции ГФ значительно не изменялись. Во всех вариантах опыта эффективность деструкции ГФ была максимальной в лаг-фазе, снижалась в 2-3 раза при переходе из лаг-фазы в фазу логарифмического роста (II) и далее уменьшалась в 1,5-2,5 раза в логарифмической фазе роста (III).

3. Сорбция ГФ почвой

Накоплению ГФ в почве может способствовать его сорбция почвенным матриксом. Сорбционная способность почв описывается изотермой сорбции, которая характеризует распределение поллютанта между твердой и жидкой фазами. Получены изотермы сорбции ГФ для дерново-подзолистой (ДП) и серой лесной (СЛ) почв, различающихся по физико-химическим свойствам и механическому составу (рис. 4). Они удовлетворительно описывались уравнением Фрейндлиха: Сг=К(Сж1/п, где Сж - концентрация ГФ в жидкой фазе (мг/л) и Ст - содержание ГФ в твердой фазе (мг/кг), а Кг и 1/п - постоянные, которые позволяют оценить сорбционную емкость и интенсивность процесса поглощения токсиканта, соответственно. Значения Кг и 1/п, полученные путем аппроксимации экспериментальных точек, для ДП почвы составили, соответственно, 15,6 и 0,64, а для СЛ почвы 18,7 и 0,73, что хорошо коррелирует с известными данными для соответствующих типов почв. При этом данные для столь широкого диапазона концентраций ГФ получены впервые.

10000 8000 6000 4000 2000 о

* *4

Рисунок 4. Изотермы сорбции ГФ. 1 -суспензия ДП почвы, 2 - суспензия СЛ почвы.

2000 4000 С,, мг/л

6000

Максимальная поглотительная емкость ДП и СЛ почв по отношению к ГФ, 3560 и 8200 мг/кг, свидетельствует об их высокой сорбционной способности, что существенно снижает биодоступность гербицида в условиях окружающей среды.

4. Изучение биодеградации ГФ в почве с помощью штаммов-деструкторов в условиях микрокосма

Отбор перспективных штаммов для биоремедиации проводили как по их деструктивной активности в почве, так и по токсикологическим показателям. Девять штаммов из созданной коллекции были проверены по следующим критериям: убыли ГФ в почве при внесении штамма, безопасности для живых организмов и показателям интегральной токсичности и фитотоксичности.

Все исследованные штаммы не выделяли в среду культивирования экзотоксины и, таким образом, не обладали токсичностью по отношению к

дафниям и фитотоксическим эффектом по отношению к проросткам овса. Через четыре недели после внесения микроорганизмов при исходном содержании ГФ в почве 30 мг/кг, его убыль составила 10-23 мг/кг (кроме МРК 8) по сравнению с 6 мг/кг в контроле (табл. 6).

Таблица 6.

Оценка перспективных штаммов-деструкторов

Штамм Деструктивные свойства Патогешюсть для теплокровных животных

Убыль ГФ мг/кг почвы Интегральная токсичность почвы, % гибели дафний

0 суток 28 суток

Контроль <6 30 24

МРК 7 12 ±3 5 -

МРК 8 <6 н/о н/о

SmSl 10 ±3 н/о +

Km 11 10±3 н/о

MPS 12 12 ±3 5 -

MPS 11 16±4 8 -

GPK I 15±3 3 -

GPK3 19±4 9 -

Kg 16 23 ±5 7 -

- отрицательный результат теста; + положительный результат теста; к/о не определяли

Штаммы МРК 7, MPS 12, MPS 11, GPK 1, GPK 3, Kg 16 не были патогенными для теплокровных животных по четырем показателям (вирулентность (LD5o), токсичность, токсигенность, диссеминация во внутренних органах). В результате комплексных лабораторных исследований для дальнейших экспериментов были отобраны наиболее эффективные штаммы Achromobacter sp. Kgl6 и О. anthropi GPK 3. Они соответствовали требованиям, которые предъявляются к микроорганизмам при интродукции в почву в целях ее ремедиации.

Данные о биодеструкции ГФ в почве с помощью интродуцированных деструкторов, в литературе отсутствуют. Процесс биодеградации ГФ в почве изучался только под воздействием аборигенной микрофлоры (Rueppel et al., 1977, Strange-Hansen et al., 2004). Максимальная степень деградации токсиканта составляла не более 11 % при дозе внесения гербицида 100 мг/кг почвы (Getenga and Kengara, 2004).

Деструктивные свойства двух наиболее активных штаммов Achromobacter sp. Kg 16 и О. anthropi GPK 3 были подробно изучены при их интродукции в ДП почву в лабораторных условиях. Степень сорбции ГФ этой почвой при влажности 20-25 % достигала 90 %, при этом весь сорбированный токсикант извлекался щелочной экстракцией, необратимого связывания в этих условиях не происходило. Оставшийся в почвенном растворе ГФ был доступен для микроорганизмов. Его

биоутилизация способствовала последующей десорбции ГФ с почвенного матрикса.

При внесении этих бактерий в почву разложение ГФ в почве достигало 66 % (К£ 16) и 50 % (СРК 3), тогда как в результате деятельности аборигенных микроорганизмов убыль токсиканта за 28 суток эксперимента составляла не более 24 % (табл. 7).

Таблица 7.

Изменение токсикологических и биологических характеристик почвы

Варианты Исходное содержание ГФ, мг/кг почвы Убыль ГФ, % от внесенного Интегральная токсичность, % гибели дафний Фитотоксич-ность, % от контроля с чистой почвой ДГ активность, °/о от контроля с чистой почвой

Продолжительность эксперимента, сутки

7 14 28 0 7 14 28 0 28 0 28

Почва, ГФ 61±8 7±3 16±3 24±4 27 23 17 37 35

Почва, ГФ, ВД6 59±6 56±5 62±3 66±3 30 15 5 0 45 14 33 64

Почва, ГФ, GPK3 60±7 30±4 47±7 50±7 20 13 0 24 62

В таблице приведены средние результаты двух опытов. Относительное стандартное отклонение не превышало 15%.

Снижение содержания ГФ в результате биодеградации сопровождалось снижением интегральной токсичности до уровня чистой почвы и значительным уменьшением фитотоксичности (табл. 7). Об активизации биологических процессов, подавляемых вследствие воздействия токсиканта, свидетельствовало увеличение ее дегидрогеназной активности, что также коррелировало со степенью удаления ГФ из почвы.

Аккумуляции ГФ способствует не только сорбция, но и его миграция в нижние горизонты почвы, где отсутствует микробиологическая активность. Миграция ГФ по вертикальному профилю почвы была отмечена в литературе и ранее (Veiga et al., 2001). Многократное внесение гербицида в почву, которое способствовало накоплению гербицида в почве и обильное увлажнение почвы увеличивали риск миграции в более глубокие слои (Vereecken, 2005, Dousset et al., 2004, Barrett and McBride, 2007).

В настоящей работе этот процесс был изучен с участием, как аборигенных микроорганизмов, так и интродуцированных штаммов О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 в колонке, моделирующей вертикальный почвенный профиль. В варианте с аборигенной микрофлорой через 21 сутки после применения гербицида 18 % токсиканта обнаруживалось в слое 10-20 см. При внесении

штаммов О. агйЪгорI йРК 3 или /\chromobacter эр. ^ 16 на этой же глубине на 21 сутки находили 12 % и 14 % внесенного ГФ, соответственно. Максимальная убыль гербицида в результате биодеструкции достигала 43 % для штамма О. аЫкгор1 ОРК 3 и 58 % для штамма АсИготоЬаЫег эр. ^ 16. В результате деятельности аборигенной микрофлоры убыль ГФ составляла 11%.

После проведенного полива, имитирующего ливень, миграция ГФ усиливалась с вертикальным водным потоком. При этом 6-8 % внесенного ГФ достигали глубины 20-30 см. Вероятно, в этом случае происходило нарушение равновесия между сорбированным и растворенным ГФ, что приводило к десорбции токсиканта, который по макропорам проникал в подповерхностный слой. Собранные после «ливня» фильтраты не содержали ГФ.

Результаты определения КОЕ показали, клетки интродуцированных штаммов в течение всего эксперимента сохранялись жизнеспособными на глубине 0-10 см, при этом их титр снижался к концу опыта на два порядка. Количество аборигенных микроорганизмов в верхнем (0-10 см) слое постепенно увеличивалось с 3,5 х 105 до 8 х Ю5 КОЕ/г почвы, по-видимому, вследствие адаптации к потреблению ГФ.

По окончании эксперимента из почвенных колонок были выделены смешанные культуры, состоящие либо только из аборигенной микрофлоры (контрольная колонка), либо из интродуцированных штаммов с аборигенными микроорганизмами (опытные колонки). Деструктивные характеристики смешанных культур, полученных из опытных колонок, в условиях периодического культивирования в среде с ГФ были достаточно близки таковым для коллекционных штаммов. Эффективность деструкции смешанной культуры с О. ап11ггор1 йРК 3 составила 86 мг/г биомассы (чистая культура из коллекции - 78 мг/г), с ЛскготоЬас1ег Бр. 16 - 29 мг/г биомассы и (чистая культура из коллекции 36 мг/г). У смешанной культуры, состоящей только из аборигенных микроорганизмов, продолжительность лаг-фазы была в 4-5 раз длиннее (96 ч) и эффективность деструкции значительно ниже (7 мг/кг). Это послужило еще одним доказательством того, что именно интродуцированные штаммы вносили основной вклад в деструкцию ГФ в почве.

5. Биоремедиация почвы, загрязненной ГФ, в условиях полевого эксперимента

Опыты по ремедиации почвы, загрязненной ГФ, были проведены в естественных природных условиях в микроделяночных опытах. Пробы отбирались на всей глубине пахотного слоя почвы 0-20 см.

Использовались следующие критерии оценки биоремедиации почвы:

- убыль ГФ в почве;

- изменение токсикологических параметров почвы;

- изменение биологической активности почвы.

Анализ динамики деструкции ГФ интродуцированными микроорганизмами позволил констатировать, что снижение концентрации ГФ в почве было достоверно более высоким, чем в контроле, во все сроки с момента внесения в почву штаммов (рис. 5). Интенсивное потребление токсиканта токсиканта происходило в течение первых двух недель после внесения бактерий. По-видимому, на первом этапе происходило разложение биодоступного ГФ из почвенного раствора, что приводило к его десорбции и увеличению биодоступности.

1

2 Рисунок 5. Динамика изменения содержания

ГФ в почве: 1- контроль без внесения 2 микроорганизмов, 2 - внесение штамма О.

ашИгор/ ОРК 3, 3 - внесение штамма О ю 20 30 АсИготоЬас1ег 5р, К^>16.

Продолжительность, сутки

После двух недель эксперимента титр интродуцированных микроорганизмов резко снижался (на 2-3 порядка), что могло являться причиной прекращения биодеструкции токсиканта. Низкая деструктивная активность аборигенной микрофлоры являлась основным фактором, определяющим скорость деструкции в контроле.

Об успешной очистке почвы от ГФ свидетельствовали также данные по изменению ДГ активности почвенного биологического комплекса, которая в течение месяца увеличивалась с 30 % до 66 % в присутствии интродуцированных штаммов и незначительно изменялась (до 38 %) в контрольном варианте с ГФ (рис. 6, А). Эффективность деструкции ГФ коррелировала с изменением интегральной токсичности почвы, которая снижалась до показателей незагрязненной почвы уже через две недели после интродукции штаммов-деструкторов, и только в два раза к концу эксперимента в контрольном варианте (рис. 6, Б). Во время проведения биоремедиации выявлено снижение фитотоксичности почвы на участках со штаммами О. агнкгорг ОРК 3 и Лс1гготоЬас1ег Бр. ^16 до показателей чистой почвы.

А

Б

2.

у

§ 40 § 30

О 10 20 30

0

10 20 Продолжительность, сутки

20

30

Продолжительность, сутки

Рисунок б. Изменение ДГ активности (А) и интегральной токсичности (Б) в процессе биоремедиации почвы: 1- контроль, 2 - внесение штамма О. ап!Игор! вРК 3, 3 - внесение штамма АскготоЬас1ег эр.

Снижение содержания ГФ в почве сопровождалось увеличением биомассы почвенных бактерий и грибов в 1,2-1,3 и 1,5-1,6 раза соответственно, что указывало на снижение токсичной нагрузки на почвенный микробиоценоз в ходе микробной ремедиации загрязненной почвы.

Эффективность деструкции ГФ у бактерий О. апЛгор1 вРК 3 при культивировании в колбах достигала 78 мг ГФ/г клеток и была выше, чем у штамма Лс/гготоЬаМег Бр. К§16 (56 мг ГФ/г клеток). Поэтому основные приемы оптимизации условий культивирования штаммов, выделенных из загрязненных почв, были представлены на примере этого штамма. В почвенных экспериментах штамм АсИготоЬааег эр. К^16 продемонстрировал наилучшие результаты, и именно он был выбрап для патентования. Возможно, что такое поведение культур может объясняться разными свойствами клеток при взаимодействии их с почвенными частицами и разной степенью доступности субстрата в этих условиях, и полученные данные необходимо учитывать при отборе деструкторов ГФ для использования их в практических целях.

6. Побор стабилизаторов для хранения биомассы штаммов-деструкторов

При изучении особенностей сохранения свойств биопрепарата на основе деструкторов ГФ была использована жидкая форма препарата (в виде пасты). Было проверено восемь добавок, которые используют в качестве стабилизаторов для замедления различных окислительно-восстановительных процессов (тиомочевина, глицерин, аскорбиновая кислота, глутамат натрия), поддержки необходимого осмотического давления (ЫаС1, 0,8 %), рН (борная кислота), ингибиторов протеаз и нуклеаз (ЭДТА) и других. Биомасса штамма О. апЖгор! вРК 3 была более стабильной при хранении, чем биомасса штамма АсИготоЬаМег Бр. К^ 16 (табл. 8).

Таблица 8.

Изменение КОЕ в процессе хранении биомассы штаммов-деструкторов при 28 °С

Стабилизаторы О. anthropi GPK 3 Achromobacter sp. Kg 16

Исходный титр, КОЕ/мл Китр, КОЕ/мл Исходный титр, КОЕ/мл Титр, КОЕ/мл

1 неделя 3 недели 1 неделя 3 недели

Водопроводная вода 5,0 х 10" 2,3x10" 7,0x10' 2,4 хЮ10 5,0x10' <10J

ШС1,0,9 % 2,7x10й 8,0x10' 1,3x10'" <10J

Аскорбиновая кислота, 0,3%, 3,5x10" 3,0x10' 1,7хЮ10 <103

Тиомочевина, 1% 4,0x10" 2,5x10' 7,6x10" 4x104

Сахароза, 10% 3,0x10" 1,4x108 6,8x10'' <103

Глицерин, 10% 1,5x10" 4,0x106 5,7x10" <10J

ЭДТА, 5мМ 8,0x10'° 1,4x10" 1x10" <103

Глутамат, 2% 5,3x10" 1,2x10* 1,5x10'" 3x10"

Борная кислота, 1% 3,5x10" 3x107 5,0x10' <10J

Использование глутамата натрия в качестве стабилизатора значительно повышало сохранность биомассы штамма Achromobacter sp. Kg 16. Титр клеток О. anthropi GPK 3 был максимальным при использовании тиомочевины и аскорбата. Эффективность подобранных стабилизаторов была также подтверждена в процессе хранения биомассы при комнатной температуре (данные не приведены). В результате исследований были подобраны оптимальные добавки, позволяющие сохранять функциональную активность деструкторов ГФ до 50 суток при комнатной температуре.

Заключение

Результаты, полученные в ходе выполнения настоящей работы, позволили разработать способ очистки почв, загрязненных ГФ, in situ. Предлагаемый способ санации почв, загрязненных этим гербицидом, обеспечивает высокую эффективность и является безопасным для человека и животных. В пользу данного заключения свидетельствуют следующие факты:

- по результатам токсикологических исследований выделенные природные штаммы-деструкторы О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 признаны безопасными для теплокровных животных и могут применяться для биоремедиации в окружающей среде без ограничений;

- штаммы минерализуют ГФ, не образуя токсичных метаболитов, содержащих С-Р связь;

- вследствие интродукции микроорганизмов содержание ГФ в почве снижается до концентраций, не оказывающих токсического действия на тест-объекты; при этом восстанавливается биологическая активность почвы;

происходит значительное снижение численности интродуцированных микроорганизмов, следовательно, проведение биоремедиационных работ не приводит к вторичному микробному загрязнению почвы биодеструкторами.

В результате проведенной работы была подана заявка на получение патента РФ № 2009105432 «Штамм бактерий АсИготоЬасШ Бр. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы», получено свидетельство о безопасности его использования, штаммы АсЬготоЬаМег ер. К^16 и О. аШИгор/ ОРК 3 были депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ В-2534Б и ВКМ В-2554В). Получен акт проведения полевых испытаний, который показывает, что высокая эффективность ремедиации почвы может быть достигнута путем интродукции специально подобранных микроорганизмов

ВЫВОДЫ

1. Из образцов загрязненных почв выделено 40 изолятов, способных использовать глифосат и метилфосфонат в качестве единственных источников фосфора, сформирована коллекция из 13 перспективных штаммов. Для биоремедиации почвы были отобраны наиболее эффективные деструкторы глифосата - О. атИгор! вРК 3 и АскготоЪас1ег Бр. К§16; они непатогенны для млекопитающих, не обладают фито- и интегральной токсичностью.

2. Подобраны оптимальные условия культивирования штамма О. апОггорг вРК 3, позволяющие увеличить эффективность деструкции глифосата в 2,5 раза: использование глутамата натрия как источника углерода, хлорида аммония и глутамата натрия как источников азота, интенсивность аэрации в диапазоне 10-60 % от насыщения, рН 6,0-7,0, голодание посевного материала по фосфору в течение 48 часов.

3. Показано, что до 90 % внесенного гербицида сорбируется дерново-подзолистой почвой в горизонте 0-20 см, 10 % глифосата остается в почвенном растворе, необратимо связанного глифосата не обнаружено. В условиях обильных осадков глифосат может мигрировать на глубину до 30 см.

4. Проведена биоремедиации загрязненной почвы в полевых условиях с интродукцией двух отобранных штаммов. В результате содержание глифосата снижалось на 59 % (О. агйкгор1 вРК 3) и 75 % (АскготоЬасгег ер. ^ 16) по сравнению с контролем (29 %) в условиях 10-кратного увеличения нормы использования глифосата, восстанавливалась биологическая активность почвы, а интегральная токсичность и фитотоксичность соответствовали показателям чистой почвы.

5. Подобраны условия для длительного хранения биомассы О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16, предназначенной для внесения в почву, с сохранением деструктивного потенциала.

6. В результате проведенных исследований разработан способ биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

Список публикации по теме диссертации

1. Жариков Г.А., Капранов В.В., Киселева Н.И., Крайнева О.А., Дядищева В.П., Марченко А.И., Леонтьевский А.А., Шушкова Т.В.. Ермакова И.Т. 2007. Использование микроорганизмов-деструкторов для биоремедиации почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями. Вестник защиты растений, №3, с. 68-69

2. Ермакова И.Т., Шушкова ТВ.. Леонтьевский А.А. 2008. Микробная деструкция органофосфонатов почвенными бактериями. Микробиология, т.77, № 5, с. 689-695.

3. Шушкова ТВ.. Васильева Г.К., Ермакова И.Т., Леонтьевский А.А. 2009. Сорбция глифосата и его микробная деградация в почвенных суспензиях. Прикладная биохимия и микробиология, т. 45, № 6, с. 664-669.

4. T. Shushkova. I. Ermakova, A. Leontievsky. 2010. Glyphosate Bioavailability in soil. Biodégradation, v. 21, № 3, p. 403-410.

5. Леонтьевский A.A., Ермакова И.Т., Шушкова T.B.. Ковалева M. H., Жариков Г.А., Киселева Н.И. 2009. Штамм бактерий Achromobacter sp. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы. Заявка № 2009105432 на получение патента РФ, 18.02.2009.

6. Zharikov G.A., Starovoitov 1.1., Ermakova I.T., Shushkova T.V. Microbiological dégradation of products for detoxication of chemical weapons and organophosphoric herbicides. 2003. Abstr. 8lh International FZK/TNO Conférence on Contaminated Soil "ConSoil 2003", Gent, Belgium, May 12-16, p. 197.

7. Ермакова И.Т., Шушкова T.B.. Старовойтов НИ., Федоров Е.Е., Щербаков А.А., Петрова А.А. 2004. Разработка методов фитобиоремедиации почв, загрязненных продуктами детоксикащга отравляющих веществ. Тез. докл. Международной конференции «Наука и бизнес: Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина», Пущино, Март 17-19, с. 55.

8. Ермакова И.Т., Рубан М.К., Шушкова Т.В.. Леонтьевский А.А. 2005. Биоутилизация глифосата бактериальными штаммами-деструкторами. Материалы Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, Россия, Сентябрь 14-16, с. 18-19.

9. Шушкова Т.В.. Ермакова И.Т., Леонтьевский А.А. 2005. Микробная деградация фосфорорганических соединений. Материалы Международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды», Саратов, Россия, Сентябрь 14-16, с. 58-59.

10. Ермакова И.Т., Жариков Г.А., Киселева Н.И., Леонтьевский А.А., Огорелышев Д.И., Шушкова Т В. 2006. Научные основы биотехнологии деструкции органофосфонатов. Материалы Международного научного семинара «От экологических исследований к экологическим технологиям», Миасс, Россия, Май 30 - Июнь 2, с. 60-61.

11. Киселева Н.И., Дядищева В.П., Ермакова Й.Т., Жариков Г.А., Крайнева О.А., Леонтьевский А.А., Марченко А.И., Рыбалкин С.П., Шушкова Т.В. 2006. Изучение деструктивной активности и токсикологическая оценка штаммов-деструкторов фосфонатов. Материалы Международного научного семинара «От экологических исследований к экологическим технологиям», Миасс, Россия, Май 30 - Июнь 2, с. 71-72.

12. Шушкова ТВ.. Огорелышев Д.И., Ермакова И.Т., Леонтьевский А.А. 2006. Биодеструкция органофосфонатов почвенными бактериями. Материалы Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, Белоруссия, Июнь 1-2, с. 47-48

13. A.Leontievsky, I.Ermakova, D.Ogorelyshev, G.Zharikov. T.Shushkova. 2006. Microbial degradation of phosphoroorganic compounds. Abstr. 10л International Symposium on the Genetics of Industrial Microorganisms, Prague, Czech Republic, June 24-28, p. 132-133

14. Жариков Г.А., Капранов B.B., Киселева Н.И, Крайнова О.А., Дядищева В.П., Леонтьевский А.А., Шушкова Т.В. 2007. Использование микроорганизмов-деструкторов и дождевых червей для биоремедиации почв, загрязненных токсичными химическими веществами. Тез. докл. Международной научно-практической конференции «Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в 21 веке: проблемы, перспективы, достижения», Минск, Июнь 4-8, с. 98-100.

15. Kiseleva N.I., Kraynova О.А., Dyadishcheva V.P., Leontyevsky A. A., Shushkova T.V.. Ermakova I. T. 2007. The development of the technology for bioremediation «in situ» of soils, contaminated with phosphorous-organic pesticides - Abstr. 9 International HCH and Pesticides Forum for CEECCA Countris "Obsolete Pesticides in Central and Eastern European, Caucasus and Central Asia Region: Start of clean up", Chisinau, Moldova, September 20-22, p. 93-94

16. Свиридов A.B., Ермакова И.Т., Шупжова Т В.. Леонтьевский А А. 2008. Ремедиация загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных биопрепаратов. Материалы Пятой международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности», Пущино, Россия, Октябрь 6-9, с. 24

17. Свиридов А.В., Ермакова И.Т., Шушкова Т В.. Леонтьевский А.А. 2008. Разработка научных основ для создания методов ремедиации загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных препаратов. Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», Пущино, Россия, Октябрь 21-24, с. 77

18. ГА.Жариков, Н.И. Киселева, О.А. Крайнова, В.П. Дядищева, М.Г.Жариков, А.А. Леонтьевский, Т.В. Шушкова, И.Т. Ермакова. 2009. Технология «in situ» биоремедиации почв, загрязненных фосфорорганическими соединениями. Материалы Пятого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, Россия, Март 16-20, с. 186-187

19. Свиридов А.В., Шушкова Т.В.. Ермакова И.Т., Леонтьевский А.А. 2009. Биохимические основы разработки микробных препаратов для ремедиации загрязненных органофосфонатами почв. Сб. тез. Научно-практической конференции «Системная биология», Пущино, Май 28, с. 13

20. Т. Shushkova. N. Kiseleva, G. Zharikov, I. Ermakova. 2009. Bioremediation of glyphosate-contaminated soils by microorganisms-degraders. Abstr. III International Conference of Environmental, Industrial and Applied Microbiology «MicroBioWorld 2009», Lisbon, Portugal, December 2-4.

http://foimatex.org/biomicroworld2009/abstracts/htm/168.htm

Подписано в печать:

06.05.2010

Заказ № 3700 Тираж - 90 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www. autoreferat. ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шушкова, Татьяна Валентиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. ОРГАНОФОСФОНАТЫ КАК КЛАСС ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ.

1.1.1. Органофосфонаты - соединения с прямой С-Р связью.

1.1.2. Природные и синтетические органофосфонаты.

1.1.3. Глифосат (N-фосфонометилглицин).

1.2. БИОДЕСТРУКЦИЯ ОРГАНОФОСФОНАТОВ.

1.2.1. Микроорганизмы - деструкторы фосфонатов.

1.2.2. Получение накопительных культур.

1.2.3. Энзимология разложения С-Р связи.

1.2.4. Физиологические особенности разложения С-Р связи.

1.2.5. Деструкция глифосата.

1.2.6. Физиологические особенности разложения глифосата.

1.3. ПОВЕДЕНИЕ ГФ В ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЕ.

1.3.1. Устойчивость ГФ.

1.3.2. Инактивация ГФ в окружающей среде.

1.3.2.1. Механизм сорбции глифосата.

1.3.2.2. Сорбция глинистыми минералами и органическим веществом.

1.3.2.3. Влияние фосфата на сорбцию ГФ.

1.3.2.4. Биодеструкция ГФ в почве.

1.3.3. Подвижность ГФ в почве.

1.4. БИОРЕМЕДИАЦИЯ - КАК СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЧВЫ ОТ ПОЛЛЮТАНТОВ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.1.1. Среды для культивирования бактерий.

2.1.2. Выделение и отбор бактерий-деструкторов.

2.1.3. Условия культивирования бактерий.

2.1.4. Таксономическое определение штаммов-деструкторов.

2.1.5. Изучение выживаемости клеток при длительном хранении.

2.2. АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.2.1. Аналитическое определение фосфатов и фосфонатов.

2.2.2. Количественное определение ГФ.

2.2.3. Определение метаболитов деструкции в культуральной жидкости.

2.2.4. Другие аналитические методы.

2.3. ЭКСПЕРИМЕНТЫ В МОДЕЛЬНЫХ ПОЧВЕННЫХ СИСТЕМАХ.

2.3.1. Характеристика используемых почв.

2.3.2. Изучение сорбции ГФ в почвенной суспензии.

2.3.3. Построение изотерм сорбции ГФ.

2.4. БИОДЕГРАДАЦИЯ ГФ В ПОЧВЕ.

2.4.1. Микробная деградация ГФ в почвенной суспензии.

2.4.2. Лабораторные эксперименты по отбору штаммов для биоремедиации.

2.4.3. Изучение миграции ГФ по вертикальному профилю и его биодеструкции в почвенной колонке.

2.4.4. Биоремедиация почвы от загрязнения ГФ в полевых условиях.

2.5. ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

2.5.1. Биотестирование на дафниях.

2.5.2. Изучение токсичности штаммов для теплокровных животных.

2.5.3. Определение дегидрогеназной активности в почве.

2.5.4. Определение биомассы аборигенной почвенной микрофлоры.

2.5.5. Определение фитотоксичности.

2.6. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

Глава 3. Результаты исследования.

3.1. СОЗДАНИЕ МУЗЕЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ ОФ.

3.1.1. Выделение, селекция и оценка деструктивной активности бактериальных штаммов.

3.1.2. Условия длительного хранения штаммов.

3.2. ОПТИМИЗАЦИЯ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ШТАММА О. anthropi GPK 3 С ЦЕЛЬЮ ПОВЫШЕНИЯ ДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ.

3.2.1. Поиск оптимального источника углерода.

3.2.2. Влияние источника азота на деструктивную активность штамма О. anthropi GPK 3.

3.2.3. Влияние источника фосфора при подготовке инокулята.

3.2.4. Голодание клеток штамма бактерий О. anthropi GPK 3 по фосфору.

3.2.4.1. Исходная концентрация клеток в инокуляте.

3.2.4.2. Продолжительность голодания инокулята.

3.2.4.3. Эффективность деструкции ГФ в зависимости от продолжительности голодания инокулята.

3.2.4.4. Содержание общего фосфора в клетках О. anthropi GPK 3 в динамике роста культуры.

3.2.5. Определение удельной нагрузки субстрата.

3.2.6. Влияние на биодеструкцию начальной концентрации ГФ.

3.2.7. Влияние значения рН и уровня аэрации на разложение ГФ.

3.3. СОРБЦИЯ И БИОДЕСТРУКЦИЯ ГФ В ПОЧВЕННЫХ СУСПЕНЗИЯХ.

3.3.1. Построение изотерм сорбции ГФ.

3.3.2. Динамика сорбция ГФ в почвенной суспензии.

3.3.3. Деградация ГФ штаммом О. anthropi GPK 3 в почвенной суспензии.

3.4. ИЗУЧЕНИЕ БИОДЕГРАДАЦИИ ГФ В ПОЧВЕ С ПОМОЩЬЮ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ.

3.4.1. Отбор штаммов для биоремедиации в условиях лабораторных почвенных экспериментов.

3.4.2. Изучение деструкции глифосата в почве штаммами О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16.

3.4.3. Биодеструкция ГФ и его распределение по вертикальному профилю в лизиметрической колонке.

3.5. БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЕННОЙ ГФ, В УСЛОВИЯХ ПОЛЕВОГО ЭКСПЕРИМЕНТА.

3.6. ПОДБОР СТАБИЛИЗАТОРОВ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ АКТИВНОЙ БИОМАССЫ ШТАММОВ-ДЕСТРУКТОРОВ.

3.7. ДЕПОНИРОВАНИЕ И ПАТЕНТОВАНИЕ.

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеструкция глифосата почвенными бактериями"

Актуальность проблемы

Одним из последствий развития современной цивилизации является загрязнение окружающей среды ксенобиотиками. Среди наиболее опасных загрязнителей -органофосфонаты (ОФ), фосфорорганические соединения, характеризующиеся наличием прямой углерод-фосфорной (С-Р) связи. ОФ необычайно устойчивы к химическому и физическому воздействию из-за особых свойств С-Р связи в их структуре. ОФ входят в состав гербицидов, антибиотиков, пламегасителей, ингибиторов коррозии, часто используются как хелатирующие добавки к детергентам и являются продуктами химической нейтрализации фосфорорганических отравляющих веществ, таких как зарин, зоман, VX.

Самый известный представитель этого класса соединений, глифосат (ГФ), является основой множества гербицидов, зарегистрированных более чем в 120 странах под различными торговыми марками (Раундап, Граунд Био, Ураган, Глисол и др.). Хотя производители приводят доказательства безопасности гербицидов на основе ГФ, независимыми исследователями было показано, что ГФ изменяет почвенную экосистему, влияя на состав и активность микрофлоры, увеличивает восприимчивость культурных растений к болезням, способствует аккумулированию тяжелых металлов в водных экосистемах и оказывает вредное воздействие на гидробионтов. При попадании в организм млекопитающих он приводит к нарушениям функций ряда органов. Остаточные количества ГФ способны сохраняться долгое время в растениях, плодах, рыбе и других продуктах питания. Он может накапливаться и сохраняться в почве вследствие сорбции и миграции и сохраняться в ней в течение нескольких лет.

В такой ситуации особую актуальность приобретают способы очистки и восстановления природной среды, загрязненной ОФ. Из-за устойчивости этих соединений к физико-химическим воздействиям, внимание исследователей привлекают микроорганизмы, способные к их биодеструкции путем разрыва С-Р связи.

Как правило, при разрушении ГФ природными микробными сообществами почвы и воды происходит его трансформация до аминометилфосфоната (АМФК), по-прежнему содержащего С-Р связь. Известны лишь отдельные штаммы-деструкторы, способные минерализовать АМФК. Деструктивный потенциал и общая эффективность таких штаммов не всегда высоки, поэтому поиск и выделение новых штаммов-деструкторов, а также повышение их активности весьма актуальны, причем, в первую очередь, для создания современных биотехнологий ремедиации почвы и воды, загрязненных ГФ.

Сведения о физиологических особенностях штаммов-деструкторов ОФ ограничены. Дефицит таких знаний также сдерживает разработку технологических приемов очистки окружающей среды от ГФ, основанных на использовании потенциала природных микроорганизмов-деструкторов. Поэтому приоритетными задачами являются изучение физиологических условий проявления максимальной деструктивной активности микроорганизмов в отношении ОФ, особенно ГФ, разработка приемов повышения их потенциала и способов применения на практике.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является разработка способа биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

В соответствии с этим решались следующие задачи:

1. Выделение и отбор штаммов-деструкторов глифосата из загрязненных почв.

2. Оптимизация условий культивирования штаммов-деструкторов глифосата.

3. Изучение взаимодействия глифосата с почвой.

4. Оценка деструктивной активности отобранных штаммов в почве в условиях микрокосма.

5. Изучение биодеструкции глифосата и изменение токсикологических показателей почвы в полевых условиях.

6. Изучение условий хранения биомассы штаммов-деструкторов.

Научная новизна

Из почв с многолетним загрязнением органофосфонатами выделены новые эффективные штаммы-деструкторы ГФ и метилфосфоновой кислоты (МФК). Наиболее активный из них, Ochrobactram anthropi GPK 3, был способен к росту в среде с концентрацией ГФ до 10 г/л. В отличие от многих известных штаммов отобранные нами бактерии обладали способностью минерализовать токсикант без накопления АМФК, как продукта трансформации, содержащего устойчивую С-Р связь. Показана способность штаммов-деструкторов выживать и сохранять деструктивную активность в почве при высоком уровне загрязнения ГФ, в десять раз превышающем рекомендуемые нормы применения гербицида.

Путем оптимизации условий культивирования (голодание посевного материала по фосфору, исходная концентрация ГФ, значение рН и рОг и др.) эффективность деструкции ГФ была повышена в 2,5 раза.

Впервые была проведена комплексная оценка процесса ремедиации загрязненной ГФ почвы, включающая как убыль ГФ при интродукции бактерий-деструкторов О. anthropi

GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16 с учетом сорбции и миграции токсиканта, так и изменение экотоксикологических характеристик загрязненной почвы. Показано восстановление биологической активности почвы в результате биоремедиации. Изучение биодеструкции ГФ интродуцированными штаммами, как в лабораторных, так и в полевых условиях проводилось впервые.

Практическая значимость

Создана коллекция бактерий-деструкторов, способных разрушать разные типы С-Р связи, которые могут использоваться для создания технологий очистки объектов окружающей среды от ОФ различной структуры. Микроорганизмы, отобранные для внесения в почву, непатогенны для теплокровных животных, не обладают фито- и интегральной токсичностью и могут использоваться в процессе биоремедиации без ограничений. Разработаны способы улучшения деструктивных свойств штаммов, выделенных из окружающей среды.

Подобраны стабилизаторы, внесение которых в биомассу штаммов-деструкторов позволяет сохранять их высокую деструктивную активность при комнатной температуре в течение 50 суток.

В лабораторных и полевых экспериментах доказана эффективность применения выделенных микроорганизмов, Achromobacter sp. Kg 16 и О. anthropi GPK 3, для биоремедиации почвы, загрязненной ГФ. В условиях периодического культивирования наибольшую эффективность как деструктор ГФ показал штамм О. anthropi GPK 3, тогда как в экспериментах с интродукцией штаммов в почву, особенно в полевых условиях, лучшим деструктором оказался Achromobacter sp. Kg 16. Получен акт полевых испытаний по биоремедиации почвы, проведенных на специально выделенных участках Серпуховского района Московской области в летний период 2006, 2007 гг.

Полученные сведения о процессах сорбции ГФ и его вертикальной миграции в почве, а также степени участия природного микробного сообщества в деструкции токсиканта позволяют более точно оценивать эффективность интродукции штаммов-деструкторов и риски при обработке почвы гербицидами на основе ГФ.

На основе проведенных исследований впервые разработан способ очистки почв, загрязненных ГФ (заявка на получение патента РФ № 2009105432 «Штамм бактерий Achromobacter sp. - деструктор органофосфонатов и способ его применения для биоремедиации почвы»).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Шушкова, Татьяна Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Из образцов загрязненных почв выделено 40 изолятов, способных использовать глифосат и метилфосфонат в качестве единственных источников фосфора, сформирована коллекция из 13 перспективных штаммов. Для биоремедиации почвы были отобраны наиболее эффективные деструкторы глифосата - О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kgl6; они непатогенны для млекопитающих, не обладают фито- и интегральной токсичностью.

2. Подобраны оптимальные условия культивирования штамма О. anthropi GPK 3, позволяющие увеличить эффективность деструкции глифосата в 2,5 раза: использование глутамата натрия как источника углерода, хлорида аммония и глутамата натрия как источников азота, интенсивность аэрации в диапазоне 10-60 % от насыщения, рН 6,0-7,0, голодание посевного материала по фосфору в течение 48 часов.

3. Показано, что до 90 % внесенного гербицида сорбируется дерново-подзолистой почвой в горизонте 0-20 см, 10 % глифосата остается в почвенном растворе, необратимо связанного глифосата не обнаружено. В условиях обильных осадков ГФ может мигрировать на глубину до 30 см.

4. Проведена биоремедиация загрязненной почвы в полевых условиях с интродукцией двух отобранных штаммов. В результате содержание глифосата снижалось на 59 % (О. anthropi GPK 3) и 75 % (Achromobacter sp. Kg 16) по сравнению с контролем (29 %) в условиях 10-кратного увеличения нормы использования ГФ, восстанавливалась биологическая активность почвы, а интегральная токсичность и фитотоксичность соответствовали показателям чистой почвы.

5. Подобраны условия для длительного хранения биомассы О. anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. Kg 16, предназначенной для внесения в почву, с сохранением деструктивного потенциала.

6. В результате проведенных исследований разработан способ биоремедиации почв, загрязненных глифосатом.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам Научно-исследовательского центра токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов Федерального медико-биологического Агентства России (г. Серпухов) проф. д.б.н. Жарикову Г.А. за организацию токсикологической экспертизы и к.б.н. Киселевой Н.И. за помощь в проведении тестов по фитотоксичности, вед.н.с. Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН (г. Пущино) к.б.н. Васильевой Г.К. за консультации при постановке почвенных экспериментов, сотрудникам ИБФМ РАН Гафарову А.Б. и Соколову С.Л. за помощь в идентификации штаммов, к.х.н. Зеленковой Н.Ф. и Винокуровой Н.Г. за консультации по вопросам аналитического определения органофосфонатов, Насыбуллиной М.Ф. за определение внутриклеточного содержания фосфора, а также всем сотрудникам лаборатории микробной энзимологии за внимание и поддержку при выполнении настоящей работы.

Особую благодарность автор приносит старшему научному сотруднику лаборатории микробной энзимологии к.б.н. Инне Тихоновне Ермаковой за благожелательное отношение и неоценимую помощь в планировании экспериментальной работы и интерпретации результатов, а также своему руководителю д. б. н. Алексею Аркадьевичу Леонтьевскому за постоянное внимание, консультации и плодотворное обсуждение этапов работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шушкова, Татьяна Валентиновна, Пущино

1. Берестецкий О.А. Методы определения токсичности почвы. Микробиологические и биохимические исследования почв. Киев: Урожай, 1971.

2. Булгаков Н. Г. Индикация состояния природных экосистем и нормирование факторов окружающей среды. Обзор существующих подходов. Усп. соврем, биол., 2002, т. 122, №2, с.115-135.

3. Бурдин К.С. Основы биологического мониторинга, М: МГУ, 1985.

4. Васильева Г.К., Суровцева Э.Г., Белоусов В.В. Разработка микробиологического способа для очистки почвы от загрязнения пропанидом и 3,4-дихлоранилином. -Микробиология, 1994, т. 63, с. 129-144.

5. Вельков В.В. Стандартизация формата описаний промышленных технологий биоремедиации. Биотехнология, 2001, №2, с. 70-76.

6. Вершинина О.А., Знаменская Л.В. Pho регулоны бактерий. Микробиология, 2002, т. 71, с. 581-595.

7. Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д. Ферменты деструкции фосфорорганических нейротоксинов. Успехи биологической химии, 2004, т. 44, с. 307-340.

8. Зеленкова Н.Ф., Винокурова Н.Г. Определение глифосата и продуктов его биодеградации хроматографическими методами. Журнал Аналитической Химии, 2008, №9, с. 958-961.

9. Кононова С.В., Несмеянова М.А. Фосфонаты и их деградация микроорганизмами. -Биохимия, 2002, т. 67, № 2, с. 220-233.

10. Кравцов И.С., Янов С.Н, Дармов И.В., Ковтун А.Л. Выделение из окружающей среды микроорганизмов, способных разлагать фосфонаты. Химическая и биологическая безопасность, 2006, № 6, с. 3-9.13.